KR100903706B1 - 배추 품종 검정용 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배추 품종 검정용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 서열번호 1 및 2, 서열번호 1 및 3 및 서열번호 1 및 4의 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 배추 품종 검정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배추 품종 검정용 프라이머는 형질전환된 배추의 품종을 PCR 방법을 통해 검정할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 배추 품종 검정용 프라이머 및 이를 이용한 검정 방법은 형질전환된 배추의 검정의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 유전자변형 농산물의 화분이동성과 유전자변형 식물체의 교잡 후대에서 모본을 확인하는 목적으로 사용할 수 있다.

배추 품종 검정, 프라이머, GMO, 계통 특이적 프라이머

Description

배추 품종 검정용 프라이머 및 이의 용도{Primer for identifying the race of chinese cabbage and use thereof}

본 발명은 배추 품종 검정용 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 서열번호 1 및 2, 서열번호 1 및 3 및 서열번호 1 및 4의 프라이머쌍 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 배추 품종 검정 방법에 관한 것이다.

분자생물학과 유전공학의 발달로 다양한 형질전환 작물이 개발되고 있다. 1984년에 처음으로 TMV저항성 담배 식물체가 개발된 이래로 제초제, 해충, 병 저항성을 지닌 형질전환(Genetically Modified, GM) 작물의 개발이 이루어지고 상업화되고 있다. 2006년 보고에 따르면 GM 작물은 22개국에서 재배되며, 재배면적은 1억만ha에 이르고 있고, 매년 그 면적이 증가되는 추세이다. GM 작물의 재배면적과 상업화가 증가되면서 각국의 개발회사와 국가는 개발된 GM 작물의 지적재산권 및 품종등록을 위하여 다양한 마커를 개발하고 있다. 또한 GM 작물을 수입하는 관련 국 가에서는 GM 작물과 식품에 대한 검정법 확립과 동시에 실제 GM 작물 및 식품의 표시에 적용가능한 검사법이 개발하고 있다. 국내뿐만 아니라 국제적으로 GM 작물 및 식품에 대한 검사법의 개발 및 표준화 연구가 활발히 이뤄지고 있다.

GM 작물을 검정하는 방법으로 현재 많이 이용되는 방법은 효소면역학적 방법과 PCR (Polymerase Chain Reaction) 방법으로 나눌 수 있다. 효소면역학적 방법은 GM 작물에 도입된 유전자에 의해서 생산되는 단백질에 특이적으로 인지하는 항체단백질을 이용하는 방법으로 검출대상이 단백질이 존재하는 GM 작물과 원료 등 비가공 식품의 검정에 적합하다. 그러나 같은 형질의 GM 작물이라도 조직이나 기관에 따라 GM 단백질의 발현양이 달라질 수 있으므로 GM 단백질이 발현되지 않는 기관의 경우에는 검정이 곤란하다.

PCR 검정법은 GM 작물에 도입된 유전자의 조절부위 또는 도입유전자의 단편을 특이적으로 증폭하는 기술로서 원료 농산물뿐 아니라 가공품에서도 검정이 가능하다. PCR을 이용한 검정법에는 GM 작물의 혼입여부를 하는 정성 PCR과 혼입된 GM 작물의 양을 확인하는 정량 PCR이 있다.

그 중 정성 PCR 분석법은 크게 4가지의 범주내에서 이뤄지고 있다. 첫째, 스크리닝 방법(Screening method)를 이용한 GM 작물의 혼입여부를 확인하는 것이다 (Pietsch et al., 1997, Screeningverfahren zur Identifizierung "gentechnisch ver" pflanzlicher Lebensmittel. Deutsche Lebensm. Rundsch. 93: 35-38). GM 작물을 개발하기 위해 일반적으로 사용되는 조절유전자는 프로모터의 경우는 컬리플라워 모자이크 바이러스 유래의 프로모터인 P-35S유전자를 이용하며, 터미테이터는 아그로박테리움 튜머페시엔스의 노파인합성유전자의 터미네이터인 T-Nos유전자를 주로 이용한다. 현재 상업화된 대다수의 GM 작물의 경우 이들 유전자가 하나이상 게놈내에 존재하게 되므로 P-35S와 T-Nos를 증폭하는 프라이머를 이용하여 GM 작물인지를 확인하는데에 사용된다. 하지만 식물이 바이러스나 박테리아에 감염되는 경우가 있기 때문에 이들 프라이머만을 이용할 경우 의사양성(false-positive) 결과를 얻을 수도 있다.

둘째, 유전자 특이적(Gene specific) 프라이머를 이용한 GM 작물 동정하는 방법이다 (Ehlers et al., 1997, Nachweis gentechnischer Verin Mais mittels PCR. Bundesgesundhbl. 4: 118-121; Vaet al., 1999, Real-time quantitative PCR detection of genetically modified maximizer maize and RoundupReady soybean in some representative foods. J. Agric. Food Chem. 47: 5261-5266). GM 작물을 개발하기 위해서 게놈내로 삽입된 목적유전자를 증폭하는 프라이머를 이용하는 방법이다. 예를 들어서 제초제저항성 유전자인 bar와 해충저항성유전자인 Cry1A(b)를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용하는 방법이다. 이방법의 경우 이들 유전자를 지닌 모든 GM 작물을 확인할 수는 있으나, 특정 GM 작물의 혼입여부를 파악하기는 어렵다.

셋째, 구조체 특이적(Construct specific) 프라이머를 이용한 GM 작물의 동정하는 방법이다 (Matsuoka et al., 2001, A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize. J. Food Hyg. Soc. Japan 42: 24-32; Hupfer et al., 1998, Detection of the genetic modification in heat treated products of Bt maize by polymerase chain reaction. Lebensm. Unters. Forsch. 206(A): 203-207; Zimmermann et al., 1998, A sensitive detection method for genetically modified MaisGard™ corn using a nested PCR-system. Lebensm.-Wiss. u. Technol. 31: 664-667; Wurz & Willmund, 1997, Identification of transgenic glyphosate-resistant soybeans. Pages 115117 in Food Produced by Means of Genetic Engineering, 2nd status report. G. A. Schreiber, K. W. Bogl, ed. Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherchutz and Veterinarmedizin, BgVV, Berlin, Germany; Busch et al., 1999, Screening- und spezifische Nachweismethode ftransgene Tomaten (Zeneca) mit der Polymeraskettenreaktion. Deutsche Lebensmittelrundschau, Heft 2: 52-56). GM 작물을 개발하기 위해서 제작된 운반체의 조절부위와 목적유전자의 결합부위에서 프라이머를 선발하고 이들을 조합하여 PCR을 수행하는 방법이다. 그러나 현재 상업화되는 형질전환 작물은 같은 운반체를 지니고 있지만 게놈내의 삽입위치의 차이에 따라서 다른 계통으로 분류되어 상업화되는 것이 많다. 따라서 이 방법으로는 특정한 계통의 GM 작물을 검출하기에는 어려움이 많다.

마지막으로 계통 특이적(Event specific) 프라이머를 이용한 GM 작물의 동정하는 방법이 있다 (Zimmermann et al., 2000, Event specific transgene detection in Bt11 corn by quantitative PCR at the integration site. Lebensm.-Wiss. u. Technol. 33: 210-216; Berdal KG & Holst-Jensen A, 2001, RoundupReadysoybean event-specific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses. European Food Research and Technology 213: 432-438; Taverniers et al., 2001, Use of cloned DNA fragments for event-specific quantification of genetically modified organisms in pure and mixed food products. Eur Food Res Technol 213, 417-424; Terry & Harris, 2001, Event-specificdetection of Roundup Ready Soya using two different real time PCR detection chemistries. Eur. Food Res. Technol. 213: 425-431). 운반체의 게놈내의 삽입위치에서 프라이머를 개발하여 증폭하는 방법이다. 이 방법은 한쪽의 프라이머를 식물 게놈의 염기서열을 바탕으로 하기 때문에 동일한 운반체로 형질전환이 이루어져도 게놈내의 삽입위치는 달라지므로 계통간에는 증폭이 이루어지지 않는다. 이들 방법들 중에서 비교적 안정적으로 GM 작물을 동정하는 것으로 알려져 있다. 또한 최근에는 서로 다른 유전자가 들어간 개체들을 교배하여 얻은 gene stacking 개체의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 따라서 이들 event specific 방법을 이용한다면 어떤 유전자를 지닌 개체들이 교배되었는지를 확인할 수도 있다.

최근에 국외 연구진은 상업화된 12종의 GM 작물에서 계통 특이적 프라이머(event specific primer)를 개발하였고 이를 GM 작물의 혼입여부를 판별하기위한 검정방법에 사용하고 있다. 뿐만 아니라 이들 계통 특이적 프라이머(event specific primer)는 단일 또는 복수의 조합으로 이용되어서 시료에 단일 혹은 복수의 GM 작물의 혼입여부를 판별하는 것으로 보고되고 있다. 또한 이들 계통 특이적 프라이머(event specific primer)는 GM 작물의 지적재산권을 확보하기위한 마커로의 이용가능성이 높다.

이에 본 발명자들은 유용한 품종의 배추를 개발하기 위하여 연구하던 중 복합 저항성을 보이도록 형질전환된 농생배추 001 품종을 개발하고, 이를 특이적으로 검정할 수 있는 프라이머 조합 및 이를 이용한 검정 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 배추 검정용으로 사용할 수 있는 프라이머쌍 및 그 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 서열번호 1 및 2, 서열번호 1 및 3 및 서열번호 1 및 4의 배추 검정용 프라이머쌍을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 배추의 품종 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머쌍, DNA 중합효소 및 PCR 반응 완충용액을 포함하는 배추의 품종 동정용 키트을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 배추 검정용 프라이머쌍은 각각 서열번호 1 및 2, 서열번호 1 및 3 또는 서열번호 1 및 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 제공하는 배추 검정용 프라이머쌍은 PCR 프라이머쌍을 말하며, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함한다. 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2, 서열번호 1 및 3 또는 서열번호 1 및 4의 염기서열을 가진다.

본 발명에서 제공되는 프라이머쌍은 배추에서 품종을 검정하는 데에 유용하게 사용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 프라이머쌍에 의해 농생배추 001 품종의 검정 및 농생배추 001이 자가 또는 타 품종과 교배된 후대 품종의 검정이 가능하다. 따라서 본 발명은 상기 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 것을 포함하는 배추의 품종 동정 방법을 제공한다.

구체적으로 배추의 품종 동정 방법은

(a) 배추로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

(b) 추출된 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에서 제공하는 SSR 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

(c) 각 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol . Biol . Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al ., Nuc . Res ., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

또한 상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성 분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 배추에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl₂ 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 바람직하게는 1.5 ~ 2.5 mM의 범위로 사용될 수 있다. 일반적으로 Mg^{2 +}가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg^{2 +}가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94 내지 95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는 56 내지 70℃이며, 보다 바람직하게는 60℃ 내지 65℃이다. 아울러, DNA의 농도 및 프라이머의 농도는 각각 25 ~ 250ng / 50μl 및 25 ~ 400 μM로 하는 것이 적절함을 알 수 있었다.

상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크 릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 보다 바람직하게는 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

상기 품종의 검정은 특정 프라이머쌍에 대한 PCR 산물이 증폭되었는지 확인하는 방법으로 수행된다. 즉, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머쌍을 이용하는 경우 약 550bp 내지 560bp(프라이머쌍 디자인 상으로는 556bp) 의 PCR 산물이 증폭되었는지 확인하는 방법으로 수행된다. 마찬가지로 서열번호 1 및 서열번호 3의 프라이머쌍을 이용하는 경우 약 640bp 내지 650bp의 PCR 산물(프라이머쌍 디자인 상으로는 646bp), 서열번호 1 및 서열번호 4의 프라이머쌍을 이용하는 경우 약 750bp 내지 760bp의 PCR 산물(프라이머쌍 디자인 상으로는 755bp)을 확인하는 방법으로 수행된다.

이와 같은 품종의 동정 방법은 신규 유전자원 도입시 품종 또는 계통 판단 및 원산지 확인을 통한 원산지 표시 위반 여부의 판정 등 품종의 동정이 필요한 경 우에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머쌍을 포함하는 배추의 품종 동정용 키트를 제공한다. 품종 동정 방법은 상기에서 기재한 바와 같다. 이외에 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 배추 품종 검정용 프라이머는 형질전환된 배추의 품종을 PCR 방법을 통해 검정할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 배추 품종 검정용 프라이머 및 이를 이용한 검정 방법은 형질전환된 배추의 검정의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 유전자변형 농산물의 화분이동성과 유전자변형 식물체의 교잡 후대에서 모본을 확인하는 목적으로 사용할 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

배추의 형질전환

본 발명에서 복합저항성 배추 형질전환체를 제조하기 위해 사용된 벡터인 416은 도 1A에서 보듯이 해충저항성 유전자인 CryIAc 유전자(서열번호 7, Genbank Accession No. AY126450), 사과로부터 분리된 개화조절 유전자인 MdMADS유전자 및 제초제저항성 유전자인 Bar유전자를 지닌 pCAMBIA3301로, 디스암드 Ti-플라스미드(disarmed Ti-plasmid)를 포함하고 있는 아그로박테리움 투머파시엔스 LBA4404(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)에 도입한 것을 동부한농(주)으로부터 분양받아 사용하였다.

배추 육종계통인 노원종자를 70% (v/v) 에탄올에서 2분간 표면 살균한 다음, 2.5% (v/v) 차아염소산 나트륨(sodium hypochlorite) 용액에서 10분간 살균하고 멸균수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 1/2 MS 기본배지 (Murashige and Skoog, 1962, Physiol Plant 15: 473-497)에 파종하여 26℃에서 암배양하고, 파종후 5일된 배추식물체의 하배축을 실험재료로 사용하였다.

하배축을 1cm 길이로 절단하여 1 mg/L BA(6-benzyladenine), 1 mg/L NAA(naphthaleneacetic acid), 10 g/L 설탕(sucrose), 8 g/L 아가(agar)가 첨가된 MS 기본배지에 치상하여 이틀간 전처리하였다.

416 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스 LBA4404를 YEP(10g/L Bacto-peptone, 10g/L Bacto-yeast extract, 5g/L NaCl) 액체배지에 접종하여 48시간 동안 진탕배양하였다. 아그로박테리움 배양액에 배추 하배축에 20분간 감염시킨 다음, 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 10 g/L 설탕(sucrose), 8 g/L 아가(agar)가 첨가된 MS배지에서 2일간 공동배양하였다. 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 300 mg/L 카베니실린(carbenicillin), 3 mg/L PPT(Phosphinothricin), 10 g/L 설탕(sucrose), 8 g/L 아가(agar)가 첨가된 MS배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양하였다. 재분화된 신초는 300 mg/L 카베니실린(carbenicillin), 3 mg/L PPT, 10 g/L 설탕(sucrose), 8 g/L 아가(agar)가 첨가된 MS배지로 옮겨 발근을 유도하였다. 발근된 개체는 순화 후 화분으로 이식하여 온실에서 생육하였다. 순화후 배추식물체에 0.3% 바스타(Basta) 용액을 처리하여 살아남은 배추식물체를 형질전환 배추로 확보하였으며, 이를 각각 416-1, 416-2, 416-3으로 명명하였다.

< 실시예 2>

유전자의 도입 확인

배추식물체로 유전자의 안정적 도입을 확인하기 위해서 서던 블럿(Southern blot) 분석을 다음과 같이 수행하였다. 게놈 DNA(Genomic DNA)는 Kim(Kim JS, 2002, Composite of a linkage map of Brassica rapa (ssp. pekinenssis) using EST clones and comparative genome study to Arabidopsis thaliana. PhD thesis, KyungheeUniversity, Suwon, Republic of Korea)의 방법을 이용하여 형질전환되지 않은 대조구(노원종자)와 상기 실시예 1에서 제조한 형질전환체 416-1, 416-2, 416-3에서 각각 추출하였다. 20 μg의 각각의 게놈 DNA를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 각각 처리하여 0.8% agarose gel에 전기영동한 다음, 모세관 전이(capillary transfer) 방법으로 나일론 멤브레인(nylon membrane)에 전이시켰다. 이를 0.5 M Na-Pi(sodium phosphate, pH 7.2), 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1% BSA(bovine serum albumin), 1 mM EDTA, 0.1 mg/ml 변성 연어 정자 DNA(denatured salmon sperm DNA)가 첨가된 용액에서 3시간 (65℃)동안 전-혼성화(prehybirdization)한 다음, [α-³²P]dCTP로 표지된 CryIAc DNA를 첨가하여 12시간 혼성화(hybirdization)하였다. 혼성화된 멤브레인을 2X SSC(Sodium Chloride Sodium Citrate), 0.1% SDS 용액 (65℃)에서 20분, 1X SSC, 0.1% SDS용액 (65℃)에서 20분 세척한 후 Bio-imaging analyzer(BAS-2000; Fuji Photo Film, Japan)로 분석하였다.

그 결과, 도 1B에서 보듯이 대조구에서는 단편이 검출되지 않았으나(lane C), 형질전환 배추식물체(레인 1, 레인 2 및 레인 3)에서는 단편이 검출되어 배추식물체의 게놈 내로 해충저항성유전자인 CryIAc가 도입되었음을 확인하였다. 서던 분석결과 형질전환 배추식물체중에서 416-1번 개체의 경우 2 카피의 유전자가 도입된 것을 확인하였고, 416-2, 416-3번 개체는 1 카피의 유전자가 도입된 것을 확인하였다.

< 실시예 3>

형질전환된 배추 식물체에서 유전자의 발현 확인

유전자 도입이 확인된 배추식물체(416-1, 416-2 및 416-3 개체)와 형질전환되지 않은 배추식물체(노원종자) 잎으로부터 트리졸(Trizol, Invitrogen, 미국)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 분리된 전체 RNA 20㎍을 1% 포름알데히드 아가로스 겔에서 전기영동한 다음, 모세관 전이 방법으로 나일론 멤브레인에 전이시켰으며, 이를 이용하여 상기 실시예 2에 기재된 방법과 같은 방법을 적용하여 노던 블럿을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 유전자 도입이 확인된 배추식물체(416-1, 416-2 및 416-3 개체, 각각 레인 1, 레인 2 및 레인 3)에서는 모두 해충저항성유전자 CryIAc의 발현이 확인되었으나, 대조구(레인 C)에서는 발현이 확인되지 않아, 삽입된 해충저항성유전자의 안정적으로 발현함을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4>

형질전환 배추의 게놈내의 인접서열증폭

상기 실시예 2 및 실시예 3에서 유전자도입 및 발현이 확인된 배추식물체중에서 유전자가 하나 삽입된 것이 확인된 416-2, 416-3을 이용하여 배추 게놈내의 인접서열을 다음과 같이 분석하였다. 게놈 DNA를 분리하여 게놈 워커(Genome walker, Invitrogen)를 사용하여 제조사가 제공한 방법으로 분석을 수행하였다. 게놈 워커의 방법에 따라 bar F1 프라이머(5'-CTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCG-3', 서열번호 1)와 AP1 프라이머(5‘-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’, 서열번호 8)를 이용하여 1차 PCR(94°C 25초, 72°C 4분간 7회 수행한 후, 94°C 25 초 67°C 4분간 32회 수행하고 67°C 4분간 최종 extension 반응을 수행(Genome walking PCR에 따라 annealing과 extention은 동일한 온도조건에서 수행)을 수행하였고, 이를 희석하여 bar F2 프라이머(5'-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3', 서열번호 5)와 또다른 AP1 프라이머(5‘-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’, 서열번호 9)를 이용하여 2차 PCR(94°C 25초 72°C 4분간 5회 수행한 후, 94°C 25 sec 67°C 4 min 22회 수행하고, 67°C 4분간 최종 extension 반응을 수행)을 수행하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 416-2와 416-3의 genomic DNA 중에서 DraI(레인 1 및 레인 5)과 EcoRV(레인 4 및 레인 8)로 처리한 경우에만 인접서열이 증폭되었으며, 416-2와 416-3에서 증폭된 밴드의 크기는 DraI과 EcoRV로 처리했을 때 동일 하게 나타났다.

< 실시예 5>

형질전환 배추의 게놈내의 인접서열분석

상기 실시예 4에서 증폭된 PCR 산물을 상용의 키트(QIAgen gel extraction kit, QIAgen, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 정제한 후 pGEM-T easy 벡터(Promega, 미국) 내로 클로닝하여 양방향의 염기서열을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 기재된 서열번호 10의 염기서열이 확인되었으며, 416-2와 416-3에서 증폭된 DNA의 염기서열이 모두 동일하게 나타났다. 이는 이들 개체들이 동일한 캘러스 유래의 형질전환체임을 의미하는 것이며, 실시예 2 내지 4의 실험결과에서 모두 동일한 위치에 밴드가 나타나는 것에도 부합하는 것이었다.

확인된 염기서열을 상동성 검색(Blast search)을 한 결과, pCAMBIA3301의 LB(left border)의 염기서열을 확인되었으나(도 4의 음영부분), 그 외 염기서열은 유사성이 나타나지 않았다. 상기 실시예 2에서 제조된 416-2와 416-3의 식물체는 해충저항성유전자가 삽입되었고, 목적하는 유전자이외의 서열은 삽입되지 않은 것으로 확인하여 이를 농생배추 001로 명명하였다.

< 실시예 6>

형질전환 배추의 계통 특이 프라이머의 제작 및 적정 PCR 조건 수립

게놈 내의 인접부위의 염기서열을 바탕으로 본 발명의 농생배추 001에 대한 계통 특이적인 마커를 개발하고자, 도입유전자의 벡터내의 염기서열과 인접 염기서을 바탕으로 프라이머를 제작하였고, 이들 프라이머 조합별로 증폭되는 산물의 예상크기는 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머조합	프라이머 명	프라이머 염기서열	증폭산물의 예상크기( bp )
A	Bar-F1	CTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCG(서열번호 1)	556
	416-R1	GGGGTTTAATATCTAAATATTTCATGAAGC (서열번호 2)
B	Bar-F1	CTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCG	646
	416-R2	CCGATTATCGAGTCAGCTTAATCACCTTTGGGCCAC(서열번호 3)
C	Bar-F1	CTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCG	755
	416-R3	CGTTGGATGTCCACATGCGCCTCACGTGATCTCGC(서열번호 4)
D	Bar-F2	GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGC(서열번호 5)	454
	416-R1	GGGGTTTAATATCTAAATATTTCATGAAGC
E	Bar-F2	GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGC	544
	416-R2	CCGATTATCGAGTCAGCTTAATCACCTTTGGGCCAC
F	Bar-F2	GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGC	653
	416-R3	CGTTGGATGTCCACATGCGCCTCACGTGATCTCGC
G	Bar-F3	CTAAAATCCAGATCCCCCGAATTAATTCGGCG (서열번호 6)	347
	416-R1	GGGGTTTAATATCTAAATATTTCATGAAGC
H	Bar-F3	CTAAAATCCAGATCCCCCGAATTAATTCGGCG	437
	416-R2	CCGATTATCGAGTCAGCTTAATCACCTTTGGGCCAC
I	Bar-F3	CTAAAATCCAGATCCCCCGAATTAATTCGGCG	546
	416-R3	CGTTGGATGTCCACATGCGCCTCACGTGATCTCGC

계통특이적인 프라이머라 하여도 일반적인 조건에서 PCR을 수행하는 경우에는 프라이머의 게놈내의 유사성 또는 프라이머의 낮은 어닐링(annealing) 온도 때문에 비특이적으로 증폭될 수 있다는 보고들이 있다(Khushbeer Malhotra, Lisa Foltz, Walter C. Mahoney and Paula A. SchueleR. 1998. Interaction and effect of annealing temperature on primers used in differential display RT-PCR. Nucleic Acids Research. 3: 854-856, James D, Schmidt AM, Wall E, Green M, Masri S. 2003 Reliable detection and identification of genetically modified maize, soybean, and canola by multiplex PCR analysis. J Agric Food Chem 51(20):5829-5834). 따라서, 계통특이프라이머를 이용한 PCR 조건을 수립하고자, DNA 농도, 프라이머 농도 및 어닐링 온도별 조건을 수립하였다.

DNA 농도별 PCR 조건을 확인하고자 상기 표 1의 프라이머 조합 B를 이용하여 분석을 수행하였다. 주형 DNA 농도를 제외한 다른 PCR 조건은 다음과 같다: 94°C에서 3분간 DNA를 변성한 후 94°C에서 45초, 65°C 45초, 72°C 1분 30분간 총 30회를 수행한 후 72°C에서 5분간 최종 연장(extension) 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 5에서 보듯이, 전체 50 μl의 PCR 반응용액에 주형 DNA를 각각 10, 25, 50, 100, 250, 500 ng 첨가하여 PCR을 수행한 결과, DNA농도가 10 ng/50 μl일 경우에는 밴드의 증폭이 확인되지 않았으나, 25 ng/50 μl 이상의 농도에서는 모두 밴드의 증폭을 확인할 수 있었다.

한편, 적절한 프라이머 농도를 확인하고자 주형 DNA를 100 ng으로 하여 프라이머 농도별(25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 μM) 밴드증폭정도를 확인하였다. 프라이머 농도를 제외한 다른 PCR 조건은 다음과 같다: 94°C에서 3분간 DNA를 변성한 후 94°C에서 45초, 65°C 45초, 72°C 1분 30분간 총 30회를 수행한 후 72°C에서 5분간 최종 연장(extension) 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 6에서 보듯이, 모든 농도에서 PCR 산물이 나타났으나, 프라이머의 농도가 800 μM 이상이 될 경우 밴드가 두꺼워지며, 밴드 위치가 다소 달라짐을 확인할 수 있었다.

아울러, 적절한 어닐링 온도를 확인하기 위하여 416-1(대조군) 과 416-3(농생배추 001)의 DNA를 100 ng, 프라이머 농도를 200 μM로 하여 그래디언트(gradient) PCR을 수행하였다. 어닐링 온도를 제외한 다른 PCR 조건은 다음과 같다: PCR 반응은 94°C에서 3분간 DNA를 변성한 후 94°C에서 45초, 56~80°C 45초, 72°C 1분 30분간 총 30회를 수행한 후 72°C에서 5분간 최종 연장(extension) 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 7에서 보듯이, 56℃ 내지 70℃에서는 416-3에서만 특이적으로 증폭됨을 확인할 수 있었다. 낮은 온도인 56℃에서도 416-1에서는 증폭이 이루어지지 않고 특이적으로 416-3에서만 증폭이 이루어져서 이들 프라이머 조합은 계통특이 개체를 선발하는데 사용될 수 있을 것으로 보였다.

이상의 결과를 종합하면, PCR을 수행할 경우, DNA농도는 25 ~ 250ng, 프라이머는 25 ~ 400 μM, 어닐링 온도 56℃ ~ 70℃로 하는 것이 적절함을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

형질전환 배추에 대한 계통 특이 프라이머 선발

상기 표 1에 기재된 프라이머를 대상으로 각각 416-1(대조군), 416-3(농생배추 001)을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94°C에서 3분간 DNA를 변성한 후 94°C에서 45초, 65°C 45초, 72°C 1분 30분간 총 30회를 수행한 후 72°C에서 5분간 최종 연장(extension) 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 8에서 보듯이, 프라이머 조합 A, B, C, F조합에서는 416-3개체에서만 특이적으로 증폭되며, 다른 조합들에서는 증폭이 충분치 않거나, 대조군인 416-1 개체에서도 증폭이 이루어짐을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 농생배추 001에 대해서 특이적으로 증폭되는 프라이머 조합인 A, B, C, F조합을 선별하여, 마커로서 이용가능한지 확인하였다.

< 실시예 8>

형질전환 배추에 대한 검정 가능여부 확인

상기에서 선별된 표 1의 A, B, C, F조합을 이용하여 이들이 농생배추 001에 대한 마커로서 적용이 가능하지 알아보았다.

본 발명의 416-2 및 416-3을 포함하여 총 16종의 해충저항성 배추 계통(노원(WT), 416-1, 416-2, 416-3, SJ4-7, SJ4-1, SJ4-12, G100, MR1-17, MR1-18, MR1-19, OLP1-11, OLP1-9, OLP1-10, OLP2-8, OLP2-9(각각 농업생명공학원에서 개발))에서 각각 게놈 DNA를 분리한 다음, 이를 주형으로 하고, 각각 표 1의 A, B, C, F조합의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94°C에서 3분간 DNA를 변성한 후 94°C에서 45초, 65°C 45초, 72°C 1분 30분간 총 30회를 수행한 후 72°C에서 5분간 최종 연장(extension) 반응을 수행하였다.

그 결과, 도 9에서 보듯이, A, B, C조합의 경우에는 본 발명의 농생배추 001(레인 3(416-2) 및 레인 4(416-3))에서만 증폭이 이루어졌으나 F조합의 경우에는 해충저항성유전자를 지닌 다른 계통의 배추에서도 증폭이 이루어졌다. 이는 F조합에 사용된 프라이머가 해충저항성 유전자와의 상동성에 의해 기인한 것으로 판단하고 F조합은 본 발명의 농생배추 001을 검정하는 프라이머 조합에서 제외시켰다.

아울러, 개발된 계통특이 마커가 현재 상업화된 배추품종들에서도 구별성과 판별성이 있는지를 확인하기 위해서 원예연구소로부터 50여종의 품종을 분양받아서 분석을 수행하였다. 분양받은 품종 중 발아가 균일한 본 발명의 품종 및 상업 품종 44개체(노원(WT), 416-1, 416-2, 416-3, 단맛배추(흥농종묘), 장미배추(농우바이오), 겨울노랑배추(사카타코리아), 금방울배추(농우바이오), 내서가락배추(중앙종묘), 영농1호배추(경신종묘), 불암3호(흥농종묘), 노란자배추(농우바이오), 하우스금가락(중앙종묘), 칠성배추(농우종묘), 강력여름(흥농종묘), 쌈맛배추(농우종묘), 칠성배추(농우종묘), 노란자배추(농우종묘), 탐북배추(농우종묘), 아시아미니배추(아시아종묘), 아시아미니노랑(아시아종묘), 진노랑배추(서울종묘), 메다까쌈배추(다끼이), 평성통배추(식물환경조절), 배추55(식물환경조절), CR그린(농우종묘), 노랑김치(흥농종묘), 신하왕배추(흥농종묘), 조생가락배추(중앙종묘), 예쁜노랭이배추(흥농종묘), CR맛그린배추(농우바이오), 삼진배추(중앙종묘), 동품배추(흥농종묘), 강한배추(농우바이오), CR명품배추(사카타), CR통일배추(흥농종묘), 금가락배추(중앙종묘), 노랑쌈배추(사카타), 옥황씨알배추(사카타), 챔피온배추(흥농씨앗), 썬그린(흥농씨앗), 불암플러스배추(흥농씨앗), 진청배추(흥농씨앗), 노랑관동배추(흥농씨앗), 지부(생공원))의 잎으로부터 DNA를 분리하고, 프라이머 A조합을 이용하여 DNA농도 100ng, 프라이머 농도는 200 μM, 어닐링 온도 60℃로 하여 30회 반응을 시켰다.

그 결과 도 10에서 보듯이, 본 발명의 농생배추 001(레인 2(416-2) 및 레인 3(416-3))을 제외한 상업화된 배추 품종에서는 어떠한 증폭도 이루어지지 않음을 알 수 있었다. 프라이머 B조합 및 C조합에 대해서도 마찬가지의 결과를 얻었다. 따라서, 본 발명의 프라이머 조합은 농생배추 001 계통의 판별과 상업화된 품종과의 구분에도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 보인다.

< 실시예 9>

후대에서의 검정 가능성 확인

계통특이적 프라이머 A, B, C조합의 마커를 이용하여 본 발명의 해충저항성배추, 즉 농생배추 001의 후대에서도 안정적으로 검정이 이루어지는지를 확인하기 위해서 416-2와 416-3개체를 자가수분하여 얻은 후대를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 주형 DNA는 100ng, 각각의 A, B, C조합의 프라이머는 200 μM, 어닐링 온도는 60℃로 하여 30회 반응을 시켰다.

그 결과, 도 11에서 보듯이, A, B, C 조합의 프라이머 모두 416-2 및 416-3의 후대에서 PCR 산물이 나타남을 알 수 있어 농생배추 001의 후대에서도 안정적으로 검정이 이루어 질 수 있음을 알 수 있었다.

아울러, PCR 산물이 나타나는 비율이 후대 개체에 0.3% Basta처리 후 살아남는 생존율과 일치하여(결과 미도시) 도입된 유전자의 후대개체로의 이동을 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과를 통해, 본 발명의 프라이머 조합을 이용하는 경우 농생배추001과 교배된 개체들에서도 빠르고 정확하게 형질전환체를 검정할 수 있으며, 유전자변형 농산물의 화분이동성과 유전자변형 식물체의 교잡 후대에서 모본을 확인할 수 있을 것으로 보인다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 배추 품종 검정용 프라이머는 형질전환된 배추의 품종을 PCR 방법을 통해 검정할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 배추 품종 검정용 프라이머 및 이를 이용한 검정 방법은 형질전환된 배추의 검정의 목적으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 유전자변형 농산물의 화분이동성과 유전자변형 식물체의 교잡 후대에서 모본을 확인하는 목적으로 사용할 수 있다.

도 1은 형질전환에 이용된 416 벡터의 모식도(A) 및 형질전환 배추에서의 유전자 도입 여부를 서던 블럿으로 확인한 결과(B)이다. (LB: left border, dual P35S: Cauliflower mosaic virus promoter 35, T35S: Cauliflower mosaic virus terminator, BAR: 제초제 저항성 유전자, Cry1Ac: 해충 저항성 유전자, RB: right border; P: positive control, M: 100pb plus ladder, C: 야생종 배추(노원), 1: 416-1, 2: 416-2, 3: 416-3)

도 2는 형질전환 배추에서의 유전자의 발현을 노던 블럿으로 확인한 결과이다. (C: 야생종 배추(노원), 1: 416-1, 2: 416-2, 3: 416-3)

도 3은 형질전환 배추에서 삽입된 구조체의 인접서열을 증폭한 결과이다. (A: genome walker를 이용한 1st PCR 결과, B: genome walker를 이용한 2nd PCR 결과, lane 1: DraI, 2: PvuII, 3: StuI, 4: EcoRV, 5: DraI, 6: PvuII, 7: StuI, 8: EcoRV)

도 4는 형질전환 배추에서 삽입된 구조체의 인접서열의 염기서열을 분석한 결과이다.

도 5는 배추 품종 검정을 위한 PCR 분석시 DNA 농도별 결과를 나타낸 것이다.( M: size marker, 1: DNA 10 ng, 2: DNA 25 ng, 3: DNA 50 ng, 4: DNA 100 ng, 5: DNA 250 ng, 6: DNA 500 ng)

도 6은 배추 품종 검정을 위한 PCR 분석시 프라이머 농도별 결과를 나타낸 것이다.(M: size marker, 1: primer 25 μM, 2: primer 50 μM, 3: primer 100 μ M, 4: primer 200 μM, 5: primer 400 μM, 6: primer 800 μM, 7: primer 1600 μM)

도 7은 배추 품종 검정을 위한 PCR 분석시 어닐링 온도별 결과를 나타낸 것이다.(1: 416-1 genomic DNA, 3: 416-3 genomic DNA)

도 8은 디자인된 프라이머쌍을 이용하여 품종 특이적인 증폭여부를 확인한 결과이다.(1: 416-1 genomic DNA을 주형으로 한 결과, 3: 416-3 genomic DNA을 주형으로 한 결과, A ~ I는 각각의 프라이머의 조합)

도 9는 선별된 프라이머를 이용하여 다양한 해충저항성 배추계통에서의 검정결과를 나타낸 것이다.(1: 노원(WT), 2: 416-1, 3: 416-2, 4: 416-3, 5: SJ4-7, 6: SJ4-1, 7: SJ4-12, 8: G100 9: MR1-17, 10: MR1-18, 11: MR1-19, 12: OLP 1-11, 13: OLP 1-9, 14: OLP 1-10, 15: OLP 2-8, 16: OLP 2-9)

도 10은 선별된 프라이머(위쪽부터 각각 A조합, B조합 및 C조합)를 이용하여 다양한 상용 배추 품종에서의 검정 결과를 나타낸 것이다.(C: 노원(WT), 1: 416-1, 2: 416-2, 3: 416-3 배추상업계통은 순서대로 단맛배추(흥농종묘), 장미배추(농우바이오), 겨울노랑배추(사카타코리아), 금방울배추(농우바이오), 내서가락배추(중앙종묘), 영농1호배추(경신종묘), 불암3호(흥농종묘), 노란자배추(농우바이오), 하우스금가락(중앙종묘), 칠성배추(농우종묘), 강력여름(흥농종묘), 쌈맛배추(농우종묘), 칠성배추(농우종묘), 노란자배추(농우종묘), 탐북배추(농우종묘), 아시아미니배추(아시아종묘), 아시아미니노랑(아시아종묘), 진노랑배추(서울종묘), 메다까쌈배추(다끼이), 평성통배추(식물환경조절), 배추55(식물환경조절), CR그린(농우종 묘), 노랑김치(흥농종묘), 신하왕배추(흥농종묘), 조생가락배추(중앙종묘), 예쁜노랭이배추(흥농종묘), CR맛그린배추(농우바이오), 삼진배추(중앙종묘), 동품배추(흥농종묘), 강한배추(농우바이오), CR명품배추(사카타), CR통일배추(흥농종묘), 금가락배추(중앙종묘), 노랑쌈배추(사카타), 옥황씨알배추(사카타), 챔피온배추(흥농씨앗), 썬그린(흥농씨앗), 불암플러스배추(흥농씨앗), 진청배추(흥농씨앗), 노랑관동배추(흥농씨앗), 지부(생공원)임)

도 11은 선별된 프라이머를 이용하여 본 발명의 형질전환 배추의 후대에서의 검정 결과를 나타낸 것이다.(C: 노원(WT), 416-2 T1: 416-2개체를 자가수정하여 얻은 T1 세대의 개체들, 416-3 T1 :416-3 개체를 자가수정하여 얻은 T1 세대의 개체들)

<110> Republic of Korea <120> Primer for identifying the race of chinese cabbage and use thereof <130> NP07-0070 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bar F1 primer <400> 1 cttcagcctg ccggtaccgc cccgtccggt cctgcccg 38 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 416-R1 primer <400> 2 ggggtttaat atctaaatat ttcatgaagc 30 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 416-R2 primer <400> 3 ccgattatcg agtcagctta atcacctttg ggccac 36 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 416-R3 primer <400> 4 cgttggatgt ccacatgcgc ctcacgtgat ctcgc 35 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bar-F2 primer <400> 5 gggttcctat agggtttcgc tcatgtgttg agc 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bar-F3 primer <400> 6 ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cg 32 <210> 7 <211> 1865 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CryIAc gene, Genbank Accession No. AY126450 <400> 7 ccatggacaa caacccaaac atcaacgaat gcattccata caactgcttg agtaacccag 60 aagttgaagt acttggtgga gaacgcattg aaaccggtta cactcccatc gacatctcct 120 tgtccttgac acagtttctg ctcagcgagt tcgtgccagg agctgggttc gttctcggac 180 tagttgacat catctggggt atctttggtc catctcaatg ggatgcattc ctggtgcaaa 240 ttgagcagtt gatcaaccag aggatcgaag agttcgccag gaaccaggcc atctctcgtt 300 tggaaggatt gagcaatctc taccaaatct atgcagagag cttcagagag tgggaagccg 360 atcctactaa cccagctctc cgcgaggaaa tgcgtattca attcaacgac atgaacagcg 420 ccttgaccac agctatccca ttgttcgcag tccagaacta ccaagttcct ctcttgtccg 480 tgtacgttca agcagctaat cttcacctca gcgtgcttcg agacgttagc gtgtttgggc 540 aaagatgggg attcgatgct gcaaccatca atagccgtta caacgacctt actaggctga 600 ttggaaacta caccgactac gctgttcgtt ggtacaacac tggcttggag cgtgtctggg 660 gtcctgattc tagagattgg gtgagataca accagttcag gagagaattg accctcacag 720 ttttggacat tgtggctctc ttcccgaact atgactccag acgttaccct atccgtacag 780 tgtcccaact taccagagaa atctacacta acccagttct tgagaacttc gacggtagct 840 tccgtggttc tgcccagggt atcgaaagat ccatcaggag cccacacttg atggacatct 900 tgaacagcat aactatctac accgatgctc acagaggata ctattactgg tctggacacc 960 agatcatggc ctctccagtt ggattctccg gacctgagtt tacctttcct ctctatggaa 1020 ctatgggaaa cgccgctcca caacaacgta tcgttgctca actaggacag ggtgtctaca 1080 gaaccttgtc ttccaccttg tacagaagac ccttcaatat cggtatcaac aaccagcaac 1140 tttccgttct tgacggaaca gagttcgcct atggaacctc ttctaacttg ccatccgctg 1200 tttacagaaa gagcggaacc gttgattcct tggacgaaat cccaccacag aacaacaatg 1260 tgccacccag gcaaggattc tcccacaggc ttagccacgt gtccatgttc cgttccggat 1320 tcagcaacag ttccgtgagc atcatcagag ctcctatgtt ctcttggatt caccgttctg 1380 ccgagttcaa caacatcatc gcatctgata gtattactca aatccctgcc gtgaagggaa 1440 acttcctttt caatggaagc gtaatcagcg gaccaggatt cactggcgga gatcttgtga 1500 gacttaacag ctctggcaac aacattcaga atagaggcta catcgaagtt cctatccact 1560 tcccatccac atctactaga tacagagtta gggttagata cgcctctgtg accccaatcc 1620 accttaacgt gaactggggc aattcatcta tcttctccaa caccgttcca gctactgcta 1680 cctcactcga taatcttcaa tccagcgatt ttggttactt cgaaagtgcc aacgcattca 1740 cttcttcatt gggcaacatc gtgggtgtta ggaatttcag cggtactgca ggagtgatca 1800 ttgacagatt cgagttcatt cctgttactg ccactcttga ggctgagtac aatctttaag 1860 gtacc 1865 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP1 primer <400> 8 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP1 primer <400> 9 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 10 <211> 632 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplified sequence <400> 10 atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct 60 aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatccc ccgaattaat tcggcgttaa 120 ttcagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta 180 caccacaata tatcctgctc taaactaatt ttgtaaccat tatgccaaaa aacctaacaa 240 atcttacaat ggtcagattt attctaagcg agccgaacca aatgattaac taattagctt 300 ttagttaaag ttatactata tcaattaccc aaataaacta cctattacaa ttagttaaat 360 cttccataaa ccaaaattca cagaaataat gcttcatgaa atatttagat attaaacccc 420 ataagaaaac aaaatttcat aaacaagagt tattattaaa gccttttttg ttttgtggcc 480 caaaggtgat taagctgact cgataatcgg tttaatataa cattaaaggt ttacttttga 540 tttggttcgg tttatttttc tataatctat tgcgagatca cgtgaggcgc atgtggacat 600 ccaacgaaat gggccaatcg ctttaccagc cc 632

Claims (3)

1. 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 1과 3으로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 1와 4으로 표시되는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 도1A의 개열지도를 가지는 백터로 형질전환 된 농생배추 001 품종 검정용 프라이머쌍.
2. (a) 배추로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;

   (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

   (c) PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 도1A의 개열지도를 가지는 벡터로 형질전환 된 농생배추 001 품종 검정 방법.
3. 제1항의 프라이머쌍을 포함하는 도1A의 개열지도를 가지는 벡터로 형질전환 된 농생배추 001 품종 검정용 키트.

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