JP2004016024A - キャベツdna検出用プライマー及び当該プライマーを用いたキャベツ混入判定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】キャベツDNAを特異的に検出可能なオリゴヌクレオチドをキャベツDNA検出用プライマーとして用いて、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したDNAを鋳型とするPCRを行い、電気泳動でケールDNAとキャベツDNAの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別する。
【選択図】 なし
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、キャベツDNA検出用プライマー及び当該プライマーを用いて簡易且つ良好な精度で原料ケールまたはケール加工食品中に含まれるキャベツ混入の有無を判定する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
現在、種々の健康食品が上市されているが、その中に、ケール(Brassica oleracea var. acephala)を原料にした健康食品がある。ケールはキャベツ(Brassica oleracea var. capitata)の原種であるが、その栄養価の高さから葉を搾って飲料としたり粉末にしたものを水に溶かして飲用している。しかしながら、原料の状態でのケールとキャベツは、葉(特に外葉・幼葉)の形状が外観上酷似している。従って、原料ケールとして入荷した場合であっても、その中にキャベツの外葉や幼葉が混入している場合に、ケールとキャベツを肉眼で識別することは困難である。ましてや、原料を搾汁した後は、両者の判別は更に困難となる。
【0003】
一方、ケールなど植物原料を加工した食品(青汁等)における原料の純度およびキャベツなどの他原料の混入を判定する方法はこれまで効果的な手段がなく、製造直前の原料目視検査や製品の出荷前での官能検査等に頼らざるを得なかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記の問題を解決するためになされたものであり、キャベツ品種のDNAに結合可能なオリゴヌクレオチドを見出し、当該オリゴヌクレオチドをPCRにおけるプライマーとして用いることにより、原料ケールまたはケール加工食品中に混入したキャベツを識別することを目的とする。
【0005】
また、本発明は、より簡易な方法で、原料ケール中に混入したキャベツを識別することを目的とする。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号1乃至6に記載のキャベツDNA検出用プライマーを提供するものである。
【0007】
これらはケールとキャベツの識別が可能であり、ケール加工食品の原料として入荷した中に混入したキャベツの有無や、青汁等のケール利用食品に混入したキャベツの有無を判定することを目的としたキャベツDNA検出用のプライマーとして用いることができる。
【0008】
また、本発明は、配列番号1乃至6に記載のキャベツDNA検出用プライマーのうち2種以上を使用して、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したDNAを鋳型とするPCR(Polymerase Chain Reaction)法を行い、電気泳動によりケールDNAとキャベツDNAの電気泳動パターンを比較することにより、原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別することができる。
【0009】
特に、前記プライマーを用いる際、フォワード側プライマーとリバース側プライマーとの組み合わせとして、配列番号1と2、配列番号3と4、配列番号5と6をセットで用いる。このフォワード側プライマーとリバース側プライマーのセットを1セットとして用いることができる。但し、より確実に結果を導くためには、少なくとも2セット用いることが必要であり、3セットのプライマーを用いてPCRを行うことがより好ましい。
【0010】
また、本発明は、配列番号10〜12で表されるDNA配列をプライマーとして用い、原料ケールから抽出したDNAを鋳型とするPCRを行い、電気泳動によりケールDNAとキャベツDNAの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールに混入したキャベツを識別することにより、原料ケールに含まれるキャベツをケールと識別することもできる。
【0011】
即ち、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)法(Nucleic Acid Res.18, 6531−6535(1990)など)によっても、原料ケールに混入したキャベツを識別することができる。
【0012】
これにより、市販のプライマーを用いて、後述するSTS化をすることなく、青汁等の原料ケールに混入したキャベツの有無を判定することができる。市販のプライマーとしては、例えば、Upstream primer(TaKaRa社製、Differential Display Kit)、10−mer kit A(オペロン社製)等が好適に用いられる。特に、配列番号10〜12で表されるDNA配列をプライマーとして用いることが好ましい。
【0013】
【実施例等】
以下、実施例等により本発明をさらに詳細に説明する。
(実施例1)植物体からの全DNAの抽出およびRAPDマーカーの検索
キャベツ−ケール間で多型の得られるプライマーを、RAPD法により検索した。まず1系統のケール(キューサイ社の契約生産者より入手)およびキャベツ(市販品を購入)それぞれの成葉からCTAB法により全DNAを抽出した。得られたDNAを鋳型とし、44種類の10ヌクレオチド(TaKaRa社製Differential Display Kitに梱包のUpstream primer 24種[DD 0l〜DD24](以下、「DDプライマー」と称することがある)及びオペロン社製10−merkit A 20種[OPA01〜20]) (以下、「OPAプライマー」と称することがある)を1種または2種組み合わせて(うち85通りを解析)プライマーとし、PCR(PerkinElmer社製GeneAmp(商標)PCR System 9700)を用いて抽出したDNAを増幅した。
【0014】
RAPD法によるDNAの増幅は以下の条件で行った。即ち、前記鋳型DNA(150ng)、2μM DDプライマー(2.5μl)あるいは20ng/μl OPAプライマー(1.5μl)(それぞれ2種のプライマーを混合する場合は、半量ずつ)、2.5mM dNTPmix(2μl、TaKaRa社製)、10×PCR 緩衝液(100mM Tris−HCl緩衝液(pH8.3)、500mM KCl)2.5μl、25mM MgCl2(1.5μl)、5U/μl 耐熱性ポリメラーゼTaq polymerase(0.25μl、TaKaRa社製)を混合し、滅菌水を加えて全量25μlの反応液を調製した。
【0015】
PCR反応は、予備変性94℃/1分に続き、変性94℃/1分、アニーリング35℃/1分、伸長反応72℃/2分を45サイクル行い、72℃/3分の伸長反応で終了した。得られた増幅断片について、1.5%アガロースゲル電気泳動を行った。この結果、11通りのプライマーの組み合わせで、13のキャベツ特異的多型断片が得られた。これらのうち、明瞭なバンドとして観察された、塩基長▲1▼約1.4kb、▲2▼約0.5kb、▲3▼約1.5kbの多型断片3種を以降の解析に用いた。それらの電気泳動像(1.5%アガロースゲル)を図1に示す。なお、上記多型断片は、それぞれ▲1▼DD04(TaKaRa社製Differential Display Kitに梱包のUpstream primer:配列番号10)、▲2▼DD19(TaKaRa社製Differential Display Kitに梱包のUpstream primer:配列番号11)、▲3▼OPA06(オペロン社製10−merkit A:配列番号12)の増幅産物である。
【0016】
図に示すように、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてRAPD法を行うことにより、キャベツ(C)とケール(K)との間で多型が得られた。以上の結果から、上記3種のプライマーを用いたRAPD法によりキャベツとケールを識別できる可能性が示唆された。
【0017】
一方、その他のプライマー、例えば、図1中のOPA03(5’→3’)AGTCAGCCACおよびOPA11(5’→3’)CAATCGCCGTではキャベツ(C)とケール(K)との間で多型は得られず、両者を識別することはできなかった。
【0018】
(実施例2)RAPD法によるケール−キャベツの識別
実施例1で得られた3種の多型断片を、それぞれ▲1▼DD0404−1400、▲2▼DD1919−500、▲3▼OPA0606−1500と命名し、これらをRAPDマーカーとしてケールとキャベツの識別を試みた。即ち、実施例1に記載の方法(CTAB法)により複数系統のケール及びキャベツから全DNAを抽出し、前記プライマー(▲1▼DD04、▲2▼DD19、▲3▼OPA06)を用いてPCRを行い、前記3種のRAPDマーカー(▲1▼DD0404−1400、▲2▼DD1919−500、▲3▼OPA0606−1500)が検出されるか否かを観察した。なお、PCR条件は実施例1と同様とした。
【0019】
得られた増副産物の電気泳動像(1.5%アガロースゲル)を図2に示す。図から明らかなように、プライマーDD04を用いた場合、キャベツは1400bp付近で増幅バンド(DD0404−1400)が検出されたが、ケール#1、#3〜5では検出されなかった。また、プライマーDD19を用いた場合、キャベツは500bp付近で増幅バンド(DD1919−500)が検出されたが、ケール#1、2および#6、7には検出されなかった。更に、プライマーOPA06を用いた場合、キャベツは1500bp付近で増幅バンド(OPA0606−1500)が検出されたが、ケール#1および#5には検出されなかった。
【0020】
一方、3種のRAPDマーカーの有無を一覧表としたDNAタイピングを下記表に示す。
【0021】
【表1】
これら3種のRAPDマーカーは、キャベツDNAを鋳型とした場合にはすべての検体で検出された。一方、ケールDNAを鋳型とした場合には系統によって増幅バンドが検出される場合と検出されない場合とがあったが、少なくとも2種のプライマー(DD04、DD19)の検出結果を比較・検討することにより、複数系統のケールとキャベツを識別することが可能であることが判明した。
【0022】
即ち、表1におけるケール#1はいずれのRAPDマーカーが検出されなかったためキャベツと異なることは明らかであるが、ケール#2はプライマーDD04を用いた場合にはRAPDマーカーDD0404−1400が検出されてしまう(キャベツと識別できない)。ところが、プライマーDD19を用いた場合、RAPDマーカーDD1919−500は検出されないため、このケール#2はキャベツとバンドパターンが異なることにより、キャベツと識別することができることになる。
【0023】
(実施例3)キャベツ識別用RAPDマーカーの塩基配列の決定
実施例2に記載のRAPDマーカーを、後述する実施例4でSTS(SequenceTagged Site)化するために、それらの塩基配列を以下の要領で決定した。キャベツDNAを鋳型とした際に増幅された3種のRAPDマーカー(▲1▼DD0404−1400、▲2▼DD1919−500、▲3▼OPA0606−1500)をそれぞれ電気泳動ゲルから切り出した。次いで、TaKaRa社製SUPREC(商標)−01(pore size 0.22μm)を用いてゲル中のDNAを抽出し、TAクローニングによって、T4DNAリガーゼでプラスミドベクター (Promega社製pGEM(商標)−T Easy Vector)に挿入した後、大腸菌(TaKaRa社製E. coli JM109コンピテントセル)を形質転換した。
【0024】
塩基配列の決定は、前記大腸菌を集菌し、アルカリ−SDS法(アルカリミニプレップ)およびポリエチレングリコール沈殿(PEG沈殿)によりプラスミドを回収し、回収したプラスミドを鋳型にBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit(Perkin Elmer社製)を用いたサイクルシークエンス(Cycle−Sequencing)反応を行った後、シークエンサー(PerkinElmer社製ABI PRISM(商標)Genetic Analyzer)により両端から塩基配列を決定した。
【0025】
これらの操作の結果、キャベツ識別用RAPDマーカーの塩基数は、▲1▼DD0404−1400…1437bp(配列番号7)、▲2▼DD1919−500…535bp(配列番号8)、▲3▼OPA0606−1500…1542bp(配列番号9)であることが判明した。その塩基配列を図3〜5に示す。
(実施例4)キャベツ識別用RAPDマーカーのSTS(Sequence Tagged Site)化
原料ケールあるいはケール食品中に含まれるキャベツを再現性よく、更に特異的に検出するため、実施例2で得られたキャベツ識別用RAPDマーカーのSTS化(DNA res.1,139−148(1994))を行った。
【0026】
実施例3で得られたそれぞれの塩基配列をもとに、GC含量、Tm値、二次構造などを考慮し、PCRプライマーの塩基配列を以下のように決定した(図3〜5下線部参照)。
【0027】
【表2】
ここで、上記表におけるForward−1及びReverse−1はDD040−1400に特異的なプライマーであり、図3の矢印で示したように、Forward−1はDD0404−1400における3−27番目のヌクレオチドに対応し、Reverse−1はDD0404−1400における1370−1393番目のヌクレオチドに対応する。
【0028】
また、上記表におけるForward−2及び Reverse−2はDD1919−500に特異的なプライマーであり、図4の矢印で示したように、Forward−2はDD1919−500における19−43番目のヌクレオチドに対応し、Reverse−2はDD1919−500における466−490番目のヌクレオチドに対応する。
【0029】
更に、上記表におけるForward−3及び Reverse−3はOPA0606−1500に特異的なプライマーであり、図5の矢印で示したように、Forward−3はOPA0606−1500における23−46番目のヌクレオチドに対応し、Reverse−3はOPA0606−1500における1492−1515番目のヌクレオチドに対応する。
【0030】
(実施例5)STS化プライマーを用いたケールとキャベツの識別
実施例4に記載のSTS化プライマーをForward−1とReverse−1(以下、両者をまとめて「set1」と称する)、Forward−2とReverse−2(以下、両者をまとめて「set2」と称する)、Forward−3とReverse−3(以下、両者をまとめて「set3」と称する)で組み合わせ、これらをキャベツDNA検出用プライマーとして、ケールとキャベツの識別を行った。
【0031】
まず、複数系統のケール(キューサイ社の契約生産者より入手)およびキャベツ(市販品を購入)の成葉からCTAB法により全DNAを抽出し、抽出した全DNAを鋳型としてPCR(PerkinElmer社製GeneAmp(商標)PCR System9700)を行った。
【0032】
STS化プライマーを用いたDNAの増幅は以下の条件で行った。即ち、前記鋳型DNA(150ng)、20μM STS化プライマー(Forward/Reverse それぞれ0.5μl)、2.5mM dNTP mix(4μl、TaKaRa社製)、10×PCR 緩衝液(100mM Tris−HCl緩衝液(pH8.3)、500mM KCl)5μl、25mM MgCl2(3μl)、5U/μl 耐熱性ポリメラーゼTaq polymerase(0.25μl、TaKaRa社製)を混合し、滅菌水(35.25μl)を加えて全量50μlの反応液を調製した。
【0033】
PCR反応は、予備変性(94℃/2分)に続き、変性(94℃/45秒)、アニーリング(66℃/1分)、伸長反応(72℃/1分)を30サイクル行った。
【0034】
前記の各プライマーによる増幅産物の電気泳動像(1.5%アガロースゲル)を図6に示す。また、同様の条件で他の検体についても行った結果を下記表に示す。
【0035】
【表3】
これら3種のSTS化プライマーを用いることで、キャベツDNAを鋳型とした場合にはすべての目的サイズのバンドが検出された。
【0036】
一方、ケールDNAは系統によって増幅バンドが検出される場合と検出されない場合とがあったが、ケール#3および#5は、RAPD法においてはRAPDマーカーが増幅されていたが(表1)、STS化プライマーを用いた場合にはDNAが増幅されず、STS化によりプライマーのキャベツDNAに対する特異性が向上したことがわかる。
【0037】
また、表3に示すように、これら3種のSTS化プライマーを用いてPCRを行った場合、キャベツDNAを鋳型とした場合には、すべての検体で3種の目的サイズDNAが増幅された。一方、ケールDNAを鋳型とした場合には系統によって増幅パターンが異なったが、2種のプライマー(set−1、set−2)を用いたPCRで同時にDNAが増幅されることはなかった。よって、少なくとも2種のプライマー(set−1、set−2)を用いたPCRの結果を比較・検討することにより、複数系統のケールとキャベツを識別することが可能であることが判明した。
【0038】
以上の結果、これらSTS化プライマーを用いることで、RAPD法と比較してPCRの再現性と鋳型DNAへの特異性および操作・判定の簡便性を更に高めたキャベツ識別を行うことができることが判明した。
【0039】
(実施例6)キャベツ添加ケール利用食品における判定
実際にケール利用食品にキャベツを混入したモデル系を作成し、実施例4で得られたSTS化プライマー(set−1、set−2、set−3)を用いたキャベツ混入判定を行った。
【0040】
試料として、前記STS化プライマーではDNAが増幅されないことを確認しているケール(表3の#12、キューサイ社の契約農家から入手)及び青汁(キューサイ社製)と、前記STS化プライマーによってDNAが3種共に増幅されることを確認しているキャベツ(表3の#3、市販品を購入)を用いた。
【0041】
1.5mlサンプリングチューブに、キャベツ混入量が▲1▼0、▲2▼1.5、▲3▼5、▲4▼10、▲5▼30、▲6▼50、▲7▼70%(w/w)となるようにキャベツ葉を採取し、ケールまたは青汁を加えて総量を200mgとした。次いで、これらのサンプルの全DNAをCTAB法により抽出した。抽出したDNAの濃度を260nmにおける吸光度から求め、当該DNAをPCR反応系に一定量(約150ng/tube)ずつ添加した。実施例5と同様の条件でPCR反応後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅バンドを観察した。その結果を下記表に示す。
【0042】
【表4】
ケールの場合は、set−2、set−3のプライマーを用いたとき、当該ケール中にキャベツが5%(w/w)混入している場合であってもキャベツDNAを検出することができ、青汁の場合はset−3のプライマーを用いたとき、1.5%(w/w)のキャベツ混入でもキャベツDNAを検出することができた。
【0043】
よって、今回の結果から、本発明に係る3種のキャベツDNA検出用STSプライマーを用いて、ケール中へのキャベツ混入を実際に判定することが可能であることが示された。
【0044】
このモデル系でのキャベツの検出限界(set−1、set−2のプライマーで共にバンドが検出され、キャベツの混入を判断可能な点)は、青汁製品を用いた系で5%(w/w)、ケールを用いた系では30%(w/w)であった。
【0045】
【発明の効果】
本発明に係るキャベツDNA検出用プライマー及び当該プライマーを用いたキャベツ混入判定方法によれば、キャベツなどのケールに近似した野菜との間においてもキャベツDNAを検出することができるため、製造直前の原料目視検査や製品の出荷前での官能検査等では識別が困難な場合であっても、簡易かつ良好な精度でケール食品中のキャベツの混入を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】RAPDプライマー(DD04、DD19、OPA06)を用いRAPD法により増幅させたキャベツDNAおよびケールDNAの電気泳動パターンを示す図である。
【図2】RAPDプライマー(DD04、DD19、OPA06)を用いRAPD法により増幅させたキャベツDNAおよびケールDNAの電気泳動パターンを示す図である。
【図3】RAPDマーカー(DD0404−1400)の塩基配列を示す図である。
【図4】RAPDマーカー(DD1919−500)の塩基配列を示す図である。
【図5】RAPDマーカー(OPA0606−1500)の塩基配列を示す図である。
【図6】STS化されたキャベツDNA検出用プライマー(set1〜set3)を用いPCR法により増幅させたキャベツDNAおよびケールDNAの電気泳動パターンを示す図である。
【配列表】
Claims (8)
- 配列番号1で表されるDNA配列からなるキャベツDNA検出用プライマー。
- 配列番号2で表されるDNA配列からなるキャベツDNA検出用プライマー。
- 配列番号3で表されるDNA配列からなるキャベツDNA検出用プライマー。
- 配列番号4で表されるDNA配列からなるキャベツDNA検出用プライマー。
- 配列番号5で表されるDNA配列からなるキャベツDNA検出用プライマー。
- 配列番号6で表されるDNA配列からなるキャベツDNA検出用プライマー。
- 請求項1乃至6に記載のキャベツDNA検出用プライマーのうち2種以上を使用して、原料ケールまたはケール加工食品から抽出したDNAを鋳型とするPCRを行い、電気泳動によりケールDNAとキャベツDNAの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールまたはケール加工食品に混入したキャベツを識別することを特徴とするキャベツ混入判定方法。
- 配列番号10〜12で表されるDNA配列をプライマーとして用い、原料ケールから抽出したDNAを鋳型とするPCRを行い、電気泳動によりケールDNAとキャベツDNAの電気泳動パターンを比較することにより原料ケールに混入したキャベツを識別することを特徴とするキャベツ混入判定方法。
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