KR101743732B1

KR101743732B1 - 양배추 리보솜 dna의 igs 부위를 이용한 일대잡종 종자 순도 검정방법

Info

Publication number: KR101743732B1
Application number: KR1020150016252A
Authority: KR
Inventors: 노일섭; 양기웅; 박종인; 황인덕; 김영욱; 우딘 아메드 나잘; 정희정
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2017-06-05
Also published as: KR20160094787A

Abstract

본 발명은 양배추 일대잡종(F1) 품종의 양친에 대하여 다형성을 나타내는 프라이머 세트를 설계하고, 상기 설계된 프라이머 세트를 이용하여 양배추 일대잡종(F1) 품종의 IGS 부위를 증폭시키고 검정하여 간단하고 정확하게 양배추 일대잡종(F1) 품종이 순종인 것을 판별하는 것을 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하는 방법에 관한 것이다.

Description

양배추 리보솜 DNA의 IGS 부위를 이용한 일대잡종 종자 순도 검정방법{Purity checking method for F1 hybrid seeds using intergenic spacer regions of Brassica oleracea var. capitata L. ribosomal DNA}

본 발명은 양배추 리보솜 DNA의 IGS 부위를 이용한 일대잡종 종자 순도 검정방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 양배추의 IGS 부위에 대하여 다형성을 나타내는 프라이머 세트를 이용하여 양배추 일대잡종(F1) 종자의 IGS 부위를 증폭시켜 양배추 일대잡종(F1) 품종이 순종인 것을 판별하는 것을 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하는 방법에 관한 것이다.

양배추(Cabbage; Brassica oleracea var. capitata L.)는 배추과(Brassicacea)에 속하는 종으로, 미국, 유럽 등 구미지역을 비롯하여 일본, 중국, 인도, 동남아시아 등 아시아지역까지 세계 채소시장에서 매우 중요한 작물이다. 특히 중국 및 인도 국가의 재배면적과 종자가격은 매년 꾸준히 상승하는 추세이며, 점점 내병성, 내충성, 내서성, 내한성, 내열구성 등의 내재해성과 고순도, 고품질 형질을 갖춘 품종 욕구가 더해가고 있다.

현재 유통 중인 양배추는 대부분 양친의 교배를 통하여 생산된 일대잡종(F1) 품종들이다. 상기 일대잡종(F1) 품종에서 생산된 종자에 대해서는 양친간 교배의 성립여부, 즉 이형성(heterozygosity)을 검정하고 그 정도를 순도(%)로서 표시하는 순도검정을 실시하여야 한다. 종래 양배추 품종에 순도검정은 형태적 관찰에 의한 포장검정을 통해 이루어지는데, 이는 재배면적과 인력이 많이 소요될 뿐만 아니라, 양배추를 수확하여 양친과의 형태적 특성을 비교하기까지 상당한 시간이 소요되기 때문에 실효성이 떨어지며, 검정자의 주관적인 판단에 의하기 때문에 순도검정의 정확성이 떨어져 신뢰를 줄 수 없다는 문제가 있다.

최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기서열의 다형성을 탐색하고, 이를 분자표지(molecular marker)로 활용하는 기술은 유전적 특성을 본질적으로 반영할 뿐만 아니라, 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용되고 있다(Helentjaris T., et al., 1986, Theor. Appl. Genet., 72:761-769.; Seller M and Bechmann J.S., 1983, Theor. Appl. Genet., 67:25-33.; Kwon Y.S., et al., 2003, Korean J. Breed., 35:319-328.).

하나의 구체적 예로, 종자식물의 45S 핵 리보솜 RNA 유전자(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)는 18S, 5.8S 및 25S/26S/28S 암호화 유전자 클러스터와 각 유전자 사이에 상대적으로 변이가 많은 ITS1(internal transcribed spacer 1) 및 ITS2(internal transcribed spacer 2)를 포함하는 한 개의 45S 시스트론 단위로 구성된다. 각각의 45S 시스트론 단위는 다양한 크기의 IGS(intergenic spacers)로 나누어지며 종렬배열(tandem repeat)을 이루고 있다. 이중 ITS 부위 염기서열은 종(species) 특이적 특성을 갖고 있으므로 종 수준이나 종 이하 분류군 수준의 계통을 추론하기 위해 이용되어 왔다. 또한, IGS 부위 염기서열 역시 nrDNA의 여러 부위 중에서 변이가 심하여 계통학적으로 가까운 품종 간에도 많은 차이를 나타내며, 반복염기서열이 있어 동일한 품종 사이에서도 생물간에 차이를 보이므로 속간, 종간 분류에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

45S 핵 리보솜 RNA 유전자 ITS 또는 IGS 부위를 이용하여 배추과에 속하는 아종 또는 품종을 동정한 기술과 관련하여, Mummenhoff 등(Mummenhoff M. et al., 2001, Am. J. Bot., 88:2051-2063.)은 엽록체 DNA trnL 유전자, trnT - trnL intergenic spacer, trnL- trnF intergenic spacer을 이용하여 다닥냉이속(Lepidium)의 계통분석 연구를 수행하였고, Mummenhoff 등(Mummenhoff M. et al., 2005, Ann. Mossouri Bor. Grad., 92:400-424.)은 핵 DNA ITS 구간과 엽록체 DNA trnL-F intergenic spacer을 이용하여 남아프리카의 배추과 고유종의 계통발생, 형태진화 및 종 분화에 관한 연구를 수행하였으며, Koch 등(Koch M.A. et al., 2012, Taxon 61:955-969.)은 핵 DNA ITS와 엽록체 DNA trnL 유전자, trnL-F intergenic spacer를 이용하여 배추과 갯장대족 새로운 속의 계통분류, 분류학 및 생물지리학에 관한 연구를 수행하였다. 그러나, 본 발명에서와 같이 양배추 아종 또는 품종의 핵 DNA IGS 부위 염기서열의 확립 및 IGS 부위를 이용한 양배추 품종의 순도를 검정하는 방법에 대해서는 아직 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 다양한 양배추의 45S nrDNA에 존재하는 IGS 부위의 염기서열을 확인할 수 있는 프라이머 세트를 설계하고, 이를 이용하여 다양한 양배추 의 45S nrDNA의 IGS 부위를 증폭시켜 생성된 증폭 산물의 유전자 패턴을 확인함으로써 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 간단하고 정확하게 검정할 수 있음을 밝혀, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 양배추 일대잡종(F1)의 IGS 부위를 증폭시킨 후 증폭된 IGS 부위를 검정하여 아가로스 겔 상에서 생성물의 크기의 차이에 따라 간단하고 정확하게 양배추 일대잡종(F1) 품종이 순종인 것을 판별하는 것을 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도 검정용 키트를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 양배추 일대잡종(F1)으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 IGS(intergenic spacer) 부위를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 IGS 부위 염기서열이 품종 특이적인 크기를 나타내면서 그 개수가 이형접합(heterozygous) 형식으로 존재하는 경우 일대잡종(F1) 품종이 순종인 것으로 판별하는 단계;를 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 양배추 일대잡종(F1)으로부터 유래된 게놈 DNA는 양배추 일대잡종(F1)의 종자 또는 양배추 전체로부터 게놈 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있으며, 바람직하게는 양배추 일대잡종(F1) 종자를 파종하고 출아한 후 어린 식물체의 잎으로부터 채취한 것을 사용하는 것이 좋다. 또한, 순도 검정 방법의 정확성을 높이기 위하여 채취된 게놈 DNA를 증폭시킨 것을 사용하여 검정하는 것이 더 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 다양한 양배추 품종의 IGS 부위를 증폭시켜 종 특이적으로 363~3,788bp의 8개의 유형으로 구별되는 다형성을 나타내며, 양배추 일대잡종(F1)에서 나타내는 IGS 부위 유전자가 양배추 양친으로부터 유래되었는지 여부를 명확히 판별할 수 있게 한다. 이때, 상기 IGS 부위는 양배추의 25S rRNA와 18S RNA 사이의 부위를 말하며, 상기 IGS 부위는 비암호화 유전자, 또는 암호화 유전자 및 비암호화 유전자로 이루어져 있다.

하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 30개의 양배추 품종(15개의 모본 및 15개의 부본)에 대하여 기존에 밝혀진 2가지의 IGS 뿐만 아니라 서로 다른 크기를 가지는 6가지의 IGS(363 bp, 1,212 bp, 1,717 bp, 1,969 bp, 2,036 bp 및 2,111 bp)를 증폭시키는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 또한, 상기 30품종의 양배추 양친과 이들을 이용하여 교배한 일대잡종(F1) 15계통으로부터 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행한 결과, 모든 IGS type은 양배추 일대잡종(F1)로 유전되는 것을 확인하였다(도 8 참조).

본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 양배추 품종의 IGS 부위를 증폭할 수 있다면 크기 및 주형에 결합하는 위치가 제한되지 않으며, 당업자라면 통상의 프라이머 선정용 소프트웨어를 이용하여 용이하게 프라이머 디자인이 가능하다. 상기 양배추 품종의 전체 IGS 부위 구성과 프라이머 부위는 도 1에 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 IGS 부위의 증폭은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 상기 PCR 반응은 당업계에 알려진 PCR 반응용액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 PCR 반응용액은 분석하고자 하는 양배추 일대잡종(F1)으로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH₂O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등을 포함한다.

또한, 상기 PCR 반응액에서 IGS 부위를 증폭시키는 반응조건 역시 관련분야에서 통상적으로 이용되는 PCR 반응 조건에 기초하여 적절히 결정할 수 있는데, 하나의 구체적 예로, 94℃에서 3분 동안 1차 변성시킨 후, 94℃에서 30초간 유지하고, 프라이머의 어닐링을 위해서는 58℃에서 30초, 그리고 프라이머의 확장을 위해서는 72℃에서 30초로 구성된 반응을 34회 정도 반복한 후 최종적으로 완전한 프라이머 연장을 위해 72℃에서 7분간 연장시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 증폭된 IGS 부위는 전기영동, 전기적 측정 및 광학적 측정으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 바람직하게는 증폭된 IGS 부위를 전기영동에 의해 검출한다. 본 발명에서 전기영동시 사용하는 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔을 사용할 수 있고, 대표적인 예로 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 전기영동 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에 따른 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도 검정은 양배추 일대잡종(F1)의 게놈 DNA를 증폭시켰을 때 나타나는 밴드의 패턴을 분석함으로써, 순도 여부를 판단할 수 있다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 프라이머 세트는 양배추 양친으로부터 유래된 IGS에 대해 다형성을 나타내므로, 각 품종 유전형질이 고정된 부본과 모본 양친에서는 이들의 대립 유전자가 각각 단일(homozygous) 밴드 패턴으로 나타나게 된다. 양배추 일대잡종(F1)의 게놈 DNA를 증폭 시켰을 때, 양배추 양친에서 나타났던 단일 밴드들이 이형접합(heterogyzous)한 상하 이중 밴드 형식으로 모두 나타나게 되면, 이 종자는 순도로 검정 받게 된다.

다른 하나의 구체적 양태로서, 서로 다른 크기의 IGS를 가지는 모본과 부본을 교배하여 생성된 양배추 일대잡종(F1)의 게놈 DNA를 증폭하였을 때 모본과 같은 형식의 대립 유전자만 단일 밴드 형식으로 나타난다면, 이 종자는 부본의 꽃가루가 수정되지 않은 모본만의 자식 개체라고 판단할 수 있게 된다.

또 다른 하나의 구체적 양태로서, 원래 부본에서 확인된 것과 다른 크기의 대립 유전자가 양배추 일대잡종(F1)에서 나타난다면, 이는 다른 부본의 꽃가루가 수정되거나, 교배 조합이 다른 이품종이 혼입된 것으로 검정할 수 있다. 따라서 양친에 대한 검정과정 없이 양배추 일대잡종(F1) 종자의 이형성(heterozygosity) 검정 결과만으로도 순도 여부를 판단할 수 있다.

본 발명은 순도검정 방법의 정확성을 높이기 위하여, 양배추 일대잡종(F1)의 양친으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)를 이용하여 양친의 IGS 부위를 증폭하고, 증폭된 IGS 부위를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 양배추 일대잡종(F1)의 양친으로부터 유래된 게놈 DNA는 직접 양배추 종자로부터 게놈 DNA를 채취하는 방법 또는 양배추로부터 게놈 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 양배추 양친 품종과 양배추 일대잡종(F1)의 IGS 부위를 각각 증폭한 후, 동시에 전기영동하였을 때, 양배추 양친 품종에서 나타나는 단일 밴드들이 일대잡종(F1)에서 상하 이중 밴드 형식으로 모두 나타나게 되면, 이 양배추 일대잡종(F1) 품종은 양배추 양친만이 교배된 순도로 검정 받을 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 양배추 일대잡종(F1) 품종의 25S rRNA와 18S rRNA 사이에 존재하는 IGS 부위를 증폭시켜 종 특이적으로 363~3,788bp의 8개의 유형으로 구별되는 다형성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 키트는 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하는데 필요한 실험(예를 들어, PCR 등) 및 결과 확인에 필요한 여러 가지 시약들, 예컨대, PCR 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있으며, 상기 시약들은 상기 상술한 바와 같으므로 이하에서는 생략한다.

본 발명의 명세서에서 용어, "프라이머"란 상보적인 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 핵산 서열은 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 10개 이상, 바람직하게는 10 내지 100개, 보다 바람직하게는 20 내지 60개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30개의 연속 염기로 구성되며, 주형과 충분히 안정된 염기쌍을 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

한편, 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 양배추 품종의 IGS(intergenic spacer) 부위를 증폭하고, 증폭된 IGS 부위를 검정하여 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하기 위한 마커로 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트를 양배추 일대잡종(F1) 종자의 순도를 검정하는 마커로 사용하는 경우 양배추 일대잡종(F1)의 순도검정 방법은, 양배추 일대잡종(F1)으로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA에서 IGS 부위를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 IGS 부위의 크기 및 대립 유전자(밴드) 패턴을 분석하여 양배추 일대잡종(F1)의 순도를 검정하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 양배추 일대잡종(F1)으로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법, 추출된 게놈 DNA에서 IGS 부위를 증폭하는 방법 및 반응조건, 및 증폭된 IGS 부위의 크기 및 밴드 패턴 분석 등은 상술한 바와 같으므로, 이하에서는 생략한다.

본 발명의 순도검정 방법은 분자표지를 기초로 하고 유전자의 전기영동에 의한 객관적인 검정방법이므로, 포장검정에서 소요되는 재배면적, 인력 및 시간의 손실 등의 문제를 해결하면서 양친 교배 여부를 정확하게 판단할 수 있다. 또한, 본 발명의 순도검정 방법에서 사용된 프라이머 세트는 다양한 양배추 품종의 IGS 부위를 증폭시켜 종 특이적으로 8개의 유형으로 구별되는 다형성 마커로, IGS 생성물의 크기가 다른 양친의 경우 아가로스 겔 상에서 쉽게 확인할 수 있어 양친의 순도 유지에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 양배추 품종의 IGS의 다양성을 확인한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 양배추 품종의 IGS를 증폭한 후 아가로오스 겔에 전기영동하여 IGS 크기를 확인한 결과이다.
도 3은 양배추 품종의 8개 유형의 IGS를 pCR^® TOPO TA 벡터에 리게션(ligation)한 후 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 양배추 품종의 IGS를 아가로오스 겔에 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 양배추 품종의 8개 유형의 IGS를 pCR^® TOPO TA 벡터에 리게션(ligation)한 후 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 양배추 품종의 IGS의 염기서열을 시퀀싱(sequencing)하여 얼라인먼트(alignment)한 결과이다.
도 5는 양배추 품종의 8개 유형의 IGS 간의 유사도를 확인하기 위해 MEGA 6 프로그램을 사용하여 작성한 계통도이다.
도 6은 양배추 품종의 8개 유형의 IGS 간의 유사도를 확인하기 위해 mVISTA 프로그램을 사용하여 유사부위를 확인한 결과이다.
도 7은 양배추 품종의 8개 유형의 IGS 염기서열을 각각 얼라이먼트하여 반복부위를 확인한 그래프이다.
도 8은 30점의 양배추 양친품종(female(F) 15점; male(M) 15점)과 이들을 교배한 일대잡종(F₁) 15 계통으로부터 게놈 DNA를 추출한 후 본 발명의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 IGS 부위를 증폭하여 아가로오스 겔에 전기영동을 통해 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 양배추 시료 준비

아시아 종묘에서 30점의 양배추 양친품종(female 15점; male 15점)과 이들을 교배한 일대잡종(F1) 15 계통을 준비하였다. 표 1에서 나타내고 있는 교배조합은 아시아 종묘에서 사용하고 있는 계통명을 기재하였으며, 교배조합에서 F는 female, M은 male, F1은 일대잡종을 나타낸다.

번호	계통명	교배조합	번호	계통명	교배조합
1		F1	25		F1
2	1464	F	26	632	F
3	621	M	27	755	M
4		F1	28		F1
5	8352	F	29	842	F
6	636	M	30	621	M
7		F1	31		F1
8	225	F	32	337S	F
9	94	M	33	94	M
10		F1	34		F1
11	9051	F	35	IB14	F
12	3074	M	36	DWB	M
13		F1	37		F1
14	2409	F	38	842	F
15	8S8-7	M	39	2409	M
16		F1	40		F1
17	26S	F	41	496B	F
18	NC1	M	42	2409	M
19		F1	43		F1
20	337	F	44	9051	F
21	P15-41	M	45	PKT-41	M
22		F1
23	2418	F
24	CT5-51	M

실시예 2 : 양배추 검출용 프라이머의 설계 및 합성

양배추(Brassica oleracea var. capitata L.)의 전체 45S rDNA 염기서열을 파이젠(www.phyzen.com)에 의뢰하여 확인하였다. 그 다음 25S의 말단부위와 18S 개시부위의 염기서열을 이용하여 IGS(intergenic spacer) 영역의 염기서열을 증폭할 수 있는 Forward 프라이머와 Reverse 프라이머를 합성하여 준비하였다. 상기 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.

	Forward 프라이머(5′→3') 염기서열	reverse 프라이머(5′→3')
IGS	ATTCAGCCCTTTGTCGCTAA(서열번호 1)	ATGACTACTGGCAGGATCAACCAG(서열번호 2)

실시예 3 : 양배추의 게놈 DNA 추출 및 IGS 증폭

상기 실시예 1에서 준비한 30점의 양배추 양친품종(female 15점; male 15점)과 이들을 교배한 일대잡종(F1) 15 계통의 어린잎을 막자사발에 넣고 액체질소를 이용하여 곱게 간 후, DNA 추출 키트(DNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Cat. No. 69104)를 사용하여 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다.

그 다음 상기 각 품종의 게놈 DNA 100ng에 상기 실시예 2에서 합성한 프라이머 세트(10pmol), Taq 중합효소 및 PCR 용액(Cat. No. G2002, ㈜제넷바이오, korea)을 혼합한 후 94℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1 사이클로 하여 34번 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. PCR 증폭이 끝난 생산물은 EtBr(ethidium bromide) 0.5㎍/㎖이 혼합된 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 후 UV 상에서 밴드를 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실험결과, 30점의 양친품종에서 기존에 밝혀져 있는 X56978(3,567bp)와 X60324(3,788bp)의 IGS 이외에 크기 차이를 가지는 6가지의 IGS를 확인하였다. 상기 6가지 IGS는 크기순으로 각각 IGS-A, IGS-B, IGS-C, IGS-D, IGS-E 및 IGS-F로 명명하였다.

실시예 4 : 새롭게 발견된 IGS 영역 클로닝 및 염기서열 확인

상기 실시예 3에서 확인된 서로 다른 크기를 가지는 6가지의 IGS(A 내지 F) 밴드를 DNA 정제키트(purification kit, Promega)를 사용하여 정제하였다. 그 다음 상기 정제한 DNA는 pCR^® TOPO TA vector(Invitrogen, USA)에 리게이션(ligation)한 후 유전자 정제키트(plasmid purification kit, Promega)를 사용하여 벡터를 정제하였다. 상기 정제된 벡터는 상기 실시예 2에서 합성한 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 3과 동일한 PCR 조건으로 유전자를 증폭한 후 EtBr(ethidium bromide) 0.5㎍/㎖이 혼합된 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 후 UV 상에서 밴드를 확인하였다. 또한, 상기 정제된 벡터는 마크로젠(Macrogen, korea)에 시퀀싱(sequencing)을 의뢰하였고, 상기 실시예 2에서 합성한 프라이머 세트를 이용하여 새롭게 발견된 IGS 염기서열을 확인하였다. 그 결과를 도 3, 도 4 및 서열번호 3 내지 8에 나타내었다.

실험결과, 6가지 IGS의 염기서열의 크기는 각각 363bp(IGS-A; 서열번호 3), 1,212bp(IGS-B; 서열번호 4), 1,717bp(IGS-C; 서열번호 5), 1,969bp(IGS-D; 서열번호 6), 2,036bp(IGS-E; 서열번호 7) 및 2,111bp(IGS-F; 서열번호 8)로 확인되었다.

실시예 5 : 본 발명에 따른 프라이머 세트의 양배추 품종 식별 가능성 검정

상기 실시예 4에서 확인된 6가지의 IGS 염기서열과 기존에 밝혀진 두가지의 IGS(X56978 및 X60324)의 염기서열을 MEGA 6 프로그램을 이용하여 계통도(phylogenetic tree)를 작성하여 각각의 서열에 대한 유사도를 확인하였다. 또한, mVISTA 프로그램을 이용하여 각 IGS 염기서열간의 유사도를 확인하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

실험결과, 본 발명의 프라이머 세트는 양배추 양친품종이 서로 다른 크기의 IGS를 포함하고 있는 경우에 한하여 양배추 품종의 식별에 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 6 : 새롭게 발견된 IGS의 반복부위(repeat region) 확인

상기 실시예 4에서 확인된 6가지의 IGS 염기서열과 기존에 밝혀진 두가지의 IGS(X56978 및 X60324)의 염기서열을 각각 얼라이먼트(alignment)하여 반복부위를 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실험결과, IGS-A와 IGS-B는 반복부위가 없었으며, IGS-C, IGS-D, IGS-E 및 IGS-F는 약간의 반복부위를 가지고 있었다.

실시예 7 : 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 양배추 품종 내 IGS 확인

상기 실시예 1에서 준비한 30점의 양배추 양친품종(female(F) 15점; male(M) 15점)과 이들을 교배한 F₁ 일대잡종 15 계통으로부터 게놈 DNA를 추출한 후 상기 실시예 2에서 합성한 프라이머 세트를 이용하여 IGS 부위를 증폭하였다. 상기 게놈 DNA 추출과 IGS 부위 증폭은 상기 실시예 3과 동일한 방법을 사용하여 실시하였다. 그 다음 상기 증폭된 DNA는 EtBr(ethidium bromide) 0.5㎍/㎖이 혼합된 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 후 UV 상에서 밴드를 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

실험결과, 양친품종이 가지고 있는 모든 IGS 타입이 일대잡종(F1)으로 유전되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 프라이머 세트는 양배추 품종에 대한 순도검정용 마커로 활용할 수 있으며, 종자혼입을 쉽게 판별할 수 있을 것으로 판단되었다.

<110> Sunchon University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Purity checking method for F1 hybrid seeds using intergenic spacer regions of Brassica oleracea var. capitata L. ribosomal DNA <130> PA-14-0217 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS forward primer <400> 1 attcagccct ttgtcgctaa 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS reverse primer <400> 2 atgactactg gcaggatcaa ccag 24 <210> 3 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-A sequence <400> 3 ccctccccct ttctaatcat acgttcctcc ccaaaacgtt aaacaccgga aaacgcaaaa 60 aaattcaagt atctaagaag acgtcgtcag aggttcgaga tttttacttg gtgaaattca 120 ctctcgcccc aatatttcag attgaccgat gaaatgcaac cctcatgtgc acaagtctcg 180 gccaaaaata acacacatgt aatatgggat tcaggtcaat catggccata tagagttgag 240 tgacatggag gaagtagtga caataacaca catattctcc atccacggcc aagtcttcgt 300 ctgttccctc tttccatgtg tttgcgggaa catgaccagg gcttgccgtg atttatgaat 360 gct 363 <210> 4 <211> 1121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-B sequence <400> 4 ccctccccct ttccaatcat acgttcctcc tcaaaacgtt aaacaccgga agtggagaag 60 aaaagaggtt ttaagacgag gtgttcttca aaggcagcag ccacatctct tccttcaatt 120 ggggtaataa tcaaaaagat attttgatta ttatcttgta acgagtagaa acattctcat 180 tgagattttt tttattattt aattggtagg aaggtttcga tgcacgggct caatcagtat 240 ttgctcagtc aaagctgaaa agtgaaatca ggttcaagtc tgaggttgtg taaactcatc 300 tctacgctgt agaaaaaatt gtgtaaaaat aacataaagg gggattgaac tcgggctcgt 360 tgtgaaagga aaaagagacc aaaccaacat gccatatgag ttattcgttt ataactataa 420 gttcaaaaat ttaaggtaaa ttcaatgatc tgaattaatt atgtatttca aaaaaaaatt 480 gtttggcatg aagctagaga caaagaggta cacaaaaatg tattcggatt ataaattcag 540 ttcaaaaaat aaataaaatc acagttttaa aacacaaaga tagaagcaaa gcatacaaga 600 aaaattcgtt tagcaataat aacaccgaga gtggttggaa agattgatgt tagcggggca 660 atgaacgtgc ggcgtatgag tggtgattgg atagctagtg tttgtaggct ctgtgctcgc 720 gcacccaact acagaccaac tatccttctc agtttcttca ctagcatagc tatgcttgtt 780 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gattggatag ctagtgtttg taggctctgt gctcgcgcac 1320 ccaactacag accaactatc cttctcagtt tcttcactag catagctatg cttgttgaac 1380 tgatcagggg cctgtgttgc gtacctatct agaaggaatt gttaagcttt gcttaaaata 1440 ttgttcgcgg catctccttc attggggaag tcgtgaacgc ataagccggc acttgtgatc 1500 cttgcgtctt tgcataattt atgcattgtt cgccaaggtg aacaagttgt ttgctgggat 1560 ctcggttgcg gaaagattat ggcggtgact cgaagaaatt ctgtcctgct aagcacgttt 1620 gtctccggac aaaagatgac ggtcaagtct tcgtctgttc cctctttcca tgtgtttgcg 1680 ggaacatgac cagggcttgc cgtgatttat gaatgct 1717 <210> 6 <211> 1969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-D sequence <400> 6 ccctccccca ttccaatcac aggttcctcc ccaaaacgtt acaaacaaaa acccctaaca 60 aaattcaagt atataagaag acgtcgtccg aggttcgaga tttttacttg gtgaaattca 120 ctctcgccac aatatttcag attgaccgat gaaatgcagc ccgcctgtgc acaagtctct 180 aataaaagca tcctgacggg agcattaaaa cccgaaaaaa tcaagggaaa atgttaatat 240 aacacttgat tggatgatgg atgatctagc cagcatcagt acacaggaca gagtgatatg 300 atcggccacc actcccggga aggatttaat 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caatgtctaa tggtgacaga 1200 ctgaaaaaaa gtgttttgtc tatataaagg gtaggcactc ttctgtgcct acgctgaagg 1260 tgggagtccg aatgggtatg tccgacttct cggtcctaca cgatcgatgg ttgggctgag 1320 gtccgatggc aggactgtct ctggcgaatt ttacggcaac ttttctgtca aattttccgg 1380 cggaccgttt agcccctaac ctcaaatttt cgcgcttgtg tggtcatggc ctggtttcat 1440 ccgtcttcta gctgctcttt tgattacatc ttgagagtgg ttggaaagat tgatgttagc 1500 ggggcatttg aacgtgtggc gtatgagtgg tgattggata gctagtgttt gtaggctctg 1560 tgctcgcgca cccaacaaca gaccaactat ccttctcatt ttcttcacta gcatagttat 1620 gcttgtttga actgatcagg ggcatatgtt gcgtacctat ctagaaggaa ttattaaact 1680 ttgcttaaaa ttttgtttgc ggcatctcct tcacttggga agttgtgaac acataagccg 1740 gcacttgtga tccttgcgtc tttgcataat ttatgcatcg tttgcaaagg tgaataagtt 1800 gtttgctgag atctcggttg cggaaagatt atggcggtga ttcgaagaaa tactgtcccg 1860 ctaagcacgt ttgtctccgg acaaaagatg acggtcaagt ctgcgtctgt tcccactttc 1920 catgtgtttg cgggaatatg acgtggtctt tccctgattt atgaaagct 1969 <210> 7 <211> 2036 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-E sequence <400> 7 ccctcccctt tccaatcata cgttcctccc caaaacgtta aacaccgaaa acgcaaaaaa 60 attcaagtat ctaagaagac gtcgtcagag gttcgagatt tttacttggt gaaattcact 120 ctcaccccaa tatttcagat tgaccgatga aatgctgccc tcatgtgcac aattctcggc 180 caaaagcatc ctgacgggag cattaactcc cgaaagagct ttcgttcaca gttgtgtcca 240 cgggtatcat ggcagctggc ttgatataat tcatcccttc agtacgcttg gcctcgatca 300 gaccacgaaa aaaataaggg aaaatgttaa cacttggttg gatgatcagc cactactgcc 360 gggaaggatg taatcgagcc agcatcagta aaacttgaga ccatcatgga ccatcagtcc 420 atgaaaaatt ctcaagctat cagtacactc agacaaaaat cacgatatgt gtactgatgg 480 actgtcaacg tgggtcagtt gtccactgac agtccacggg aagggcaaac gtgctgctga 540 tatgtgtact aacggacagt cctcgtgggc gaaaatcacc caaacagtcc acgttgactg 600 tccatcagta cacaattgtc tactgacgga cagtcctcgt aggcgaaaat cacccacgga 660 cattcctcgt gggcgaaaat cacccacgga tagtccacgg gaagggccaa cgtgctgata 720 tgcgtactaa cggacagtca tcgtgggcca aaatcacccg gatagtccac gggaagggcc 780 aacgtgctga tatgtgtact gacggacagt cctcgtggcg aaaatcaccc 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ttgccgtgat 2100 ttatgaatgc t 2111

Claims

양배추 일대잡종(F1)으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 IGS(intergenic spacer) 부위를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 IGS 부위 염기서열이 서열번호 3의 363bp 증폭산물, 서열번호 4의 1,212bp 증폭산물, 서열번호 5의 1,717bp 증폭산물, 서열번호 6의 1,969bp 증폭산물, 서열번호 7의 2,036bp 증폭산물, 서열번호 8의 2,111bp 증폭산물, 3,567bp 증폭산물 및 3,788bp 증폭산물의 8개 유형으로 구별되는 다형성을 나타내면서 그 개수가 이형접합(heterozygous) 형식으로 존재하는 경우 일대잡종(F1) 품종이 순종인 것으로 판별하는 단계;를 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 품종의 순도를 검정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 상기 양배추 일대잡종(F1)의 종자 또는 어린 식물체의 잎으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 양배추 일대잡종(F1) 품종의 순도를 검정하는 방법.
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 양배추 일대잡종(F1) 품종의 순도를 검정하기 위한 키트.