KR102198566B1 - 고구마 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 arms-pcr용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 고구마 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 고구마 품종 판별용 분자마커를 이용하면 상용되고 있는 고구마의 품종 판별이 가능하므로, 고구마 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

고구마 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도{Tetra primers ARMS-PCR molecular marker for discriminating cultivars of sweet potato and uses thereof}

본 발명은 고구마 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

고구마(Ipomoea batatas)는 메꽃과에 속하는 쌍떡잎 식물로, 쌀, 밀, 감자, 옥수수, 카사바와 함께 전 세계적으로 가장 중요한 6대 작물 중 하나이다. 고구마는 단백질, 탄수화물, β-카로틴과 안토시아닌 등의 영양소가 풍부하여, 식량, 사료 또는 산업의 소재로 사용된다. 이렇듯 중요한 작물임에도 불구하고, 고구마의 게놈 시퀀스는 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 최근, 고구마의 근연종으로 알려진 2배체 야생종인 Ipomoea trifida의 게놈 연구가 수행되고 발표되었으나, 고구마의 게놈은 육배체이며, 다형성이고, 게놈 사이즈가 크며, 게놈 구성 또한 동질배수체(autopolyploid), 이질배수체(allopolyploid) 또는 두가지 모두를 포함하는 복잡성으로 인해 아직까지 게놈 서열이 완전히 밝혀지지 않았다.

분자마커는 식물의 연구 및 육종 프로젝트에서 광범위하게 이용된다. 가장 처음으로 알려진 분자마커는 Botstein이 발표한 것으로, 인간 게놈 지도를 만들 때 사용된 RFLP(restriction fragment length polymorphism)이다. PCR(polymerase chain reaction) 기술이 발명된 이후, RAPD(random amplified polymorphic DNA), AFLP(amplified fragment length polymorphism), SSR(simple sequence repeat) 그리고 SNP(single nucleotide polymorphism) 등 많은 분자마커들이 개발되었다. SNPs는 대립형질의 변이와 초고처리량, 및 자동화 기술에 적용될 수 있는 장점이 있어, 다른 분자마커들에 비해 가장 널리 이용되고 있다. RAPD와 AFLP 마커가 고구마의 유전적 연관관계를 위해 이용되어 왔고, SSR 마커는 고구마의 다양성 평가와 형질 분석에 이용되어 왔다. 최근에는 고구마 게놈 연구를 위한 게놈 시퀀싱과 어셈블리 방법 등이 사용되어, 분자마커부터 시퀀싱까지 여러 연구가 이루어지고 있는 상황이다.

고구마는 무분별한 재식으로 인해 수확량 및 품질의 저하, 다른 품종의 혼합으로 인한 병충해 등의 문제가 발생하였다. 또한, 고구마의 경우 특허권 및 로열티 문제로 고구마 품종에 대한 변별력 요구가 급증하고 있으나, 고구마는 동일 품종 내에서도 형태적 구분이 어려워 판별에 어려움을 겪고 있다. 더욱이, 현재 고구마 재배 시 단일 품종화가 이루어지지 않고 있으며 혼재되어 존재하여 상품의 단일화나 규격화가 힘든 상태이다. 고구마 품종의 구별을 위한 분자마커에 관한 보고가 일부 있었으나, 대한민국 지역에 적합한 품종 판별 마커의 개발은 없는 실정이다. 본 발명자는 한국에서 많이 재배되고 있으며, 맛, 풍미, 향 및 생김새가 비슷해 구별이 어려운 4가지 고구마 품종(베니하루까, 안노베니, 풍원미, 호감미)을 대상으로, 이들을 구별할 수 있는 분자마커를 개발하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1403494호에는 '고구마의 품종판별을 위한 SSR 프라이머 및 이를 이용한 고구마의 품종 판별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1961653호에는 '고구마 품종 판별용 SNP 분자 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 고구마 품종 판별을 위한 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 GBS(Genotyping-by-sequencing) 데이터를 기반으로 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미의 4가지 고구마 품종을 구별할 수 있는 2개의 SNP를 선발하고 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)용 프라이머를 제작하여 분석한 결과, 상기 2개의 SNP가 4가지 고구마 품종을 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 고구마 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고구마 품종 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 고구마 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 고구마 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고구마 품종 판별용 분자마커를 이용하면 상용되고 있는 고구마의 품종 판별이 가능하므로, 고구마 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 육성 품종에 대한 지적재산권 확보 및 향후 고구마 품종 등록 시 품종 보증의 분자마커로 활용 가능하다.

도 1은 고구마 품종의 형태학적 특징을 보여주는 것으로, a는 베니하루까, b는 안노베니, c는 풍원미, d는 호감미이다.
도 2는 SNP 04-27457768 마커 증폭용 테트라 프라이머 ARMS-PCR 산물의 전기영동 결과(a)와 SNP 03-16195623 마커 증폭용 테트라 프라이머 ARMS-PCR 산물의 전기영동 결과(b)이다. M: 100-bp DNA ladder 마커, A; 베니하루까, B; 안노베니, C; 풍원미, D; 호감미.
도 3은 SNP 04-27457768 좌의 ARMS-PCR 산물의 시퀀싱 결과(a)와 SNP 03-16185623 좌의 ARMS-PCR 산물의 시퀀싱 결과(b)이다. 고구마 4 품종의 양방향 시퀀싱 결과에 GBS의 결과 서열을 대조군으로 정렬한 것으로, 목표로 잡았던 지역과 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 노란색 상자는 SNP 좌를 나타내며, 붉은색 화살표는 바깥쪽 프라이머 세트, 푸른색 화살표는 SNP 특이적인 내부 프라이머 세트를 의미한다.
도 4는 SNP 04-27457768 좌 및 SNP 03-16195623 좌에서의 품종별 시퀀싱 분석 파장의 결과이다. a; 안노베니의 SNP 04-27457768 좌, b; 호감미의 SNP 04-27457768 좌, c; 베니하루까의 SNP 03-16195623 좌, d; 풍원미의 SNP 03-16195623 좌, e; 호감미의 SNP 03-16195623 좌.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 고구마 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 서열번호 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)용 프라이머 세트이다.

"ARMS-PCR"이란, 대립유전자 특이적(allele-specific) 프라이머를 이용하여 SNP(single nucleotide polymorphsim)를 검출하기 위한 PCR이다. Taq 중합효소를 이용한 PCR에 있어서, 프라이머의 3' 말단에 위치하는 미스매치는 PCR 과정 중 결합(annealing)을 현저하게 감소시켜 더 이상 증폭이 되지 않도록 한다. 이는 Taq 중합효소의 3'에서 5' 방향으로 핵산말단가수분해효소(exonuclease) 교정(proofreading) 활성의 부재에 기인한다. 따라서, ARMS-PCR에는 고충실도(high fidelity)를 가지는 중합효소는 사용이 불가하다. ARMS-PCR의 증폭 산물은 대립유전자의 SNP 위치 염기가 동형성(homogygous)일 경우 2개의 산물이 생성되며, 대립유전자의 SNP 위치 염기가 이형성(heterogygous)일 경우 3개의 증폭 산물이 생성된다. ARMS-PCR에는 2개의 바깥쪽(outer) 프라이머와 2개의 내부(inner) 프라이머가 필요되는데, 바깥쪽 프라이머는 SNP 위치 염기를 포함하는 영역의 양쪽 말단을 표적으로 디자인되어, 이들 프라이머에 의해 증폭되는 산물은 증폭 반응의 대조군 역할과 동시에 내부 프라이머의 증폭 주형으로 사용될 수 있다. 또한, 내부 프라이머는 3' 말단에 대립유전자에 위치한 각각의 SNP 염기와 매칭되도록 디자인된다. 본 발명에서는 내부 프라이머의 3' 말단 염기뿐만 아니라, 3' 말단으로부터 2번째 위치하는 염기도 주형과 미스매치되도록 변형하여 내부 프라이머를 설계하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 고구마 품종 판별용 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 5는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer)이고, 서열번호 2 및 6은 역방향 내부 프라이머(reverse inner primer)이며, 서열번호 3 및 7은 정방향 바깥쪽 프라이머(forward outer primer)이고, 서열번호 4 및 8은 역방향 바깥쪽 프라이머(reverse outer primer)이다(표 2).

본 발명의 일 구현예에 따른 고구마 품종 판별용 프라이머 세트는, 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진, SNP 04-27457768 마커 증폭용 프라이머 세트; 및 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진, SNP 03-16195623 마커 증폭용 프라이머 세트;로 이루어져 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물은 349 bp, 241 bp 및 164 bp 크기의 산물을 나타낼 수 있고, 이 중 349 bp 및 164 bp의 산물을 나타내는 고구마 품종은 SNP 염기 위치(SNP 04-27457768)에 G 염기 동형성을, 349 bp 및 241 bp의 산물을 나타내는 고구마 품종은 SNP 염기 위치에 C 염기 동형성을, 3가지 크기의 산물을 모두 나타내는 고구마 품종은 SNP 염기 위치에 이형성을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 또한, 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물은 440 bp, 292 bp 및 205 bp 크기의 산물을 나타낼 수 있고, 이 중 440 bp 및 292 bp의 산물을 나타내는 고구마 품종은 SNP 염기 위치(SNP 03-16195623)에 T 염기 동형성을, 440 bp 및 205 bp의 산물을 나타내는 고구마 품종은 SNP 염기 위치에 C 염기 동형성을, 3가지 크기의 산물을 모두 나타내는 고구마 품종은 SNP 염기 위치에 이형성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 각 프라이머의 서열 길이에 따라 각 서열 내의 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 고구마 품종 판별용 프라이머 세트에 있어서, 상기 고구마 품종은 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고구마 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 고구마 품종 판별용 키트에 있어서, 상기 고구마 품종은 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한,

고구마 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 고구마 품종의 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 판별 방법에 있어서, 상기 고구마 품종은 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 방법은 고구마 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 고구마 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 본 발명의 증폭 반응은 바람직하게는 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 고구마 품종을 판별하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 고구마 품종 판별은 테트라 프라이머 ARMS-PCR에 따른 증폭 산물의 크기에 기반하여 대립유전자의 이형성 또는 동형성을 구별하고, 이를 통해 고구마 품종을 판별할 수 있게 된다. 구체적으로는, 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 SNP 04-27457768 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하면 베니하루까와 풍원미는 각각 SNP 위치에서 G 염기 또는 A 염기의 동형성을 보이고, 안노베니와 호감미는 이형성을 보인다. 또한, 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 SNP 03-16195623 마커 증폭용 프라이머 세트를 이용하면 안노베니는 SNP 위치에서 T 염기의 동형성을 보이고, 베니하루까, 풍원미 및 호감미는 이형성을 보인다. 따라서, 상기 2개의 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물의 결과 조합을 통해 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미 품종을 판별할 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

국내·외 지역에서 수집한 66 품종의 고구마 식물들은 28±2℃ 온도 하에서 16 시간의 광조건, 8시간의 암조건 하에서 기내배양 상태로 재배되었다.

2. 게놈 DNA의 추출

총 게놈 DNA는 기내 배양된 66개 식물체의 잎에서 추출되었다. 간단하게, 유묘 단계에 있는 신선하고 어린 잎을 액체 질소와 금속 재질의 막대와 함께 튜브에서 마쇄하고, 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)이 포함된 예열된 CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide) 완충액을 이용하여 추출하였다. 불순 물질들은 클로로포름:이소아밀 알코올(chloroform:isoamyl alcohol, 24:1)로 제거하였고, DNA는 차가운 2-프로판올(propanol)을 넣어 침전시킨 후에, 70% 에탄올로 세척하였다. 건조시킨 DNA 펠렛은 물에 녹였으며, DNA 샘플들은 모두 RNA 오염을 방지하기 위해 RNase A를 처리하였다. DNA의 품질과 양은 분광광도계로 분석하였고, EtBr(Ethidium Bromide)로 염색된 1.5% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다.

3. Genotyping-by-sequencing (GBS)

Elshire의 방법으로부터 변형된 방법과 ApeKI (GCWGC)를 이용하여 각 품종별로 66개의 개별적인 바코드를 이용하여 GBS 라이브러리를 준비하였다. 라이브러리는 GBS 시퀀싱을 위해 Illumina HiSeq 2500 paired-end read 플랫폼에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 이후에, 원시 리드(raw read)들은 바코드 시퀀스에 따라 재배열 되었으며, 내부의 python script를 통해 정제되었다. 또한 리드들은 Cutadapt 프로그램을 통해 common adapter를 포함하고 있는 시퀀스를 정제하였다. 정제된 리드들을 참조서열에 배열하기 위해서 Burrows-Wheeler Aligner 프로그램을 사용하였다. 이후의 분석을 위해 배열 결과물은 SAMtools이라는 프로그램을 이용하여 BAM 포맷의 파일로 변환시켰다. 이중대립 좌(bi-allelic loci)를 고려하는 내부의 script는 불러온 SNP 위치 중 중요한 지역을 선택하기 위해 이용되었다. SNP/InDel 리드와 맵핑된 리드의 비율에 따라 변형 유형은 하기 세 가지 범주로 분류되었다: 90% 이상에 대한 동형성 SNP/InDel, 40% 이상 및 60% 이하에 대한 이형성 SNP/InDel, 나머지 기타. 분자마커의 품질을 조정하기 위해 MSP(missing proportion) 0.3 미만 및 MAF(minor allele frequency) 0.05 초과를 선택하였다.

4. 특이적 프라이머의 디자인

각각의 바깥쪽(outer) 및 내부(inner) 프라이머들은 4 품종의 고구마를 판별하기 위해 2개의 SNPs(SNP 04-27457768, SNP 03-16195623)에 기반하여 디자인되었다. Ye 등(Nucleic Acids Res (2001), 29(17): e88)에 의해 개발된 프로그램이 프라이머 디자인에 사용되었으며, 대립형질 밴드가 1.5의 비율을 가지면서 100~300 bp의 단편 크기를 가지도록 설정하였다. 테트라 프라이머 ARMS-PCR용 프라이머 고안은 http://primer1.soton.ac.uk/primer1.html에서 제공하는 프로그램을 사용하였다.

5. 테트라 프라이머 ARMS-PCR

고구마 품종의 분자적 판별을 위해 테트라 프라이머 ARMS-PCR을 수행하였다. 반응은 50 ng의 주형 DNA, 0.5 U의 r-Taq DNA 중합효소(Takara, 일본), 2 ㎕의 10x완충 용액 및 0.25 mM의 dNTPs가 포함된 총 20 ㎕의 부피로 수행되었다. 바깥쪽 프라이머와 내부 프라이머의 농도는 각각 0.25 μM와 0.5 μM로 사용하였다. SNP 04-27457768의 증폭 조건은 94℃에서 5분, 이후 35번 동안 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 후에 추가적으로 72℃에서 5분 동안의 연장으로 구성되었다. SNP 03-16195623의 증폭 조건은 94℃에서 5분, 이후 35번 동안 94℃에서 30초, 66℃에서 30초, 72℃에서 30초 후에 추가적으로 72℃에서 5분 동안의 연장으로 구성되었다. 모든 PCR 산물들은 EtBr로 염색된 1.5%의 아가로스 겔에 전기영동 되었다. 절편의 크기는 정규 규격의 마커와 함께 비교되었다.

6. 시퀀싱 및 서열 정렬

DNA 시퀀스 분석을 위해 SNP 04-27457768과 SNP 03-16195623의 바깥쪽 프라이머를 이용해 PCR과 전기영동이 수행되었다. 그 후에 Bigdye Terminator Cycle Seqeuncing Kit(Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 제조업자의 매뉴얼에 따라 dideoxy cycle sequencing PCR을 수행하였다. 그 후, 구슬 기반의 PCR 정제 기법이 사용되었다. 시퀀싱 산물은 ABI 3730XL DNA 분석기(Applied Biosystems)를 통해 수행되었고, 시퀀스의 편집과 contig의 조립은 Sequence Scanner 소프트웨어를 이용해 수행되었습니다. 품종 간의 서열 비교를 위해서 CLC Sequence Viewere 8(www.clcbio.com)이 이용되었다.

실시예 1. GBS 분석 결과

GBS는 다중 시퀀싱을 통해 유기체에서 SNP를 발견하는 기술이며, 또한 제한효소를 이용하여 게놈의 복잡성을 줄이는 기술로서 많은 SNPs 분석에서 이용되고 있다. SNP는 같은 종의 개체들 간에 가장 풍부한 형태의 유전적 변이이며, 또한 자동화 시스템이 가능한 분자마커 중 하나이다.

GBS 접근을 이용한 고구마로부터의 SNP의 탐색을 위해, 게놈 DNA의 절단을 위해 5 염기 절단 제한효소인 ApeKI가 사용되었으며, 다양한 국가와 지역에서 수집된 66가지 품종의 96-plex GBS 라이브러리가 제작되었다. 시퀀싱은 Illumina HiSeq 2500 시퀀서의 flow cell에서 수행되었으며, 총 505,450,000 리드들이 생성되었다. 추가로, 이전에 토마토에서 적용되었던 참조서열 기반의 SNP calling pipeline(Kim JE. et al., (2014) Mol cells 37(1): 36-42)을 이용하여 시퀀스 데이터로부터 SNP 탐색을 수행하였으며, 총 376,395개의 원시 SNPs가 탐색되었다. SNP 데이터들은 작은 대립 유전자 빈도(MAF) 5% 이상과 실종 비율(MSP) 30% 미만의 기준을 이용하여 추정 마커를 위해 필터링되었다. 그 결과, 총 39,424개의 이중 대립 SNPs들이 선발되었고, 이들은 다른 품종 간의 판별을 위한 분자마커로 사용될 수 있을 것으로 예측되었다.

66가지 품종 중, 본 발명자는 대한민국에서 생산과 소비에 있어 높은 비중을 차지하며 비슷한 특징을 가지는 4개의 품종(베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미)을 비교하기로 결정하였고, 상기 4개의 품종이 SNP 좌에서 다른 서열을 갖는 총 2,543개의 SNPs를 선발하였다. 그 중에 depth가 10 이상인 SNPs는 80개가 있었다. 본 발명자는 상기 80개의 SNPs들을 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미의 고구마 품종을 구별하는 후보가 될 수 있다고 판단하였으며, 그 중 선택된 SNP를 이용하여 테트라 프라이머 ARMS-PCR을 수행하였다.

실시예 2. 2개 SNPs의 특징

본 발명자는 4개의 고구마 품종을 구별하기 위해 GBS 데이터를 기반으로 SNP를 선발하였다. SNP의 선정 기준은 4개의 고구마 품종들 간에 차이를 보이는 read depth가 높은 지역을 선택한 것으로, 결과적으로 2개의 SNP 좌를 선발하였다. Ipomoea trifida의 서열에 정렬한 것에 따르면, SNP 04-27457768좌는 97.7%의 identity로 염색체 4번의 인트론 지역(itf04g26880)에 위치해 있을 것으로 추정되었다. Ipomoea nil의 주석 정보에 따르면, PED1(3-ketoacyl-CoA thiolase 2, peroxisomal)과 같은 기능을 할 것으로 추정되었다. I. trifida에서 이 좌는 G 대립인자를 갖지만, 고구마에서는 G 또는 C의 대립인자가 존재하였다. 마찬가지로, SNP 03-16195623 좌는 71.2%의 identity로 염색체 3번의 CDS 지역(itf03g20590)에 위치해있는 것으로 추정되었으며, EBF1(EIN3-binding F-box protein 1)과 같은 기능을 하는 것으로 예측되었다. 이 SNP 좌는 I. trifida에서는 C 대립인자, 고구마에서는 C 또는 T 대립인자를 갖는 것으로 확인되었다.

실시예 3. 테트라 프라이머 ARMS-PCR 분석 결과

본 발명자는 상기 실시예 2의 SNP 좌를 표적으로 ARMS-PCR을 위한 프라이머를 디자인하였다. 테트라 프라이머 ARMS-PCR 시스템은 SNP에 기반하여 유전형을 분석(genotyping)하는 간단하고 경제적인 방법 중 하나이다. 내부 프라이머들은 각각의 SNP 위치 염기를 기반으로 디자인 되었으며, 3' 말단 염기와 3' 말단으로부터 2번째 염기를 변형시켰다. 그 이유는 3' 말단 염기 하나의 변형만으로는 반발력이 불충분하기 때문이다. 바깥쪽 프라이머는 SNP 위치 염기를 포함하는 영역의 양쪽 말단에서 시퀀싱되도록 설계되었고, 이들은 대조군의 역할과 내부 프라이머와 특이적 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다.

Tetra-primers ARMS-PCR용 프라이머

SNP	Primer	Primer sequence(5'→3') (서열번호)	Allele	Tm(℃)	Amplicon
04 27457768	Forward inner	CTTTTGCTGTGGAAATGTAAATAAGAG (1)	G	52.7	164 (bp)
	Reverse inner	AATCTTCAGTGCTAGCTCATTTGTAATG (2)	C	55.4	241
	Forward outer	CCTCCTAAACTTTTGCAGCTAAGAGTATT (3)		56.9	349
	Reverse outer	TCCAGAGTATATAACAAACCTTTGTGG (4)		54.7
03 16195623	Forward inner	CTTCCAACGTCTGACCGTGTAACCTATCC (5)	C	63.2	205
	Reverse inner	TTGACGGACGAAGTGGTGCTAGCCATA (6)	T	64.6	292
	Forward outer	AAACCGAGCAGACTCTTTCCCAGTTTCC (7)		63.5	440
	Reverse outer	CTAGTTTGGCTATGGTGGGCAAGCTTTG (8)		62.9

4개 고구마 품종의 분자적 동정을 위해, 상기 표 2에 개시된 프라이머들을 이용하여 ARMS-PCR을 수행하였다. 그 결과, SNP 04-27457768에서 4개 품종간의 차이가 확인되었다(도 2a). 이질배수성은 안노베니와 호감미에서 나타났으며, 각각의 동질배수성은 베니하루까와 풍원미에서 나타났다. 베니하루까는 349 bp 및 164 bp의 밴드를 보여 이 좌에서 G 염기에 대해서 동형성을 갖는 것을 알 수 있었다. 풍원미는 349 bp 및 241 bp의 밴드를 보여 이 좌에서 C 염기에 대해서 동형성을 갖는 것을 보여주었다. 다른 두 품종들은 349 bp, 241 bp 및 164 bp의 밴드를 보여, 이 좌에서 G 염기와 C 염기의 이형성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

SNP 03-16195623에서는 안노베니는 동질배수성을, 나머지 3개의 고구마 품종은 이질배수성을 보여주었다(도 2b). 안노베니는 440 bp 및 292 bp 밴드를 보여 이 좌에서 T 염기에 대해서 동형성을 갖는 것을 보여주었다. 그러나 나머지 3개의 고구마 품종들은 440 bp, 292 bp 및 205 bp의 밴드를 보여, 이 좌에서 T 염기와 C 염기의 이형성을 갖는다는 것을 보여주었다.

실시예 4. DNA 서열의 정렬 결과

DNA 서열 분석은 ARMS-PCR의 전기영동 결과를 평가하기 위해 PCR 산물을 이용하여 수행되었다. PCR 산물은 오직 바깥쪽의 프라이머만 사용하여 증폭되었고, 시퀀싱은 각 지역의 정방향 및 역방향으로 수행되었다. 그리고 서열 분석은 Ipomoea trifida를 기반으로 한 GBS 결과와 각 품종의 양 방향 결과를 모두 정렬(alignment)하여 수행하였다. 시퀀싱 결과는 정확히 목표로하는 지역과 일치하였고(도 3), 이는 PCR과 전기영동의 실험의 정확성을 증명하였다. 또한, 두 대립 염기는 시퀀싱 파장에서도 똑같이 나타나(도 4), 본 발명에 따른 2개의 SNP는 4개의 고구마 품종(베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미)을 구분하는 분자마커로서 이용될 수 있음을 알 수 있었고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 테트라 프라이머 ARMS-PCR 방법은 고구마의 분자적 판별에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되었다.

<110> University of seoul Industry Cooperation Foundation. <120> Tetra primers ARMS-PCR molecular marker for discriminating cultivars of sweet potato and uses thereof <130> PN19282 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cttttgctgt ggaaatgtaa ataagag 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aatcttcagt gctagctcat ttgtaatg 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cctcctaaac ttttgcagct aagagtatt 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tccagagtat ataacaaacc tttgtgg 27 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cttccaacgt ctgaccgtgt aacctatcc 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgacggacg aagtggtgct agccata 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaaccgagca gactctttcc cagtttcc 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctagtttggc tatggtgggc aagctttg 28

Claims (8)

1. 서열번호 1 내지 4로 표시된 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 5 내지 8로 표시된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 품종 판별용 프라이머 세트.
2. 삭제
3. 제1항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 품종 판별용 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 품종 판별용 키트.
5. 고구마 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 품종의 판별 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응은 테트라 프라이머 ARMS-PCR(tetra-primers amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction)인 것을 특징으로 하는 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 품종의 판별 방법.
7. 삭제
8. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 겔 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 베니하루까, 안노베니, 풍원미 및 호감미로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 고구마 품종의 판별 방법.

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