KR20110108809A

KR20110108809A - 고구마 유래 ＳＲＤ１ 유전자 ｃＤＮＡ 및 이를 이용한 다수성 형질전환 식물체

Info

Publication number: KR20110108809A
Application number: KR1020100028208A
Authority: KR
Inventors: 배정명; 신정섭; 노설아; 백경희
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-03-29
Filing date: 2010-03-29
Publication date: 2011-10-06
Also published as: US8618357B2; US20110239328A1; KR101260565B1

Abstract

본 발명은 고구마 유래 SRD1 유전자의 cDNA, 상기 cDNA을 포함하는 식물 형질전환용 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 생산한 뿌리작물 등의 형질전환 식물체에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의한 고구마 SRD1 유전자의 cDNA를 이용한 형질전환 고구마에서는 그 저장뿌리의 비대 성장이 촉진이 되었으며, 특히 저장뿌리의 개수가 2배 증가하였다. 따라서 이 유전자는 저장뿌리의 개수를 높이고자 하는 형질전환 뿌리작물 식물체, 혹은 저장뿌리의 비대 성장속도를 촉진시키고자 하는 형질전환 식물체 제작에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

고구마 유래 ＳＲＤ１ 유전자 ｃＤＮＡ 및 이를 이용한 다수성 형질전환 식물체{Sweetpotato SRD1 cDNA and high-numbered transgenic plants using the same}

본 발명은 다수성 (多數性) 형질전환 뿌리작물 제작을 위한 고구마 유래 SRD1 유전자 cDNA 및 이를 이용한 다수성 형질전환 식물체에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 고구마 유래 SRD1 유전자의 cDNA, 그리고 이 cDNA를 포함하는 형질전환용 벡터와 상기 벡터를 이용하여 뿌리작물의 저장뿌리 개수가 증가하는 다수성 (多數性) 형질전환 뿌리작물을 생산하는 방법 등에 관한 것이다.

고구마는 세계 7대 식량 작물의 하나로서 그 저장뿌리는 인간에게 좋은 영양 급원임과 동시에 단위 면적당 높은 바이오매스를 제공한다. 고구마 뿌리 발달의 초기 단계에서는 흰색에 가까운 실뿌리 (fibrous root)를 형성한 후 뿌리 발달이 진행됨에 따라 이들 실뿌리의 일부에 색소가 침착되고, 이 후 색소 침착된 뿌리의 일부가 다시 저장뿌리로 발달하게 된다.

고구마 저장뿌리의 형태 형성에 관한 초기 연구들 (Kokubu, 1973, Bulletin of the Faculty of Agriculture, Kagoshima University 23, 1-126; Wilson and Lowe, 1973, Annuls in Botany 37, 633-643; Nakatani and Komeichi, 1991)에 기초하면 고구마의 저장뿌리는 첫 번째 형성층 (cambium) 내부에 비정상적으로 두 번째 형성층이 발달되어 있는 저장뿌리라고 정의하고 있다. 저장뿌리의 길이 성장, 비대 성장 그리고 저장뿌리의 생산 량 등은 토양의 온도, 습도, 빛의 세기, 광주기, 이산화탄소, 그리고 건조 정도에 의해 영향을 받는다 (Loretan etal.,1994, Advances in Space Research 14, 277-280; Hill et al.,1996, Acta Horticulturae 440, 25-30; Mortley et al.,1996, Acta Horticulturae 440, 31-36; Eguchi et al.,1998, Biotronics 27, 93-96; Pardalesetal.,1999, Plant Production Science 2, 247-251; Kano and Ming,2000, Environment Control in Biology 38, 113-120; van Heerden and Laurie, 2008, Physiologia Plantarum 134, 99-109). 특히, 상기한 바와 같이 고구마의 저장뿌리는 실뿌리의 일부만이 저장뿌리로 발달이 되는데, 토양의 온도가 20-36℃ 일 때는 13-31℃에 비해 저장뿌리의 개수가 증가하지만 (Kano and Ming, 2000, Envioronmental Control in Biology, 38, 113-120), 토양의 온도가 40℃일때는 25℃에 비해 저장뿌리의 개수가 감소한다 (Pardales et al., 1999, Plant Prod. Sci. 2, 247-251)는 보고가 있었다. 하지만, 실뿌리에서 저장뿌리로 발달되는 단계에 관여하는 분자적 메카니즘에 관한 연구는 전혀 보고된 바가 없다. 만약 실뿌리에서 저장뿌리로 발달하는 과정을 제어할 수 있다면 고구마의 생산량을 조절할 수 있을 것이다.

최근에 발달된 다양한 분자적 차원에서의 접근 방법으로 인하여 고구마의 저장뿌리 발달에 관련될 것으로 추정되는 유전자들을 탐색할 수 있었으며, 결과적으로 발달하고 있는 고구마 저장뿌리에서 차등적인 발현 양상을 보이는 유전자들을 확인할 수 있었다. (You et al.,2003, FEBS Letters 536,101-105; Tanaka et al., 2005, Journal of Plant Physiology 162, 91-102). 일본의 Tanaka 등은 고구마 KNOX1 (class 1 knotted1-like homeobox) 유전자의 발현 부위가 사이토카이닌의 일종인 trans-zeatin riboside (t-ZR)이 분포하는 위치와 일치한다는 관찰을 근거로 세 가지 고구마 KNOX1 유전자가 저장뿌리 내에서 사이토카이닌의 함량을 조절하는 유전자일 것이라고 추정하였다 (Tanaka et al., 2008,Journal of Plant Physiology 165,1726-1735). 최근에 Ku 등은 고구마에서 IbMADS1 유전자를 분리하여서 저장뿌리 발달에 관련된 기능을 감자 과다발현 형질전환체를 제작하여 분석하였다 (Ku et al., 2008, Annals of Botany 102,57-67). 하지만, 최근까지 고구마 형질전환체 제작의 어려움으로 인해 고구마의 저장뿌리 발달에 관련된 유전자의 기능을 knock-out 혹은 과다발현 고구마 형질전환체를 이용해 직접적으로 분석하는 것은 거의 불가능 하였다.

한편, 인삼 등의 고부가가치 저장뿌리 작물들은 대부분 다년간에 걸쳐 저장뿌리가 지하에서 성장을 하는데 이 성장기간 동안 저장뿌리는 여러 가지의 병원성 곰팡이에 노출이 되어 수확기가 되기 전에 뿌리 썩음 병으로 재배를 중단해야 되는 경우가 많이 있다. 특히, 우리나라 대표적인 고부가가치 뿌리작물인 인삼의 6년근 밭에서는 저장뿌리의 약 50%가 뿌리 썩음 병으로 재배를 중단해야 하는 실정이다. 저장뿌리 작물 재배에 있어서 이러한 피해를 최소화하기 위해서는 뿌리 썩음 병에 강한 내성 품종 육종과 아울러 저장뿌리의 재배기간을 단축시킬 수 있는 분자육종법이 개발되어야 한다. 이러한 분자육종을 위해서는 저장뿌리 발달에 관련되는 유전자원의 확보 및 그 기능 분석에 관한 연구가 선행되어야 한다.

따라서 저장뿌리의 생산성을 높이기 위해 저장뿌리의 발달에 관련되는 유전자 도입을 이용한 다수성 (多數性) 혹은 조숙성 (早熟性) 형질전환 뿌리작물 제작에 대한 요구가 계속적으로 있어 왔다.

본 발명은 상기 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 다수성 (多數性) 형질전환 뿌리작물을 생산하기 위한 고구마 SRD1 유전자의 cDNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 SRD1 유전자의 cDNA를 포함하는 식물체 형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 다수성 (多數性) 뿌리작물을 생산하고자 하는 경우, 상기 고구마 SRD1 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 제조된 형질전환 뿌리작물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 고구마 SRD1 유전자의 cDNA를 클로닝하여, 식물체 형질 전환용 발현 벡터를 제작하였으며 동일 벡터들을 이용하여 고구마 형질전환체를 제작하여 그 생산성을 확인한 바 고구마의 저장뿌리 발달이 현저히 촉진되었으며, 특히 저장뿌리의 개수가 2배 증가한 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 일 양태는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 DNA를 제공한다.

상기 DNA는 고구마 SRD1 유전자의 cDNA에서 유래된 것임을 특징으로 한다.

상기 cDNA 염기서열은 총 1,002 bp로서 93 bp의 5‘ 비 번역지역, 654 bp의 ORF (Open Reading Frame; 서열번호 3, 217개 아미노산), 그리고 255 bp의 3’ 비 번역지역으로 이루어짐을 특징으로 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 서열을 포함하는 분리된 DNA를 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 DNA를 포함하는 식물 형질전환용 바이너리 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 DNA 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 고구마 SRD1 유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 고구마 SRD1 유전자의 ORF를 포함하는 식물 형질전환용 바이너리 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 ORF 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 상기 ORF에 의해 번역되며 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질을 제공한다.

본 발명에서 상기 식물체 형질전환용 벡터는 외래 유전자를 도입된 식물체 내에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 형질전환용 바이너리 벡터이다.

또한, 상기 본 발명에 의한 고구마 SRD1 cDNA는 pMBP1 벡터의 CaMV35S 프로모터와 NOS 터미네이터 사이에 위치할 수 있다. 본 발명에서는 pMBP1 벡터를 사용하였으나, 다른 식물 형질전환용 벡터로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

상기 바이너리 벡터는 아그로박테리움을 이용하는 방법, 혹은 유전자 총을 이용한 방법 등으로 식물체를 형질전환시킬 수 있다. 본 발명에서는 그 예로서 아그로박테리움을 이용하여 고구마에 형질전환시켰다.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한이 있는 것은 아니나, 고구마, 인삼 등을 포함하는 고부가가치 저장뿌리 작물이 바람직하다. 본 발명에 의한 고구마 SRD1 유전자는 고구마 외에도 저장뿌리의 비대 성장을 촉진시키거나 저장뿌리 개수를 증가시키고자 하는 어떤 식물에도 도입될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 SRD1 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 저장뿌리 개수를 증가시키는 방법을 제공한다. 상기와 같이 저장뿌리 개수를 증가시키면 전체 저장뿌리 생산량을 증가시킬 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 SRD1 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 저장뿌리의 비대 성장 시기를 촉진시키는 방법을 제공한다. 상기와 같이 식물 저장뿌리 비대 성장 시기를 촉진시키면 인삼과 같은 고부가가치 뿌리작물의 재배기간을 단축할 수 있고 이에 따라 뿌리병해로 인한 피해를 감소시킬 수 있어 뿌리작물의 생산성을 개선할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 SRD1 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 식물 저장뿌리를 생산하는 방법을 제공한다. 상기와 같이 균일한 크기의 식물 저장뿌리를 생산할 수 있으면 저장뿌리의 상품성을 개선하여 농가소득 증대에 기여할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 저장뿌리 식물체에 오옥신을 처리하여 SRD1 유전자 발현을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 저장뿌리 발달을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의한 SRD1 유전자는 외부에서 처리한 오옥신에 의해 유전자 발현이 유도되어 저장뿌리 생산성을 증가시킬 수 있다. 상기 오옥신의 처리는 소정의 농도로 일정 시간 처리하는 것이 바람직하다. 예를 들어 상기 오옥신의 처리농도는 500 - 2000 μM가 바람직하며, 오옥신의 처리시간은 500 μM의 농도로 처리하는 경우 6 ~ 12 시간인 것이 바람직하다.

상술한 바와 같이 본 발명은 고구마(Ipomoea batatas) 유래 SRD1 유전자의 cDNA에 관한 것으로서, 이 유전자는 식물체 저장뿌리의 발달을 촉진시켜 저장뿌리의 개수를 증가시키고 저장뿌리 발달 시기를 촉진할 수 있다. 그러므로 본 발명은 인삼, 고구마 등 고부가가치의 다수성 (多數性) 혹은 조숙성 (早熟性) 형질전환 뿌리작물 개발에 효과적으로 이용될 수 있는 매우 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자 cDNA의 염기서열과 IbMADS1 cDNA 염기서열을 비교한 도면으로 파란 화살표는 SRD1 특이 프라이머 위치를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자 cDNA의 아미노산 서열과 IbMADS1 cDNA의 아미노산 서열을 비교한 도면이다.
도 3은 진홍미 고구마(Ipomoea batatas cv.‘Jinhongmi’)의 저장뿌리 초기 발현 유전자들 중 MADS-box 유전자들의 염기서열을 SRD1 과 IbMADS1의 염기서열에 비교한 도면으로 염기서열 위의 숫자는 SRD1 cDNA의 염기서열 번호를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자의 발현양상을 조사하기 위해 사용하였던 고구마 조직들(A)과 고구마 식물에서의 발현양상(B)을 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자에 의해 생산된 SRD1 단백질의 세포 내 발현 위치를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자의 저장뿌리 내 발현양상을 나타내는 도면으로, (A, B, C) 고구마 어린 저장뿌리의 cross-section, (D, E, F) Sense riboprobe로 혼성화 시킨 cross-section, (G, H, I) Anti-sense riboprobe로 혼성화 시킨 cross-section을 나타내고, PC는 primary cambium; SC는 secondary cambium; PH는 primary phloem이다.
도 7은 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자의 발현이 외부에서 처리하는 IAA에 의해 조절됨을 나타내는 도면이다.
도 8은 고구마의 저장뿌리 발달 초기에 증가되는 내부 IAA 함량에 의해 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자의 발현 양이 증가함을 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자 cDNA가 삽입된 고구마 형질전환체에서 유전자 삽입을 확인한 도면으로, M는 사이즈 마커; C는 positive control (전장 SRD1 cDNA를 함유하고 있는 pMBP1); WT는 wild-type이다.
도 10은 본 발명에 의한 고구마 유래 SRD1 유전자 cDNA가 삽입된 고구마 형질전환체에서 SRD1 유전자의 발현을 확인한 도면으로, 상위 열은 실뿌리의 cross-section이고, 하위 열은 해당 상위 열의 중심주 내부를 확대한 것이며, MPH는 metaphloem; MX는 metaxylem; PC는 primary cambium; SC는 secondary cambium; PXY는 protoxylem이다.
도 11은 본 발명에 의한 고구마 SRD1 cDNA가 삽입된 고구마 형질전환체의 뿌리 생장을 야생종과 비교한 도면이다.
도 12는 본 발명에 의한 고구마 SRD1 cDNA가 삽입된 고구마 형질전환체 뿌리의 세포 분화 정도를 야생형과 비교한 도면이다.
도 13은 본 발명에 의한 고구마 SRD1 cDNA가 삽입된 고구마 형질전환체의 저장뿌리 생산 능력을 야생종과 비교한 도면이다.
도 14는 본 발명에 의한 고구마 SRD1 cDNA가 삽입된 애기장대 형질전환체의 생장 및 발달을 야생종과 비교한 도면이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고구마 SRD1 유전자 cDNA 의 염기서열 분석

고구마의 어린 괴근에서 RNA를 추출하여 EST (Expressed Sequence Tag) 라이브러리를 구축한 후 2,859개의 EST를 클로닝하여 NCBI에 등록하였다 (NCBI accession numbers: BU690119 - BU692977, You et al., 2003, FEBS Letters 536, 101-105). 이 들 EST 중, MADS-box 단백질을 코딩하는 cDNA가 확인이 되었으며, 이 cDNA의 염기서열을 결정하여 분석한 결과 93 bp의 5‘ 비 번역지역, 654 bp의 ORF (Open Reading Frame, 217개 아미노산), 그리고 255 bp의 3’ 비 번역지역을 포함하고 있는 전체 1,002 bp로 구성되어 있었다. 이 전장 cDNA를 NCBI에 ‘a sweetpotato MADS-box cDNA’라는 이름으로 등록하였으며 (NCBI accession no.FJ237529), 이 후 SRD1 ( S torage R oot D evelopment related gene 1)으로 다시 명명하였다 (Noh et al., 2010, J. Experimental Botany, doi:10.1093/jxb/erp399).

SRD1 염기서열은 앞서 보고된 IbMADS1 cDNA (Ku et al., 2008, Annals of Botany 102,57-67) 와 99%의 상동성을 보였다 (도 1). IbMADS1 cDNA의 염기서열(서열번호 4)과 비교했을 때 SRD1의 5' UTR이 33 bp 짧았으며 3' UTR은 SRD1이 30 bp 길었다. ORF 내의 염기서열을 비교했을 때, SRD1의 180번째 염기가 thymine에서 guanine으로 변경된 SNP (single nucleotide polymorphism), 그리고 염기서열 558번과 559번 사이에 3개의 염기가 결실 (deletion) 되어 있었다. 결과적으로 IbMADS1 아미노산 서열(서열번호 5)과 비교했을 때, SRD1의 29번 아미노산 페닐알라닌 (phenylalanine)이 류신 (leucine)으로 변경되었으며, SRD1의 아미노산 서열 155번째와 156번째 사이에 한 개의 아미노산 (IbMADS1에서는 glutamine)이 분실된 것을 확인하였다 (도 2).

SRD1이 IbMADS1의 대립유전자 변종 (allelic variant)인지 아니면 IbMADS1과는 다른 독립적인 유전자인지 확인하기 위해, 우선 본 실험에서 공시 재료로 사용하였던 진홍미 고구마(Ipomoea batatas cv.‘Jinhongmi’)의 게놈 (genome) 상에서 IbMADS1의 존재 여부를 조사하였다. 앞서 보고된 고구마 저장뿌리 비대 초기 cDNA 라이브러리에서 분리된 2,859 개의 EST (You et al., 2003, FEBSLetters 536,101-105) 중에 11개의 MADS-box 염기서열이 확인되었다. 이들의 염기서열을 비교한 결과 9개의 클론들은 SRD1과 동일한 염기서열이었으며, 2개는 IbMADS1과 동일한 염기서열이었다 (도 3). 이러한 결과는 SRD1과 IbMADS1 두 가지 유전자 모두 진홍미 고구마의 게놈 (genome) 상에 존재하고 있는 독립적인 유전자임과 동시에 두 유전자 모두 저장뿌리에서 발현하고 있음을 의미한다. 그리고 또한 SRD1이 저장뿌리 발달 초기에는 major MADS-box 유전자임을 시사한다.

실시예 2: SRD1 의 발현 양상 분석

① Northern 분석 방법

SRD1의 발현 양상을 확인하기 위해 저장뿌리가 발달하기 전 (FR stage)의 개체로부터 실뿌리(FR; Fibrous root (diameter <0.2 cm)), 줄기, 잎 및 엽병 그리고 저장뿌리 발달 초기 (YSR stage)의 개체로부터 뿌리(YSR; Young Storage Root (diameter 0.5 ~ 1.0 cm)), 줄기, 잎, 엽병, 그리고 저장뿌리가 완전히 성장하고 난 후의 개체(MSR stage)로부터 실뿌리조직(FR-MSR; Mature Storage Root (diameter >5.0 cm))(도 3 참조)으로부터 전체 RNA를 4.4M guanidinium-SDS lysis buffer (chirgwin et al., 1979)와 5.7M CsCl gradient method (Glisin et al., 1974)를 사용하여 추출한 후 약 25㎍의 전체 RNA (total RNA)를 1% 아가로즈-포름알데히드 겔(agarose-formaldehide gel)에 전기영동하고, Tropilon-plus^TM (Tropix, USA) 나일론막(nylon membrane)에 전이(transfer)시켰다.

프로브(Probe)는 1kb SRD1 cDNA를 함유하고 있는 2.5ng의 플라스미드(plasmid), dCTP를 제외한 100μM dNTP mix, 100μM의 dCTP-biotin, 10μM의 벡터(pBluescript II) 프라이머 T3 (5‘-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3';서열번호 6) 와, T7 (3'- CGGGATATCACTCAGCATAATG-5';서열번호 7), 1× PCR 버퍼(buffer)와 1 unit의 Taq 폴리머라제(polymerase)를 각각 첨가하여 최종부피가 10㎕되도록 조정하고, 95℃에서 5분간 처리하여 95℃에서 5분간 처리하여 95℃ 30초, 58℃ 20초, 72℃ 30초를 30회 증폭하여 제작하였다.

상기 PCR로 증폭된 비오틴으로 표지된 프로브(biotinylated probe)는 QIAquickTM PCR purification kit (QIAGEN, Germany)로 정제하였고, 약 100ng을 막(membrane)에 첨가하여 65℃ 혹은 68℃에서 18시간 동안 혼성화(hybridization)하였다. 2× SSC/1% SDS를 실온에서 5분 2차례, 0.1× SSC/1% SDS로 15분 2차례, 그리고 1× SSC로 실온에서 5분 2차례 처리하였다. 프로브 검출(Probe detection)은 Southern-starTM kit(Tropix,USA)를 사용하여 실시하였다. 블럿(Blot)을 블럭킹 버퍼(blocking buffer) (1× PBS, 0.2% I-Block^TM Reagent와 0.5% SDS)로 처리한 후, 스트렙타비딘 결합 알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase conjugated streptavidin)를 붙여준 다음 CDP-StarTMReady-to-Use를 처리해 주었다. 막(Membrane)은 X-ray film (Fujifilm, Japan)에 10분 ~ 1시간 30분간 노출하였다.

② SRD1 의 발현 양상 확인

약 1kb의 고구마 SRD1 클론을 PCR을 이용하여 바이오틴 표지화(biotin labeling)를 시킨 후 노던(Northern) 분석에 탐침으로 사용하였다. SRD1은 저장뿌리 발달 전과 저장뿌리가 완전히 발달한 개체의 실뿌리 (fibrous root) 조직에서 확인되었으며, 저장뿌리 발달 초기의 어린 저장뿌리에서 그 발현 양이 증가하였다. 지상부에서는 어떤 발달 단계에서도 발현하지 않았다 (도 4). 즉 이러한 발현 양상은 SRD1이 뿌리 특이적으로 발현하고 있으며, 그 발현 양이 저장뿌리 발달 초기에 더욱더 증가함을 나타낸다.

실시예 3: 세포내 SRD1 유전자의 발현 위치 분석

SRD1의 세포내 발현 부위를 확인하기 위해 양파 세포를 이용한 세포내 분포 (subcellular localization) 관련 실험을 수행하였다. SRD1의 코딩 염기서열 (651 bp)을 SRD1-103 (5´-CATCCCGGGATGGGGAGGGGCAAG-3´: 서열번호 8)과 SRD1-920R (5´- GTGAGCTCCACTGCCATAAGACCACAAGG-3´: 서열번호 9) 프라이머를 사용하여 증폭한 후 smGFP와 프레임에 맞게 삽입하여 CaMV35S에 의해 조절 받는 SRD1 :: GFP 벡터를 완성하였다. 일시적 형질전환은 Chiu 등 (1996,Current Biology 6, 325-330)의 방법으로 실시하였다. 양파의 표피 세포를 벗겨서 1/2 MS 배지 [half-strength MS salts (Duchefa), 0.3% phytagel(Sigma)] 위에 치상한 후 유전자 총(PDS-1000/He; Bio-Rad)을 이용하여 SRD1 :: smGFP 플라스미드 DNA (1 μg)을 양파의 표피 세포에 전달 (deliver) 하였다. 이때 stopping screen은 rupture disk의 3 cm 아래에 위치하고 양파 샘플은 stopping screen의 6 cm 아래에 위치하게 하였으며, 헬륨 (helium)의 압력은 1100 psi를 사용하였다. Bombardment 후에는 25℃ 암 상태에서 24 시간 동안 방치하였다. 녹색 형광은 형광현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰되었다.

GFP 유전자만으로 형질전환된 양파 세포에서는 세포 전체에서 녹색 형광을 관찰 할 수 있었는데, SRD1 :: GFP로 형질전환된 세포에서는 핵 안에서만 녹색 형광을 관찰할 수 있었다 (도 5). 이 결과는 SRD1이 핵에 위치하고 있으며, 다른 MADS-box 유전자에서 확인된 바와 같이 SRD1 역시 전사 인자로 작용할 가능성을 시사하고 있다.

실시예 4: 저장뿌리에서 SRD1 유전자의 발현 부위 분석

SRD1의 저장뿌리 조직 내 발현 부위를 확인하기 위해 in situ hybridization을 실시하였다. 이를 위해 직경이 0.5 cm 인 저장뿌리의 횡단면을 잘라서 FAA 용액 (50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% formaldehyde)에 4℃에서 10일간 처리한 후, 샘플을 연속적으로 높아지는 농도의 에탄올로 (50, 60, 70, 80, 90, 95, 100%) 30분씩 탈수시킨 후 파라핀에 5일간 임베딩 (embedding) 시켜 10 μm 두께로 섹션 (section) 하였다. 섹션 (section)을 일련의 처리 (hydration, proteinase K 처리, acetylation, dehydration)를 거친 후 크실렌 (xylene)으로 처리하였다. 전장 SRD1 cDNA를 프로브로 이용하였다. DIG RNA labelling kit (Roche Dianostics)를 이용하여, Digoxigenin (DIG)-표지 센스 및 안티센스 SRD1 프로브를 T3 및 T7 RNA 폴리머라제로 합성하여 프로브를 표지(labelling) 하고, 혼성화 (hybridization)과 검출 (detection)은 Shin 등 (2006, Planta 224,32-41)의 방법으로 수행하였다. SRD1 mRNA의 발현(accumlation)을 CCD 카메라(DP70; Olympus)가 장착된 일반광학현미경(BX51; Olympus)으로 분석하였다.

SRD1의 mRNA는 저장뿌리의 유관속 조직과 형성층에 주로 분포하고 있었는데, 그 중에서도 일차 형성층 (PC; primary cambium), 체관 (PH; phloem), 그리고 이차 형성층 (SC; secondary cambium)에서 강하게 발현하고 있었다 (도 6). 일차 형성층과 이차 형성층은 고구마의 저장뿌리가 초기 비대 성장을 할 때 가장 활발히 세포 분열이 일어나는 곳임을 감안할 때 SRD1의 이러한 발현 양상은 SRD1이 고구마 저장뿌리 비대 성장 초기에 관련되어 있음을 시사하고 있다.

실시예 5 : 오옥신 처리에 의한 SRD1 의 발현 조절 분석

SRD1 유전자의 오옥신(Indole-3-acetic acid; IAA) 처리에 의한 전사 조절을 조사하기 위해 먼저 SRD1-특이적인 프라이머를 결정하였다. 이를 위해 포워드 (forward) 프라이머의 3‘ 말단에는 염기서열 180번째 (SRD1과 IbMADS1 사이에 SNP가 존재하는 부위)를 포함시키고, 리버스 (reverse) 프라이머의 3’ 말단에는 3 bp 결실 (deletion)이 있는 부위를 포함시켜 두 가지 프라이머 (5'-AGAGGAGAAATGGGTTGTTTA-3'(서열번호 10) 및 5'-GTGCACGAAACTCCCCTT-3'(서열번호 11))를 제작하였다 (도 1 참조). 이들 프라이머를 사용하여 58℃의 프라이머 어닐링 (annealing) 온도를 사용하여 PCR 증폭하였을 시에 SRD1 염기서열만 증폭을 하고 IbMADS1 염기서열은 증폭하지 않음을 확인한 후 차후에 진행되는 PCR 분석에 사용하였다.

고구마 뿌리에 다음과 같은 방법으로 오옥신을 처리하였다. 단일 엽병에 단일 잎이 달린 고구마를 채취하여 물이 채워진 플라스크에 3 주간 담가 두었다. 엽병의 말단에서 실뿌리가 발달하면 이것들을 다양한 농도 (0, 50, 500, 1000, 2000 μM)의 IAA 용액으로 옮겨 25℃, 암 상태에서 다양한 기간 동안 (0-24 h) 방치하였다. 처리 후 RNeasy Plant Mini Kit^TM (Quiagen)를 사용하여 전체 RNA를 추출하여 실시간 (real-time) RT-PCR 분석에 이용하였다.

전체 RNA (5 μg)을 SuperScript III first-strand cDNA synthesis kit (Invitrogen)를 사용하여 first strand cDNA를 합성한 후 30 μl TE에 희석하여 PCR에 사용하였다. 실시간 (Real-time) PCR은 LightCycler 480 quantification system (Roche diagnostics)를 사용하여 실시하였으며, 발현 정도는 5´-CAACTACCAGCCACCAACTGT-3´(서열번호 12) 와 5´-CAGATCCTCACGAGCTTCAC-3´(서열번호 13) 프라이머를 사용하여 증폭되는 고구마 β- tubulin 발현 양으로 보정 (normalize)하였다. 실시간 (Real-time) PCR은 처음에 95℃에서 10분간 처리한 후, 45회의 95℃ 10초, 58℃ 10초, 72℃ 20초를 반복하였다. Melting 곡선 분석은 65℃-97℃에서 수행하였으며, LightCycler 480 quantification software (Roche Diagnotics)의 second derivative maximum method를 사용하여 데이터를 취하였다.

다양한 농도 (0, 50, 500, 1000, 2000 μM)의 IAA를 3 시간동안 처리하였을 경우 SRD1 mRNA 수준이 조절되는 양상을 보였는데 (도 7의 A), 50μM 과 500μM의 IAA에서는 SRD1의 전사물 수준이 다소 감소한 반면 1000μM의 IAA 처리에서는 SRD1의 전사물 수준이 상당히 증가하였다. 2000μM IAA 처리에서는 전사물 수준이 다시 감소하여 IAA를 처리하지 않은 대조구와 비슷한 정도의 수준을 보였다. 한편, 500μM의 IAA를 다양한 시간 (0, 0.5, 1, 3, 6, 12, 24 시간) 동안 처리한 결과 처리 후 6시간째 SRD1의 전사물 수준이 크게 증가하였다. 하지만 0.5, 1, 3, 12, 24 시간 처리 구에서는 오히려 그 전사물의 수준이 대조구에 비해 감소하였다 (도 7의 B). 이러한 결과들은 SRD1의 전사물 수준이 외부에서 처리한 IAA에 의해 영향을 받지만 전사물의 수준이 증가하는 반응은 특이한 농도와 시간대에서만 일어남을 시사하고 있다.

실시예 6 : 고구마 저장뿌리 발달 단계에 따른 SRD1 유전자의 발현 조절

상기에서 SRD1의 전사물 수준이 IAA 농도에 의해 조절됨을 확인하였기에 고구마 저장뿌리 발달 단계에 따른 IAA 농도와 그에 따른 SRD1의 전사물 수준을 분석하였다.

고구마 뿌리의 IAA 농도를 측정하기 위해 직경이 1.0, 1.5, 3.0, 5.0 mm 되는 뿌리를 채취하여 Boonplod (2005, PhD thesis, University of Hohenheim, Stuttgart, Germany) 방법으로 IAA 농도를 측정하였다. 동결건조된 10 g 고구마 샘플을 80% 차가운 메탄올 (50 ml)에서 분쇄한 후 4℃, 암 상태에서 밤새 (overnight) 동안 방치하였다. 메탄올 추출물을 진공 건조기를 사용하여 완전히 농축시킨 후 4 mL 0.01 M 암모늄 아세테이트 (ammonium acetate, pH 9.0)에 녹인 후 20,000 rpm에서 20분간 원심 분리하였다. 상등액을 10 mL 폴리비닐피롤리돈 ( polyvinylpyrrolidone; PVP; Sigma)과 4 mL DEAE-Sephadex A-25 (Sigma)로 채운 칼럼에 로딩 한 후 0.1 M 아세트산 (acetic acid)을 사용하여 free IAA를 함유하고 있는 음이온 화합물 (anionic compound)을 용리 (elute) 시킨 후 C₁₈Sep-PaKcartridge(Sigma)에 통과시켜 다시 정제하였다. 4 mL의 0.1 M 아세트산 (acetic acid)에 용해된 40% 메탄올 (methanol)을 사용하여 IAA를 용리 (elute) 시켜 메탄올을 증발시키고 나머지를 IAA 양 측정에 사용하였다. Phytodetek™-IAA immunoassay detection kit (Agdia Inc., ID, USA)를 이용하여 IAA 양을 측정하였다.

고구마 뿌리의 직경이 1.0 mm에서 5.0 mm로 증가하는 동안 고구마 내부의 IAA 함량도 점진적으로 증가하여서, 직경이 5 mm인 뿌리의 IAA 함량은 직경이 1.0 mm인 뿌리의 IAA 함량에 비해 4배 정도 증가하였다 (도 8의 A).

이렇게 증가한 IAA 함량이 SRD1의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 직경이 1.0, 1.5, 3.0, 5.0 mm 뿌리를 채취하여 You 등 (2003, FEBS Letters 536, 101-105)의 방법으로 전체 RNA를 추출하여 실시간 RT-PCR (real time RT-PCR) 분석에 이용하였다. 실시간 RT-PCR 방법은 실시예 5에서 사용한 방법과 동일하였다.

고구마 뿌리의 직경이 커질수록 증가하는 IAA 함량에 반응하여 SRD1의 전사물 수준도 증가하였다 (도 8의 B). 하지만 뿌리의 직경이 1 mm에서 5 mm로 증가하는 동안 IAA 함량은 점진적으로 증가하는데 반해, SRD1의 전사물 수준은 직경이 1 mm-3 mm 뿌리에서 거의 변화가 없었으며 직경이 5 mm인 뿌리에서만 그 수준이 약 3.5 배 증가하였다. 이러한 결과는 SRD1의 전사를 유도하기 위해서 필요한 최소 IAA 농도가 존재함을 의미하며, 뿌리의 직경이 5 mm로 발달하였을 때 비로소 그 필요 농도에 도달했음을 알 수 있다. 또, 직경이 5 mm에 이르렀을 때 비로소 저장뿌리의 형태적 특징인 이차 형성층이 나타낸다는 이전의 보고들 (Wilson and Lowe, 1973, Annuls in Botany 37, 633-643; Nakatani and Komeichi, 1991, Japanese Journal of Crop Science 60, 91-100)을 고려할 때 SRD1 유전자의 기능이 오옥신에 의해 매개되는 이차형성층의 발달에 관여함을 시사한다.

실시예 7 : 바이너리 벡터 제작 및 고구마 형질전환

고구마 내에서 SRD1 유전자의 기능을 직접적으로 분석하기 위해 과다발현용 바이너리 벡터를 제작하였다. 전장 SRD1 cDNA를 T3와 T7 프라이머로 증폭한 후 pMBP1 바이너리 벡터의 BamHI과 KpnI 인식 부위에 삽입하고 이 벡터를 아그로박테리움 GV3101에 형질전환시켜 고구마 형질전환에 사용하였다. 율미 고구마의 정단 분열 조직으로부터 배 발생 캘러스를 유도한 후 1 mg/L 2,4-디클로로페녹시아세틱액시드 (2,4-dichlorophenoxyaceticacid; 2,4-D), 3% 수크로오스 (sucrose)와 0.4% 젤라이트 (gelrite)를 함유한 MS 배지 (MS1D)에 치상한 후 25℃ 암 상태에서 배양하였으며, 동일한 배지에 4주 간격으로 계대 배양하여 증식하였다. 상기 벡터를 함유하고 있는 아그로박테리아와 공동 배양한 후 배 발생 캘러스를 100 mg/L 카나마이신 (kanamycin)과 400 mg/L 크라포란 (claforan)을 함유하고 있는 MS1D 배지에 치상한 후 25℃ 암 상태에서 4-5 개월 동안 배양하였으며 3주마다 계대 배양하였다. 카나마이신에 저항성을 보이는 캘러스를 100 mg/L 카나마이신 (kanamycin)을 함유하며, 호르몬이 제거된 배지로 옮겨 체세포 배를 유도하였다. 재분화된 식물체는 동일 배지 25℃, 16/8 시간 (빛/암) 조건에서 배양하였다.

실시예 8 : 고구마 형질전환체 확인 및 발현 분석

기내 배양 고구마 형질전환체의 잎으로부터 게놈 DNA를 분리한 후 SRD1-특이 프라이머와 (5'-CTTTAATAAGTTTCAGGCATATGG-3': 서열번호 14)와 NOS 터미네이터 (NOS terminator) 프라이머 (5'-CGCGCGCGATAATTTATCC- 3': 서열번호 15)를 사용하여 PCR 증폭하여 형질전환체 여부를 확인하였다 (도 9).

형질전환체에서 SRD1의 발현 양을 확인하기 위해 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 형질전환체의 실뿌리에서 전체 RNA를 추출하였다. SuperScript III first-strand synthesis supermix (Invitrogen)을 사용하여 first-strand cDNA를 합성하여 RT-PCR에 사용하였다. SRD1-특이 프라이머 (5´- AGAGGAGAAATGGGTTGTTTA -3´(서열번호 16); 5´- GTGCACGAAACTCCCCTT -3´(서열번호 17))를 사용하여 95℃에서 5분간 변성 (denature) 시킨 후 94°C 30초 , 58°C 30초, 그리고 72°C 30초를 30회 반응한 후 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 고구마 β- tubulin 유전자를 내부 대조구로 사용하였다. 형질전환체 #1에서는 SRD1의 발현이 약하게 증가하였고 #2, #3, #4, #5에서는 SRD1의 발현이 강하게 증가하였다 (도 10). 이들 중 #1과 #3을 선택하여 표현형 분석을 하였다.

실시예 9 : 형질전환 고구마의 뿌리 성장 분석

SRD1 고구마 형질전환체의 뿌리 성장을 야생형(wild type)과 비교하였다. 이를 위해 기내 배양한 형질전환체로부터 잎이 2-3개 달린 정단 부위를 잘라서 MS 배지에서 25℃, 장일 조건으로 14일간 배양하였다. SRD1-ox (overexpressing) #1과 #3는 야생형에 비해 직경이 크고 길이가 짧은 실뿌리를 생산하였으며, 실뿌리의 개수도 형질전환체에서는 감소하였다 (도 11 및 표 1).

이렇게 차이 나는 형질전환체의 뿌리 성장을 세포 차원에서 관찰하기 위해 가장 직경이 큰 실뿌리를 채취해서 뿌리의 정단 부위로부터 1 cm 부위에서 크로스-섹션 (cross-section)을 준비하였다. 뿌리 샘플을 0.1 M 소디움 포스페이트 (sodium phosphate) 버퍼, pH 7.0에 2% (w/v) 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)와 2% (v/v) 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)를 섞어서 4℃에서 10일간 고정시킨 후 샘플을 0.1 M 소디움 포스페이트 (sodium phosphate) 버퍼에 5분간 두 번 세척하고, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 100% 에탄올에 순서대로 탈수 시킨 후 아크릴 레진 (LR White; London Resin Company)에 5일간 포매시켜 1.0 μm 두께로 절단하였다. 섹션 (Section)을 1% 사프라닌(safranin) O에 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.

형질전환체에서는 야생형에 비해 세포 분열이 현저히 증가되어 있었다. 특히 중심 주 내부에 있는 일차 형성층(PC) 세포와 후생목부 (metaxylem; MX) 세포의 분열이 증가하여 결과적으로 이들 세포의 개수가 현저히 증가하였다 (도 12 및 표 2). 이러한 세포 분열의 증가는 #1 형질전환체에 비해 #3 형질전환체에서 더욱더 심화되었는데, 이 결과는 이러한 세포 분열의 증가가 과다발현된 SRD1에 기인하고 있음을 시사한다. 특별히, SRD1의 발현이 강하게 증가된 #3 형질전환체에서는 원생목부 (protoxylem; PXY) 세포 주위로 형성층 세포의 분열이 관찰되어 이차 형성층(SC)이 형성되고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 양상의 세포 증식 (metaxylem 세포 분열, 일차 형성층 세포 분열)은 고구마의 실뿌리가 저장뿌리로 발달되는 비대 초기에 나타나는 현상이며, 이차 형성층은 고구마의 저장뿌리에서만 관찰되는 특이한 구조임을 감안할 때, 이들 결과들은 SRD1이 형성층 세포와 후생목부 (metaxylem) 세포의 분열을 촉진하여 고구마의 저장뿌리 발달 초기의 비대 성장에 관련하고 있음을 시사한다. 아래 표 1은 실뿌리의 부피 성장에 대한 SRD1 과발현의 효과를 나타내고, 표 2는 실뿌리에서 세포 분열에 대한 SRD1 과발현의 효과를 나타낸다.

Root area	WT ^a D ^b (㎛)	1		3
Root area	WT ^a D ^b (㎛)	D ^b (㎛)	Rate ^c	D ^b (㎛)	Rate ^c
Cortex+stele ^d	640±35	1064±55	1.66±0.02	1400±37	2.12±0.06
Cortex ^e	480±27	784±48	1.64±0.01	1024±42	2.10±0.03
Stele ^f	160±13	280±11	1.68±0.07	376±22	2.30±0.05

^aWild type.

^bDiameter measured with transverse sections of fibrous roots.

^cExpansion rate relative to the wild type.

^dDetermined by measuring the largest diameter on the circle enclosed by epidermal cells.

^eCalculated by subtracting the diameter of the stele from thediameter of the cortex and stele.

^fDetermined by measuring the largest diameter on the circle enclosed by endodermis cells.

Cell type	WT ^a No.of cells ^b	1		3
Cell type	WT ^a No.of cells ^b	No.of cells ^b	Rate ^c	No.of cells ^b	Rate ^c
Cortex	232±18	503±39	2.17±0.00	570±15	2.46±0.12
Stele ^d	140±3	432±2	3.08±0.05	538±11	3.84±0.01
Metaxylem ^e	26±3	108±13	4.15±0.32	127±5	4.88±0.33
Cambium	44±6	100±7	2.27±0.13	161±35	3.66±0.26

^aWild type.

^bCounted on transverse sections of fibrous roots.

^cProliferation rate relative to the wild type.

^dNumbers of entire cells inside endodermis cells.

^eNumbers of metaxylem cells including mature and immaturemetaxylem cells.

실시예 10: 형질전환 고구마의 저장뿌리 생산 분석

형질전환 고구마의 저장뿌리 생산을 비교하기 위해, 재분화된 어린 형질전환 식물체를 토양으로 옮겨 순화 과정을 거친 후 온실에서 4 개월 동안 재배하였다. SRD1-ox #3 형질전환체의 경우 야생형에 비해 더 많은 저장뿌리를 생산하여 결과적으로 SRD1-ox #3에서 생산된 저장뿌리의 개수가 야생형에 비해 2배 정도 증가하였다 (도 13). 또한, 야생형에서는 발달된 저장뿌리의 크기가 다양하였으나, 형질전환체에서 발달된 저장뿌리의 크기는 매우 균일하였다. 한편, 저장뿌리가 발달하는 부위에도 차이가 있었다. 고구마 실뿌리의 발달이 시작된 지점과 저장뿌리의 최상부 (proximal end) 사이를 뿌리줄기 (root stem)라고 정의할 때 (도 13의 *), SRD1-ox #3의 뿌리줄기 길이가 현저히 감소하여서 야생형에 비해 약 1/5 수준이었다. 형질전환체에서 저장뿌리 개수의 증가는 저장뿌리의 비대 성장에 관여하는 SRD1의 과다 발현으로 인해 형질전환체에서 저장뿌리의 발달이 촉진되었음을 시사하며, 형질전환체에서 뿌리줄기 길이의 감소는 형질전환체에서 저장뿌리의 발달이 야생형에 비해 더 일찍 시작되었음을 시사한다. 결과적으로 저장뿌리의 비대 성장에 관여하는 SRD1 유전자를 과다발현시켜 다수성 (多數性)의 고구마 형질전환체를 생산하였다.

따라서 본 발명에 의한 SRD1 cDNA는 저장뿌리의 발달이 촉진된 형질전환 식물체, 특히 저장뿌리의 개수가 증가된 형질전환 식물체 생산 등에 효과적으로 이용될 수 있다.

실시예 11: SRD1 의 애기장대 형질전환체 제작 및 분석

SRD1과 IbMADS1이 염기서열상의 매우 높은 상동성을 가지고 있기 때문에 기능적으로 동일한 기능을 하는 유전자인지 여부를 확인하고자 SRD1 애기장대 형질전환체를 제작하였다. 실시예 5에서 제작된 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens C58C1)에 냉-해동(Freeze-thaw) 방법(An, G. 1987, Methods in Enzymology)으로 도입하였다.

형질전환된 아그로박테리아(Agrobacteria)는 2일 동안 28℃에서 진탕 배양한 후, 플로랄딥(floral dip) 방법 (Clough 와 Bent, 1998, The Plant Journal)에 근거하여 애기장대(Arabidopsis thaliana cv. columbia)의 개화직전 암술머리에 접종하여 애기장대 식물체를 형질전환시켰다.

애기장대 형질전환체로부터 종자를 수확한 다음, 카나마이신(kanamycin, 30 mg/L)을 함유하는 MS 배지에 도말하여 저항능을 가진 형질전환 식물체 (T1)를 선별하여 SRD1 cDNA가 싱글 카피(single copy)로 도입되어 카나마이신 저항성에 대한 분리비가 3:1로 나타내는 T2 식물체를 구별하여 동형접합 종자(homozygous seed)를 확보하였다. 이들 종자를 토양에 파종하여 형질전환체의 성장을 야생형과 비교하였다.

형질전환체는 야생형에 비해 꽃대의 길이가 짧고, 꽃의 크기가 작은 반면에 꽃대의 개수는 현저히 증가하였으며 이로 인해 개화기간도 더 오래 지속되었다 (도 14). 형질전환체의 뿌리는 야생형에 비해 뿌리털의 발달이 촉진되어 뿌리털의 개수 및 길이가 증가하였다. 한편, Ku 등 (2008, Annals of Botany 102,57-67)은 IbMADS1 과다발현 애기장대 형질전환체에서 꽃 조직의 형태나 개화 시기를 야생형과 비교했을 시에 차이가 없었다고 보고하였다. 결론적으로 SRD1 과다발현 애기장대 형질전환체의 표현형과 IbMADS1 과다발현 애기장대 형질전환체의 표현형은 일치하지 않았으며, 이 결과는 SRD1과 IbMADS1이 기능적으로 다른 역할을 하는 유전자라 할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며,이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Industrial and Academic Collaboration Foundation <120> Sweetpotato SRD1 cDNA and high-numbered transgenic plants using the same <130> P11-100315-01 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1002 <212> DNA <213> Ipomoea batatas cv. Jinhongmi <400> 1 ctagcgtctt caacaattct accctactat catcccccaa gacttccccg accagctgca 60 gaaaacccca tcccagaaat agggaggaga aggatgggga ggggcaaggt tgaaattagg 120 aggatcgaaa agtcgaccaa caggcgagtc accttctgga agaggagaaa tgggttgttt 180 aagaaggcta tggagatggg gattctgtgc gatgctgaag tgggattgat gatcttctcc 240 agcacaggga agctccatga attcgcaaca actagcatca gatccgtaat tgaacgctac 300 aacaagacac aaggtgacag ccttcaatcc cctctggacc caacattaga actcaagttt 360 tggcaaatag aagtagcaat tctgaggcaa caattacaca acatgcaaga agatcatcgg 420 aaagtaatgg gagaagtcta tgggctgagt gttaaagacc tgcagaatct tgaaaaccaa 480 ctggaaatga gtttgagcgg catcagaatg aagaaggaac aaatactaat tgaacagatt 540 caagaactaa cccacaaggg gagtttcgtg caccaggaaa actttgaact ctttaataag 600 tttcaggcat atggcacaag tgacccaaat gcagtgaatg gggacaccat ttctccatat 660 gacttcacca ttagtgaaga atcccaaggc cacatacatt tccagcttcc tcaaaacttc 720 agcgatctag ccagagcatt atattagact caacgtaaat gatgcagctg ctgatgaata 780 aaattcaaga gaaattattc cgagtgatgg tgggccgtgg aaactccaag tatgggatgg 840 tggactatcc tctattaaaa tatcaaatgt acctgagaat ataatcttct ccttgtggtc 900 ttatggcagt gtttttgaat tgtgggattc gtgtgttttg agttgtatgt aggtttttaa 960 attggtgttt gatgttaaat aaactgatcg agcttaactg tt 1002 <210> 2 <211> 217 <212> PRT <213> Ipomoea batatas cv. Jinhongmi <400> 2 Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Ile Arg Arg Ile Glu Lys Ser Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Val Thr Phe Trp Lys Arg Arg Asn Gly Leu Phe Lys Lys Ala 20 25 30 Met Glu Met Gly Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Met Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu His Glu Phe Ala Thr Thr Ser Ile Arg Ser 50 55 60 Val Ile Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Gln Gly Asp Ser Leu Gln Ser Pro 65 70 75 80 Leu Asp Pro Thr Leu Glu Leu Lys Phe Trp Gln Ile Glu Val Ala Ile 85 90 95 Leu Arg Gln Gln Leu His Asn Met Gln Glu Asp His Arg Lys Val Met 100 105 110 Gly Glu Val Tyr Gly Leu Ser Val Lys Asp Leu Gln Asn Leu Glu Asn 115 120 125 Gln Leu Glu Met Ser Leu Ser Gly Ile Arg Met Lys Lys Glu Gln Ile 130 135 140 Leu Ile Glu Gln Ile Gln Glu Leu Thr His Lys Gly Ser Phe Val His 145 150 155 160 Gln Glu Asn Phe Glu Leu Phe Asn Lys Phe Gln Ala Tyr Gly Thr Ser 165 170 175 Asp Pro Asn Ala Val Asn Gly Asp Thr Ile Ser Pro Tyr Asp Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Glu Glu Ser Gln Gly His Ile His Phe Gln Leu Pro Gln Asn 195 200 205 Phe Ser Asp Leu Ala Arg Ala Leu Tyr 210 215 <210> 3 <211> 654 <212> DNA <213> Ipomoea batatas cv. Jinhongmi <400> 3 atggggaggg gcaaggttga aattaggagg atcgaaaagt cgaccaacag gcgagtcacc 60 ttctggaaga ggagaaatgg gttgtttaag aaggctatgg agatggggat tctgtgcgat 120 gctgaagtgg gattgatgat cttctccagc acagggaagc tccatgaatt cgcaacaact 180 agcatcagat ccgtaattga acgctacaac aagacacaag gtgacagcct tcaatcccct 240 ctggacccaa cattagaact caagttttgg caaatagaag tagcaattct gaggcaacaa 300 ttacacaaca tgcaagaaga tcatcggaaa gtaatgggag aagtctatgg gctgagtgtt 360 aaagacctgc agaatcttga aaaccaactg gaaatgagtt tgagcggcat cagaatgaag 420 aaggaacaaa tactaattga acagattcaa gaactaaccc acaaggggag tttcgtgcac 480 caggaaaact ttgaactctt taataagttt caggcatatg gcacaagtga cccaaatgca 540 gtgaatgggg acaccatttc tccatatgac ttcaccatta gtgaagaatc ccaaggccac 600 atacatttcc agcttcctca aaacttcagc gatctagcca gagcattata ttag 654 <210> 4 <211> 1022 <212> DNA <213> Ipomoea batatas <400> 4 gatttccatg ttggtgtgaa caaccaccta aacctagcgt cttcaacaat tctaccctac 60 tatcatcccc caagacttcc ccgaccagct gcagaaaacc ccatcccaga aatagggagg 120 agaaggatgg ggaggggcaa ggttgaaatt aggaggatcg aaaagtcgac caacaggcga 180 gtcaccttct ggaagaggag aaatgggttg ttgaagaagg ctatggagat ggggattctg 240 tgcgatgctg aagtgggatt gatgatcttc tccagcacag ggaagctcca tgaattcgca 300 acaactagca tcagatccgt aattgaacgc tacaacaaga cacaaggtga cagccttcaa 360 tcccctctgg acccaacatt agaactcaag ttttggcaaa tagaagtagc aattctgagg 420 caacaattac acaacatgca agaagatcat cggaaagtaa tgggagaagt ctatgggctg 480 agtgttaaag acctgcagaa tcttgaaaac caactggaaa tgagtttgag cggcatcaga 540 atgaagaagg aacaaatact aattgaacag attcaagaac taacccacaa gcaggggagt 600 ttcgtgcacc aggaaaactt tgaactcttt aataagtttc aggcatatgg cacaagtgac 660 ccaaatgcag tgaatgggga caccatttct ccatatgact tcaccattag tgaagaatcc 720 caaggccaca tacatttcca gcttcctcaa aacttcagcg atctagccag agcattatat 780 tagactcaac gtaaatgatg cagctgctga tgaataaaat tcaagagaaa ttattccgag 840 tgatggtggg ccgtggaaac tccaagtatg ggatggtgga ctatcctcta ttaaaatatc 900 aaatgtacct gagaatataa tcttctcctt gtggtcttat ggcagtgttt ttgaattgtg 960 ggattcgtgt gttttgagtt gtatgtaggt ttttaaattg gtgtttgatg ttaaataaac 1020 tg 1022 <210> 5 <211> 218 <212> PRT <213> Ipomoea batatas <400> 5 Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Ile Arg Arg Ile Glu Lys Ser Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Val Thr Phe Trp Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 30 Met Glu Met Gly Ile Leu Cys Asp Ala Glu Val Gly Leu Met Ile Phe 35 40 45 Ser Ser Thr Gly Lys Leu His Glu Phe Ala Thr Thr Ser Ile Arg Ser 50 55 60 Val Ile Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Gln Gly Asp Ser Leu Gln Ser Pro 65 70 75 80 Leu Asp Pro Thr Leu Glu Leu Lys Phe Trp Gln Ile Glu Val Ala Ile 85 90 95 Leu Arg Gln Gln Leu His Asn Met Gln Glu Asp His Arg Lys Val Met 100 105 110 Gly Glu Val Tyr Gly Leu Ser Val Lys Asp Leu Gln Asn Leu Glu Asn 115 120 125 Gln Leu Glu Met Ser Leu Ser Gly Ile Arg Met Lys Lys Glu Gln Ile 130 135 140 Leu Ile Glu Gln Ile Gln Glu Leu Thr His Lys Gln Gly Ser Phe Val 145 150 155 160 His Gln Glu Asn Phe Glu Leu Phe Asn Lys Phe Gln Ala Tyr Gly Thr 165 170 175 Ser Asp Pro Asn Ala Val Asn Gly Asp Thr Ile Ser Pro Tyr Asp Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Glu Glu Ser Gln Gly His Ile His Phe Gln Leu Pro Gln 195 200 205 Asn Phe Ser Asp Leu Ala Arg Ala Leu Tyr 210 215 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 7 cgggatatca ctcagcataa tg 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 8 catcccggga tggggagggg caag 24 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 9 gtgagctcca ctgccataag accacaagg 29 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 10 agaggagaaa tgggttgttt a 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 11 gtgcacgaaa ctcccctt 18 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 12 caactaccag ccaccaactg t 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 13 cagatcctca cgagcttcac 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 14 ctttaataag tttcaggcat atgg 24 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 15 cgcgcgcgat aatttatcc 19 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 16 agaggagaaa tgggttgttt a 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 17 gtgcacgaaa ctcccctt 18

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 DNA.
제1항에 있어서, 상기 DNA는 고구마 SRD1 유전자의 cDNA에서 유래된 것임을 특징으로 하는 DNA.
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 서열을 포함하는 분리된 DNA.
제1항 기재의 DNA를 포함하는 식물 형질전환용 바이너리 벡터.
제1항 기재의 DNA 또는 제4항 기재의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
제1항 기재의 DNA 또는 제4항 기재의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체.
서열번호 3의 염기서열을 갖는 고구마 SRD1 유전자의 ORF(Open Reading Frame).
제7항 기재의 고구마 SRD1 유전자의 ORF를 포함하는 식물 형질전환용 바이너리 벡터.
제7항 기재의 ORF 또는 제8항 기재의 벡터에 의해 형질전환된 미생물.
제7항 기재의 ORF 또는 제8항 기재의 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체.
제7항 기재의 ORF에 의해 번역되며 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 분리된 단백질.
SRD1 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 저장뿌리 개수를 증가시키는 방법.
SRD1 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 저장뿌리의 비대 성장 시기를 촉진시키는 방법.
SRD1 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후, 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 균일한 크기의 식물 저장뿌리를 생산하는 방법.
저장뿌리 식물체에 오옥신을 처리하여 SRD1 유전자 발현을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 저장뿌리 발달을 조절하는 방법.