CN113881646B

CN113881646B - 参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1及其基因和应用

Info

Publication number: CN113881646B
Application number: CN202111139797.XA
Authority: CN
Inventors: 权威; 马锦绣; 庞斌双; 左静红; 王伟伟; 唐益苗; 高世庆; 张胜全; 张立平; 孙辉; 赵昌平
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-08-04
Anticipated expiration: 2041-09-28
Also published as: CN113881646A

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1及其基因和应用。本发明以小麦品种Fielder为实验材料，得到了小麦抗病TaFAH1基因，在小麦中过表达TaFAH1基因，显著提高了小麦品种Fielder对条锈菌的抗性，因此该基因参与抗病性反应，可作为抗病育种的候选基因，可用于抗病品种的选育，为小麦抗病育种提供有力保障。

Description

参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1及其基因和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1及其基因和应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)作为世界三大粮食作物之一，在全球大部分国家的饮食结构中占有重要的地位，我国是世界小麦的主产国也是最大的消费国。病虫害等生物胁迫的发生严重影响了小麦的产量和品质，培育抗病虫害的小麦品种是解决抗病虫和维护绿色生态最行之有效的办法，条锈病作为小麦上最主要的病害之一，常年引起10％左右的产量损失。培育和种植抗病品种是防治小麦条锈病最为经济、环保、有效的措施，随着转基因技术的发展，抗病相关基因的挖掘为小麦抗病品种的培育提供有力的技术支撑，具有重要的应用价值。

2-羟基脂肪酸(2-Hydroxy fatty acids,2-HFAs)主要存在于鞘脂中，特别是在高等植物中，2-HFAs包含在90％以上的复杂鞘脂中。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，FAH是拟南芥Bax抑制剂-1(AtBI-1)所必需的功能，它是一种内质网膜定位细胞死亡抑制因子，研究发现在拟南芥中2-HFAs与抗氧化应激有关，其中AtFAH1(2-羟基VLCFA)对氧化应激的响应尤为强烈。FAH基因编码的脂肪酸羟化酶基因在水稻中的表现为OsFAH1和OsFAH2催化鞘脂脂肪酸的2-羟基化，2-羟基鞘脂形成质膜微区。目前还未见小麦中同源基因的，本发明将小麦中同源基因进行克隆，并将该基因转化到小麦中，获得过表达小麦株系，对其进行条锈菌接种后发现，在该过表达株系对条锈菌具有一定条锈菌的抗性，说明该基因参与小麦条锈病的抗病性反应。

发明内容

本发明的目的是提供参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1。

本发明的再一目的是提供编码上述参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的提供上述参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1的应用。

根据本发明的参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1，来源于小麦品种Fielder，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO.1

1 MVAQAFTVDL DKPLVFQVGH LEEQYQDWVH QPIVSKEGPR FFANDVLEFL TRTKWWAVPL

61 IWLPVVCWCL NTSIQMGHTV PEVALMVVAG IFIWTLVEYV LHRYLFHIDT KSYWTNTAHY

121 LLHGCHHKHP MDGLRLVFPP TAAAILCYPF WNFVKLFTTT TTTPGVFGGG LLGYVIYDCT

181 HYYLHHAQPS SDPAKYLKKY HLNHHFRIQN KGFGITSTLW DHVFGTLPST KTADKSS*

本发明所提供的编码参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:2：

1 ATGGTTGCTC AAGCCTTTAC CGTCGATTTG GACAAGCCTC TTGTATTTCA GGTTGGTCAT

61 CTGGAGGAAC AGTATCAGGA CTGGGTTCAC CAGCCAATTG TTAGCAAAGA GGGGCCACGG

121 TTTTTTGCCA ATGATGTATT GGAGTTCTTA ACACGTACGA AATGGTGGGC AGTTCCTCTC

181 ATTTGGTTGC CTGTTGTTTG CTGGTGCTTG AATACATCAA TCCAAATGGG CCACACAGTT

241 CCAGAAGTAG CGCTGATGGT TGTGGCAGGA ATATTCATCT GGACACTGGT TGAATACGTG

301 CTGCATCGGT ACCTTTTCCA CATAGATACT AAAAGTTACT GGACAAACAC AGCTCACTAC

361 CTTCTGCATG GATGCCATCA CAAGCATCCA ATGGATGGAC TTCGACTTGT GTTTCCACCA

421 ACTGCTGCAG CCATCTTGTG CTATCCGTTC TGGAATTTTG TCAAGCTCTT CACTACTACA

481 ACTACCACTC CTGGCGTGTT TGGAGGTGGC CTGTTGGGTT ACGTGATCTA TGATTGCACA

541 CACTACTACC TGCATCACGC ACAGCCCTCA TCCGATCCTG CAAAATATCT CAAGAAATAC

601 CATCTGAACC ATCACTTCAG AATTCAAAAC AAGGGCTTTG GAATAACATC GACCCTGTGG

661 GACCATGTAT TTGGAACGCT GCCTTCAACA AAAACCGCCG ACAAGAGCTC TTGA

含有TaFAH1基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有TaFAH1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元表达载体系统和可用于植物微弹轰击法的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用本发明的基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗条锈病小麦的方法。而且不限于条锈病，其他病害也包括在内。

本发明所提供的培育抗病小麦的方法，包括将含有上述抗病基因的过表达载体导入小麦细胞中的步骤，得到过表达小麦株系。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaFAH1基因导入植物细胞，可获得对小麦条锈病具有一定抗性的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

根据本发明的具体实施方式，本发明以小麦品种Fielder为实验材料，得到了小麦抗病TaFAH1基因，在小麦中过表达TaFAH1基因，显著提高了小麦品种Fielder对条锈菌的抗性，因此该基因参与抗病性反应，可作为抗病育种的候选基因，可用于抗病品种的选育，为小麦抗病育种提供有力保障。

附图说明

图1显示TaFAH1基因在小麦不同组织中的表达分析；

图2-A小麦转TaFAH1基因株系与野生型对比，其中，WT表示非转基因对照小麦；L1-L3表示FAH过表达转基因小麦株系；

图2-B小麦转TaFAH1基因株系RT-PCR鉴定，WT表示非转基因对照小麦；L1-L3表示FAH过表达转基因小麦株系；

图3显示TaFAH1基因过表达小麦株系的抗病表现，WT表示非转基因对照小麦；L1-L3表示TaFAH1过表达转基因小麦株系。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：小麦抗病相关TaFAH1基因的cDNA克隆。

对生长15天左右的小麦幼苗叶片，用Trizol提取小麦总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for Rapid Amplification of cDNAEnds Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得TaFAH1基因。

用Trizol提取小麦幼苗的总RNA，用superscript II(invitrogen)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaFAH1基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-ATGGTTGCTCAAGCCTTTACCGT-3’，

P2：5’-GGAACCACTCTATTCGCAACACC-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为714bp左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaFAH1基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至714位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID NO:2所示TaFAH1基因的重组载体命名为pTE-TaFAH1。TaFAH1基因的序列在Genabnk上进行比对，在小麦中未发现同源蛋白基因，证明TaFAH1基因是一个新的基因。

实施例2：TaFAH基因基因组织特异表达分析

以开花期的小麦品种Fielder的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、颖壳、芒、花粉为材料，分析FAH基因在小麦不同组织中的表达水平。该开花期小麦品种Fielder的组织部位的RNA提取及反转录方法同实施例1。采用荧光定量PCR法分析FAH基因在不同组织中的表达水平。根据克隆的FAH基因序列，设计荧光定量PCR引物P3：5’-CGGACGGATGAACAAACAAT-3’；P4：5’-AATGAACGACGCTGGTGCTAT-3’。FAH基因在小麦不同组织中的表达水平见图1，结果表明，TaFAH1基因在小麦开花期的根和花粉中表达水平最高。

实施例3：培育TaFAH基因过表达转基因小麦

1、重组表达载体的构建

pBI121-TaFAH1重组表达载体的构建

以小麦品种Fielder的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后BamHI和SpeI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV29A启动子之后的BamHI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体pBI121-TaFAH1。

引物序列如下：

P5(TaFAH1[BamHI]-F)：5’–GGATCCATGGTTGCTCAAGCCTTTACCGTCGATTTG-3’

P6(TaFAH1[SpeI]-R)：5’–CGGACTAGTAGAGCTCTTGTCGGCGGTTTTTGTTGAA-3’

2、转基因小麦的获得和鉴定

1)转基因小麦的获得

将上述构建的重组表达载体pBI121-TaFAH1用冻融法转化根癌农杆菌C₅₈C1，再用整合有pBI121-TaFAH1的根癌农杆菌C₅₈C1转化小麦Fielder的幼胚，经过共培养和诱导培养后用含100mg/L卡那霉素的分化MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用RT-PCR做进一步鉴定筛选，所用的引物为P3和P4。

P3：5’-CGGACGGATGAACAAACAAT-3’

P4：5’-AATGAACGACGCTGGTGCTAT-3’

2)转TaFAH1基因植株抗病性鉴定

将获得T2代转基因株系，种植于花盆中，如图2A所示，在农艺性状表现与野生型没有差异。待其生长到成株期，对其采用喷雾接种的方式进行条锈菌接种，条锈菌生理小种为条中33号，接种后保湿24个小时，第三天进行二次接种，以保证接种的均一性，对照材料为野生型品种。接种后的14-20天，对材料进行田间调查鉴定。观察叶片病菌侵染情况并拍照。图2B显示小麦转TaFAH1基因株系RT-PCR鉴定结果。

统计结果显示，不同的过表达转基因小麦株系，相较对照野生型接种后的严重度均有很大程度的减轻，如图3所示。判断该过表达小麦转基因株系对小麦条锈菌具有抗性，该基因参与小麦条锈病的抗病性生理反应，是一种参与小麦抗病的相关基因。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1及其基因和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 237

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 1

Met Val Ala Gln Ala Phe Thr Val Asp Leu Asp Lys Pro Leu Val Phe

1 5 10 15

Gln Val Gly His Leu Glu Glu Gln Tyr Gln Asp Trp Val His Gln Pro

20 25 30

Ile Val Ser Lys Glu Gly Pro Arg Phe Phe Ala Asn Asp Val Leu Glu

35 40 45

Phe Leu Thr Arg Thr Lys Trp Trp Ala Val Pro Leu Ile Trp Leu Pro

50 55 60

Val Val Cys Trp Cys Leu Asn Thr Ser Ile Gln Met Gly His Thr Val

65 70 75 80

Pro Glu Val Ala Leu Met Val Val Ala Gly Ile Phe Ile Trp Thr Leu

85 90 95

Val Glu Tyr Val Leu His Arg Tyr Leu Phe His Ile Asp Thr Lys Ser

100 105 110

Tyr Trp Thr Asn Thr Ala His Tyr Leu Leu His Gly Cys His His Lys

115 120 125

His Pro Met Asp Gly Leu Arg Leu Val Phe Pro Pro Thr Ala Ala Ala

130 135 140

Ile Leu Cys Tyr Pro Phe Trp Asn Phe Val Lys Leu Phe Thr Thr Thr

145 150 155 160

Thr Thr Thr Pro Gly Val Phe Gly Gly Gly Leu Leu Gly Tyr Val Ile

165 170 175

Tyr Asp Cys Thr His Tyr Tyr Leu His His Ala Gln Pro Ser Ser Asp

180 185 190

Pro Ala Lys Tyr Leu Lys Lys Tyr His Leu Asn His His Phe Arg Ile

195 200 205

Gln Asn Lys Gly Phe Gly Ile Thr Ser Thr Leu Trp Asp His Val Phe

210 215 220

Gly Thr Leu Pro Ser Thr Lys Thr Ala Asp Lys Ser Ser

225 230 235

<210> 2

<211> 1428

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum)

<400> 2

atggttgctc aagcctttac cgtcgatttg gacaagcctc ttgtatttca ggttggtcat 60

ctggaggaac agtatcagga ctgggttcac cagccaattg ttagcaaaga ggggccacgg 120

ttttttgcca atgatgtatt ggagttctta acacgtacga aatggtgggc agttcctctc 180

atttggttgc ctgttgtttg ctggtgcttg aatacatcaa tccaaatggg ccacacagtt 240

ccagaagtag cgctgatggt tgtggcagga atattcatct ggacactggt tgaatacgtg 300

ctgcatcggt accttttcca catagatact aaaagttact ggacaaacac agctcactac 360

cttctgcatg gatgccatca caagcatcca atggatggac ttcgacttgt gtttccacca 420

actgctgcag ccatcttgtg ctatccgttc tggaattttg tcaagctctt cactactaca 480

actaccactc ctggcgtgtt tggaggtggc ctgttgggtt acgtgatcta tgattgcaca 540

cactactacc tgcatcacgc acagccctca tccgatcctg caaaatatct caagaaatac 600

catctgaacc atcacttcag aattcaaaac aagggctttg gaataacatc gaccctgtgg 660

gaccatgtat ttggaacgct gccttcaaca aaaaccgccg acaagagctc ttgaatggtt 720

gctcaagcct ttaccgtcga tttggacaag cctcttgtat ttcaggttgg tcatctggag 780

gaacagtatc aggactgggt tcaccagcca attgttagca aagaggggcc acggtttttt 840

gccaatgatg tattggagtt cttaacacgt acgaaatggt gggcagttcc tctcatttgg 900

ttgcctgttg tttgctggtg cttgaataca tcaatccaaa tgggccacac agttccagaa 960

gtagcgctga tggttgtggc aggaatattc atctggacac tggttgaata cgtgctgcat 1020

cggtaccttt tccacataga tactaaaagt tactggacaa acacagctca ctaccttctg 1080

catggatgcc atcacaagca tccaatggat ggacttcgac ttgtgtttcc accaactgct 1140

gcagccatct tgtgctatcc gttctggaat tttgtcaagc tcttcactac tacaactacc 1200

actcctggcg tgtttggagg tggcctgttg ggttacgtga tctatgattg cacacactac 1260

tacctgcatc acgcacagcc ctcatccgat cctgcaaaat atctcaagaa ataccatctg 1320

aaccatcact tcagaattca aaacaagggc tttggaataa catcgaccct gtgggaccat 1380

gtatttggaa cgctgccttc aacaaaaacc gccgacaaga gctcttga 1428

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggttgctc aagcctttac cgt 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaaccactc tattcgcaac acc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggacggatg aacaaacaat 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatgaacgac gctggtgcta t 21

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatccatgg ttgctcaagc ctttaccgtc gatttg 36

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggactagta gagctcttgt cggcggtttt tgttgaa 37

Claims

1.参与植物抗病的相关蛋白TaFAH用于提高植物条锈菌抗性的应用，其特征在于，所述参与植物抗病的相关蛋白TaFAH1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物为小麦。

2.提高植物抗病性的方法，其特征在于，所述方法包括在植物中过表达参与植物抗病的相关TaFAH1基因的步骤，其中，所述参与植物抗病的相关TaFAH1基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白，所述植物为小麦。

3.如权利要求2所述的提高植物抗病性的方法，其特征在于，所述参与植物抗病的相关TaFAH1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。