KR101826732B1 - 단일염기다형성 (snp) 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

국화 품종식별용 프라이머 세트, 국화 품종식별용 키트 및 국화 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 공지된 국화 129개의 품종에 대해 다형성 및/또는 삽입-결실을 보이는, 국화 품종식별용 프라이머 세트, 이를 이용한 키트, 및 이를 이용하여 국화 품종을 식별하는 방법에 관한 것이다. 상기 프라이머 세트를 국화 품종식별용 단일염기다형성 마커로 사용함으로써, 국화 품종의 진위성 규명 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 다양한 분야에 크게 기여할 수 있다.

Description

단일염기다형성 (SNP) 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 및 키트 {Method and Kit for identifying variety of Chrysanthemum using single nucleotide polymorphism markers}

국화 품종을 식별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 국화 품종의 식별 방법에 관한 것이다.

DNA 마커는 게놈상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기서열 단편을 의미한다. DNA 마커는 작물 육종분야에서 형질과 연관된 마커의 개발과 이를 이용한 MAS (marker assisted selection), 유전자 지도 작성, 양적 형질 유전자좌 분석, 순도 검정, 유전적 다양성 분석 및 품종식별 등의 분야에 활용되고 있다.

일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정과 품종간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA 분석 방법은 표현형에 근거한 식별 방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다. 국제 신품종 보호 연맹 (UPOV)은 DNA 마커를 신품종의 특성 조사와 식물 품종 보호권 부여에 활용하기 위한 논의를 진행 중이다. 다양한 연구에서 유전자 수준에서의 염기서열 차이를 이용하여 품종식별을 위한 분자 마커로 활용할 수 있는 가능성을 제안하고 있다. 구체적으로 분자 마커 종류 중 품종간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체 상의 분포 정도를 고려할 때 SSR (Simple Sequence Repeat), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 방법을 활용하는 것을 제안하고 있다.

국내에서 품종식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황을 살펴보면, 농촌진흥청에서 벼, 콩 등에 대한 SSR 분자 마커 및 국립종자원에서 국화에 대한 SSR 분자 마커를 이용한 품종식별 기술을 보고한 바 있다. 국립 종자원은 SSR 분자 마커를 이용하여 고추, 배추, 수박 등에 대한 작물의 DNA 프로파일 및 SNP 분자 마커를 이용하여 참깨 등에 대한 작물의 DNA 프로파일을 데이터 베이스화하였으며, 종자 분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 수단으로서 분자 마커를 활용하여 품종보호 출원품종에 대한 대조품종 선정에 유전자 분석 결과를 활용하고 있는 추세이다.

국내에서 품종식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황의 다른 예를 살펴보면, 시판 고추 F1 품종식별을 위한 SNP 마커 (등록특허 10-0974821), 국내외산 벼 품종식별 SNP 마커 (등록특허 10-0713669), 초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 (공개 16-71238)등 유전자 마커를 이용한 다양한 분석법이 농업적으로 활용되고 있다.

이처럼 유전물질 (DNA)를 이용한 개체간의 차이에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔고, 최근 분자유전학 및 DNA 분석기술의 발달로 분자생물학적 수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자마커(genetic marker) 개발이 활발히 진행되고 있다.

핵산을 이용한 유전자 증폭 기술 (Polymorase chain reaction : PCR)등 다양한 DNA 분석 기법이 발전함에 따라 종판별 및 개체식별 등 다양한 산업 전반에 걸쳐 활용되고 있다. 특히, 대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응 (Allele-specific PCR : AS-PCR)은 유전자 증폭을 위하여 사용되는 프라이머 말단에 SNP가 위치하며, 프라이머 말단에 인위적인 돌연변이를 디자인하여 프라이머 끝 (3` end)부분의 단일 염기가 결합되거나 또는 결합되지 못하는 특징을 이용함으로써 유전자 증폭 산물의 형성 유무를 통해 개체별 SNP형을 확인하는 방법이다.

2015년 12월 현재, 국화 품종은, 국립종자원에 신품종보호 등록된 품종수가 653품종으로, 화훼 작물 중 품종보호 등록건수가 두번째로 많은 작물이며, 화훼 작물 중 약 20%를 점유하는 주요 작물이므로 품종보호가 시급한 상황이다. 국화의 품종보호를 위한 검정을 위해서는 재배시험을 수행해야 하며, 재배시험 시 재배 환경의 영향을 받고, 특성 검정에 많은 시간이 소요되기 때문에 분자 마커를 이용한 육종과 품종식별 방법 개발의 중요성이 증대되고 있다. 따라서 신속하고 경제적으로 국화의 품종을 판별할 수 있는 기술이 요구되고 있으며, 본 연구에서는 단일염기다형성 (SNP) 등의 변이를 이용하여 국화 품종을 식별하고자 하였다.

일 양상은 국화 품종식별용 프라이머 세트를 제공한다.

다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종식별용 키트를 제공한다.

다른 양상은 상기 프라이머 세트를 이용하여 국화의 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

국화의 품종식별을 위한 유전자분석 시스템을 제공한다. 시스템 개발에 사용한 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism : SNP) 마커는 종간 또는 연령간, 성별간, 염색체가 갖고 있는 염기서열 중 개체 또는 품종간의 편차를 나타내는 염기변이를 말하며, 한 염기쌍 (single base-pare variation)의 차이로 DNA 서열의 다형성 중에서 가장 많은 빈도로 존재한다. 시스템 개발에 사용한 삽입-결실 (insert/deletion : indel) 마커는 하나 이상의 염기가 삽입-결실되는 염기변이를 의미하며, 삽입은 하나 이상의 염기가 추가되는 변경이고, 결실은 하나 이상의 염기가 제거되는 변경을 의미한다. 이러한 특징을 이용하여, 품종을 판별하기 위한 유전자 마커를 선별하였고, 선별한 마커들 중에서 변별력이 있고 특이도 및 민감도에서 우수한 결과를 나타낸 마커들을 사용하여 품종식별에 사용하였다.

일 양상은, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC5 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC6 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC8 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC9 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC13 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC28 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC30 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC34 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC39 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC41 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC42 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC43 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC48 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC59 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC61 프라이머 세트를 포함하는, 국화 품종식별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 공지된 국화 품종에 대해 높은 다형성을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 프라이머 세트는 국화 품종을 식별하기 위해 이용될 수 있다. 상기 프라이머 세트는 예를 들면, 하기 표 2에 기재된 국화 품종 중 하나 이상의 품종을 식별하기 위해 이용되는 것일 수 있다.

상기 프라이머는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼 하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

상기 프라이머의 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정될 수 있고, 10 내지 60nt, 15 내지 50nt, 또는 15 내지 40nt인 것일 수 있다. 상기 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만, 주형과 혼성복합체 (hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적인 것일 수 있다.

상기 마커는 각 프라이머 세트를 통해 얻어진 증폭 산물, 각 프라이머 세트 자체, 또는 프라이머 세트의 조합을 의미하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 1 내지 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 16쌍의 프라이머 세트를 하기 표 1에 나타내었다.

마커 이름	프라이머 염기서열 (5'->3')
DkC1	정방향(서열번호 1)	TAAGAGCCAAAAGGTCCCGAC
	역방향(서열번호 2)	ACATCATCCTCACTGTACGACGTG
DkC5	정방향(서열번호 3)	AACAAGATCAGCTGAGGCAGATA
	역방향(서열번호 4)	AGTTTACAAACCTCTGCACTTTCAG
DkC6	정방향(서열번호 5)	GGTCAACCACAAGCGTCTGC
	역방향(서열번호 6)	AACACTAAACTCCTAAACTCTTCCGC
DkC8	정방향(서열번호 7)	CGGAAAGTTGGAGATTGGTTGA
	역방향(서열번호 8)	AACACTAAACTCCTAAACTCTTCCGC
DkC9	정방향(서열번호 9)	AATCTCACCGACAAACCAATTC
	역방향(서열번호 10)	AATAATAAAGAAAATCCACCTTCACC
DkC13	정방향(서열번호 11)	TCCACGTTAAGTATCGGCCG
	역방향(서열번호 12)	ATCGTGCAAAAACACATGTGTC
DkC28	정방향(서열번호 13)	TCGTAAGGCTGAAATGATCTTGG
	역방향(서열번호 14)	AGAATTCAATGTACATAACAGTCAACAC
DkC30	정방향(서열번호 15)	TGCAATTCTGATATCAGCAGAAGTG
	역방향(서열번호 16)	TGTTAGACTACAGTTTGGGTTGTTTTC
DkC34	정방향(서열번호 17)	TAACTTTTAGTCTACTATGTCGTTAGGAATAT
	역방향(서열번호 18)	AAAGAATAAAAAAGGTCATATGTGTCC
DkC39	정방향(서열번호 19)	TCAAGTCATTATCCGGTTATTGG
	역방향(서열번호 20)	ATTTTGAGTTTGCATAGTCAAACCTG
DkC41	정방향(서열번호 21)	TGACCCTGGGGAGTTGACAC
	역방향(서열번호 22)	AGAATTAAGGGAACTAACCAGAGATACC
DkC42	정방향(서열번호 23)	TGCTACTCTTTTGTTTCTTTATATTACTGTG
	역방향(서열번호 24)	AGAATTAAGGGAACTAACCAGAGATACC
DkC43	정방향(서열번호 25)	GGGTACAAAAGTACTACTGATCCTTCC
	역방향(서열번호 26)	AGAATTAAGGGAACTAACCAGAGATACC
DkC48	정방향(서열번호 27)	AGGCTTGTAGCTGCTCGGATT
	역방향(서열번호 28)	TCGACAAACACTTCTCGTAGCTAG
DkC59	정방향(서열번호 29)	AACTTTATCCCAACAATTGCCAG
	역방향(서열번호 30)	CAGACCTCGTCCACGTCTCC
DkC61	정방향(서열번호 31)	CAAAAATGGTCTGGTGCTAATGAC
	역방향(서열번호 32)	CAGACCTCGTCCACGTCTCC

상기 국화 품종식별용 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC1 프라이머 세트는 서열번호 35의 165번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 구별하고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC5 프라이머 세트는 서열번호 36의 23번째 염기인 단일염기다형성 A와 T를 구별하고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC6 프라이머 세트는 서열번호 37의 20번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 구별하고, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC8 프라이머 세트는 서열번호 38의 22번째 염기인 단일염기다형성 A와 T를 구별하고, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC9 프라이머 세트는 서열번호 39의 2번째 내지 20번째 염기의 삽입-결실(indel)를 식별하고, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC13 프라이머 세트는 서열번호 40의 20번째 염기인 단일염기다형성 A와 G를 구별하고, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC28 프라이머 세트는 서열번호 41의 165번째 염기인 단일염기다형성 A와 G를 구별하고, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC30 프라이머 세트는 서열번호 42의 25번째 염기인 단일염기다형성 G와 A를 구별하고, 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC34 프라이머 세트는 서열번호 43의 32번째 염기인 단일염기다형성 T와 A를 구별하고, 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC39 프라이머 세트는 서열번호 44의 244번째 염기인 단일염기다형성 T와 C를 구별하고, 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC41 프라이머 세트는 서열번호 45의 17번째 염기인 단일염기다형성 G와 A를 구별 및 20번째 염기인 단일염기다형성 A와 C를 구별하고, 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC42 프라이머 세트는 서열번호 46의 22번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 구별 및 31번째 염기인 단일염기다형성 C와 G를 구별하고, 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC43 프라이머 세트는 서열번호 47의 26번째 내지 27번째 염기인 단일염기다형성 CC와 GT를 구별하고, 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC48 프라이머 세트는 서열번호 48의 21번째 염기인 단일염기다형성 T와 A를 구별하고, 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC59 프라이머 세트는 서열번호 49의 23번째 염기인 단일염기다형성 A와 G를 구별하고, 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC61 프라이머 세트는 서열번호 50의 24번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 구별하는 것일 수 있다.

상기 DkC1 프라이머 세트, DkC5 프라이머 세트, DkC6 프라이머 세트, DkC8 프라이머 세트, DkC9 프라이머 세트, DkC13 프라이머 세트, DkC28 프라이머 세트, DkC30 프라이머 세트, DkC34 프라이머 세트, DkC39 프라이머 세트, DkC41 프라이머 세트, DkC42 프라이머 세트, DkC43 프라이머 세트, DkC48 프라이머 세트, DkC59 프라이머 세트, 및 DkC61 프라이머 세트가 표 2에 기재된 국화 품종 중 하나 이상의 품종을 식별할 수 있는 것은, 각 단일염기다형성 또는 삽입-결실 변이 위치에서의 특정 염기가 표 2에 기재된 국화 품종 중 하나 이상에서 특이적으로 높거나 또는 낮은 빈도로 나타나는 것에 근거한 것이다.

상기 프라이머 세트를 구성하는 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 표지될 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 방사성 표지 물질은, ³²P 또는 ³⁵S 와 같은 방사성 동위원소가 첨가된 PCR 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입될 수 있다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR 또는 AS-PCR에 의해 생성되는 증폭 산물의 유무 및 크기 따라 단일염기다형성 유전자형을 구별하거나 또는 삽입-결실 (indel)을 식별할 수 있다.

다른 양상은 DkC1 프라이머 세트, DkC5 프라이머 세트, DkC6 프라이머 세트, DkC8 프라이머 세트, DkC9 프라이머 세트, DkC13 프라이머 세트, DkC28 프라이머 세트, DkC30 프라이머 세트, DkC34 프라이머 세트, DkC39 프라이머 세트, DkC41 프라이머 세트, DkC42 프라이머 세트, DkC43 프라이머 세트, DkC48 프라이머 세트, DkC59 프라이머 세트, 및 DkC61 프라이머 세트를 포함하는 국화 품종식별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP 혼합물 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 PCR 완충 용액을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 DNA 중합효소는 예를 들면, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우 (Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소인 것일 수 있다. 상기 PCR 완충 용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유하는 것일 수 있다. 또한, PCR, 구체적으로 AS-PCR, 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 키트는 안내서를 포함하는 것일 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충 용액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

다른 양상은 국화로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DkC1 프라이머 세트, DkC5 프라이머 세트, DkC6 프라이머 세트, DkC8 프라이머 세트, DkC9 프라이머 세트, DkC13 프라이머 세트, DkC28 프라이머 세트, DkC30 프라이머 세트, DkC34 프라이머 세트, DkC39 프라이머 세트, DkC41 프라이머 세트, DkC42 프라이머 세트, DkC43 프라이머 세트, DkC48 프라이머 세트, DkC59 프라이머 세트, 및 DkC61 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물로부터 상기 국화의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 국화 품종을 식별하는 방법을 제공한다.

상기 게놈 DNA는 상기 국화의 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 또는 그의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득된 것일 수 있다. 상기 게놈 DNA는 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용하여 수득된 것일 수 있다.

상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 증폭은 AS-PCR을 이용하여 수행될 수 있다.

핵산의 증폭은 DkC1 프라이머 세트, DkC5 프라이머 세트, DkC6 프라이머 세트, DkC8 프라이머 세트, DkC9 프라이머 세트, DkC13 프라이머 세트, DkC28 프라이머 세트, DkC30 프라이머 세트, DkC34 프라이머 세트, DkC39 프라이머 세트, DkC41 프라이머 세트, DkC42 프라이머 세트, DkC43 프라이머 세트, DkC48 프라이머 세트, DkC59 프라이머 세트, 및 DkC61 프라이머 세트를 사용하여 수행되는 것일 수 있다.

PCR 또는 AS-PCR 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상기 키트 또는 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다. PCR 또는 AS-PCR 반응은 당업계에 PCR 또는 AS-PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 국화로부터 유래된 게놈 DNA, 상기 프라이머 세트, DNA 중합 효소 (예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충 용액 및 물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기 (Geiger counter) 또는 액체 섬광계수기 (liquid scintillation counter)와 같은 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

상기 방법에서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 국화의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, DkC1 프라이머 세트, DkC5 프라이머 세트, DkC6 프라이머 세트, DkC8 프라이머 세트, DkC9 프라이머 세트, DkC13 프라이머 세트, DkC28 프라이머 세트, DkC30 프라이머 세트, DkC34 프라이머 세트, DkC39 프라이머 세트, DkC41 프라이머 세트, DkC42 프라이머 세트, DkC43 프라이머 세트, DkC48 프라이머 세트, DkC59 프라이머 세트, 및 DkC61 프라이머 세트에 의해 공지된 국화 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 증폭된 산물로부터 국화 품종을 결정하는 단계는 자동 염기서열 분석기를 이용하여, 증폭 산물 (밴드)의 크기를 컴퓨터 프로그램에 의해 확인함으로써 수행되는 것일 수 있다. 공지된 국화 품종에 대하여 상기 프라이머 세트를 통해 증폭된 산물 (각 대립유전자에 해당함)의 유무 및 크기를 미리 하나의 표로 정리한다. 예를 들면, 대립유전자 단일염기다형성이 존재하는 경우 "1"로 나타내고, 대립유전자 단일염기다형성이 존재하지 않는 경우 "0"으로 나타낼 수 있다. 또는 예를 들면, 두개의 대립유전자 단일염기다형성이 존재하는 경우, 증폭된 산물 유무에 따라 어느 하나의 대립유전자 유전자형을 "1"로 나타내고, 다른 하나의 대립유전자 유전자형을 "0"으로 나타낼 수 있다.

즉, 품종을 식별하고자 하는 국화로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭된 산물의 크기를 분석한 다음, 이 분석 결과를 상기 공지된 국화 품종의 핵산을 증폭한 결과와 통계 프로그램을 이용하여 비교함으로써 국화의 품종을 결정할 수 있다.

일 양상에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트, 국화 품종식별용 키트, 및 국화 품종을 식별하는 방법은, 국내 및 외국에서 수집된 국화 품종을 대상으로 분자 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 및 체계를 확립하였다. 또한, 일 양상에 따른 국화 품종식별용 프라이머 세트, 국화 품종식별용 키트, 및 국화 품종을 식별하는 방법에 의하면, 주요 국화 품종을 식별할 수 있으므로 국화 품종의 진위성 규명, 종자분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 분야에 기여할 수 있다.

도 1은 대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응 (AS-PCR)을 수행하기 위한 프라이머의 모식도이다.
도 2a, 2b 및 2c는 국화 품종을 식별하기 위한 16쌍의 프라이머 세트 및 내재유전자인 rbcL을 이용하여 PCR을 수행한 결과이다.
도 3는 국화 품종을 식별하기 위한 16쌍의 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물을 확인한 결과이다. 도 3a는 DkC1 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3b는 DkC5 프라이머 세트, 도 3c는 DkC6 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3d는 DkC8 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3e는 DkC9 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3f는 DkC13 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3g는 DkC28 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3h는 DkC30 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3i는 DkC34 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3j는 DkC39 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3k는 DkC41 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3l는 DkC42 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3m는 DkC43 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3n는 DkC48 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3o는 DkC59 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물, 도 3p는 DkC61 프라이머 세트를 이용한 증폭 산물을 확인한 결과이다.
도 4는 국화 품종을 식별하기 위한 16쌍의 프라이머 세트에 의해 분석된 품종의 대립유전자 유전자형을 1 또는 0으로 코드화한 결과이다.
도 5는 국화 품종을 식별하기 위한 16 쌍의 프라이머 세트에 의해 분석된 국화 품종간의 유전적 유사도를 나타낸다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 국화 품종식별을 위한 마커의 평가

(1) 국화 시료

하기 표에 기재된 국화 129 품종을 국화 품종식별 가능성 검정을 위해 사용하였다. 구체적으로, 국화의 유전자 염기서열 분석 및 유전자 변이 발굴을 위한 시료는, 경상남도농업기술원 화훼연구소에서 분양받은 91점 및 충남농업기술원 화훼연구소에서 분양받은 38점, 총 129품종을 대상으로 하였다.

[표 2]

(2) 국화 게놈 DNA 분리

국화 게놈 DNA는 NucleoSpin^® Plant 게놈 키트 (MN Co. Germany)를 이용하여 분리하였다. 국화 시료를 분쇄한 후, 분쇄된 국화 시료에 용해 버퍼 (lysis buffer) 300㎕를 첨가하고, 60℃에서 3시간 반응시켰다. 반응이 끝난 시료를 10,000 x g에서 10분간 원심분리하고, 원심분리한 시료에서 상층액 300㎕를 취하였다. 상층액 300㎕에 침전 버퍼 75㎕를 넣어 원심분리를 10,000 x g에서 5분간 실시하고, 결합 용액 450㎕를 넣어 균질하게 혼합한 후 컬럼 (column)에 통과시켜 불순물을 제거하였다. 컬럼을 세척 버퍼 (wash buffer) 600㎕로 3회 세척 (washing)한 후, 멸균 증류수 100㎕를 이용하여 컬럼으로부터 게놈 DNA를 회수하였다. 추출된 게놈 DNA는 ND-1000 UV-Vis 분광광도계 (spectrophotometer) (NanoDrop Technologies, USA)를 이용하여 농도와 순도를 측정한 후, 차세대 염기서열분석에 사용하였다.

(3) 차세대 염기서열분석 결과를 활용한 RNA 서열 확인

국화의 SNP 염기서열을 확보하기 위해, 국화 델리아크림 (스프레이형)과 설미(스텐다드형) 2품종에 대하여 illumina hiseq 2000으로 차세대 염기서열분석을 실시하였다. RNA 유전체 분석을 통해 생성된 국화의 원 데이터 (raw data) 중에서 quality-value가 20 이상인 서열들만을 필터링하고 어셈블을 수행하였다. 차세대 염기서열분석을 통하여 총 635,671개의 SNP를 확인하였으며, 이중 품종간 다형성을 지니는 18,041개의 SNP를 선발하였다.

차세대 염기서열분석은, 짧은 리드 데이터 (Short read data)를 서열 품질 (quality)에 따라 트리밍 (trimming)하고, 참조 게놈 (reference genome)과의 정렬 (alignment)을 수행한 후, 공통 서열 (consensus sequence)을 작성하여 수행하였다. 프로그램을 이용하여 원 (raw) SNP 및 In/Del을 검출 (detection)한 후에, SEEDERS in-house script를 이용하여 샘플 간의 SNP 및 In/Del 매트릭스 (matrix)를 작성하고, 유의한 SNP 및/또는 In/Del 후보를 선발하였다.

(4) 국화 염기서열 분석 및 유전자 변이 탐색

국화의 품종식별을 위한 SNP 및 InDel을 탐색하기 위하여 차세대 염기서열분석을 통하여 확보된 유전체 정보를 사용하였다. 국화 품종식별에 가능한 SNP 및 InDel 후보군을 선발하고 국화 품종식별에 적용이 가능한 유전자 변이를 탐색하기 위하여, 염기서열 분석을 위한 90 개의 프라이머를 제작하였다. 이 프라이머를 이용하여 주요 국화 8 종 (일월, 백마, 신마, 설미, 프로기, 포드, 아르거스, 델리아크림)에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 품종식별용 SNP 위치를 찾기 위해, 품종별 염기서열분석 결과를 DNASTAR 컴퓨터 프로그램 (www. dnastar.com)을 이용한 ClustalW 방법으로 분석하였다. 총 69 개의 SNP 및 InDel이 확인되었으며, 이 중 국화 품종식별에 용이한 47개의 SNP를 1차 선발하였다.

(5) 대립유전자 특이 PCR 프라이머 제작

InDel 마커는 두 개의 플랭킹 프라이머 (flanking primers)로 InDel을 포함하는 DNA 단편을 증폭하여 분석하였다. SNP 프라이머를 제작하기 위해 대립유전자 특이 PCR 방법을 참조하였다 (Drenkard, E. et al., 2000 Plant Physiol 124, 1483-1492, Kwok, S. et al., 1990 Nucleic Acids Res 18, 999-1005) (도 1 참조).

국화 품종을 식별하기 위한 대립유전자 특이 PCR을 위한 프라이머를 제작하기 위해, 3` 말단으로부터 2 내지 5번째 위치의 염기 중 어느 하나 또는 두 개의 염기를 변이시킨 변형 서열을 제작하였다. 염기서열에서 3` 말단으로부터 2 내지 5번째 위치의 염기 중 어느 하나가 A, T, G, C 중 어느 하나로 변이된 변형 서열을 국화 품종식별을 위한 마커로 사용한 결과, 특정 대립유전자에 대하여는 PCR 증폭을 방해하지 아니하면서 타 품종과 식별을 가능한 것을 확인할 수 있었다. 그리하여, 국화 품종을 식별하기 위한 마커를 개발함에 있어서, SNP 또는 Indel 위치는 3` 말단이고, 3번째 염기에 인위적인 불일치가 유도되도록 센스 프라이머와 안티센스 프라이머를 제작하였다. SNP 마커의 결합 온도는 60℃, 크기는 177 내지 607 bp가 되도록 제작하였다. 국화 품종별 유전자형은 아가로즈 겔 상에서 PCR 산물의 증폭 유무로 결정하였다 (도 2 참조). 그로부터, 국내산 국화 129 품종을 식별하기에 용이한 국화 품종식별용 47쌍의 프라이머 세트를 제작하였다. 47쌍의 프라이머 세트는 하기 표 3과 같다.

[표 3]

(5) 탐색된 유전변이에 대한 염기서열 재분석 (re-sequencing) 및 유전자 마커 선발

국내산 국화 시료 129종을 대상으로, 45개의 SNP에 대한 염기서열을 재분석 (re-sequencing)하였다. 염기서열 재분석을 위한 PCR은, 반응 산물이 약 700 bp가 되도록 프라이머를 합성하여 PCR 반응을 수행하고, 반응 산물을 다중-웰 여과 플레이트 (Multi-well filter plate) (Pall Corporation, USA)로 정제한 후 BigDyeⓡ Terminator (v3.1) Cycle 시퀀싱 키트(squencing Kit) (Applied Biosystems, UK)을 사용하여 수행하였다.

정제한 PCR 산물 2㎕에 5X 버퍼 1.75㎕, Big Dye 0.5㎕ 및 프라이머 5 pmol/㎕를 첨가한 후, 총 10㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 반응은, 96℃에서 10초간 가열한 후, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분간, 34회 반복하여 수행하였다. PCR 반응 후 에탄올로 정제하고 건조한 뒤, 건조된 시료에 Hi-DiTM 포름아미드 (Formamide) 8㎕를 첨가하고, 95℃에서 2분간 반응시킨 후 염기서열 분석 장비인 ABI 3730xl (Applied Biosystems)을 통해, 각 품종의 염기서열을 결정하였다. 염기서열 분석을 통해 얻어진 유전자 염기서열은 SNP 확인을 위하여 Lasergene SeqMan program (DNASTAR, Inc., USA)을 이용 분석하였다.

염기서열 재분석 결과, 효율적인 국화 품종식별에 용이한 16개의 SNP 마커를 최종 선별하였다. 16쌍의 프라이머 세트를 이용하여 품종 특이적인 증폭 산물이 형성된 것을 알 수 있다. 또한, 품종식별의 정확성을 향상시키고자 필요에 따라 염록체에 위치한 RBCL 유전자를 대상으로 대조군 마커를 제작하여 이용하였다.

(6) 대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응 (AS-PCR)을 이용한 국화 식별

국화 품종을 식별하기 위해 16개의 단일염기다형성 (SNP) 마커와 내재 대조군 마커 (RBCL)로서 염록체에 위치한 RBCL 유전자를 대상으로, AS-PCR을 수행하였으며, 하기 표 4에 기재된 서열번호 1부터 32의 프라이머 (DkC1 프라이머 세트, DkC5 프라이머 세트, DkC6 프라이머 세트, DkC8 프라이머 세트, DkC9 프라이머 세트, DkC13 프라이머 세트, DkC28 프라이머 세트, DkC30 프라이머 세트, DkC34 프라이머 세트, DkC39 프라이머 세트, DkC41 프라이머 세트, DkC42 프라이머 세트, DkC43 프라이머 세트, DkC48 프라이머 세트, DkC59 프라이머 세트, DkC61 프라이머 세트)를 이용하였다.

16개 SNP 마커의 개별 분석을 위한 PCR (AS-PCR)은 게놈 DNA 50 ng에 10 x 버퍼 2.5㎕, dNTP (각 2.5mM) 1㎕, 10 pmol로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 0.5㎕와 중합효소 (Taq polymerase, Takara, Japan) 2U을 첨가한 후, 멸균 증류수로 최종 25㎕가 되도록 증액하였다. 유전자의 증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems, USA)을 이용하였으며, 94℃에서 15분간 변성 후, 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 동안 반응을 30회 반복 수행하였다. PCR 증폭 산물은 3% 아가로즈 겔 (agarose gel) 상에서 전기영동을 통해 확인하였다. 단일 PCR의 결과는 도 2와 동일하였다.

(7) 마커의 국화 품종식별 가능성 검정

상기 마커의 국화 품종식별 가능성을 조사하였다. 하기 식 1을 사용하여 PIC (polymorphism information content)값을 산출하였다. 하기 식 1에서 K는 각 대립유전자의 총 밴드수이며, Pi는 마커의 밴드 중에서 i 번째 공통 밴드 패턴의 빈도수를 나타낸다 (Anderson et al. 1993).

< 식 1 >

증폭 산물의 크기(bp) 및 PIC 값을 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 싱기 국화 품종식별용 프라이머 세트, 서열번호 1과 2 (마커명: DkC1), 서열번호 3과 4 (마커명: DkC5), 서열번호 5과 6 (마커명: DkC6), 서열번호 7와 8 (마커명: DkC8), 서열번호 9와 10 (마커명: DkC9), 서열번호 11와 12 (마커명: DkC13), 서열번호 13와 14 (마커명: DkC28), 서열번호 15와 16 (마커명: DkC30), 서열번호 17와 18 (마커명: DkC34), 서열번호 19와 20 (마커명: DkC39), 서열번호 21와 22 (마커명: DkC41), 서열번호 23와 24 (마커명: DkC42), 서열번호 25와 26 (마커명: DkC43), 서열번호 27와 28 (마커명: DkC48), 서열번호 29와 30 (마커명: DkC59), 서열번호 31와 32 (마커명: DkC61)의 16개 마커의 평균 PIC값은 0.403으로, 상기 마커를 통해 국화 품종의 식별이 충분히 가능함을 확인하였다. 상기 마커의 대립유전자 (밴드) 유무를 정확하게 판별하기 위하여, 내재 대조군 마커로 서열번호 33과 34 (마커명: RBCL)을 사용함으로써 국화 품종을 식별하는데 정확도를 기하였다.

대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응 (AS-PCR)을 통해 16개 SNP 마커의 유전자 증폭 산물을 도 4의 데이터베이스와 비교하여 품종을 할 수 있다. 상기 마커에 대해 대립유전자 (밴드) 유무를 판별하여 밴드가 존재할 경우에는 점수 "1"로 코드화하고, 밴드가 존재하지 않을 경우에는 "0"으로 코드화 하였다. 도 4는 국화 129개를 대상으로, 상기 국화 품종식별용 프라이머 세트를 사용하여 확인된 대립유전자의 유무를 코드화한 결과이다. 품종을 식별하고자 하는 국화로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭하고 증폭 산물과 도 4의 결과를 비교 분석함으로써 국화 품종을 식별할 수 있다. 구체적으로, 16개의 단일염기다형성 마커 및 삽입-결실 마커를 이용하여 공지된 129품종을 정확하게 식별이 가능하다.

대립유전자의 유무를 NTSYS pc (version 2.10b)(Rohlf, 2000) 컴퓨터 프로그램에 입력하고 Jaccard's 방법 (Sneath and Sokal, 1973)에 준하여 유전적 유사도 값을 계산하였다. 계산된 유전적 유사도를 이용하여 UPGMA (Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average)(Sneath and Sokal, 1973)에 의해 집괴 분석하여 계통도 (dendrogram)를 작성하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 상기 국화 품종식별용 프라이머 세트에 의해 분석된 각 국화 품종의 유전적 유사도를 나타낸다. 이를 통해, 상기 프라이머 세트를 이용하여 품종의 구별이 가능함을 확인할 수 있었다.

<110> Korea seed and variety service <120> Method and Kit for identifying variety of Chrysanthemum using single nucleotide polymorphism markers <130> PN116624 <160> 51 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC1 F-primer <400> 1 taagagccaa aaggtcccga c 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC1 R-primer <400> 2 acatcatcct cactgtacga cgtg 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC5 F-primer <400> 3 aacaagatca gctgaggcag ata 23 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC5 R-primer <400> 4 agtttacaaa cctctgcact ttcag 25 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC6 F-primer <400> 5 ggtcaaccac aagcgtctgc 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC6 R-primer <400> 6 aacactaaac tcctaaactc ttccgc 26 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DkC8 F-primer <400> 7 cggaaagttg gagattggtt ga 22 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Chrysanthemum <400> 37 ggtcaaccac aagcgtcggy gatcgatacc acggtgragr atgcgcggcr gatggtggtg 60 gttgtggtgg atttgtttgg atcggaaagt tggagattgg tggkggttgg atttgattga 120 ttggtggagg tggattttct ttannatttg atatttgaag atgaaatttg aaaaaggtta 180 agaattaaag agagccctcc gaacctccga cgtgcagccg gtggccggag gcagcggaag 240 agtttaggag tttagtgtt 259 <210> 38 <211> 177 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 38 cggaaagttg gagattggtg gwggttggat ttgattgatt ggtggaggtg gattttcttt 60 annatttgat atttgaagat gaaatttgaa aaaggttaag aattaaagag agccctccga 120 acctccgacg tgcagccggt ggccggaggc agcggaagag tttaggagtt tagtgtt 177 <210> 39 <211> 330 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 39 gaatctcacc gacaaaccaa ttcatcccat cttccccaac acttcagcca aaccaaagta 60 tcaacaatga ccgacaaagg aacaaagaaa aagaaaagaa aaacaaaaca cgtcaactgg 120 ctatcaatca caaagccaac gatcaacgta taaaagtggc gactggttat cacaaaacca 180 acggtcaacc acaagtgtcg gcgatcgata ccacggtgga gaatgcgcgg cagatggtgg 240 tggttgtggt ggatttgttt ggatcggaaa gttggagatt ggtggtggtt ggatttgatt 300 gattggtgaa ggtggatttt ctttattatt 330 <210> 40 <211> 293 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 40 tccacgttaa gtatcggacr cagcttaaag aakctgatga tttgttaaat agttataagt 60 cggagcctga atgtgctccg actaaatcmt acatacgtgg caacgataag tgcaagttag 120 cacttaatrt gttgccagat gtggtgtatg ataaggaatg ggatatgatt atgattgacg 180 cgcctaaggg atattatccc gaggcgccrg gkaggatggg ggctatatat tcggctgcgg 240 ttatggctag gaataggaaa aaatccggtg tgacacatgt gtttttgcac gat 293 <210> 41 <211> 192 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 41 tcgtaaggct gaaatgatct tggaccanaa tttctggctg ggtaggcatg tcttttcccc 60 ctgttagcaa atgaacctgg agcctttgac aacggcamat ttttatcacc cttttcttca 120 gtttgtgtag ctgctttaga tgcaattctg atatcagcag aattrttttg actgttatgt 180 acattgaatt ct 192 <210> 42 <211> 481 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 42 tgcaattctg atatcagcag aattrttttg actgttatgt acattgaatt ctgcattccc 60 atttgtagtt gaccaattct catgtgttat gtcgggcatc gttgaaacat tgcctgattg 120 attatttgac atattggccg aactgccttc attattcatg ttattagcag aactttcttg 180 agaaaactga ttagrgaaag aacttcctga gctcggattc aaattaaatt gggtatggta 240 aatgtttggc tgaacaagcg aaatgggttg tgtaggcatt ggaagaatcc cttgggaaac 300 aggagatgta tacctcaact gaccaaattg gaagagaggt tgggacgggt ttatgtggcc 360 catggatgaa ccaacaggtg gctgaaaatg aagaggcatc tgtattgaac cgatttgtat 420 ggctggaact ggagatggta tgagtgtagg cccagaaaac aacccaaact gtagtctaac 480 a 481 <210> 43 <211> 222 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 43 taacttttag tctactatgt crttaggaag awaktccaca tgtaactttt tkagtgtcaa 60 ttgaatttct ttttacataa aaagtatcaa attggaaatg ttttcatgat aaaaatggrc 120 ttgagaaaar tyatgtttga ctatgcaaac tcaaaatgga cttttttcct aacctgtata 180 gcaacatgca ctataggaca catatgacct tttttattct tt 222 <210> 44 <211> 269 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 44 tcaagtcatt atccggttat tggaaatttt tycttgctca aagtcctacy gccgctcctt 60 ctgattttca tgattcagcg tttcaagact ctacatggga aaaaatacca ggtaactttt 120 agtctactat gtcrttagga agawaktcca catgtaactt tttkagtgtc aattgaattt 180 ctttttacat aaaaagtatc aaattggaaa tgttttcatg ataaaaatgg rcttgagaaa 240 artyatgttt gactatgcaa actcaaaat 269 <210> 45 <211> 245 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 45 tgaccctggg gagttgrcam agtggtcttt ctacagggct ttgattgctg agttcattgc 60 tactcttttg tttctttaya twactgtstt gactgttatt gggtacaaaa gtactactga 120 tcctgsyttg aacgctgacc mgtgtggtgg tgttggtatt cttggtattg cttgggcttt 180 tggtggtatg atmtttgttc ttgtttactg cactgctggt atctctggtt agttcccttw 240 mytct 245 <210> 46 <211> 188 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 46 tgctactctt ttgtttcttt ayatwactgt sttgactgtt attgggtaca aaagtactac 60 tgatcctgsy ttgaacgctg accmgtgtgg tggtgttggt attcttggta ttgcttgggc 120 ttttggtggt atgatmtttg ttcttgttta ctgcactgct ggtatctctg gttagttccc 180 ttwmytct 188 <210> 47 <211> 145 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 47 gggtacaaaa gtactactga tcctgsyttg aacgctgacc mgtgtggtgg tgttggtatt 60 cttggtattg cttgggcttt tggtggtatg atmtttgttc ttgtttactg cactgctggt 120 atctctggtt agttcccttw mytct 145 <210> 48 <211> 373 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 48 aggcttgtag ctgctcggct wcaatttgac gtaatgggga cggaaacart gttggtcgct 60 cgtaccgatg ctgttggtgc caccctcatc cagtccaata tcgatacrag ggaccatcag 120 tttattcttg gtgtgactaa ccctaagctt aaaggcaaag ggttagccac acttttktcy 180 gaggcaatgg ctgctgggaa aagcggkcct gagcttcaag ctctagaaga taattggcta 240 tcgatggctc atttgaagac gttttctgat gccgttgttg atgcaattgg agcaatgaac 300 gctactgaca tcgagaaaag aaggaagcta aatgaatgga tgaactgttc tagctacgag 360 aagtgtttgt cga 373 <210> 49 <211> 457 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 49 aactttatcc caacaattgc aargctgggc tatgtttggc agttcataac actggcgggt 60 ttccatgctg acgccttggt ggttgataca tttgcaaaag attacgcgac aagagggatg 120 ttggcttatg tggagaggat tcaaagggag gaaaggaaac atggtgtgga cacattggct 180 catcaaaaat ggtctggtgc taattaytat gacagggtgc ttagractgt tcaaggtggt 240 attacctcaa cagctgctat gggcaaaggt aaataaactt ttcatccttt agtgactaaa 300 aacgagtccg taaattacat taaatctacc actacggttt tttgtgacac aaattgtgtc 360 gctagaatcg accgagtaat tatttttgtg ttactaatgt ctattgtaaa tgcaggagtg 420 actgaggaac aatttaagga gacgtggacg aggtctg 457 <210> 50 <211> 274 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 50 caaaaatggt ctggtgctaa ttaytatgac agggtgctta gractgttca aggtggtatt 60 acctcaacag ctgctatggg caaaggtaaa taaacttttc atcctttagt gactaaaaac 120 gagtccgtaa attacattaa atctaccact acggtttttt gtgacacaaa ttgtgtcgct 180 agaatcgacc gagtaattat ttttgtgtta ctaatgtcta ttgtaaatgc aggagtgact 240 gaggaacaat ttaaggagac gtggacgagg tctg 274 <210> 51 <211> 502 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Chrysanthemum <400> 51 tcttcatatc caccgtgcaa tgcatgcagt tatcgataga cagaagaatc atggtatgca 60 ctttcgtgta ctagctaaag cgttacgttt gtctggtgga gatcatattc atgctggtac 120 cgtagtaggt aaacttgaag gggaaagaga aatcacttta ggttttgttg atttactacg 180 tgatgattat attgagaaag atcgaagccg cggtatttat ttcactcagg attgggtctc 240 tctaccgggt gttctgcccg ttgcttcggg gggtattcac gtttggcata tgcccgctct 300 taccgagatc tttggagatg attccgtact acaattcggg gggggaactt tagggcaccc 360 ttggggaaat gcacctggtg ccgtagctaa ccgagtagct ctagaagcat gtgtacaggc 420 tcgtaatgag ggacgtgatc ttgctcgtga ggggaatgaa attattcgtg aggctagcaa 480 atggagtcct gaattagctg ct 502

Claims (8)

1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC1 프라이머 세트;
   서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC5 프라이머 세트;
   서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC6 프라이머 세트;
   서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC8 프라이머 세트;
   서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC9 프라이머 세트;
   서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC13 프라이머 세트;
   서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC28 프라이머 세트;
   서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC30 프라이머 세트;
   서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC34 프라이머 세트;
   서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC39 프라이머 세트;
   서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC41 프라이머 세트;
   서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC42 프라이머 세트;
   서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC43 프라이머 세트;
   서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC48 프라이머 세트;
   서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC59 프라이머 세트;
   및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC61 프라이머 세트를 포함하고, 하기 표에 기재된 국화 품종 가운데 하나 이상을 식별하는, 국화 품종식별용 프라이머 세트
   [표]
   

   

   
   .
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC1 프라이머 세트는 서열번호 35의 165번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하고,
   서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC5 프라이머 세트는 서열번호 36의 23번째 염기인 단일염기다형성 A와 T를 식별하고,
   서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC6 프라이머 세트는 서열번호 37의 20번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하고,
   서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC8 프라이머 세트는 서열번호 38의 22번째 염기인 단일염기다형성 A와 T를 식별하고,
   서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC9 프라이머 세트는 서열번호 39의 2번째 내지 20번째 염기의 삽입-결실(indel)를 식별하고,
   서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC13 프라이머 세트는 서열번호 40의 20번째 염기인 단일염기다형성 A와 G를 식별하고,
   서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC28 프라이머 세트는 서열번호 41의 165번째 염기인 단일염기다형성 A와 G를 식별하고,
   서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC30 프라이머 세트는 서열번호 42의 25번째 염기인 단일염기다형성 G와 A를 식별하고,
   서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC34 프라이머 세트는 서열번호 43의 32번째 염기인 단일염기다형성 T와 A를 식별하고,
   서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC39 프라이머 세트는 서열번호 44의 244번째 염기인 단일염기다형성 T와 C를 식별하고,
   서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC41 프라이머 세트는 서열번호 45의 17번째 염기인 단일염기다형성 G와 A를 식별 및 20번째 염기인 단일염기다형성 A와 C를 식별하고,
   서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC42 프라이머 세트는 서열번호 46의 22번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별 및 31번째 염기인 단일염기다형성 C와 G를 식별하고,
   서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC43 프라이머 세트는 서열번호 47의 26번째 내지 27번째 염기인 단일염기다형성 CC와 GT를 식별하고,
   서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC48 프라이머 세트는 서열번호 48의 21번째 염기인 단일염기다형성 T와 A를 식별하고,
   서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC59 프라이머 세트는 서열번호 49의 23번째 염기인 단일염기다형성 A와 G를 식별하고, 및
   서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DkC61 프라이머 세트는 서열번호 50의 24번째 염기인 단일염기다형성 C와 T를 식별하는 것인, 국화 품종식별용 프라이머 세트.
4. 청구항 1의 국화 품종식별용 프라이머 세트를 포함하고, 하기 표에 기재된 국화 품종 가운데 하나 이상을 식별하는, 국화 품종식별용 키트
   [표]
   

   

   
   .
5. 국화로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 1의 국화 품종식별용 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
   얻어진 증폭 산물로부터 하기 표에 기재된 국화 품종 가운데 상기 국화의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 국화 품종을 식별하는 방법
   [표]
   

   

   
   .
6. 청구항 5에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계는 대립유전자 특이적 중합효소 연쇄반응에 의한 것인, 국화 품종을 식별하는 방법.
7. 청구항 5에 있어서, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 국화 품종을 식별하는 방법.
8. 청구항 5에 있어서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 국화의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 청구항 1의 국화 품종식별용 프라이머 세트에 의해 하기 표에 기재된 국화 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것인, 국화 품종을 식별하는 방법
   [표]
   

   

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