KR20220105025A - 수레국화속 식물 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수레국화속 식물에 속하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 프라이머 세트에 대한 것이다. 보다 상세하게는 상기 두 식물의 식물 엽록체 유전체를 파악하고, 이를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 이용하여 제작한 프라이머 및 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 노란수레국화 또는 분홍수레국화에 대하여 각각 특정적으로 증폭되므로, 침입외래종인 상기 두 식물을 빠르고 정확하게 판별하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

수레국화속 식물 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer sets for discrimination plants of Centaurea, and use thereof}
본 발명은 침입 외래종인 수레국화속 식물에 속하는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 또는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 각각을 판별할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
세계적으로 유전자원 보유국의 지위인정과 생명자원 보전의 필요성에 대한 관심이 고조되고 있는 추세이며, 세계 각국은 국가 신성장동력 창출의 기본소재이자 자국 식량 안보의 핵심인 식물유전자원의 확보와 보존에 막대한 노력을 경주하고 있다. 이를 위한 활동으로 생물다양성협약(Convention on Biological Diversity, CBD), 멸종위기에 처한 야생동식물 국제거래 협약(Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora, CITES) 등이 있다.
또한 생물유전자원 접근과 이익 공유(Access to genetic resources and Benefit Sharing, ABS)에 대한 적극적 대응과 함께 세계 생명자원전쟁에 대비하여 자원을 확보하고 이용기반을 구축해야 하는 상황이지만 지구 온난화 등 환경 변화에 따른 자원조성 전략의 조정이 필요하다. 이에 있어, 침입 외래종(Invasive Alien Species, IAS)이 20세기 이후 지구의 생물다양성에 가장 위협적인 요소로 제기되고 있다.
특히 기후변화와 연계되어 복합적으로 나타나는 침입 외래종의 문제는 세계 GDP의 10%를 소모시키는 21세기 지구의 가장 주요한 환경문제로 지적되고 있다. 이로 인해, 세계 침입종 프로그램(Global Invasive Species Program, GISP)은 국가 차원에서 기후변화와 침입외래종의 문제를 연계시켜 접근하고 대응해야 함을 지적하고 있으며 최근 유엔은 지속가능개발목표(Sustainable Development Goals, SDG)로 2020년까지 침입외래종의 유입과 피해저감을 설정하고 있다.
우리나라에 있어서, 소나무재선충, 뉴트리아, 황소개구리, 붉은귀거북, 파랑볼우럭(블루길), 큰입배스(배스), 뒤영벌, 솔입혹파리 등 침입 외래종에 의한 국내 생태계 훼손 및 농업, 산업 분야 피해는 이미 주요한 사회이슈로 여겨지고 있다. 더불어 향후 기후변화에 따른 새로운 침입 외래종의 도입과 기존 침입외래종의 확산 등에 의해 생태계 혼란이 가중될 것으로 예측되고 있다.
그러나 기후변화 등에 따른 외래종의 생리, 생태적 변화를 평가하고, 이와 연계하여 외래종의 사전 침입예방 대책 수립은 물론 침입외래종을 관리하는 국가와 지역 차원의 전략수립은 아직까지 이루어지지 않고 있으며, 침입외래종을 선별할 수 있는 특정 방법 또한 확립되어 있지 않은 상태이다.
특히 침입 외래종 중 식물에 있어서, 국화과 외래식물은 열매에 달린 관모를 통해 바람을 이용한 장거리 확산이 가능하여 출현빈도가 가장 높은 것으로 알려져 있다.
상기 국화과에 속하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis)는 가축에 치명적인 독성을 포함하고 있으며, 식물의 가시로 인해 방목된 가축의 식물 섭취 속도를 늦추고 다른 식물의 발아 및 성장을 제한하는 등 경제적, 환경적으로 광범위한 영향을 미친다.
더불어 분홍수레국화(Centaurea maculosa)는 식물체에 있는 가시로 가축의 입과 소화기관에 상처를 주며, 특수한 화학물질을 분비해 다른 종의 생장을 억제하여 생물 다양성을 감소시키는 등 경제적, 환경적으로 광범위한 영향을 미친다.
따라서 국내 식물 생태계 및 가축의 보호를 위하여 다양한 식물종에서 상기 두 식물을 명확하게 판별하여 제거하는 것이 필요하나, 현재 상기 두 식물을 정확하게 구별할 수 있는 방법은 없는 실정이다.
지금까지 식물(특히 종자)의 형태학적 특징을 이용한 분류 동정 기법에 크게 의존하고 있으며, 최근 환경부 국립생물자원관과 국립과학수사연구연 (안전행정부) 등을 중심으로 DNA barcode를 이용한 식물자원의 유전자 판별감식에 관한 분자유전학적 연구가 수행되거나 향정신성 식물의 분자마커개발 등에 관한 연구가 준비 중에 있다.
그러나, 식물군에 따라서는 대표적인 DNA 바코드(barcode) 구간인 비암호화(noncoding) 지역의 재현성이 현저히 낮거나, 핵 DNA ITS지역의 염기서열과 엽록체 DNA의 rbcL, matK 유전자 등이 과내 또는 속내 분류군간에 동일하거나(예, 인동과 등), 해상력이 매우 낮은 문제점이 있다.
따라서 상기 문제점을 극복하여 국내 분포하는 다양한 식물 중에서 상기 분홍수레국화 및 노란수레국화를 각각 정확하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 침입 외래종인 수레국화속(Centaurea)에 속하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 각각을 판별할 수 있는 ARMS(Amplification refractory mutation system)-PCR 방법을 적용한 프라이머를 제작하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수레국화속 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 프라이머 세트에 대한 것으로, 보다 상세하게는 노란수레국화 또는 분홍수레국화 엽록체 유전체를 파악하고 이를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 이용하여 제작한 프라이머 및 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 조합의 프라이머 세트는 노란수레국화 또는 분홍수레국화에 대하여 각각 특정적으로 증폭되므로, 침입외래종인 상기 두 식물을 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 수레국화속(Centaurea) 식물인 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 엽록체 유전체의 유전자 지도에 대한 도이다.
도 2는 수레국화속 식물인 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 엽록체 유전체의 유전자 지도에 대한 도이다.
도 3은 노란수레국화에 있어서, ARMS(Amplification refractory mutation system) 방법을 적용하여 제작한 프라이머들을 다양하게 조합한 후, 각각의 증폭 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 분홍수레국화에 있어서, ARMS 방법을 적용하여 제작한 프라이머들을 다양하게 조합한 후, 각각의 증폭 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 노란수레국화에 있어서, 확정된 조합의 ARMS 기반 프라이머의 증폭 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 분홍수레국화에 있어서, 확정된 조합의 ARMS 기반 프라이머의 증폭 여부를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 침입 외래종인 수레국화속(Centaurea)에 속하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 각각을 판별할 수 있는 프라이머를 제작하고, 이에 있어 각 대상종에 대하여 판별 특이성을 높인 조합의 프라이머 세트를 도출하였다.
따라서 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, “외래종”은 도입종, 귀화종, 침입종을 통칭하는 용어로 특정한 인위적 목적 여부에 관계없이, 본래의 자생지가 아닌 외부에서 들어와 다른 생물의 서식지를 점유하여 번식하는 생물종을 지칭한다. 또한 “침입 외래종”은 생태계에 도입되고 확산되면서 생물다양성과 연계된 생태계서비스를 위협하거나 또는 악영향을 미치는 외래종을 의미한다.
상기 외래종의 위해성 평가의 기준은 첫째, 외래생물 중 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물, 둘째, 외래생물에 해당하지 아니하는 생물 중 특정지역에서 생태계의균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물, 셋째, 유전자의변형을 통하여 생산된 유전자변형생물체 중 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물로 규정하고 있다.
상기 침입 외래종은 유전자원의 유용성(availability)을 변화시키거나 침입하는 생태계의 체계(연대)를 교란시켜 생태계의 기능을 변화시키고 토속과 외래종의 교잡을 통해 생태계의 유전자 풀을 변화시키며 토양에서의 물질대사과정을 변화시키고 특히 탄소포획과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히 토속종간의 위치, 생태학적 지위, 자리 경쟁이 나타나며 토속종의 다양성을 감소시키는 원인이 되고 있다.
본 발명에 있어서, 수레국화속(Centaurea) 품종 식물은 국화과에 속하며, 350 내지 600 종을 포함하는 속의 식물이다. 상기 수레국화속 품종 식물은 귀화식물(Naturalisation) 또는 생태계교란식물로 불리며, 이는 외국에서 자생하던 종이 침입하거나 재배식물의 씨앗이 야생으로 번진 종들을 의미하고, 토종식물보다 월등히 뛰어난 생장 능력을 가지고 있다. 안정화되어 있던 식물생태계가 외부요인에 의해 변화가 있을 시에 쉽게 유입, 정착, 확산, 우점하여 생태계를 교란하여 피해를 준다.
우리나라에서도 수레국화속 품종 식물 그 중에서도 노란수레국화 및 분홍수레국화의 번식에 의한 다양한 피해 사례가 발생하는 바, 이의 제거를 위하여 명확하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.
따라서 본 발명은 노란수레국화 또는 분홍수레국화를 판별(식별)하기 위하여, 각 식물의 엽록체 유전체 중 특이적 SNP를 보유한 유전자를 탐색하고, ARMS-PCR 기법을 적용하여 상기 유전자를 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
본 발명에 있어서, 상기 “단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)”은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.
본 발명에 있어서, “다형성(polymorphism)”은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에 있어서, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 “프라이머”는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
상기 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862), 및 미국 특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
특히 본 발명은 노란수레국화 및 분홍수레국화 각각의 엽록체 유전체를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 적용하여 제작한 프라이머인 것을 특징으로 한다. 상기 "ARMS(Amplification refractory mutation system)" 방법은 점 돌연변이(point mutation)를 검출하는 방법이다. PCR 반응시에 프라이머의 3’염기서열은 결정적으로 이후의 PCR 반응 여부에 작용하므로, 만약 프라이머의 3’염기서열이 점 돌연변이 등에 의해 달라지면 이후의 과정이 성공적으로 진행되지 않아 대상지역을 증폭할 수 없다는 원리를 이용한 기법을 의미한다.
상기 원리를 이용하여 대상종에만 특이적으로 반응할 수 있는 프라이머를 제작하게 되면 이를 분자수준에서 종을 식별할 수 있는, 종특이적인 분자 마커로 이용할 수 있다. 종특이적인 마커개발을 위해서는 변이가 나타난 SNP 지역을 프라이머의 3’말단에 위치하도록 프라이머의 위치를 결정한 후, 3’말단 바로 앞의 염기를 다른 염기로 치환하여 프라이머를 제작한다.
이렇게 되면 대상종은 제작한 프라이머에서 3’말단 바로 앞의 염기서열이 달라지고, 나머지 비교종들은 프라이머의 3’말단 부분에서 2개의 염기가 달라져 증폭이 어려워진다. 이 때 염기 간의 부조화(mismatch) 정도를 고려하여 바꿀 염기를 결정하게 된다. 그 후 제작한 종특이적 프라이머가 특이적으로 반응할 수 있는 PCR 반응 조건을 찾고, 확인된 실험 조건이 다른 집단 및 다른 개체에서도 동일한 결과를 생산하는지 복수의 실험재료를 대상으로 검증작업을 마치면 해당 프라이머를 대상종의 종특이적 분자 마커로 활용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트인 것을 특징으로 한다.
더불어 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트 중 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머쌍은 노란수레국화(Centaurea solstitialis)를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
더불어 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트 중 상기 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머쌍은 분홍수레국화(Centaurea maculosa)를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 키트를 제공한다.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “중합효소연쇄반응“은 DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 실험법을 의미하며, 예로는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele Specific Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip) 및 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법이며, 상기 판별 방법에 있어서 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 엽록체 DNA 추출
수레국화속(Centaurea) 식물인 노란수레국화(Centaurea solstitialis), 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 및 잔디잎소귀나물(Centaurea diffusa)의 엽록체 DNA를 분리하였다. 더불어 비교군으로서 근연분류군인 홍화(Carthamus tinctorius)의 엽록체 DNA 또한 분리하였다. 구체적으로, 각 식물별로 50-100g 상당의 신선하고 어린 잎을 준비하여 이물질이 없도록 증류수를 이용하여 씻어서 물기를 닦아낸 후, 냉장상태로 2-3일 보관하여 불필요한 전분 생성을 억제하였다.
준비한 잎을 1-2 cm2 정도의 크기로 절단한 후, 분리 버퍼(Isolation buffer(CIB; 0.35M Sorbitol, 50Mm Tris-HCl, 5mM EDTA, 0.1% BSA (w/v, sigma A4503), 0.01% DL-DTT))를 상기 잎이 잠길 만큼 넣고 혼합하였다. 혼합한 샘플을 먼저 4겹의 거즈를 이용하여 짠 다음, 다시 3겹의 미라클로스(miracloth (CALBIOCHEM Co.))를 이용하여 자연적으로 분리하였다. 그런 후 200g에서 3분간 원심분리하여 상층액을 모아 1,000g에서 7분간 다시 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 펠렛(pellet)에 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)를 제거한 CIB(chloroplast isolation buffer)를 넣어 용해시켰다. 그런 후, 40/80% 퍼콜 구배(Percoll gradient)를 이용하여 3,200g에서 15분간 원심분리하여 엽록체 층을 분리하였다. 엽록체 층만을 수집하여 3배에 해당하는 CIB(BSA를 제거한 buffer)를 첨가한 후 1,700g에서 1분간 원심분리하여 정제된 엽록체로 구성된 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛에 BSA를 제거한 CIB를 넣어 용해한 다음, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Cat. No. 69104)를 이용하여 엽록체 DNA를 분리하여 NGS 분석용 템플레이트(template)로 이용하였다.
실시예 2. 엽록체 DNA 분석
2.1 엽록체 DNA 분석 방법
상기 추출한 엽록체 DNA를 분석하기 위하여 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)을 통한 데이터 생성, 갭-채우기(Gap-filling), 어노테이션(Annotation), 비교 분석(Comparative analysis) 및 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 수행하였다. 상기 실시예 1에서 추출한 DNA를 이용한 NGS 분석이 완료된 후 생성된 데이터(reads)를 이용하여 1차적으로 신생조합방법(de novo assembly)으로 분석하였다. 이를 통해 엽록체 게놈에 해당하는 reads를 모아 스캐폴드 컨티그(scaffold contig)를 만들고 레퍼런스 시퀀스(Reference sequence)와 비교하여 갭(gap)들을 확인하였다. 그런 후 레퍼런스 시퀀스의 해당 지역에 대한 염기서열을 이용하여 갭-채우기(gap-filling)용 프라이머를 제작하고 마크로젠(서울특별시에 위치)에 의뢰하여 생어 방법(Sanger method)으로 염기서열을 확인하여 모든 갭들을 채웠다. 최종적으로 갭-채우기를 완료한 후 전체 엽록체 게놈의 염기서열을 결정하였다. 최종적으로 결정된 염기서열을 이용하여 엽록체 게놈 상의 유전자의 종류 및 순서를 확인하는 어노테이션 과정을 수행하였다. 이를 위하여 엽록체 게놈 분석에서 주로 사용하는 플랫폼인 도그마(DOGMA)와 지니어스(Geneious) 프로그램을 사용하였다.
어노테이션 과정을 수행한 후 근연분류군의 엽록체 게놈 염기서열과 비교 분석하여, 해당 분류군의 엽록체 게놈의 구조적 특징이나 변이 정도 등에 대해 분석하였다.
2.2 엽록체 DNA 분석 결과
수레국화속(Centaurea)속 식물들과 근연분류군인 홍화(Carthamus tinctorius)의 엽록체 유전체를 비교하여 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다(표 1: 수레국화속 식물의 엽록체 유전체 유전자), 표 2: 수레국화속 식물과 홍화의 엽록체 유전체의 길이 및 AT 함량 비교). 더불어 확인한 분홍수레국화의 엽록체 유전체의 유전자 지도 및 노란수레국화의 엽록체 유전체의 유전자 지도를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.
분홍수레국화 엽록체 유전체의 유전자 지도에 따르면 도 1과 같이, 엽록체 유전체 크기는 152,518 bp이며, 총 114개의 유전자로 구성됨을 확인하였다(RNA 유전자 (34개), 단백질 유전자 (46개), 리보솜의 단백질(ribosomal protein) (21개), 전사/번역(transcription/translation) (13개)).
더불어 노란수레국화 엽록체 유전체의 유전자 지도에 따르면 도 2와 같이, 엽록체 유전체 크기는 151,967 bp이며, 총 114개의 유전자로 구성됨을 확인하였다(RNA 유전자 (34개), 단백질 유전자 (46개), 리보솜의 단백질(ribosomal protein) (21개), 전사/번역(transcription/translation) (13개)).
상기 분홍수레국화 및 노란수레국화의 엽록체에 포함되는 RNA 유전자, 단백질 유전자, 리보솜의 단백질, 전사/번역 유전자에 해당하는 유전자 목록은 하기 표 1에 나타내었으며, 두 식물간 동일한 것을 확인하였다.
유전자 그룹 유전자 명칭 갯수
RNA 유전자 리보솜 RNAs rrn4.5, rrn5, rrn16, rrn23 4
트랜스퍼 RNAs
(Transfer RNAs)		 trnA-UGC, trnC-GCA, trnD-GUC, trnE-UUC, trnF-GAA, trnfM-CAU, trnG-GCC, trnG-UCC, trnH-GUG, trnI-CAU, trnI-GAU, trnK-UUU, trnL-CAA, trnL-UAA, trnL-UAG, trnM-CAU, trnN-GUU, trnP-UGG, trnQ-UUG, trnR-ACG, trnR-UCU, trnS-GCU, trnS-GGA, trnS-UGA, trnT-CGU, trnT-UGU, trnV-GAC, trnV-UAC, trnW-CCA, trnY-GUA 30
단백질 유전자 광계(Photosystem) I psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ 5
광계(Photosystem) II psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ 15
시토크롬(Cytochrome) petA, petB, petD, petG, petL, petN 6
ATP 합성(ATP synthases) atpA, atpB, atpE, atpF, atpH, atpI 6
루비스코의 큰 단위
(Large unit of Rubisco)		 rbcL 1
NADH 탈수소효소
(NADH dehydrogenase)		 ndhA, ndhB, ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK 11
ATP-의존적 프로테아제 서브유닛 P
(ATP-dependent protease subunit P)		 clpP 1
외피막 단백질(Envelope membrane protein) cemA 1
리보솜의 유전자 리보솜의 큰 단위(Large units of ribosome) rpl14, rpl16, rpl2, rpl20, rpl22, rpl23, rpl32, rpl33, rpl36 9
리보솜의 작은 단위(Small units of ribosome) rps11, rps12, rps14, rps15, rps16, rps18, rps19, rps2, rps3, rps4, rps7, rps8 12
전사/번역 유전자 RNA 폴리머라아제
(polymerase)		 rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2 4
개시인자(Initiation factor) infA 1
기타 단백질
(Miscellaneous protein)		 accD, ccsA, matK 3
가상 단백질 및 보존된 판독 프레임
(Hypothetical proteins and conserved reading frames)		 ycf1, ycf15, ycf2, ycf3, ycf4, 5
총 　 　 114
더불어 하기 표 2에 따르면, 수레국화속 식물 중에서 잔디잎소귀나물이 153,202bp로 가장 긴 것으로 나타났으며, 노란수레국화가 151,967bp로 가장 짧은 것으로 확인되었다. 더불어 수레국화속 식물들은 AT 함량(content)이 유사하게 나타났다.
종 LSC
(large single copy) 		SSC
(small single copy) 		역반복
(Inverted Repeat, IRs) 		총
길이 (bp) AT (%) 길이 (bp) AT (%) 길이 (bp) AT (%) 길이 (bp) AT (%)
분홍수레국화
(Centaurea maculosa) 		83,595 64.1 18,487 68.6 25,218 56.9 152,518 62.3
노란수레국화
(Centaurea solstitialis) 		83,255 64.0 18,577 68.5 25,066 56.8 151,967 62.2
잔디잎소귀나물
(Centaurea diffusa) 		83,596 64.1 18,487 68.6 25,238 56.8 153,202 62.2
홍화
(Carthamus tinctorius) 		84,166 64.0 18,598 68.6 25,156 56.9 153,114 62.2
실시예 3. 분홍수레국화 및 노란수레국화 특이적 프라이머 개발
3.1 각 식물별 특이적 유전자 탐색
상기 실시예 2에서 확인한 분홍수레국화와 노란수레국화 엽록체 유전체를 기반으로 상기 두 식물을 구분할 수 있는 특이적인 유전자를 확인하였다. 구체적으로 상기 실시예 2에서 확인한 각 식물의 엽록체 유전자의 염기서열을 MAFFT v.7 (https://mafft.cbrc.jp /alignment/server/)을 이용하여 정렬하였으며, DNAsp v.6 (http://www.ub.edu/dnasp/)을 이용하여 SNP를 탐색하였다. 더불어 PAUP v.4.10b를 이용하여 근연 결합 계통도(neighbour joining(NJ) dendrogram)를 작성한 후 유연관계를 분석하였다. 그 결과 엽록체 유전자의 42개 지역, 핵 유전자의 38개 지역(Asteraceae universal COS gene 36site, ITS 2site) 총 80개 지역을 후보군으로 선정하였다.
상기 후보군을 기반으로 생거 시퀀싱을 통해 각 유전자에 있어서 특이적 SNP 지역(SNP site)을 확인하였다.
3.2 프라이머 제작
그 결과 분홍수레국화에서 3개 유전자(ITS, At3g44680, ycf2), 노란수레국화에서 3개 유전자(ITS, ycf2, rbcL)에 특이적인 SNP 지역이 있음을 확인하였고 상기 확인된 유전자들을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
유전자 증폭은 Solgent Diastar Taq polymerase(Solgent, Korea)를 이용하여 증폭하였으며, PCR 반응은 터치다운 PCR(Touchdown PCR) 기법을 이용하였다. 1번째 단계에서 98℃, 5분간 초기 변성 후 98℃에 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 30초간 반응시켰다. 이때 1회 반복마다 어닐링 온도(annealing temperature)를 1℃씩 낮췄으며, 이를 10회 반복하였다. 그리고 2번째 단계에서 98℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초를 20회 반복하고 이어서 72℃에서 10분간 수행하였다.
추출(Purification)은 PCR 생성물(products)을 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 분리하였으며, Wizardⓡ SV Gel 및 PCR Clean-UP System(Promega)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 겔에서부터 DNA를 추출하였다. DNA 염기서열은 다카라코리아바이오메디칼(TaKaRa Korea Biomedical Inc.)에 의뢰하여 ABI PRISM(model 3700, version 3.6.1) 자동 DNA 염기서열 분석(automatic sequencer)을 통해 결정하였다.
그러나 상기와 같이 제작한 프라이머를 이용하여 분홍수레국화 및 노란수레국화 선별을 위한 PCR 반응을 수행하였을 때, 일부를 제외하고 모두 동일한 크기의 DNA 밴드를 생산하는 것으로 확인되었다(데이터 미기재). 따라서 상기 프라이머는 특이성이 부족한 것으로 판단되어, 이에 ARMS-PCR 기법을 적용하여 ARMS 기반 프라이머를 제작하였다.
먼저, 프라이머 길이를 19-23 염기서열로 설정하였고 3‘말단에서 2번째 염기서열에 미스매치(mismatch)를 주었다. GC 함량은 50-60%로 설정하였으며, OligoAnalyzer Tool(sd.idtdna.com/calc/analyzer)를 이용하여 헤어핀(Hairpin), 셀프-다이머(Self-Dimer), 헤테로-다이머(Hetero-Dimer)를 측정하였다. 헤어핀은 25℃ 이상이며 셀프-다이머, 헤테로-다이머 모두 5개 이상의 결합을 가지지 않는 것을 선별하였다. 이를 토대로 PCR 진행 시 특정 종에서만 프라이머 어닐링(Primer annealing) 및 연장(Extension)이 진행되는 ARMS 기반 프라이머를 제작하였다. 상기와 같이 제작된 ARMS 기반 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
타겟 종 프라이머 방향 시퀀스 (5'-3') 크기
노란수레국화 S-ITS-2GF F TGCCCTGCGATGCTTGCGA 510
S1-ITS-2CF F TGCCCTGCGATGCTTGCCA
S1-ITS-2AF F TGCCCTGCGATGCTTGCAA
S1-ITS-3GF F TGCCCTGCGATGCTTGGTA
S1-ITS-3TF F TGCCCTGCGATGCTTGTTA
S1-ITS-3AF F TGCCCTGCGATGCTTGATA
S1-ITS-2TR R CGAGCAACTCTCTAGCATCTG
S1-ITS-2CR R CGAGCAACTCTCTAGCATCCG
S1-ITS-2GR R CGAGCAACTCTCTAGCATCGG
S1-ITS-3GR R CGAGCAACTCTCTAGCATGAG
S1-ITS-3TR R CGAGCAACTCTCTAGCATTAG
S1-ITS-3AR R CGAGCAACTCTCTAGCATAAG
S2-ITS-2AF F ATGCGTTCAACGTGCCTAAA 502
S2-ITS-2GF F ATGCGTTCAACGTGCCTAGA
S2-ITS-2CF F ATGCGTTCAACGTGCCTACA
S2-ITS-3TF F ATGCGTTCAACGTGCCTTTA
S2-ITS-3CF F ATGCGTTCAACGTGCCTCTA
S2-ITS-3GF F ATGCGTTCAACGTGCCTGTA
S2-ITS-2AR R AGCTCGATACGAAGGCCTAA
S2-ITS-2CR R AGCTCGATACGAAGGCCTCA
S2-ITS-2GR R AGCTCGATACGAAGGCCTGA
S-RBCL2TF F CGTGCTCTACGTCTGGTG 771
S-RBCL2CF F CGTGCTCTACGTCTGGCG
S-RBCL2GF F CGTGCTCTACGTCTGGGG
S-RBCL3TF F CGTGCTCTACGTCTGTAG
S-RBCL3AF F CGTGCTCTACGTCTGAAG
S-RBCL3CF F CGTGCTCTACGTCTGCAG
S-RBCL2GR R CATATGCCAAACGTGAATACGG
S-RBCL2AR R CATATGCCAAACGTGAATACAG
S-RBCL2TR R CATATGCCAAACGTGAATACTG
S-RBCL3GR R CATATGCCAAACGTGAATAGCG
S-RBCL3TR R CATATGCCAAACGTGAATATCG
S-RBCL3AR R CATATGCCAAACGTGAATAACG
S-YCF22AF F AAACCCTCCACTTCAATTGGTAAC 720
S-YCF22CF F AAACCCTCCACTTCAATTGGTACC
S-YCF22GF F AAACCCTCCACTTCAATTGGTAGC
S-YCF23TF F AAACCCTCCACTTCAATTGGTTTC
S-YCF23CF F AAACCCTCCACTTCAATTGGTCTC 720
S-YCF23GF F AAACCCTCCACTTCAATTGGTGTC
S-YCF22AR R TTTTTTCCACCAAGAACGTTTAC
S-YCF22CR R TTTTTTCCACCAAGAACGTTTCC
S-YCF22GR R TTTTTTCCACCAAGAACGTTTGC
S-YCF23AR R TTTTTTCCACCAAGAACGTTATC
S-YCF23GR R TTTTTTCCACCAAGAACGTTGTC
분홍수레국화 M-ITSF F CCAAGGAAAACAAAACTCAAGAAGGAC 480
M-ITS2TF F CCAAGGAAAACAAAACTCAAGAAGGTC
M-ITS2CF F CCAAGGAAAACAAAACTCAAGAAGGCC
M-ITS2GF F CCAAGGAAAACAAAACTCAAGAAGGGC
ITS4 R TCCTCCGCTTATTGATATGC
CMA35NF2T F GACCCATGTTGTATTGGATGTA 305
CMA35NF3T F GACCCATGTTGTATTGGATTGA
CMA35NF3A F GACCCATGTTGTATTGGATAGA
CMA35NF3C F GACCCATGTTGTATTGGATCGA
CMA35NR2T R ACCCAAAATTGACCCTTTTTG
CMA35NR3G R ACCCAAAATTGACCCTTTGCG
CMA35NR3C R ACCCAAAATTGACCCTTTCCG
CMA35NR3A R ACCCAAAATTGACCCTTTACG
STF2CF F TAAGTATCATACCAAATCCCACT 580
STF2AF F TAAGTATCATACCAAATCCCAAT
STF2GF F TAAGTATCATACCAAATCCCAGT
C16-1R R TCCAGGACCTTGTTCAGAAATAC
더불어 상기 표 3의 프라이머 중 정방향 프라이머와 역방향 프라이머에 있어서, 다양하게 조합하여 노란수레국화 또는 분홍수레국화 각각을 특이적으로 선별할 수 있는 조합의 프라이머 세트를 도출하였다.
각 프라이머를 다양하게 조합하여 PCR을 수행하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 노란수레국화 중 S1-ITS에 있어서, 4번(S1-ITS-3GF/S1-ITS-3GR) 조합이 가장 뚜렷한 밴드를 나타내었다. 더불어 S2-ITS에 있어서, 5번(S2-ITS-3CF/S2-ITS-2CR) 조합이 가장 뚜렷한 밴드를 나타내었다. 또한 rbcL에 있어서, 3번(S-RBCL2GF/S-RBCL2TR) 조합이 가장 뚜렷한 밴드를 나타내었다. 더불어 ycf2에 있어서, 2번(S-YCF22CF/S-YCF22CR) 조합이 가장 뚜렷한 밴드를 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 분홍수레국화 중 ITS에 있어서, 3번(M-ITS2CF/ITS4) 조합이 가장 강한 시그널(signal)을 보여주었다. ycf2에 있어서, 3번(STF2GF/C16-1R) 조합만 검출되는 것이 확인되었다. 더불어 At3g44680에 있어서, 1번(CMA35NF2T/CMA35NR2T) 조합만 검출되는 것을 확인하였다.
따라서 상기 도 3 및 도 4의 결과를 바탕으로 하기 표 4와 같이, 노란수레국화에 대한 프라이머 세트 4종, 분홍수레국화에 대한 프라이머 세트 3종을 확정하였다.
대상종 프라이머 염기서열(5'-3') 크기
(bp) 		위치 서열
번호
노란수레국화 S1-ITS-3GF TGCCCTGCGATGCTTGGTA 510 ITS(nca) 1
S1-ITS-3GR CGAGCAACTCTCTAGCATGAG 2
S2-ITS-3CF ATGCGTTCAACGTGCCTCTA 502 ITS(nc) 3
S2-ITS-2CR AGCTCGATACGAAGGCCTCA 4
S-RBCL2GF CGTGCTCTACGTCTGGGG 771 rbcL(cpb) 5
S-RBCL2TR CATATGCCAAACGTGAATACTG 6
S-YCF22CF AAACCCTCCACTTCAATTGGTACC 720 ycf2(cp) 7
S-YCF22CR TTTTTTCCACCAAGAACGTTTCC 8
분홍수레국화 M-ITS2CF CCAAGGAAAACAAAACTCAAGAAGGCC 480 ITS(nc) 9
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 10
STF2GF TAAGTATCATACCAAATCCCAGT 580 ycf2(cp) 11
C16-1R TCCAGGACCTTGTTCAGAAATAC 12
CMA35NF2T GACCCATGTTGTATTGGATGTA 305 At3g44680(nc) 13
CMA35NR2T ACCCAAAATTGACCCTTTTTG 14
* a, 핵(nuclear); b, 엽록체(chloropalst)
3.3 대상종에 대한 확정된 프라이머 조합의 특이적 증폭 확인
더불어 상기 표 4의 프라이머에 있어서, 확정된 각 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 쌍이 각 종에 대해서만 특정적으로 증폭되는지 확인하여 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 그 결과 각 조합에 따른 프라이머 쌍은 각 종에 대하여 특정적으로 증폭됨을 확인하였다.
종합적으로 본 발명은 수레국화속 식물에 속하는 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별 기술에 대한 것으로, 보다 상세하게는 상기 두 식물의 식물 엽록체 유전체를 파악하고, 이를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 이용하여 제작한 프라이머 및 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 노란수레국화 또는 분홍수레국화에 대하여 각각 특정적으로 증폭되므로, 침입외래종인 상기 두 식물을 각각 빠르고 정확하게 판별하는데 유용하게 활용될 수 있다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primer sets for discrimination plants of Centaurea, and use thereof <130> 1-2P <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1-ITS-3GF <400> 1 tgccctgcga tgcttggta 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S1-ITS-3GR <400> 2 cgagcaactc tctagcatga g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S2-ITS-3CF <400> 3 atgcgttcaa cgtgcctcta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S2-ITS-2CR <400> 4 agctcgatac gaaggcctca 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-RBCL2GF <400> 5 cgtgctctac gtctgggg 18 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-RBCL2TR <400> 6 catatgccaa acgtgaatac tg 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-YCF22CF <400> 7 aaaccctcca cttcaattgg tacc 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S-YCF22CR <400> 8 ttttttccac caagaacgtt tcc 23 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M-ITS2CF <400> 9 ccaaggaaaa caaaactcaa gaaggcc 27 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 <400> 10 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STF2GF <400> 11 taagtatcat accaaatccc agt 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C16-1R <400> 12 tccaggacct tgttcagaaa tac 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMA35NF2T <400> 13 gacccatgtt gtattggatg ta 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMA35NR2T <400> 14 acccaaaatt gacccttttt g 21

Claims (8)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머쌍은 노란수레국화(Centaurea solstitialis)를 판별할 수 있는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머쌍은 분홍수레국화(Centaurea maculosa)를 판별할 수 있는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별용 키트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 판별용 키트.
  7. 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노란수레국화(Centaurea solstitialis) 또는 분홍수레국화(Centaurea maculosa) 판별 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
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KR20200049500A (ko) * 2018-10-30 2020-05-08 한국방송통신대학교 산학협력단 국화 품종 구별을 위한 ssr 마커 및 이의 용도

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