KR20220105116A - 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 캐나다엉겅퀴 식물 엽록체 유전체의 특정 SNP 마커 및 프라이머에 대한 것이다. 보다 상세하게는 캐나다엉겅퀴 엽록체 유전체의 특정 SNP 변이 지역을 확인하고 이를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 이용하여 제작한 프라이머 및 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 캐나다엉겅퀴에 대하여 특정적으로 증폭되므로 침입 외래종인 캐나다엉겅퀴를 보다 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별 방법에 관한 것이다.
세계적으로 유전자원 보유국의 지위인정과 생명자원 보전의 필요성에 대한 관심이 고조되고 있는 추세이며, 세계 각국은 국가 신성장동력 창출의 기본소재이자 자국 식량 안보의 핵심인 식물유전자원의 확보와 보존에 막대한 노력을 경주하고 있다. 이를 위한 활동으로 생물다양성협약(Convention on Biological Diversity, CBD), 멸종위기에 처한 야생동식물 국제거래 협약(Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora, CITES) 등이 있다.
또한 생물유전자원 접근과 이익 공유(Access to genetic resources and Benefit Sharing, ABS)에 대한 적극적 대응과 함께 세계 생명자원전쟁에 대비하여 자원을 확보하고 이용기반을 구축해야 하는 상황이지만 지구 온난화 등 환경 변화에 따른 자원조성 전략의 조정이 필요하다. 이에 있어, 침입 외래종(Invasive Alien Species, IAS)이 20세기 이후 지구의 생물다양성에 가장 위협적인 요소로 제기되고 있다.
특히 기후변화와 연계되어 복합적으로 나타나는 침입 외래종의 문제는 세계 GDP의 10%를 소모시키는 21세기 지구의 가장 주요한 환경문제로 지적되고 있다. 이로 인해, 세계 침입종 프로그램(Global Invasive Species Program, GISP)은 국가 차원에서 기후변화와 침입외래종의 문제를 연계시켜 접근하고 대응해야 함을 지적하고 있으며 최근 유엔은 지속가능개발목표(Sustainable Development Goals, SDG)로 2020년까지 침입외래종의 유입과 피해저감을 설정하고 있다.
우리나라에 있어서, 소나무재선충, 뉴트리아, 황소개구리, 붉은귀거북, 파랑볼우럭(블루길), 큰입배스(배스), 뒤영벌, 솔입혹파리 등 침입 외래종에 의한 국내 생태계 훼손 및 농업, 산업 분야 피해는 이미 주요한 사회이슈로 여겨지고 있다. 더불어 향후 기후변화에 따른 새로운 침입 외래종의 도입과 기존 침입외래종의 확산 등에 의해 생태계 혼란이 가중될 것으로 예측되고 있다.
그러나 기후변화 등에 따른 외래종의 생리, 생태적 변화를 평가하고, 이와 연계하여 외래종의 사전 침입예방 대책 수립은 물론 침입외래종을 관리하는 국가와 지역 차원의 전략수립은 아직까지 이루어지지 않고 있으며, 침입외래종을 선별할 수 있는 특정 방법 또한 확립되어 있지 않은 상태이다.
상기 침입 외래종 중 식물의 판별에 있어서, 지금까지 식물(특히 종자)의 형태학적 특징을 이용한 분류 동정 기법에 크게 의존하고 있으며, 최근 환경부 국립생물자원관과 국립과학수사연구연 (안전행정부) 등을 중심으로 DNA 바코드(barcode)를 이용한 식물자원의 유전자 판별감식에 관한 분자유전학적 연구가 수행되거나 향정신성 식물의 분자마커개발 등에 관한 연구가 준비 중에 있다.
그러나, 식물군에 따라서는 대표적인 DNA 바코드 구간인 비암호화(noncoding) 지역의 재현성이 현저히 낮거나, 핵 DNA ITS지역의 염기서열과 엽록체 DNA의 rbcL, matK 유전자 등이 과내 또는 속내 분류군간에 동일하거나(예, 인동과 등), 해상력이 매우 낮은 문제점이 있다.
따라서 상기 문제점을 극복하여 국내 분포하는 다양한 식물 중에서 타겟하는 침입 외래종 식물을 각각 정확하게 판별할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 침입 외래종인 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense (L.) Scop.)를 판별할 수 있는 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커와 이를 기반으로 ARMS(Amplification refractory mutation system)-PCR 방법을 적용한 프라이머를 제작하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 캐나다엉겅퀴 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 캐나다엉겅퀴 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 캐나다엉겅퀴 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 위치; 및 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 위치; 및 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 SNP를 포함하는 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 캐나다엉겅퀴 판별용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 캐나다엉겅퀴 엽록체 유전체의 특정 SNP 마커 및 프라이머에 대한 것으로, 보다 상세하게는 캐나다엉겅퀴 엽록체 유전체의 특정 SNP 변이 지역을 확인하고 이를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 적용하여 제작한 프라이머 및 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 캐나다엉겅퀴에 대하여 특정적으로 증폭되므로 침입 외래종인 캐나다엉겅퀴를 보다 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense (L.) Scop.) 엽록체 유전체의 유전자 지도에 대한 도이다.
도 2는 캐나다엉겅퀴 atpB 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 3은 캐나다엉겅퀴 rpoB 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 4는 캐나다엉겅퀴 psbA 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 5는 캐나다엉겅퀴 accD 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 6은 캐나다엉겅퀴 유전체에 있어서, 본 발명에 따른 조합의 프라이머 세트를 이용한 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nasted PCR)을 수행하였을 때 생성되는 단편의 크기를 나타낸 도이다.
도 7은 캐나다엉겅퀴에 있어서, 확정된 조합의 ARMS 기반 프라이머의 증폭 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 캐나다엉겅퀴 atpB 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 3은 캐나다엉겅퀴 rpoB 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 4는 캐나다엉겅퀴 psbA 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 5는 캐나다엉겅퀴 accD 염기서열 내 변이 양상 및 특정 SNP 지역을 확인한 도이다.
도 6은 캐나다엉겅퀴 유전체에 있어서, 본 발명에 따른 조합의 프라이머 세트를 이용한 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nasted PCR)을 수행하였을 때 생성되는 단편의 크기를 나타낸 도이다.
도 7은 캐나다엉겅퀴에 있어서, 확정된 조합의 ARMS 기반 프라이머의 증폭 여부를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 침입 외래종인 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)를 판별할 수 있는 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 확인하고, 이를 검출할 수 있는 제제인 프라이머를 제작하였다.
따라서 본 발명은 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 위치; 및 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "외래종"은 도입종, 귀화종, 침입종을 통칭하는 용어로 특정한 인위적 목적 여부에 관계없이, 본래의 자생지가 아닌 외부에서 들어와 다른 생물의 서식지를 점유하여 번식하는 생물종을 지칭한다. 또한 “침입 외래종”은 생태계에 도입되고 확산되면서 생물다양성과 연계된 생태계서비스를 위협하거나 또는 악영향을 미치는 외래종을 의미한다.
상기 외래종의 위해성 평가의 기준은 첫째, 외래생물 중 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물, 둘째, 외래생물에 해당하지 아니하는 생물 중 특정지역에서 생태계의균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물, 셋째, 유전자의변형을 통하여 생산된 유전자변형생물체 중 생태계의 균형을 교란하거나 교란할 우려가 있는 생물로 규정하고 있다.
상기 침입 외래종은 유전자원의 유용성(availability)을 변화시키거나 침입하는 생태계의 체계(연대)를 교란시켜 생태계의 기능을 변화시키고 토속과 외래종의 교잡을 통해 생태계의 유전자 풀을 변화시키며 토양에서의 물질대사과정을 변화시키고 특히 탄소포획과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히 토속종간의 위치, 생태학적 지위, 자리 경쟁이 나타나며 토속종의 다양성을 감소시키는 원인이 되고 있다.
본 발명에 있어서, 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense (L.) Scop., Cirsium arvense)는 엉겅퀴속(Cirsium)에 속하며, 유럽 원산의 귀화식물로 들판, 경작지 주변 등에서 자라는 여러해살이풀이다. 우리나라 경기도 안산을 중심으로 퍼져 나가 자라며, 세계적으로 아시아, 북아메리카에 귀화하여 분포한다. 서양가시엉겅퀴와 달리 땅속줄기로 번식하여 군락을 이루고 꽃은 암수딴포기로 핀다. 상기 캐나다엉겅퀴는 귀화식물(Naturalisation) 또는 생태계교란식물로 불리며, 이는 외국에서 자생하던 종이 침입하거나 재배식물의 씨앗이 야생으로 번진 종들을 의미하고, 토종식물보다 월등히 뛰어난 생장 능력을 가지고 있다. 안정화되어 있던 식물생태계가 외부요인에 의해 변화가 있을 시에 쉽게 유입, 정착, 확산, 우점하여 생태계를 교란하여 피해를 준다.
우리나라에서도 상기 캐나다엉겅퀴의 번식에 의한 다양한 피해 사례가 발생하는 바, 이를 명확하게 판별할 수 있는 판별 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명에 있어서, "단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)"은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, DNA 서열 다형성(polymorphism) 중에서 가장 많이 존재하는 형태이다.
본 발명에 있어서, "다형성(polymorphism)"은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며 다형성 부위 중에서, 사람에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명에 있어서, "대립유전자(allele)"는 상동염색체의 동일한 유전자 좌 위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP은 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명에 있어서, "마커(marker)"는 유전적으로 불특정 연관된 유전자 좌(genetic locus)를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 마커의 유전자 지도 상의 위치는 유전자 좌로 표시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 단일염기다형성 마커는 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense) atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 염기가 G인 단일염기다형성 마커; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 염기가 T인 단일염기다형성 마커; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 및 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째 염기가 G인 단일염기다형성 마커;인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 단일염기 다형성마커를 검출할 수 있는 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 또한 상기 폴리뉴클레오타이드는 단염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 프라이머는 3‘마지막 염기가 단일염기다형성 부위에 상보적으로 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
상기 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862), 및 미국 특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
특히 본 발명은 본 발명에서 확인한 SNP 변이 지역을 기반으로, ARMS-PCR 기법을 적용하여 상기 SNP 변이 지역을 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였다.
따라서 본 발명은 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 위치; 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 위치; 및 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 SNP를 포함하는 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "ARMS(Amplification refractory mutation system)" 방법은 점 돌연변이(point mutation)를 검출하는 방법이다. PCR 반응시에 프라이머의 3’염기서열은 결정적으로 이후의 PCR 반응 여부에 작용하므로, 만약 프라이머의 3’염기서열이 점 돌연변이 등에 의해 달라지면 이후의 과정이 성공적으로 진행되지 않아 대상지역을 증폭할 수 없다는 원리를 이용한 기법을 의미한다.
상기 원리를 이용하여 대상종에만 특이적으로 반응할 수 있는 프라이머를 제작하게 되면 이를 분자수준에서 종을 식별할 수 있는, 종특이적인 분자 마커로 이용할 수 있다. 종특이적인 마커개발을 위해서는 변이가 나타난 SNP 지역을 프라이머의 3’말단에 위치하도록 프라이머의 위치를 결정한 후, 3’말단 바로 앞의 염기를 다른 염기로 치환하여 프라이머를 제작한다.
이렇게 되면 대상종은 제작한 프라이머에서 3’말단 바로 앞의 염기서열이 달라지고, 나머지 비교종들은 프라이머의 3’말단 부분에서 2개의 염기가 달라져 증폭이 어려워진다. 이 때 염기 간의 부조화(mismatch) 정도를 고려하여 바꿀 염기를 결정하게 된다. 그 후 제작한 종특이적 프라이머가 특이적으로 반응할 수 있는 PCR 반응 조건을 찾고, 확인된 실험 조건이 다른 집단 및 다른 개체에서도 동일한 결과를 생산하는지 복수의 실험재료를 대상으로 검증작업을 마치면 해당 프라이머를 대상종의 종특이적 분자 마커로 활용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드이다.
또한 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 프라이머쌍 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 캐나다엉겅퀴를 판별하는 방법은 당분야에 공지된 어느 방법이든 적용될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nested PCR)을 수행하여 캐나다엉겅퀴를 판별하였다.
본 발명에 있어서, 상기 네스티드 PCR이란 타겟(target) 이외의 염기서열에 프라이머가 붙는 비 특이적 결합(non-specific binding)의 증폭을 줄이기 위한 방법이다. 기존 pcr은 타겟 DNA 염기서열 끝에 상보적인 프라이머를 필요로 하며 PCR 산물들은 사이클(cycle)에 따라 증폭된다. 그러나 기존 PCR은 프라이머가 타겟 템플레이트(target template) 염기부분이 아닌 부정확한 염기서열 부위에 부착되어 원치않는 가닥을 만들어내는 문제점을 가지고 있다. 상기 네스티드 PCR은 1차 PCR 반응 및 2차 PCR 반응이 수행되며, 1차 PCR 반응에서 생성되는 단편이 두 번째 PCR 반응의 템플레이트가 된다. 두 번째 PCR에서 프라이머가 어닐링(annealing)되지 않는 특징이 있다. 이를 통해 두 번째 PCR에서 범위를 타겟 시퀀스(target sequence)에 가깝게 더 좁게 잡아준다. 상기 방법은 비특이적 결합의 증폭 가능성이 낮고, 적은 양의 DNA를 사용하더라도 충분한 양의 증폭산물을 얻을 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 캐나다엉겅퀴 판별용 키트를 제공한다.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한 본 발명은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “중합효소연쇄반응“은 DNA 사슬 중에서 목적하는 일부분만을 대량으로 증폭시키는 실험법을 의미하며, 예로는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 대립유전자 특이 중합효소연쇄반응(Allele Specific Polymerase Chain Reaction), Nested-중합효소연쇄반응(Nested-Polymerase Chain Reaction), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip) 및 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법이며, 상기 판별 방법에 있어서 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 보다 바람직하게는 네스티드 PCR을 통해 수행될 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 엽록체 DNA 추출
엉겅퀴속(Cirsium) 식물인 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 엽록체 DNA를 분리하였다. 보다 구체적으로는 50-100g 상당의 신선하고 어린 잎을 준비하여 이물질이 없도록 증류수를 이용하여 씻어서 물기를 닦아낸 후, 냉장상태로 2-3일 보관하여 불필요한 전분 생성을 억제하였다.
준비한 잎을 1-2 cm2 정도의 크기로 절단한 후, 분리 버퍼(Isolation buffer(CIB; 0.35M Sorbitol, 50Mm Tris-HCl, 5mM EDTA, 0.1% BSA (w/v, sigma A4503), 0.01% DL-DTT))를 상기 잎이 잠길 만큼 넣고 혼합하였다. 혼합한 샘플을 먼저 4겹의 거즈를 이용하여 짠 다음, 다시 3겹의 미라클로스(miracloth (CALBIOCHEM Co.))를 이용하여 자연적으로 분리하였다. 그런 후 200g에서 3분간 원심분리하여 상층액을 모아 1,000g에서 7분간 다시 원심분리하였다. 원심분리 후 얻어진 펠렛(pellet)에 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)를 제거한 CIB(chloroplast isolation buffer)를 넣어 용해시켰다. 그런 후, 40/80% 퍼콜 구배(Percoll gradient)를 이용하여 3,200g에서 15분간 원심분리하여 엽록체 층을 분리하였다. 엽록체 층만을 수집하여 3배에 해당하는 CIB(BSA를 제거한 buffer)를 첨가한 후 1,700g에서 1분간 원심분리하여 정제된 엽록체로 구성된 펠렛을 수거하였다. 이 펠렛에 BSA를 제거한 CIB를 넣어 용해한 다음, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, Cat. No. 69104)를 이용하여 엽록체 DNA를 분리하여 NGS 분석용 템플레이트(template)로 이용하였다.
실시예 2. 엽록체 DNA 분석
2.1 엽록체 DNA 분석 방법
상기 추출한 엽록체 DNA를 분석하기 위하여 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)을 통한 데이터 생성, 갭-채우기(Gap-filling), 어노테이션(Annotation), 비교 분석(Comparative analysis) 및 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)을 수행하였다. 상기 실시예 1에서 추출한 DNA를 이용한 NGS 분석이 완료된 후 생성된 데이터(reads)를 이용하여 1차적으로 신생조합방법(de novo assembly)으로 분석하였다. 이를 통해 엽록체 게놈에 해당하는 reads를 모아 스캐폴드 컨티그(scaffold contig)를 만들고 레퍼런스 시퀀스(Reference sequence)와 비교하여 갭(gap)들을 확인하였다. 그런 후 레퍼런스 시퀀스의 해당 지역에 대한 염기서열을 이용하여 갭-채우기(gap-filling)용 프라이머를 제작하고 이를 이용하여 생거 방법(Sanger method)으로 염기서열을 확인하여 모든 갭들을 채웠다. 최종적으로 갭-채우기를 완료한 후 전체 엽록체 게놈의 염기서열을 결정하였다. 최종적으로 결정된 염기서열을 이용하여 엽록체 게놈 상의 유전자의 종류 및 순서를 확인하는 어노테이션 과정을 수행하였다. 이를 위하여 엽록체 게놈 분석에서 주로 사용하는 플랫폼인 도그마(DOGMA)와 지니어스(Geneious) 프로그램을 사용하였다.
어노테이션 과정을 수행한 후 근연분류군의 엽록체 게놈 염기서열과 비교 분석하여, 해당 분류군의 엽록체 게놈의 구조적 특징이나 변이 정도 등에 대해 분석하였다.
2.2 엽록체 DNA 분석 결과
상기 2.1을 통해 확인한 캐나다엉겅퀴의 엽록체 유전체의 유전자 지도를 도 1에 나타내었다.
캐나다엉겅퀴 엽록체 유전체의 유전자 지도에 따르면 도 1과 같이, 엽록체 유전체 크기는 152,379 bp이며, 총 113개의 유전자로 구성됨을 확인하였다(RNA 유전자 (34개), 단백질 유전자 (46개), 리보솜의 단백질(ribosomal protein) (21개), 전사/번역(transcription/translation) (12개)).
캐나다엉겅퀴 엽록체에 포함되는 RNA 유전자, 단백질 유전자, 리보솜의 단백질, 전사/번역 유전자에 해당하는 유전자는 하기 표 1에 나타내었다.
| 유전자 그룹 | 유전자 명칭 | 갯수 | |
| RNA 유전자 | 리보솜 RNAs | rrn4.5, rrn5, rrn16, rrn23 | 4 |
| 트랜스퍼 RNAs (Transfer RNAs) |
trnA-UGC, trnC-GCA, trnD-GUC, trnE-UUC, trnF-GAA, trnfM-CAU, trnG-GCC, trnG-UCC, trnH-GUG, trnI-CAU, trnI-GAU, trnK-UUU, trnL-CAA, trnL-UAA, trnL-UAG, trnM-CAU, trnN-GUU, trnP-UGG, trnQ-UUG, trnR-ACG, trnR-UCU, trnS-GCU, trnS-GGA, trnS-UGA, trnT-CGU, trnT-UGU, trnV-GAC, trnV-UAC, trnW-CCA, trnY-GUA | 30 | |
| 단백질 유전자 | 광계(Photosystem) I | psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ | 5 |
| 광계(Photosystem) II | psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ | 15 | |
| 시토크롬(Cytochrome) | petA, petB, petD, petG, petL, petN | 6 | |
| ATP 합성(ATP synthases) | atpA, atpB, atpE, atpF, atpH, atpI | 6 | |
| 루비스코의 큰 단위 (Large unit of Rubisco) |
rbcL | 1 | |
| NADH 탈수소효소 (NADH dehydrogenase) |
ndhA, ndhB, ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK | 11 | |
| ATP-의존적 프로테아제 서브유닛 P (ATP-dependent protease subunit P) |
clpPa | 1 | |
| 외피막 단백질(Envelope membrane protein) | cemA | 1 | |
| 리보솜의 유전자 | 리보솜의 큰 단위(Large units of ribosome) | rpl2a, rpl14, rpl16a, rpl20, rpl22, rpl23, rpl32, rpl33, rpl36 | 9 |
| 리보솜의 작은 단위(Small units of ribosome) | rps2, rps3, rps4, rps7, rps8, rps11, rps12a, rps14, rps15, rps16a, rps18, rps19 | 12 | |
| 전사/번역 유전자 | RNA 폴리머라아제 (polymerase) |
rpoA, rpoB, rpoC1a, rpoC2 | 4 |
| 개시인자(Initiation factor) | 0 | ||
| 기타 단백질 (Miscellaneous protein) |
accD, ccsA, matK | 3 | |
| 가상 단백질 및 보존된 판독 프레임 (Hypothetical proteins and conserved reading frames) |
ycf1, ycf2, ycf3a, ycf4, ycf15 | 5 | |
| 총 | 113 | ||
더불어 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 LSC(large single copy), SSC(small single copy) 및 역반복(Inverted Repeat, IRs)에 대한 길이 및 AT 함량은 하기 표 2에 나타내었다.
| 종 |
LSC
(large single copy) |
SSC
(small single copy) |
역반복
(Inverted Repeat, IRs) |
총 | ||||
| 길이 (bp) | AT (%) | 길이 (bp) | AT (%) | 길이 (bp) | AT (%) | 길이 (bp) | AT (%) | |
|
캐나다엉겅퀴
(Cirsium arvense) |
83.412 | 64.2 | 18,607 | 68.5 | 25,180 | 56.9 | 152,379 | 62.3 |
또한 하기 표 3과 같이, 캐나다엉겅퀴 엽록체 유전체의 유전자 구성에 있어서 총 113개의 유전자로 4개의 rRNA, 30개의 tRNA, 그리고 79개의 CDS를 가지고 있는 것으로 확인되었다.
| 종 |
코딩 시퀀스
(coding sequence, CDS) |
rRNA | tRNA | 유전자 |
| 캐나다엉겅퀴 | 79 | 4 | 30 | 113 |
실시예 3. 캐나다엉겅퀴 특이적 마커 개발
3.1 마커 지역 선정
국내 생물다양성을 위협할 수 있는 미유입 외래식물종을 판별할 수 있는 SNP (single nucleotide polymorphism) 분자마커를 개발하기 위하여 상기 실시예 2에서 확인한 마커 개발 대상종인 캐나다엉겅퀴의 엽록체 유전체를 GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)상에서 검색한 같은 엉겅퀴속(Cirsium속)의 서양가시엉겅퀴(C. vulgare), 뒤덮힌 엉겅퀴(C. eriophorum)의 엽록체 유전체와 비교하여 변이가 있는 지역을 탐색하였다. 이때 상기 서양가시엉겅퀴 및 뒤덮힌 엉겅퀴는 캐나다엉겅퀴와 유전적으로 유사한 분류군이기 때문에 비교군으로 선정하였다.
그 결과 캐나다엉겅퀴 유전체에 있어서, 엽록체 46개 지역, 핵 2개 지역(ITS 2sites), 미토콘드리아 1개 지역(ccmFc) 총 49개의 지역을 후보군으로 선정하였다.
상기 선정한 후보 분자마커를 캐나다엉겅퀴 및 우리나라에 자생하는 이의 근연종인 고려엉겅퀴(C.setidense)에 적용하여 확인한 후 생거 시퀀싱을 통해 SNP 사이트(SNP site)를 확인하였다.
3.2 마커 지역 증폭 및 염기서열 분석
상기 선정한 후보군 지역 내의 SNP를 확인하기 위해 76개의 프라이머 세트를 제작하였다.
유전자 증폭은 EmeraldAmp PCR Master Mix(Takara Korea Biomedical Inc.)을 이용하여 증폭하였다. 1번째 단계에서 94℃, 2분간 초기 변성 후 94℃에 30초, 55℃에서 40초, 72℃에서 1분으로, 30회 반응시켰다.
MEGAquick-spin™ Plus Total Fragment DNA Purification Kit(iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 PCR 생성물(products)로부터 DNA를 추출(Purification)하였으며, DNA 염기서열은 마크로젠에 의뢰하여 3730xl DNA 분석기(3730xl DNA analyzer)을 통해 결정하였다.
획득한 염기서열 분석을 통해서 캐나다엉겅퀴 유전체의 특이적인 SNP 지역을 확인하였다. 이때, 2개체~3개체 이상의 DNA 샘플을 대상으로 SNP 지역에 변이가 있는지 확인하고, 변이가 있는 지역은 마커 탐색에서 제외하였다.
그 결과 도 2 내지 도 5와 같이, 캐나다엉겅퀴의 accD 염기서열에서 1개 지역, atpB 염기서열에서 2개 지역, psbA 염기서열에서 1개 지역, rpoB 염기서열에서 1개 지역임을 확인하였다.
보다 구체적으로, atpB 유전자의 염기서열 중 CDS(Coding sequence) 영역(서열번호 13)의 948번째 염기가 G이며, 999번째 염기가 A인 것을 확인하였다. 더불어 rpoB 유전자의 염기서열 중 CDS 영역(서열번호 14)의 1068번째 염기가 T이며, psbA 유전자의 염기서열 중 CDS 영역(서열번호 15)의 411번째 염기가 A인 것을 확인하였다. 또한 accD 유전자의 염기서열 중 CDS 영역(서열번호 16)의 488번째 염기가 G인 것을 확인하였다.
이를 기반으로 ARMS-PCR 기법을 적용하여 SNP 구간에서 프라이머 3‘말단과 말단으로부터 2번째 염기를 바꾸어 캐나다엉겅퀴에 특이적인 프라이머를 제작하였다.
보다 구체적으로, 프라이머 길이를 19-23 염기서열로 설정하였고 3‘말단에서 2번째 염기서열에 미스매치(mismatch)를 주었다. GC 함량은 50-60%로 설정하였으며, OligoAnalyzer Tool(sd.idtdna.com/calc/analyzer)를 이용하여 헤어핀(Hairpin), 셀프-다이머(Self-Dimer), 헤테로-다이머(Hetero-Dimer)를 측정하였다. 헤어핀은 25℃ 이상이며 셀프-다이머, 헤테로-다이머 모두 5개 이상의 결합을 가지지 않는 것을 선별하였다. 이를 토대로 PCR 진행 시 캐나다엉겅퀴에 대해서만 특이적으로 반응할 프라이머 세트를 제작하였다.
더불어 각 프라이머의 조합을 바꾸어 캐나다엉겅퀴를 정확하게 판별할 수 있는 조합의 프라이머쌍을 개발하였다. 개발된 프라이머 및 이의 조합은 하기 표 4에 나타내었다.
| 대상종 | 프라이머 | 방향 | 염기서열(5'-3') | 위치 | 서열 |
|
캐나다
엉겅퀴 |
Cir_atpB_743F | 정방향 | TTGGTTTGACTGCCCTAACTATG | atpB | 1 |
| Cir_atpB_1331R | 역방향 | GGAGAACCCGTAAATACTTCTGC | 2 | ||
| Cir_atpB_F4 | 정방향 | ACAAGAAAGAATTACTTCTACCCAG | 3 | ||
| Cir_rpoB_712F | 정방향 | CAATTTGCTTGTGTAGAGGGAGA | rpoB | 4 | |
| Cir_rpoB_1315R | 역방향 | TTCCTTCAGATGTGTCAATTGGG | 5 | ||
| Cir_rpoB_F1 | 정방향 | TAAGTTCTGAGGAGTTGGTATCAAA | 6 | ||
| Cir_psbA_239F | 정방향 | GTGCCATTATTCCTACTTCTGCA | psbA | 7 | |
| Cir_psbA_775R | 역방향 | TCAATCGGCCAAAATAACCATGA | 8 | ||
| Cir_psbA_F1 | 정방향 | TGAGTGGGAACTTAGTTTCCGTATA | 9 | ||
| Cir_accD_76F | 정방향 | GGCAGTCTTGGTCCTATTGAAAA | accD | 10 | |
| Cir_accD_677R | 역방향 | TGAACCCACAAATGCCTGTATTT | 11 | ||
| Cir_accD_F1 | 정방향 | GTTATCTTCAGTATCAAATCCGCAG | 12 |
본 발명의 프라이머를 이용한 검출 방법에 있어서 비 특이적 결합(non-specific binding)의 증폭을 줄이기 위하여 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nested PCR)을 수행하였다. 따라서 상기 표 4의 프라이머의 조합에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머는 1차 PCR 반응을 위한 외부 프라이머(Outer primer)로 사용하였고, 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9 및 서열번호 12의 프라이머는 2차 PCR 반응을 위한 내부 프라이머(Inner Primer)로 사용하였다.
더불어 상기 조합의 프라이머 세트를 이용하여 실제 캐나다엉겅퀴를 정확하게 판별할 수 있는지 네스티드 PCR을 수행하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
네스티드 PCR을 수행하기 위하여, EmeraldAmp PCR Master Mix(Takara Korea Biomedical Inc.)을 이용하여 각 유전자를 증폭하였다. 1번째 단계에서 94℃, 2분간 초기 변성 후 94℃에서 20초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로, 30회 반응시켜 수행하였다.
그 결과 본 발명의 각 조합에 따른 프라이머 쌍에 있어서, 각 유전자에 대하여 도 6과 같은 크기의 단편을 생산하는 것을 확인하였다. 보다 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머는 atpB 유전자에 대해서 1차 PCR 결과 589 bp의 단편을 생산하고, 서열번호 3의 프라이머는 상기 589 bp의 단편을 기반으로 408 bp 크기의 단편을 생산하였다. 더불어 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머는 rpoB 유전자에 대해서 1차 PCR 결과 604 bp의 단편을 생산하고, 서열번호 6의 프라이머는 상기 604 bp의 단편을 기반으로 272 bp의 단편을 생산하였다. 또한 더불어 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머는 psbA 유전자에 대해서 1차 PCR 결과 537 bp의 단편을 생산하고, 서열번호 9의 프라이머는 상기 389 bp의 단편을 기반으로 272 bp의 단편을 생산하였다. 또한 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머는 accD 유전자에 대해서 1차 PCR 결과 602 bp의 단편을 생산하고, 서열번호 12의 프라이머는 상기 602 bp의 단편을 기반으로 214 bp의 단편을 생산하였다.
더불어 최종적으로 도 7과 같이, 본 발명의 각 조합의 프라이머는 캐나다엉겅퀴의 rpoB, psbA, atpB 및 accD에 있어서 특정적으로 증폭되는 것을 확인하였다.
종합적으로 본 발명은 침입외래종인 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense) 판별용 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 캐나다엉겅퀴 엽록체 유전체의 특정 SNP 변이 지역을 확인하고 이를 기반으로 ARMS-PCR 방법을 이용하여 제작한 프라이머 및 이의 조합에 대한 것이며, 본 발명에 따른 프라이머 조합은 캐나다엉겅퀴에 대하여 특정적으로 증폭되므로 침입 외래종인 캐나다엉겅퀴를 보다 빠르고 정확하게 판별하여 제거하는데 유용하게 활용될 수 있다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation
REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency)
<120> Composition for discriminating Cirsium arvense, and use thereof
<130> 1-3P-1
<150> KR 10-2021-0007557
<151> 2021-01-19
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_atpB_743F
<400> 1
ttggtttgac tgccctaact atg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_atpB_1331R
<400> 2
ggagaacccg taaatacttc tgc 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_atpB_F4
<400> 3
acaagaaaga attacttcta cccag 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_rpoB_712F
<400> 4
caatttgctt gtgtagaggg aga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_rpoB_1315R
<400> 5
ttccttcaga tgtgtcaatt ggg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_rpoB_F1
<400> 6
taagttctga ggagttggta tcaaa 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_psbA_239F
<400> 7
gtgccattat tcctacttct gca 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_psbA_775R
<400> 8
tcaatcggcc aaaataacca tga 23
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_psbA_F1
<400> 9
tgagtgggaa cttagtttcc gtata 25
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_accD_76F
<400> 10
ggcagtcttg gtcctattga aaa 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_accD_677R
<400> 11
tgaacccaca aatgcctgta ttt 23
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cir_accD_F1
<400> 12
gttatcttca gtatcaaatc cgcag 25
<210> 13
<211> 1494
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDS sequence of atpB gene
<400> 13
atgggactta ctactacttc tgattctggg gtttccacgc ttgaaaaaaa gaacctgggg 60
cgtatcgccc aaatcattgg tccggtacta gatgtagctt ttccgccagg caaaatgcct 120
aatatttata acgctctggt agttaagggt cgagatacgg ttggtgaacc aattaatgta 180
acttgtgagg tacaacaatt attaggaaac aatcgagtta gggccgtagc tatgagtgct 240
acagacggtc taacgagagg aatggatgta attgatacgg gagctccgct aagtgttccg 300
gtcggtggag cgactctcgg acgaattttc aacgtgcttg gcgagcctgt tgacaattta 360
ggtcctgtag atactagcat aacatttcct attcatagat ctgcgcctgc ctttatacag 420
ttagatacaa aattatctat ttttgaaacc ggaattaaag tagtagatct tttagcccct 480
tatcgccgtg gaggaaaaat cggactattc gggggagctg gcgtgggtaa aacggtactc 540
attatggaat tgattaacaa tattgccaaa gctcacggag gcgtatccgt atttggggga 600
gtcggtgaac ggactcgtga aggaaatgat ctttacatgg aaatgaaaga atctggagta 660
attaatgaag aaaatattgc agaatcaaaa gtggctttag tttacggtca gatgaatgaa 720
ccgccgggag ctcgtatgag agttggtttg actgccctaa ctatggcgga atatttccga 780
gatgttaatg aacaagacgt acttttattt attgacaata tcttccgttt tgttcaagca 840
ggatctgaag tatccgcctt gttgggtaga atgccttccg ctgtgggtta tcaacctacc 900
cttagtaccg aaatgggttc tttacaagaa agaattactt ctaccaagga agggtccata 960
acttctattc aagctgttta tgtacctgca gatgatttaa ccgaccctgc tcctgctacg 1020
acatttgcac atttagatgc tactaccgta ctatcaagag gattagcagc caaaggtatc 1080
tatccagcag tagatccttt agattcaacg tcaactatgc tacaaccccg catcgttggt 1140
gaagaacatt atgaaattgc acaacaggtt aagcaaactt tacaacgtta caaagaactt 1200
caagatatta tagctattct tggcttggac gaattatccg aagaggatcg tttaaccgta 1260
gcaagagcgc gaaaaattga gcgtttctta tcacaacctt ttttcgtagc agaagtattt 1320
acgggttctc cgggaaaata tgttggttta gcagaaacaa ttagaggctt tcaattaatc 1380
ctttccggag aattagatgg tcttcctgaa caggcctttt atttggtagg taacatcgat 1440
gaagctacgg cgaaggctat gaacttagaa atggagagca attcgaaaaa atga 1494
<210> 14
<211> 3234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDS sequence of rpoB gene
<400> 14
atggatgagt ataaatcact gccaatttca aaagaatccg ggatagacgc aatgtccaca 60
atacctggat ttaatcagat acaatttgaa ggattttgta ggttcattga tcagggtttg 120
acagaagaac tttctaagtt tccaaaaatt gaagatacaa atcaagaaat tgactttgaa 180
ttatttttgg aaagatatca attggtagaa cccctgataa cggaaagaga tgctgtgtat 240
gaatcactca catattcttc tgaattatat gtatccgcga gacttatttg gaaaaacgat 300
aggcgtaggt atatccaaga acaaacaatt ttgataggaa agatccctct aatgacttct 360
ctgggagctt ttatagtaaa tggaatatat agaattgtga tcaatcaaat attgcgaagt 420
cccggtattt attaccagtc agaattgaac gataacggaa tttcggtcta taccggcacc 480
ataatatcag attggggagg aagattagaa ttagagattg atagaaaagc aaggatatgg 540
gttcgtgtga gtaggcaaca aaaactatct attctagttc tattatcagc tatgggtttg 600
aatataagag aaattctaga gaatgtttgc tatcctgaac tatttttgtc ttttctgaat 660
gataaaaaaa aaatcgggtc aaaagaaaat gctattttgg agttttatca acaatttgct 720
tgtgtagagg gagatccggt attttctgaa tccttatcta aggatttaca aaaaaaattc 780
tttcaacaaa gatgtgaatt gggagggatt ggtcgacgaa atatgaatcg gagactgaac 840
cttgatatac cccagaccaa tacatttttg ttaccgcgag atatattggc agccgcggat 900
cgtttgattc gaataaaatt tggaatgggt acacttgacg atatgaatca tttgaaaaat 960
aaacgtattc gttctgtagc agatctttta caagagcaat ttggattggc cttggttcgt 1020
ttagaaaata tggctcgagg aaacatatat gcagcactta agcataattg gataccaact 1080
cctcagaact tagtaaattc aactccatta acaggtactt ataaagcttt tttccgttta 1140
catccattat ctcaagtttt ggatcgaact aatccattga cacaaatagt tcatgggaga 1200
aaattgagtt atttgggccc ggggggattg actgcgcgaa ctgctacttt tccaatacga 1260
gatattcatc ctagtcacta tgggcgtatt tgcccaattg acacatctga aggaataaat 1320
gttggactta ttggatcctt agcaattcat gcgaggattg gtcgttgggg gtctctagaa 1380
agtccgtttt ataaaatttc tgagagatca aaaggggccc ggatgcttta tttatcaccg 1440
ggtagagatg aatactatat ggtagccgca ggaaattctt tggccttaaa tcagggtatt 1500
caggaagaac aggttgttcc agctcgatat cgtcaagaat tcctgactat tgcatgggaa 1560
caggttcatc ttcgaagtat tttttccttc caatattttt ctattggagc ttccctcatt 1620
ccttttatcg agcataatga tgcgaatcgg gctttaatga gttctaacat gcaacgtcaa 1680
gcagtccctc tttctcagtc cgagaagtgc attgttggaa ctggattgga aggccaagcg 1740
gctctagatt caggggctct tgctatagcc gaacacgagg gaaaaattct ttataccgat 1800
gctgacaaga tccttttatc aggtaatgga gatactctaa gcattccatt agttatgtat 1860
aaacgttcca acaaaaatac ttgtatgcat caaaaccccc aggttcggca gggtaaatgc 1920
attaaaaagg gacaaatttt agcgtatggt gctgctacag ttggtggcga actagctttg 1980
gggaaaaacg tattagtagc ttatatgcca tgggaaggtt acaattttga agatgcagta 2040
ctcattagcg agcgcttagt atatgaagat atttatactt cttttcacat acgtaaatat 2100
gaaattcaga ttaaccaagg ccccgaaagg gtcactaatg aaataccgca tttagaagcc 2160
catttactcc gaaatttaga caaaaatgga attgtaatgc tgggatcttg ggtggaaaca 2220
ggtgatattt tagtaggtaa attaacgccc caaatggtga aagaatcatc gtatgccccg 2280
gaagatagat tgttacgaac catacttggc atgcgggtat atacttcaaa agaaacttgt 2340
ctaaaactac ctataggcgg taggggtcgg gttattgatg tgagatgggt ccatagttct 2400
aagacagatg agacagataa gacagaaagg attcgtgtat atattttaca gaaacgtgaa 2460
atcaaagtag gcgataaagt agctggaaga catggaaata agggtatcat ttcaaaaatt 2520
ttgcctagac aagatatgcc ttatttgcaa gatggaagac ccgttgatat ggtcttcaac 2580
ccattaggag taccttcacg aatgaatgta ggacaaatat ttgaatcttc actcgggtta 2640
gcgggggggt tgctagacag acattatcga atagcgcctt ttgatgagag atatgaacaa 2700
gaagcttcga gaaaactggt gttttctgaa ttatatgaag ccagtaagca aacagcgaat 2760
ccatgggtat ttgaacccga gtatccaggg aaaagcagaa tatttgatgg aagaacgggg 2820
gatccttttg aacaacctgt tataatagga aagccttata tcttgaaatt aattcatcaa 2880
gttgatgata aaatccatgg gcgttccagc gggcgttatt cacgtcttac acaacaaccc 2940
cttaaaggaa gggccaagaa agggggacaa cgggtaggag aaatggaggt ttgggcttta 3000
gaggggtttg gcgttgctta tattttacaa gagatgctta cttataaatc tgatcatatt 3060
agagctcgcc aggaagtact tggtagtata atctttggag aaacaatacc gactcctgag 3120
gatgctccag aatcttttcg gttgctcgtt cgagaactac gatctttagc tctggaactg 3180
aatcattttc ttgtatctga gaagactttc cagattaata gtaaggaagc ttaa 3234
<210> 15
<211> 1062
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDS sequence of psbA gene
<400> 15
atgactgcaa ttttagagag acgcgaaagc gaaagcctat ggggtcgctt ctgtaactgg 60
ataaccagca ccgaaaaccg tctttacatt ggatggtttg gtgttttgat gatccctacc 120
ttattgaccg caacttctgt atttattatc gccttcattg ctgctcctcc agtagatatt 180
gatggtattc gtgaacctgt ttctggatct ctactttatg gaaacaatat tatttcaggt 240
gccattattc ctacttctgc agctataggt ttgcattttt acccaatatg ggaagcagca 300
tccgttgatg aatggttata caatggtggt ccttatgaac taattgttct acacttctta 360
cttggtgtag cttgttacat gggtcgtgag tgggaactta gtttccgtct aggtatgcga 420
ccttggattg ctgttgcata ttcagctcct gttgcagctg cgactgctgt tttcttgatc 480
tacccaattg gtcaaggaag cttttctgat ggtatgcctc taggaatttc tggtactttc 540
aacttcatga ttgtattcca ggctgagcac aatattctta tgcacccatt tcacatgcta 600
ggcgtagctg gtgtattcgg cggctcccta ttcagtgcta tgcatggttc cttggtaacc 660
tctagtttga tcagggaaac cacagaaaat gaatctgcta atgaaggtta cagattcggt 720
caagaagaag aaacttataa tatcgtagcc gctcatggtt attttggccg attgatcttc 780
caatatgcta gtttcaacaa ctctcgttct ttacatttct tcctagctgc ttggcctgta 840
gtaggtatct ggttcactgc gttaggtatc agcactatgg ctttcaacct aaatggtttc 900
aatttcaacc aatcggtagt tgatagtcaa ggccgtgtaa ttaatacttg ggctgatatc 960
attaaccgtg ctaaccttgg tatggaagtt atgcatgaac gtaatgctca taatttccct 1020
ctagacttag ctgctatcga agctccatct acaaatggat aa 1062
<210> 16
<211> 1464
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDS sequence of accD gene
<400> 16
atgaaaagat ggtggttcaa ttcgatgtta tttaagacgg agttcgcaca cagatgtagg 60
ctaagtaaat caacgggcag tcttggtcct attgaaaatg ccagtgaaag taaagatcgg 120
aatagaaatg atacggataa aaacattcag agttggggtg gtcatgacaa ttacagtaat 180
gttgatcttt tttttggcgt caaggacatt tggaatttca tctctgatga tactttttta 240
gttaaagata gtaatgggga cagttattct atatattttg atattgaaaa ttatattttt 300
gagattgaca atgatcatcc tttttgtagt gaactagaaa gttcttttga tcgggattct 360
agttatctga ataatggatc taagagtaag aatccccacc acgatcggga catggatgat 420
actcaatata cttggaataa tcacattaat agttgcattg acagttatct tcagtatcaa 480
atccgtagtg atagttacat tgtaagtggt agtgacaatt acagtaacaa ttacgtttat 540
ggttccattt gtggtgaaag tggaaatagt agtaaaagcg aggatgccgg tataagaacc 600
agaacgagtg gtaaaactat accagaaagt tctactgatc tggatgtaac tcaaaaatac 660
aggcatttgt gggttcaatg cgaaaattgt tatggattaa attataagaa attttttaaa 720
tcaaaaatga atctttgtga acaatgtgga tatcatttga aaatgagtag ttcagataga 780
atcgaacttt cgatcgatcc gggtacttgg gagcctatgg atgaagacat ggtctctctg 840
gatcccattg aatttcattt ggaggaggag ccttatcaaa atcgtatcga ttcttatcaa 900
agaaagacag gattaaccga ggctgttcaa acaggcatag ggcaactaaa cggtattacc 960
gtagcaattg gggttatgga ttttcagttt atggggggta gtatgggatc cgtagtcggg 1020
gagaaaatta cccgtttgat tgaatacgct actaaagaat ttctacctct tattatagtg 1080
tgtgcttccg gaggggcacg catgcaagaa ggaagtttga gtttgatgca aatggctaaa 1140
atagcttctg ctttatatga ttatcaatca aataaaaagt tattctatgt accaatcctt 1200
acatctccta ctaccggtgg ggtgacagct agttttggta tgttggggga tatcattatt 1260
gccgaaccca atgcctacat tgcgtttgcg ggtaaaagag taattgaaca aacattgaat 1320
aaaacagtac ccgaaggttc acaagcggct gagtatttat tccagaaggg cttattcgat 1380
ctaatcgtac cacgtaatcc tttaaaaagc gttctgagtg agttatttca actccatact 1440
ttctttcctt tgaatcaaaa ttag 1464
Claims (12)
- 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 위치;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 위치;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 위치;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 위치; 및
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 단일염기다형성 마커는,
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 염기가 G인 단일염기다형성 마커;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 염기가 T인 단일염기다형성 마커;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 염기가 A인 단일염기다형성 마커; 및
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째 염기가 G인 단일염기다형성 마커; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 판별용 조성물.
- 제 1항에 있어서
상기 제제는 단일염기다형성 마커 부위를 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화(hybridization)하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 판별용 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 단일염기다형성(SNP) 마커를 검출할 수 있는 프라이머, 프로브 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 판별용 조성물.
- 캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS(Coding sequence) 영역의 948번째 위치;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 atpB 유전자의 염기서열 중 서열번호 13으로 표시되는 CDS 영역의 999번째 위치;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 rpoB 유전자의 염기서열 중 서열번호 14로 표시되는 CDS 영역의 1068번째 위치;
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 psbA 유전자의 염기서열 중 서열번호 15로 표시되는 CDS 영역의 411번째 위치; 및
캐나다엉겅퀴(Cirsium arvense)의 accD 유전자의 염기서열 중 서열번호 16으로 표시되는 CDS 영역의 488번째; 중 선택되는 하나 이상의 유전자 좌의 SNP를 포함하는 10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별용 프라이머 세트.
- 제 5항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 표시되는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제 6항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 세트인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제 5항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 네스티드 PCR(Nested polymerase chain reaction, Nasted PCR)에 사용되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
- 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 캐나다엉겅퀴 판별용 키트.
- 제 9항에 있어서,
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 판별용 키트.
- 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 캐나다엉겅퀴 판별 방법.
- 제 11항에 있어서,
상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210007557 | 2021-01-19 | ||
| KR20210007557 | 2021-01-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220105116A true KR20220105116A (ko) | 2022-07-26 |
Family
ID=82609758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210164610A KR20220105116A (ko) | 2021-01-19 | 2021-11-25 | 캐나다엉겅퀴 판별용 조성물 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220105116A (ko) |
-
2021
- 2021-11-25 KR KR1020210164610A patent/KR20220105116A/ko not_active Application Discontinuation
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