KR20220050296A - 배추 계통 구분을 위한 단일 염기 다형성 기반 마커 및 이의 용도 - Google Patents

배추 계통 구분을 위한 단일 염기 다형성 기반 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배추의 계통을 구분하기 위한 SNP 마커, 조성물, 키트, 이를 이용하여 배추의 계통을 구분하는 방법, 및 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

Description

배추 계통 구분을 위한 단일 염기 다형성 기반 마커 및 이의 용도 {Novel marker based on Single Nucleotide Polymorphism for identification of line of Brassica rapa ssp. pekinensis}
배추의 계통을 구분하기 위한 SNP 마커, 조성물, 키트, 이를 이용하여 배추의 계통을 구분하는 방법, 및 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.
배추는 밭에서 재배하는 두해살이 잎줄기 채소로서, 전세계적으로 음식의 주재료 및 부재료로서 널리 사용되고 있다. 배추는 재배 기간에 따라서 크게 조생종, 중생종, 만생종으로 나뉘며, 결구형태에 따라서는 결구종, 반결구종, 불결구종으로 구분된다. 이렇듯 배추 내에서도 다양한 종류의 계통 및 품종이 존재하므로, 양질의 배추를 생산하기 위해서는 우수한 품질을 갖는 배추를 선별적으로 재배할 필요가 있다.
생물의 종 및 계통의 식별에 있어서, 종래에 형태적, 이화학적 방법도 사용되어 왔으나, 배추과 작물은 염색체 구성이 복잡하여 분석지표가 확립되기 어렵기 때문에 주관적으로 계통 및 종 판별이 이루어지며, 일부 방법의 경우에는 환경에 의해 영향을 받아 일관되지 않은 단점이 있었다. 최근 분자생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기서열의 다형성을 탐색하고 이를 마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성 등 다양한 분야에 활용되고 있으며, 관련하여 양배추 등 다양한 식물에 대해서도 이러한 기술을 활용하여 순도검정 등에 적용된 바 있으나(한국등록특허 제10-1690067호), 배추의 계통 구분에 이용된 것은 보고된 바 없다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 배추 내에서도 재배 기간 및 시간 단축을 도모하기 위하여 환경에 영향 받지 않고 배추의 엘리트 라인을 선별함과 동시에, 배추 종자 순도의 대량 검증 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 배추의 엘리트 라인의 유전체 변이 분석을 통한 계통 특이적 SNP 마커를 발굴하고, 상기 SNP 마커로 배추의 계통을 명확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 배추의 계통 구분용 SNP 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 배추의 계통 구분용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 배추의 계통 구분용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 배추의 계통을 구분하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 배추의 계통 구분용 SNP 마커를 제공한다. 구체적으로, 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서, SNP 위치인 각 서열의 251번째 염기를 포함하고, 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 배추의 계통 구분용 SNP 마커를 제공한다.
본 발명에서 용어 "배추"는 배추 속 순무의 재배종으로서 일반적으로 밭에서 재배하는 두해살이 잎줄기 채소를 의미하며, 학명은 Brassica rapa ssp. pekinensis이다. 배추의 분류 카테고리를 기원지 및 동아시아 내에서의 전파 과정을 고려하여 한국 육종자원, 한국 재래종, 중국 북방계, 중국 남방계, 일본 육종자원으로 분류될 수 있으며, 재배 기간에 따라서 크게 조생종, 중생종, 만생종으로 나뉘고, 결구형태에 따라서는 결구종, 반결구종, 불결구종으로 구분되므로, 배추 내에서도 표현형, 특성, 유전형질 등에 따라 계통이 달라질 수 있다.
본 발명에서 용어 "계통"은 동식물에서 유전형질이 같은 개체군에서 유전형질을 개선하거나 변경시켜 얻은 각각의 결과물을 의미한다. 본 발명에서는 자가수분 및 반수체 배가를 통하여 순계화된 개체(계통)들을 활용하였으며, 상기 계통은 자원명, 계통명, 또는 품종명으로 표현될 수 있고, 상기 자원명은 본 발명의 목적상 Accession ID와 혼용될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 계통은 자원명(Accession ID) 26021, 26022, CNU_12239, 12015, 28059, 28061, CNU_11411, CNU_11412, CNU_11479, 또는 CNU_11480을 갖는 계통일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 26021 계통은 중국 북방계 기원 배추로서, 강한 축엽성, 실린더형의 결구 구성, 및 결구 선단의 외엽이 바깥으로 말리는 외엽 특성을 갖는다. 상기 26022 계통은 중국 북방계 기원 배추로서, 강한 축엽성, 실린더형의 결구 구성, 및 결구 선단의 외엽이 바깥으로 말리는 외엽 특성을 갖는다. 상기 CNU_12239 계통은 중국 남방계 기원 배추로서, 고온 하에서도 결구를 이루는 특성, 잎털이 나타나지 않는 특성, 및 안으로 말리는 내엽 특성을 갖는다. 상기 12015 계통은 중국 남방계 기원 배추로서, 고온 하에서도 결구를 이루는 특성, 잎털이 나타나지 않는 특성, 및 안으로 말리는 내엽 특성을 갖는다. 상기 28059 계통은 중국 산동계 기원 배추로서, 일본에서 육성된 품종(평총1호)의 내혼계이며, 결구 형성 및 병저항성 육종 소재인 특성을 갖는다. 상기 28061 계통은 중국 산동계 기원 배추로서, 일본에서 육성된 품종(송도신2호)의 내혼계이며, 결구 형성의 특성을 갖는다. 상기 CNU_11411 계통은 국내 육종 회사로부터 공여된 계통으로서, 내한성이 강하여 월동재배 가능, 황색의 내엽, 및 배추 뿌리혹병 감수성의 특성을 갖는다. 상기 CNU_11412 계통은 국내 육종 회사로부터 공여된 계통으로서, 내한성이 강하여 월동재배가 가능, 황색의 내엽, 및 배추 뿌리혹병 저항성의 특성을 갖는다. 상기 CNU_11479 계통은 국내 야생배추를 소포자 배양을 하여 육성한 계통으로서, 결구를 이루지 않으며, 무의 지상부와 같이 결각이 두드러지게 나타나고, 잎털이 나타나지 않는 특성을 갖는다. 상기 CNU_11480 계통은 국내 야생배추를 소포자 배양을 하여 육성한 계통으로서, 결구를 이루지 않으며, 무의 지상부와 같이 결각이 두드러지게 나타나고, 잎털이 나타나는 특성을 갖는다.
구체적으로, 상기 계통은 정밀육종을 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "정밀육종(precision breeding)"은 개별적인 육종 목적을 달성하기 위해 유전자의 특정한 부분을 타겟으로 하는 육종 방식으로서, 임의로 작물을 육종하는 것과 반대의 개념이다. 정밀육종에는 SNP 마커, 유전체교정, 유전자 가위 등의 다양한 기술이 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 대표적으로 SNP 마커를 이용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "SNP 마커"는 DNA 서열상의 단일 염기 다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP) 대립인자 염기쌍을 의미한다. 상기 SNP는 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자가 존재하는 다형성 부위(polymorphic site)에서 단일 염기만이 다른 경우를 의미하며, 구체적인 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 보다 구체적으로 5% 이상, 더욱 구체적으로 10% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립 유전자를 갖는다. 상기 SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있어, 개체의 유전적 다양성을 발생시킨다. 또한, SNP는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함할 수도 있으며, 본 발명의 SNP 마커는 배추 속 순무종의 배추(pekinensis) 내에서 계통을 구분하는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 상기 SNP 마커는 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 SNP 마커는 서열번호 1 내지 20의 폴리뉴클레오티드가 계통 자원명(Accession ID) 26021, 26022, CNU_12239, 12015, 28059, 28061, CNU_11411, CNU_11412, CNU_11479, 또는 CNU_11480 중에서 각각 하나의 계통을 결정하는 마커일 수 있고, 상기 SNP 위치는 서열번호 1 내지 20의 폴리뉴클레오티드 각각에서 251번째 염기서열일 수 있다.
본 발명자들은 핵심 집단의 기원에 대한 육종 관련 정보 확보한 후, 핵심 집단의 유전체 재분석 및 유전체 구조 분석을 진행하였으며, 이후 대표적인 10개의 계통에 특이적인 각각의 계통마다 2개의 마커로서 서열번호 1 내지 20을 개발하였다.
일 예로, 상기 배추의 계통 구분용 SNP 마커는 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서, SNP 위치인 각 서열의 251번째 염기를 포함하고, 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 배추의 계통 구분용 SNP 마커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치인 각 서열의 251번째 염기가 배추의 계통을 특이적으로 구분할 수 있는 SNP 마커가 될 수 있음을 확인하였다(실시예 3 및 4).
본 발명에서 염기서열 또는 폴리뉴클레오티드는, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로 70% 상동성, 더욱 구체적으로 80%, 특히 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
따라서, 상기 서열번호 1 내지 20으로 이루어진 각각의 염기서열에서 251번째 염기서열인 SNP 위치의 서열이 동일한 이상, 이외의 영역은 서열번호 1 내지 20으로 표시되는 염기서열과 높은 상동성을 갖는 염기서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 보다 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90%이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
일 예로, 상기 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중, 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 C인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 11로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 12로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 C인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 13로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 14로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 15로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 16로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 17로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 C인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 서열번호 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 20으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 20의 폴리뉴클레오티드는 251번째 염기를 SNP로 포함하여 특정한 배추의 계통을 구분할 수 있음을 확인하였다(실시예 3 및 4).
일 예로, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) 26021 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) 26022 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 5 또는 서열번호 6로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) CNU_12239 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 7 또는 서열번호 8로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) 12015 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 9 또는 서열번호 10로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) 28059 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 11 또는 서열번호 12로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) 28061 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 13 또는 서열번호 14로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) CNU_11411 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 15 또는 서열번호 16로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) CNU_11412 계통을 구분하기 위한 마커; 상기 서열번호 17 또는 서열번호 18로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) CNU_11479 계통을 구분하기 위한 마커; 또는 상기 서열번호 19 또는 서열번호 20로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, 자원명(Accession ID) CNU_11480 계통을 구분하기 위한 마커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 20의 폴리뉴클레오티드는 251번째 염기를 SNP로 포함하여 특정한 배추의 계통인 자원명(Accession ID) 26021, 26022, CNU_12239, 12015, 28059, 28061, CNU_11411, CNU_11412, CNU_11479, 또는 CNU_11480 계통을 구분할 수 있음을 확인하였다(실시예 3 및 4)
본 발명의 다른 하나의 양태는 배추의 계통 구분용 조성물을 제공한다.
본 발명의 목적상 상기 조성물은 상기 배추 계통 구분용 SNP 마커를 검출할 수 있는 프로브, 프라이머, 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 배추의 계통 구분용 조성물일 수 있다.
본 발명에서 용어 "검출할 수 있는 제제"는 당업계에서 일반적으로 유전자를 검출하는 데 이용되는 임의의 제제를 모두 포함하며, 마커의 존재를 확인할 수 있는 제제라면 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 검출할 수 있는 제제는 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 마커를 증폭하고 검출할 수 있는 제제를 의미할 수 있고, 구체적으로는 프로브, 프라이머 쌍, 항체, 앱타머, 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 검출할 수 있는 제제는 프로브, 프라이머 또는 증폭할 수 있는 제제일 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브"는 공지의 방법으로 특정 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화될 수 있는 것이라면 본 발명의 범주에 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J Sambrook et al, 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃ 1 X SSC, 01% SDS, 구체적으로는 60℃ 01 X SSC, 01% SDS, 보다 구체적으로는 68℃ 01 X SSC, 01% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가
능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al, supra, 950-951, 117-118 참조)
본 발명에서 용어, "프라이머"는 검출하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용할 수 있다. 본 발명에서 프라이머는 PCR 반응을 통한 마커에 검출되기 위해 제작될 수 있으며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 따라 당업계에 알려진 방법으로 합성될 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머 쌍은 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트"는 KASP를 위하여 사용되는 프라이머 세트를 의미한다.
본 발명에서 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"은 형광시료를 이용한 PCR 기반의 유전형 분석 방법의 일종으로서, 상동의(homogenous) 형광(fluorescence) 기반 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립유전자(allele)-특이적인 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다. KASP를 통해, SNP와 같은 염기서열의 차이를 포함한 두 가지의 정방향 프라이머와 공통된 염기서열의 역방향 프라이머를 이용하여 두 개의 DNA 단편을 증폭시키고, 이 때 SNP 차이에 따른 각기 다른 형광시료가 반응하는 현상으로 유전자를 구분할 수 있다. KASP는 형광물질의 차이를 통해 유전형을 분석할 수 있어 정확하고 경제적으로 유전자형을 분석할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 KASP용 프라이머 세트는 본 발명의 SNP 위치 서열의 차이를 포함한 두 가지의 정방향 프라이머와 공통된 염기서열의 역방향 프라이머를 포함하는 프라이머세트일 수 있으며, 상기 두 가지의 정방향 프라이머는 SNP의 존부를 확인하기 위해 서로 다른 색을 발하는 형광물질과 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 KASP 프라이머 세트는 상기 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 21 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 24 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 30 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 33 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 33 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 36 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 39 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 39 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 42 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 45 및 서열번호 46의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 45 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 48 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 51 및 서열번호 52의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 51 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 54 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 57 및 서열번호 58의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 57 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 60 및 서열번호 62의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 63 및 서열번호 64의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 63 및 서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 66 및 서열번호 68의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 69 및 서열번호 70의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 69 및 서열번호 71의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 72 및 서열번호 73의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 72 및 서열번호 74의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 서열번호 75 및 서열번호 76의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 75 및 서열번호 77의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 또는 서열번호 78 및 서열번호 79의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 78 및 서열번호 80의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 KASP 프라이머 세트 중, 상기 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 21 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 26021 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 24 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 26021 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 26022 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 30 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 26022 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 33 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 33 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_12239 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 36 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_12239 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 39 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 39 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 12015 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 42 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 12015 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 45 및 서열번호 46의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 45 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 28059 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 48 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 28059 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 51 및 서열번호 52의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 51 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 28061 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 54 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) 28061 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 57 및 서열번호 58의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 57 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11411 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 60 및 서열번호 62의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11411 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 63 및 서열번호 64의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 63 및 서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11412 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 66 및 서열번호 68의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11412 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 69 및 서열번호 70의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 69 및 서열번호 71의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11479 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 72 및 서열번호 73의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 72 및 서열번호 74의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11479 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 75 및 서열번호 76의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 75 및 서열번호 77의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11480 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트; 또는 서열번호 78 및 서열번호 79의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 78 및 서열번호 80의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 자원명(Accession ID) CNU_11480 계통을 구분하기 위한 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 배추 계통 구분용 키트를 제공한다. 상기 키트는 배추의 계통을 구분하기 위한 조성물을 포함하여 배추의 계통을 구분하고 특정한 계통이 존재하는지 여부를 확인하기 위해 이용될 수 있다.
구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR　키트, 면역 스트립, DNA 칩 키트, 단백질 칩　키트, 래피드(rapid)　키트　또는 MRM(Multiple reaction monitoring)　키트, 및 ELISA　진단　키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 배추의 계통을 구분할 수 있다면 그 작동 원리나 형태에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 배추 계통 구분을 위해 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분　조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다른 구성 성분의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 마커의 검출을 위한 프라이머 쌍, 및 검출 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 키트는 마커 검출을 위해 수행되는 증폭 반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있고, 또한, 실시간 PCR 반응 수행 및 분석을 위해 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 버퍼 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 배추의 계통을 구분하는 방법을 제공한다.
일 예로, 상기 배추의 계통을 구분하는 방법은 (a) 배추로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 마커를 검출하기 위한 제제를 이용하여 마커를 검출하는 단계를 포함하는, 배추의 계통을 구분하는 방법일 수 있다.
본 발명에서, 상기 게놈 DNA는 배추의 계통을 구분할 수 있는 한, 채취 방법 및 위치 등과 관계없이 제한없이 이용될 수 있으며, 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, 상기 검출은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 중합효소반응(real time RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting), 유전자　칩, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 배추의 계통을 구분하는 방법은 (a) 배추로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제6항의 상기 a) 내지 t)의 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및 (c) 상기 KASP의 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 배추의 계통을 구분하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 (c)단계에서 KASP의 증폭 결과, 본 발명의 SNP를 포함한 폴리뉴클레오티드에 상보적으로 결합한 정방향 프라이머에 부착하였던 형광시료가 검출되는 정도에 따라 배추의 계통을 구분할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
일 예로, 상기 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법은 (a) 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법일 수 있다.
본 발명에서 표적 DNA를 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 실시간 PCR(Real-time PCR), 핵산 서열 기재 증폭 (nucleic acid sequence based amplification), 전사 기재 증폭 시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소 (replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
또한, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 구체적으로는 형광을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 (b)단계에서 결정된 염기서열 중, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) 26021 계통; 상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) 26022 계통; 상기 서열번호 5 또는 서열번호 6로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) CNU_12239 계통; 상기 서열번호 7 또는 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) 12015 계통; 상기 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) 28059 계통; 상기 서열번호 11 또는 서열번호 12로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) 28061 계통; 상기 서열번호 13 또는 서열번호 14로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) CNU_11411 계통; 상기 서열번호 15 또는 서열번호 16로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) CNU_11412 계통; 상기 서열번호 17 또는 서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) CNU_11479 계통; 또는 상기 서열번호 19 또는 서열번호 20로 기재되는 폴리뉴클레오티드는 자원명(Accession ID) CNU_11480 계통으로 구분하기 위한 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, 자원명(Accession ID) 26021 계통; 상기 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우, 자원명(Accession ID) 26022 계통; 상기 서열번호 5으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 6로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, 자원명(Accession ID) CNU_12239 계통; 상기 서열번호 7으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우, 자원명(Accession ID) 12015 계통; 상기 서열번호 9으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우, 자원명(Accession ID) 28059 계통; 상기 서열번호 11으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우 또는 서열번호 12로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우, 자원명(Accession ID) 28061 계통; 상기 서열번호 13으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우 또는 서열번호 14로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우, 자원명(Accession ID) CNU_11411 계통; 상기 서열번호 15으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우 또는 서열번호 16로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우, 자원명(Accession ID) CNU_11412 계통; 상기 서열번호 17으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우 또는 서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우, 자원명(Accession ID) CNU_11479 계통; 또는 상기 서열번호 19으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 20로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, 자원명(Accession ID) CNU_11480 계통으로 구분하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배추의 계통 구분용 마커를 이용하여 환경에 영향받지 않고 배추의 엘리트 라인을 선별함과 동시에 배추 종자 순도의 대량 검증이 가능하게 되어, 우수한 품질을 갖는 배추를 선별적으로 재배할 뿐만 아니라, 배추 재배 비용 및 기간을 단축을 기대할 수 있다.
도 1은 배추 핵심 집단의 유전체 재분석을 위하여 구축한 파이프라인을 나타낸 도이다.
도 2는 배추의 핵심 집단 내에서 식별된 SNP를 대상으로 계통 특이적인 SNP를 식별하고 최종적으로 계통 구분용 KASP 마커 디자인의 수행을 위해 구성한 작업 체계를 나타낸 도이다
도 3은 계통 특이적 SNP를 식별한 과정 및 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 NGS 분석을 통해 식별된 계통 특이적 SNP를 나타낸 도이다.
도 5는 26021에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 26021에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 26022에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 26022에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 CNU_12239에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 CNU_12239에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 12015에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 12015에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 28059에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 28059에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 28061에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 28061에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 CNU_11411에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 CNU_11411에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 CNU_11412에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 CNU_11412에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 CNU_11479에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 CNU_11479에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 CNU_11480에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 CNU_11480에 대한 계통 특이적 SNP 검증 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예 1: 핵심 집단의 기원지 및 작형 분류
실시예 1-1: 핵심 집단의 기원지 조사
동아시아 지역에서 수집된 현대 배추 육종에서 활용되는 계통 및 유전자원 156점을 활용하여 배추의 핵심 집단을 구성하였다. 종래에 핵심 집단의 계통에 대한 고찰이 이루어진 바 없어 SNP 식별을 위하여 핵심 집단 내 계통의 기원지 정보를 조사하였다. 이에 따라, 핵심 집단은 크게 국내(76개 계통), 중국계(58개 계통), 비 배추형(16개 계통), 및 일본계(6개 계통) 순으로 이루어지며, 국내 및 중국계 유전자원이 핵심 집단 내에서 큰 비중을 차지하고 있음을 확인하였다.
상기 국내 계통(76개 계통)은 국내 재래종(5개 계통) 및 국내 육종 회사 공여 계통(71개 계통)으로 구분되며, 상기 국내 육종 회사 공여 계통(71개 계통)에 대한 정보를 구체화하고 개별적 설문을 진행한 결과, 부모본으로 활용된 계통 정보, 기원지, 도입 시기, 및 개발시기, 배추의 작형, 뿌리 혹병 병저항성 유무와 같은 농업적 특성을 확인하였다. 이에 따라, 현재 보유한 국내 육성 계통은 봄과 가을작형이 많은 것으로 나타났다.
상기 중국계 계통(58개 계통)은 한국에서 육성되고 있는 배추의 기원으로서, 계통명, 사진 자료, 및 표현형 조사 결과로 분류를 수행한 결과, 중국계 계통은 북방계(10개 계통), 산동계(1개 계통), 및 남방계(5개 계통)로 분류됨을 확인하였다.
실시예 1-2: 핵심 집단의 기원에 대한 육종 관련 정보 확보
핵심 집단은 배추의 상업적인 육종이 시작된 19세기 말 이후 육성된 계통, 동아시아 전역의 지역 재래종, 및 현행 국내 육종자원을 통합한 유전자원이다. 중국의 지역 재래종들은 한국 및 일본으로 유입되었고, 1920년에 결구형질이 고정된 계통군이 일본에서 나타났다. 수량 및 수송성이 우수한 일본 계통은 1950년 이후 F1 하이브리드(hybrid)를 활용한 식량 증산에 초점이 맞춰진 한국의 육종 프로그램에서 부모본으로서 적극적으로 활용되었다. 이후, 봄여름 작기에서의 추대 억제, 여름 작기에서의 생산을 위한 내서성, 배추 생산을 위한 저해요인으로 알려진 뿌리혹병 저항성 도입등과 같이 재배가능 환경의 확대와 수량 증대를 위해 시기별로 새로운 해외 유전자원을 도입하거나 분리계를 선발하여 현재의 국내 배추 계통군이 구성됨을 확인하였다.
실시예 2: 핵심 집단의 유전체 재분석 및 유전체 구조 분석
실시예 2-1: 핵심 집단의 유전체 재분석을 위한 파이프라인 구축
유전체 재분석을 위하여, (1)원시 데이터인 NGS 데이터 생성(Preparing NGS data), (2)데이터 전처리 및 표준 유준체 상에 리드 정렬(Read preprocessing and alignment), (3)정렬 결과 편집(Bam file modification), 및 (4)유전변이 추출(Variant calling)의 네 단계로 구분하여 진행하였다(도 1).
(1) 원시 데이터인 NGS(Next-Generation Sequencing) 데이터 생성(Preparing NGS data)
Illumina NovaSeq 및 HiSeq platform으로 paired-end sequencing이 수행된 156개 NGS 데이터를 분석 대상으로 하였으며, 이 과정에서 생성된 FASTQ 형식으로 저장된 파일을 원시 데이터로 하였다. 계통별 변이 탐색에 활용하기 위한 배추의 표준 유전체로 Brassica rapa spp. pekinensis (ver 3.0)을 이용하였다.
(2) 데이터 전처리 및 표준 유전체 상에 리드 정렬(Read preprocessing and alignment)
데이터 전처리 과정은 원시데이터의 정확도를 증가시키는 과정이다. 구체적으로, 생성된 FASTQ 파일은 해독한 염기의 정확도(quality score 또는 error rate)를 포함하므로, Fast QC(v.0.11.8)를 통해 계통별 리드(read) 서열의 정확도 및 어댑터(adaptor) 서열의 존재 유무를 확인하였으며, Trimmomatic(v.0.36)를 통해 오류 확률이 높은 영역 및 어댑터 서열이 나타난 리드들을 제거함으로써 염기서열의 정확도를 관리하였다.
리드 정렬 단계는 유전 변이를 포함하는 리드들을 표준 유전체의 염기 서열과 비교하여 리드의 염기서열과 일치하는 위치를 표준 유전체 염기 서열에서 찾는 과정이다. 이를 위하여, BWA(v.0.7.17-r1188)을 활용하여 리드의 표준 유전체 상에서 정렬(alignment)을 수행하였다. 리드들의 정렬 결과는 SAM(sequence alignment map) 형식으로 저장하였다.
(3) 정렬 결과 편집(Bam file modification)
본 과정은 정렬 후속 과정으로서 변이를 추출하기에 앞서 정렬된 결과를 염색체별로 분류하고 PCR 과정에서 발생하는 인공적 결함(artifact)을 제거하기 위한 단계이다. 이를 위하여, samtools(v.1.9)를 이용하여 정렬 결과인 SAM 파일을 BAM 포맷으로 전환하고, 정확한 정렬의 가능성을 의미하는 MAPQ가 30 이하(-q30)인 리드 서열을 제거하였다. 또한, picard-tools의 MarkDuplicates 옵션을 이용하여 정렬된 리드들 중 PCR duplicate를 제거하였다.
이후, 상기 정렬 후속 과정의 일종으로 Indel(Insertion or Deletion) 영역에 정렬된 리드의 재정렬을 수행하였다. 구체적으로, GATK package (v.3.7)의 RealignerTargetCreator 옵션으로 유전체 어셈블리(genome assembly)상에 리드가 정렬된 영역 상에서 indel 위치를 식별하고 IndelRealigner 해당 위치의 리드에 대한 정렬을 재 수행하였다.
한편, picard-tools의 AddOrReplaceReadGroups 기능으로 각 계통별 파일에 계통 ID 정보를 BAM 파일의 리드군에 부여하였다.
(4) 유전변이 추출(Variant calling)
1) 각 계통의 BAM 파일로부터 변이 정보 생성
유전변이 추출 단계는 정렬, 정렬 후속 과정 및 염기 정확도 재 보정 등을 수행한 후, 리드들의 BAM/SAM 파일을 통합하여 SNP/Indel 영역을 찾는 과정이다. 이를 위하여 본 발명자들은 bcftools(v.1.9)의 mpileup 및 call 기능을 파이프로 연결한 명령어를 통해 계통별 BAM 파일로부터 변이 정보를 VCF 포맷으로 구성하였다. bcftools(v.1.9)의 filter 옵션으로 상기 VCF 파일을 계통의 깊이(depth)에 따라 30X 이상 및 30X 미만으로 구분하여 필터링하였다. 깊이는 유전체에서 각 염기가 리드에 의해 평균적으로 시퀀싱되어 규명된 정도를 의미한다.
2) 계통 개별적 변이 정보의 통합 및 집단 SNP의 필터링
본 발명자들은 변이 정보를 통합하기 위해, 계통별로 구성한 VCF 파일들을 In-house perl script로 취합하여 배추 156개 계통이 이루는 집단에서 나타날 수 있는 모든 SNP 위치를 식별하고 이를 텍스트 파일로 저장하였다. 이후, bcftools(v.1.9)의 mpileup 및 call 기능을 파이프로 연결한 명령어에 156개 계통의 bam 파일과 집단 SNP 위치 정보를 입력하여 집단에 대한 공동 변이 추출(joint variant calling)을 수행하였다.
한편, 변이 추출을 통해 얻은 SNP/Indel은 모듀 유의한 유전변이로 간주하기 어려우므로, 필터링을 통해 거짓 양성에 해당하는 SNP/Indel을 제거하고 유의한 SNP/Indel을 도출하는 과정을 수행하였다. 구체적으로, vcftools(v.0.1.13)을 통해 집단 내에서 다-대립형질의(multi-allelic) SNP가 나타나는 위치를 필터링하고 깊이가 3 이하인 유전형은 결측값(missing value)으로 변환하였다. plink(v.1.90b6.9)의 기능으로 maf(minium allele frequency) 0.05 미만, 결측률(missing rate) 10% 이상의 SNP 위치를 필터링하였다. Tassel 5.0 GUI software를 통해 heterozygous allele 비율이 10% 이상인 SNP를 필터링하였으며, plink(v.1.90b6.9)를 활용하여 LD pruning을 수행하였다(Sliding window 50 SNPs, Step:5 R2≥0.3).
그 결과, 핵심 집단을 구성하는 NGS 데이터의 배추 genome assembly ver 3.0와 대비하여 발굴을 통해 348,130개의 SNP 변이 위치를 식별하였다. 해당 결과는 핵심 집단의 유전체 구조 추정, 계통 특이적 SNP 식별, SNP 검증, 및 유전형 분석(genotyping)을 위한 프라이머 디자인에 활용되었다.
실시예 2-2: 핵심 집단의 유전체 구조 분석
배추 핵심 집단의 SNP 데이터를 활용한 구조 분석으로 핵심 집단의 유전체 구조를 밝히고 분석에 의한 클러스터화(clustering) 결과를 분석하였으며, 그 결과, 중국 북방계와 중국 남방계의 도입 순서 등에서 기존의 문헌으로 탐색한 실제 계통들의 기원지 및 특성과 일치함을 확인하였다.
실시예 3: 계통 특이적 마커 개발
핵심 집단 내에서 식별된 SNP를 대상으로 계통 특이적인 SNP를 식별하고 최종적으로 계통 구분용 KASP 마커 디자인의 수행을 위한 작업 체계를 구성하였다(도 2)
계통 특이적 SNP 마커를 식별하기 위해, 실시예 2-1에 의해 배추 핵심 집단 내의 SNP를 식별 및 이에 대한 계통별 유전형을 확인한 이후, 동일한 SNP 변이 위치에 대한 계통간의 비교를 수행하였다. 전체 집단 내에서 특정 계통만이 보유한 자체적인 SNP들의 스크리닝을 위한 알고리즘을 In-house perl script로 구현하였다.
In-house perl script는 VCF 파일의 유전형 정보를 활용하며, VCF 파일 내에 기재된 각 SNP 위치에 대해 집단 내의 오직 한 계통에서만 동형접합 유전자(alternative homozygous allele)가 나타나는 SNP를 확인하였다. 집단 내 SNP 위치의 유전형들 중 이형접합 대립유전자(heterozygous allele)가 하나 이상 나타난 경우 해당 SNP를 제외하였다.
개발한 스크립트로 시퀀싱 깊이 30X 이상(98개 계통) 및 이하(58개 계통) 그룹에서 각각 71,513개 및 26,395개의 계통 특이적 SNP를 식별하였다. 그룹 간 공통 SNP인 4,197개를 제외하여 156개 계통 전체에 대한 89,478개의 계통 특이적 SNP를 최종 식별하였다(도 3).
한편, Genome assembly 상의 위치정보를 활용하여 계통 특이적 SNP를 염색체 별로 집계하여 이를 시각화하였다. 이러한 시각화를 통해 계통 별로 육종에 기피되거나 반영도가 낮은 유전적 영역의 추정도 기대할 수 있다.
이후, 핵심 집단 내의 계통에 나타난 모든 계통 특이적 SNP의 실질적인 마커 전환 가능성 평가를 수행하였다. 평가는 계통 특이적인 SNP 자체 및 SNP 인접 서열의 특성을 고려하여 진행하였으며 작업에서 고려한 요인 및 수행방법은 다음과 같다.
구체적으로, BLASTN을 통해 SNP 인접서열(SNP 좌우 250bp)의 배추 표준 유전체 상에서의 중복된 빈도 및 수준 확인을 고려하였다. samtools의 faidx 옵션으로 SNP 위치의 좌우 250 bp에 해당하는 영역을 추출 및 fasta 파일로 저장하고, 계통 특이적 SNP를 포함한 501bp 서열을 BLASTN으로 배추 genome assembly 상에 맵핑(mapping) 후 이를 집계하였다. 배추 genome assembly ver 3.0에서 제공한 transposon element(TE) 관련 gff 상에 기재된 총 201,261개의 반복 식별 영역 상에 계통 특이적 SNP의 존재 유무 및 SNP 인접서열이 중첩되는 수준의 평가하였다. tabix(v.0.2.5)로 계통 특이적 SNP만을 포함하는 vcf 파일을 indexing 하고, tabix(v.0.2.5)로 모든 TE 영역 범위 내에 나타난 계통 특이적 SNP 및 이를 보유한 계통명을 확인하며, In-house script로 SNP 인접서열 (501bp)의 추출영역과 TE 식별 영역의 overlapped length를 계산하였다. In-house script로 배추 핵심 집단 SNP의 vcf 파일에서 계통별 genotype을 기재한 정보 중 계통 특이적 SNP 그룹만의 genotype depth 정보만을 추출 후 정리하였다. 이후, snpEFF(v.4.3t)를 활용하여 계통 특이적 SNP들의 annotation을 수행하여 SNP의 유전자 구조상의 발생 위치 및 효과를 판별하였다.
실시예 4: KASP 마커를 이용한 계통 특이적 변이 검증
상기 실시예 2 및 3에 의해 식별된 계통 특이적 변이의 검증을 위한 계통 선발을 실시하였다. 배추의 분류 카테고리를 기원지 및 동아시아 내에서의 전파 과정을 고려하여 한국 육종자원, 한국 재래종, 중국 북방계, 일본 육종자원으로 분류하고 보유한 30X 이상으로 시퀀싱이 수행된 자원 중 서로 유전적 거리가 가까운 계통을 식별하여 카테고리별로 2개의 대표 계통을 선별하였으며 이에 따라 총 10개의 계통을 계통 특이적 변이의 검증 과정에 반영하였다. 상기 선별된 10개의 계통은 하기 표 1에 나타내었다.
No. Accession ID(자원명) 지리적 유래 학명 계통명
1 26021 Chinese northern type Brassica rapa ssp. pekinensis E1
2 26022 E2
3 CNU_12239 Chinese southern type 501
4 12015 FT-50
5 28059 Japanese breeding lines 평총1호
6 28061 송도신2호
7 CNU_11411 Korean breeding lines C-33
8 CNU_11412 C-34
9 CNU_11479 Korean landrace 11수-9,좀81-1-2M-4-2
10 CNU_11480 11수-10,좀81-1-2M-1-1
Sanger sequencing을 통한 계통 특이적 변이 검증을 위한 변이 선발 및 프라이머 세트를 디자인한 후, SNP 평가 결과를 반영하여 계통 각각에 대하여 2개의 SNP에 대한 검증용 프라이머를 선발하였으며, 선발된 10개 계통 특이적 SNP에 대한 평가 결과에서 SNP 인접 서열이 배추 genome assembly 상에 복제(duplication)가 없는 SNP를 선택하였고, 계통 특이적 SNP가 genome assembly 상에 반복 영역 내에 위치하거나, SNP 인접서열이 반복 영역과 중첩이 나타나는 SNP의 경우 프라이머 구성 대상에서 제외하였다.
인접 염기 서열을 SNP 위치 전후 250bp씩, 총 501bp 중 251번째에 위치하는 SNP를 타겟으로 하여 이를 검증하기 위한 프라이머를 제작하였다. SNP들의 인접서열(501bp)로 primer3을 활용하여 각 인접서열에서 프라이머를 구성하였으며, 조건은 ⅰ)프라이머는 인접염기서열상의 251bp에 위치하는 SNP를 타겟으로 함; ⅱ)SNP 기준 좌우 50bp 영역에서 프라이머 서열이 제작되지 않도록 마스킹(masking); 및 ⅲ)프라이머의 product 사이즈는 300~350bp로 설정하였다. 상기 기준으로 구성한 프라이머 세트를 이용하여 엑손, 인트론, 5'UTR 순으로하여, SNP 발생 위치가 같은 경우 SNP를 지지하는 리드의 깊이가 높은 것을 선택함으로써 프라이머 세트를 선발하여 검증하였다.
관련하여, Primer3의 SEQUENCE_FORCE_LEFT_END 옵션을 활용하여 변이 위치를 forward primer sequence의 3' 말단에 고정하여 10개 계통별로 서로 다른 특이적 SNP 4~5개를 targeting하는 50개의 KASP 마커를 구성하였다. 목표로 하는 변이 위치에 대하여 경쟁적으로 증폭 반응이 이루어지는 KASP 마커의 특성에 따라 계통 특이적 SNP의 reference allele과 alternative allele에 대한 각각에 대한 primer와 common primer를 구성하였다(표 5). 상기 KASP 마커 세트로 본 발명의 SNP를 검증한 결과, 계통 특이적인 마커로서의 효과가 확인되었으며, 각 계통을 판별하기 위한 SNP를 포함하는 서열은 [표 2] 및 서열번호 1 내지 20에 나타내었다.
서열번호 Accession ID(자원명) SNP 위치 계통 특이적 SNP 서열
1 26021 A02_18369509 C/T
2 26021 A06_6118599 G/A
3 26022 A01_6548614 A/T
4 26022 A03_3737651 A/C
5 CNU_12239 A09_12241049 G/T
6 CNU_12239 A09_20123503 C/A
7 12015 A03_2956471 C/T
8 12015 A05_6836152 C/G
9 28059 A07_23181319 G/T
10 28059 A07_23193769 C/T
11 28061 A06_19890710 C/A
12 28061 A10_450622 A/C
13 CNU_11411 A07_20012970 G/A
14 CNU_11411 A09_37233481 C/T
15 CNU_11412 A07_21781162 C/G
16 CNU_11412 A09_42427036 C/G
17 CNU_11479 A03_21060850 A/C
18 CNU_11479 A06_3079806 A/G
19 CNU_11480 A01_11372183 G/T
20 CNU_11480 A03_10121108 G/A
아울러, 10개 계통의 계통 특이적 SNP 검증에 사용된 상기 KASP 프라이머 세트의 구성은 [표 3] 및 서열번호 21 내지 80과 같다.
서열번호 Accession ID (자원명) Primer_Common
(Reverse primer)		 Primer_Allele1[FAM]
(Forward primer)		 Primer_Allele2[HEX]
(Forward primer)		 chr position(bp)
21~23 26021 TGTACAAGTCCTAGCACGCC TCTCCAAACGAAAACAAGACCAC TCTCCAAACGAAAACAAGACCAT A02 18369509
24~26 26021 CACCTTCTGGGAGAGGCTTC CCCTTATCTGTTTTACTCTTTGCTTCG CCCTTATCTGTTTTACTCTTTGCTTCA A06 6118599
27~29 26022 TCTGTGGCTGCATGCTTGTA TCAGAGTGCTATCCGAAAATTTAA TCAGAGTGCTATCCGAAAATTTAT A01 6548614
30~32 26022 AGGAGTTCTTGATTCTGTCGCA CAAATTCAGCAGCCTCACCAA CAAATTCAGCAGCCTCACCAC A03 3737651
33~35 CNU_12239 TCATTACTCCTGGGACTCCGT TACTGCAGAGCTACTGAGAG TACTGCAGAGCTACTGAGAT A09 12241049
36~38 CNU_12239 TGCTCAGGTTATTGGTGCTT CACTCTTATCTGCGTCATTTAACC CACTCTTATCTGCGTCATTTAACA A09 20123503
39~41 12015 AGTGGCCAGGGATTTGAACC GATGCACACAAGGCGGCCTC GATGCACACAAGGCGGCCTT A03 2956471
42~44 12015 CGTCAATGGAACCGACGGTA CTCCGGATTGAGCCTCCGGC CTCCGGATTGAGCCTCCGGG A05 6836152
45~47 28059 GAGGTGGGAGAGGAAGAGGA GTCTTATCACTTACATTGGAAGGCG GTCTTATCACTTACATTGGAAGGCT A07 23181319
48~50 28059 GACACGGGTTTGAGCAACAC CGCTCACTGGTAACACCGAC CGCTCACTGGTAACACCGAT A07 23193769
51~53 28061 GGTTTTGCAGAACCTTGTCTT TCCTATTCCTGAAGATAAAGTTCCC TCCTATTCCTGAAGATAAAGTTCCA A06 19890710
54~56 28061 AAAGAGGATTCATAAAGCTTACGCA TCCGGGCAACATTCGTCTAA TCCGGGCAACATTCGTCTAC A10 450622
57~59 CNU_11411 TCAAACTCGTGAAGCGGAGG GAGAATGGCTTGAGGGATTACG GAGAATGGCTTGAGGGATTACA A07 20012970
60~62 CNU_11411 GAGAATGTTGTGGTGCGTGT CACCAACATGATGGTGGTGAC CACCAACATGATGGTGGTGAT A09 37233481
63~65 CNU_11412 AGGCTTCTTCAGTGGTTCACC TGCATTAGTTTGCCTCTTGATGC TGCATTAGTTTGCCTCTTGATGG A07 21781162
66~68 CNU_11412 CGCTATCGTCACTTTCATCAACT CGACAGGAAAGGTAAAGGCATATC CGACAGGAAAGGTAAAGGCATATG A09 42427036
69~71 CNU_11479 TACTGCCTCGGTTGATGCAA CTGCACGCGACAGCAACA CTGCACGCGACAGCAACC A03 21060850
72~74 CNU_11479 ACAGGACTCGGACTAGCCAT AAGGTGCGGACTCCTCCA AAGGTGCGGACTCCTCCG A06 3079806
75~77 CNU_11480 TCACTCTCACTCTCTTCCTCCA GAGATGGGAGTGTTGTTGAAGAG GAGATGGGAGTGTTGTTGAAGAT A01 11372183
78-80 CNU_11480 TCGTCTCACCAGACCTAGAGT TCCGTCTAGAATCGAGCTAAAAG TCCGTCTAGAATCGAGCTAAAAA A03 10121108
또한, 서열번호 21 내지 80의 염기서열로 표현되는 본 발명의 KASP 마커들은 배추 계통에 특이적인 SNP를 반영하고 있는 마커들이므로, 본 발명의 SNP 마커와 마찬가지로 배추 계통을 구분할 수 있다.
실시예 5: 배추 계통 구분을 위한 SNP 마커 20종 최종 검증
상기 실시예 4에서 KASP 마커를 이용하여 검증한 서열번호 1 내지 20의 SNP가 실제로 배추 계통을 구분할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 검증을 수행하였다. 구체적으로, NGS 분석을 통해 식별된 본 발명의 계통 특이적 SNP 검증을 위하여 이를 포함하는 배추 표준 유전체상 영역을 Sanger sequencing한 결과 실제 각 계통에서 계통 특이적 SNP가 나타나는지 확인하였다.
이를 위하여, NGS 분석을 통해 식별된 서열번호 1 내지 20의 SNP로 표현되는 계통 특이적 SNP 20종을 특정하여 도 4에 나타내었다. 이후, 배추 각각의 계통의 염기 서열을 정렬(align)한 후의 결과에서 계통 특이적 SNP를 포함한 행과 인접한 2행만을 시각화하였다.
그 결과, 본 발명의 서열번호 1 내지 20의 SNP 모두 자원명(Accession ID) 26021, 26022, CNU_12239, 12015, 28059, 28061, CNU_11411, CNU_11412, CNU_11479, 또는 CNU_11480 계통에 특이적이며, 이에 따라 각각의 계통을 구분할 수 있는 마커가 됨을 확인하였다. 구체적으로, 검증에 따라 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우에는, Accession ID 26021 계통; 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우에는, Accession ID 26022 계통; 서열번호 5으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 6로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, Accession ID CNU_12239 계통; 서열번호 7으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우에는, Accession ID 12015 계통; 서열번호 9으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우에는, Accession ID 28059 계통; 서열번호 11으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우 또는 서열번호 12로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우에는, Accession ID 28061 계통; 상기 서열번호 13으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우 또는 서열번호 14로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우에는, Accession ID CNU_11411 계통; 서열번호 15으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우 또는 서열번호 16로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우에는, Accession ID CNU_11412 계통; 서열번호 17으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우 또는 서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우에는, Accession ID CNU_11479 계통; 및 서열번호 19으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 20로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우에는, Accession ID CNU_11480 계통으로 구분할 수 있음을 확인하였다. 상기 서열번호 1 내지 20의 SNP에 대한 검증 결과는 각각 도 5 내지 24의 순서로 나타내었다.
상기 결과로부터 본 발명의 서열번호 1 내지 내지 20은 계통 특이적 SNP 마커로서 계통을 특이적으로 구분할 수 있고, 서열번호 21 내지 80도 계통 특이적 KASP 마커로서 계통을 특이적으로 구분할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Novel marker based on Single Nucleotide Polymorphism for identification of line of Brassica rapa ssp. pekinensis <130> KPA200481-KR <160> 80 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Brassica rapa <400> 1 aacagcttga ggaacccatt cacaattgtt atcccagtaa gcaacgagct cgatatccaa 60 atagcccgat ttccaagtag cccgatcttc acatagctcg atcttagcat caagttcgat 120 ctccaatgcg ctcggacata ctcgaggagc cgacaatgca tctttctccc taaaaacgat 180 atgccgatga aatataaata ttttgagaat gcatgttgtc taatggtatc tccaaacgaa 240 aacaagacca caactggcag gaagcacgtg ataattcaca aaggcgtgct aggacttgta 300 cacgaatcaa atcaatagtt catagcctga atgcaccgcc ctctcatcgt ctacgcaaaa 360 aacacatgat caaacatctg acaccattct catctccgct agctcgcagt caccgagaca 420 agaacaagcc cgccttggta aataatcatc cttaaccaat ttgcgcatat aattatattg 480 catcagataa ataaattctt g 501 <210> 2 <211> 501 <212> DNA 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accaacagta gggagttttg ccatggctag tccgagtcct gttggtggtt 300 cagctggttt gtctgggact actaggagta caccactaag agctgttagg atgtctcctg 360 gtgctcagaa atttacgact ccaccaaaga aaggagaggg tgatttcccc acacccatgt 420 ccttagaaca ggcgatcgaa ggttttaggc aactaggcgt gtatcctcag atagaatact 480 ggcgtgacag actaaggcaa t 501 <210> 19 <211> 501 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Brassica rapa <400> 19 ttgtggccga cgcgttgctt ctcacccgca gtctctccgg cacgttttcg tctgctggct 60 cggttccaat ccgtgcacca atcacgattg acgacgagga tgatgatgat gatgatgatg 120 gttctgttac agacgatggt tttgagtctg tctctgggga tgcagacgat gaggctgagc 180 tagaggatgt gattagggtt ctaggggaag agtcagttgg agaaaatgga gatgggagtg 240 ttgttgaaga ggaagcttct gttaattact ctcctttgga ggaagagagt gagagtgaag 300 ttagtgaagc taaactagtc attccccggg ccagtttgtc tttgaatgat gatgaagttt 360 tgggtagtag tagtggtgat gaagaagctg aagtcgaaga taagacattg cagtctggag 420 atttgggatt ggttgatgag cctgagtgct caggttctgt tctaactgat gtcgtttcca 480 cggaggatga agcggttgag a 501 <210> 20 <211> 501 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Brassica rapa <400> 20 gagacaagaa agaagctcac agcaaaggga catattcctc aagaaggata catcttagag 60 tatcttccag tcccgcctaa ctgtctgtca gtgccagaag tttctgatgg ttccaactcc 120 atgtcagtgg taaggccgtc gaaaccaaaa tgctttcttg agttcattga ttacttttgg 180 cttgtttaca aactaacccg gaatgtatgc cattcttttt tttcaggatc cgtctagaat 240 cgagctaaaa gacgttctca ggaaagtggt agcgatcaac aactctaggt ctggtgagac 300 gaactttgag tcgcatagag ctgaagccaa tgaaatgttt agagtggtgg atacctatct 360 tcaggtgagg ggtactgcaa agccaacaag aaacattgac atgagattcg gggtgtccaa 420 gatctcggac agttcctcct caaaagcttg gacagaaaag atgagaacac ttttcattcg 480 gaaaggttca ggcttctctt c 501 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 21 tgtacaagtc ctagcacgcc 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 22 tctccaaacg aaaacaagac cac 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 23 tctccaaacg aaaacaagac cat 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 24 caccttctgg gagaggcttc 20 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 25 cccttatctg ttttactctt tgcttcg 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 26 cccttatctg ttttactctt tgcttca 27 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 27 tctgtggctg catgcttgta 20 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 28 tcagagtgct atccgaaaat ttaa 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 29 tcagagtgct atccgaaaat ttat 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 30 aggagttctt gattctgtcg ca 22 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 31 caaattcagc agcctcacca a 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 32 caaattcagc agcctcacca c 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 33 tcattactcc tgggactccg t 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 34 tactgcagag ctactgagag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 35 tactgcagag ctactgagat 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 36 tgctcaggtt attggtgctt 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 37 cactcttatc tgcgtcattt aacc 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 38 cactcttatc tgcgtcattt aaca 24 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 39 agtggccagg gatttgaacc 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 40 gatgcacaca aggcggcctc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 41 gatgcacaca aggcggcctt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 42 cgtcaatgga accgacggta 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 43 ctccggattg agcctccggc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 44 ctccggattg agcctccggg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 45 gaggtgggag aggaagagga 20 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 46 gtcttatcac ttacattgga aggcg 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 47 gtcttatcac ttacattgga aggct 25 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 48 gacacgggtt tgagcaacac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 49 cgctcactgg taacaccgac 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 50 cgctcactgg taacaccgat 20 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 51 ggttttgcag aaccttgtct t 21 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 52 tcctattcct gaagataaag ttccc 25 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 53 tcctattcct gaagataaag ttcca 25 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 54 aaagaggatt cataaagctt acgca 25 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 55 tccgggcaac attcgtctaa 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 56 tccgggcaac attcgtctac 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 57 tcaaactcgt gaagcggagg 20 <210> 58 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 58 gagaatggct tgagggatta cg 22 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 59 gagaatggct tgagggatta ca 22 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 60 gagaatgttg tggtgcgtgt 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 61 caccaacatg atggtggtga c 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 62 caccaacatg atggtggtga t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 63 aggcttcttc agtggttcac c 21 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 64 tgcattagtt tgcctcttga tgc 23 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 65 tgcattagtt tgcctcttga tgg 23 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 66 cgctatcgtc actttcatca act 23 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 67 cgacaggaaa ggtaaaggca tatc 24 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 68 cgacaggaaa ggtaaaggca tatg 24 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 69 tactgcctcg gttgatgcaa 20 <210> 70 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 70 ctgcacgcga cagcaaca 18 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 71 ctgcacgcga cagcaacc 18 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 72 acaggactcg gactagccat 20 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 73 aaggtgcgga ctcctcca 18 <210> 74 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 74 aaggtgcgga ctcctccg 18 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 75 tcactctcac tctcttcctc ca 22 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 76 gagatgggag tgttgttgaa gag 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 77 gagatgggag tgttgttgaa gat 23 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse common primer <400> 78 tcgtctcacc agacctagag t 21 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 79 tccgtctaga atcgagctaa aag 23 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 80 tccgtctaga atcgagctaa aaa 23

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에서, SNP 위치인 각 서열의 251번째 염기를 포함하고, 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 배추의 계통 구분용 SNP 마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 계통은 정밀 육종(precision breeding)을 위한 것인, 마커.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 20에서 선택된 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 중,
    서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 C인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 5로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 6으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 7로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 9로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 11로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 12로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 C인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 13로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 14로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 15로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 16로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 C 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 17로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 C인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 A 또는 G인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드;
    서열번호 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 T인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
    서열번호 20으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 염기가 G 또는 A인 251번째 염기를 포함하는 5 내지 501개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인, 배추의 계통 구분용 SNP 마커.
  4. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID 26021 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 3 또는 서열번호 4로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID 26022 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 5 또는 서열번호 6로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID CNU_12239 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 7 또는 서열번호 8로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID 12015 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 9 또는 서열번호 10로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID 28059 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 11 또는 서열번호 12로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID 28061 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 13 또는 서열번호 14로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID CNU_11411 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 15 또는 서열번호 16로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID CNU_11412 계통을 구분하기 위한 마커;
    상기 서열번호 17 또는 서열번호 18로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID CNU_11479 계통을 구분하기 위한 마커; 및
    상기 서열번호 19 또는 서열번호 20로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP 마커는, Accession ID CNU_11480 계통을 구분하기 위한 마커인, 배추의 계통 구분용 SNP 마커.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 배추의 계통 구분용 SNP 마커를 검출할 수 있는 프로브, 프라이머, 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 배추의 계통 구분용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프라이머는 하기의 a) 내지 t)의 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물:
    a) 서열번호 21 및 서열번호 22의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 21 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    b) 서열번호 24 및 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 24 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    c) 서열번호 27 및 서열번호 28의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 27 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    d) 서열번호 30 및 서열번호 31의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 30 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    e) 서열번호 33 및 서열번호 34의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 33 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    f) 서열번호 36 및 서열번호 37의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 36 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    g) 서열번호 39 및 서열번호 40의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 39 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    h) 서열번호 42 및 서열번호 43의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 42 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    i) 서열번호 45 및 서열번호 46의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 45 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    j) 서열번호 48 및 서열번호 49의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 48 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    k) 서열번호 51 및 서열번호 52의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 51 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    l) 서열번호 54 및 서열번호 55의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 54 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    m) 서열번호 57 및 서열번호 58의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 57 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    n) 서열번호 60 및 서열번호 61의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 60 및 서열번호 62의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    o) 서열번호 63 및 서열번호 64의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 63 및 서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    p) 서열번호 66 및 서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 66 및 서열번호 68의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    q) 서열번호 69 및 서열번호 70의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 69 및 서열번호 71의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    r) 서열번호 72 및 서열번호 73의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 72 및 서열번호 74의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    s) 서열번호 75 및 서열번호 76의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 75 및 서열번호 77의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
    t) 서열번호 78 및 서열번호 79의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 78 및 서열번호 80의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 a) 및 b)는 Accession ID 26021 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 c) 및 d)는 Accession ID 26022 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 e) 및 f)는 Accession ID CNU_12239 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 g) 및 h)는 Accession ID 12015 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 i) 및 j)는 Accession ID 28059 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 k) 및 l)은 Accession ID 28061 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 m) 및 n)은 Accession ID CNU_11411 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 o) 및 p)는 Accession ID CNU_11412 계통을 구분하기 위한 프라이머;
    상기 q) 및 r)은 Accession ID CNU_11479 계통을 구분하기 위한 프라이머; 및
    상기 s) 및 t)는 Accession ID CNU_11480 계통을 구분하기 위한 프라이머인, 배추의 계통 구분용 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항의 조성물을 포함하는 배추 계통 구분용 키트.
  9. (a) 배추로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 마커를 검출하기 위한 제제를 이용하여 마커를 검출하는 단계를 포함하는, 배추의 계통을 구분하는 방법.
  10. (a) 배추로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제6항의 상기 a) 내지 t)의 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 KASP의 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는, 배추의 계통을 구분하는 방법.
  11. (a) 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (b)단계에서 결정된 염기서열 중,
    서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 2로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, Accession ID 26021 계통;
    상기 서열번호 3으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 4로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우, Accession ID 26022 계통;
    상기 서열번호 5으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 6로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, Accession ID CNU_12239 계통;
    상기 서열번호 7으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 8로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우, Accession ID 12015 계통;
    상기 서열번호 9으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 10으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우, Accession ID 28059 계통;
    상기 서열번호 11으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우 또는 서열번호 12로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우, Accession ID 28061 계통;
    상기 서열번호 13으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우 또는 서열번호 14로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우, Accession ID CNU_11411 계통;
    상기 서열번호 15으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우 또는 서열번호 16로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우, Accession ID CNU_11412 계통;
    상기 서열번호 17으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 C인 경우 또는 서열번호 18로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 G인 경우, Accession ID CNU_11479 계통; 및
    상기 서열번호 19으로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 T인 경우 또는 서열번호 20로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 251번째 서열이 A인 경우, Accession ID CNU_11480 계통으로 구분하는 것인, 배추의 계통 구분을 위한 정보의 제공 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230068537A (ko) * 2021-11-11 2023-05-18 공주대학교 산학협력단 밀의 성숙기 판별용 바이오마커

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