KR20230068537A - 밀의 성숙기 판별용 바이오마커 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따라 규명된 밀의 성숙기에 유의하게 영향을 미치는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 마커는 밀의 재배 특성을 재배 품종을 선택하는데 도움을 줄 수 있고, 밀 품종에 따라 적합한 재배 방법을 제시하는 것이 가능하다.
Description
본 발명은 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 밀의 성숙기 판별용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 밀의 성숙기 판별 방법에 관한 것이다.
밀은 동양에서 보조식량으로 쓰이지만 서양에서는 주식량이며, 쌀과 함께 세계의 2대 식량 작물이다. 90% 이상이 제분되어 제면·제빵·제과·공업용으로 사용된다. 세계 밀 생산량은 최근 10년 동안 소비량 증가 추세에 맞추어 꾸준히 증가하고 있지만, 수량성 증대는 밀 육종 프로그램에서 여전히 제일 중요한 목표이다.
이상기후로 인한 재배 환경의 급격한 변화로 인하여 생산성 증진과 안정성을 동시에 확보해야 하기 때문에 세계 각국은 지속적인 관련 연구를 수행하고 있다. 유럽은 최근에 기후 변화 대응을 위한 내건성 증진과 밀 수량 증대에 관한 연구가 활발하다. 그러나, 국내에서의 밀에 대한 연구는 타국과 비교해서 매우 부진한 편이다.
밀의 수량은 단위면적당 분얼수, 1수립수 및 종자 무게의 영향을 가장 많이 받는 것으로 알려져 있으며, 이러한 측면에서, 밀 수량 증대를 위해 밀의 농업 형질과 유전적 특성을 연구하고, 국내 밀 육종 또는 밀 재배에 적용될 수 있는 한국형 밀 핵심집단의 SNP 분석 및 분자 마커를 개발하는 것이 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레이드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 밀의 성숙기 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 밀 시료의 DNA로부터 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 36번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 성숙기가 빠른 밀 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레이드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물을 제공한다.
상기 마커는 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개, 구체적으로 5 내지 150개, 보다 구체적으로 5 내지 100개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커일 수 있다. 또한, 상기 마커는 상기 36번째 염기가 T일 경우 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별하는 것일 수 있다.
본 발명의 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 단일 염기 다형성 마커는 밀 2D번 염색체(genome)의 BA00470958일 수 있으며, 상기 BA00470958는 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G일 수 있다.
즉, 본 발명에 있어서, 밀의 성숙기의 판단은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 T인 경우 성숙기가 빨라 출수기도 빠르며, 영양생장기간이 짧고, 식물체의 크기도 작으며 빠른 개화를 나타냈고, 상기 36번째 염기가 G인 경우 성숙기가 늦고 영양생자기간이 길어 식물체의 크기가 대체적으로 큰 것으로 나타났다. 본 발명의 일 실시예에서, 유전자형이 TT인 경우 성숙기가 빠른 것으로 나타냈고, 유전자형이 GG인 경우 TT의 유전자형 보다 성숙기가 늦은 것으로 판별되었다(표 4 및 5).
본 발명에서 용어 "판별"은 고구마 품종 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 품종의 다양성을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '구별'과 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "SNP(Single Nucleotide Polymorphism)"란, 단일염기다형성으로, 게놈에서 단일염기(A, T, C, 또는 G)가 종의 멤버들간 또는 한 개체의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.
본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 밀의 성숙기를 확인하고자 하는 대상인 밀을 의미하며, 상기 밀로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 밀의 성숙기 시기를 판단할 수 있다.
상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "다형성(Polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(Locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(Allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.
본 발명의 용어 "대립유전자(Allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(Biallele)를 갖는다.
본 발명은 밀에서 유전자를 분리하고, GWAS 분석결과와 GAPIT을 통해 성숙기에 대하여 LOD값 5이상을 선택하였으며 이를 통하여 SNP 탐색 및 NCBI를 통해 SNP와 연관되어 있는 유전자를 탐색하였다.
핵심집단 계통 및 SNP chip data를 활용하여 SNP 염기서열을 배열하였으며 출수시기에 연관된 SNP 마커를 선별하였다.
구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 성숙기 결정에 특이적임을 확인하였고, 구체적으로 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기가 T로 특이적이고, 성숙시기가 빠르고, 식물체가 작아지거나, 개화기 빠른 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태로, 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다.
상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 2 및 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
일예로, 상기 프라이머는 일 예로 서열번호 2(5'-AGTCTTCTACGCCTTCACC-3') 및 서열번호 3(5'-CATAGACACACCGATACACG-3')의 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(Template)와 염기쌍(Base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 키트를 제공한다.
상기 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.
본 발명의 HRM 분석 키트는 밀의 성숙기 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 밀의 성숙기를 판단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 밀의 성숙기 판단용 HRM 분석 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기의 변이에 따른 이중가닥의 해리 정도의 차이를 감지하여 유전자형을 판단하는 키트일 수 있다.
상기 "고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 분석" 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법으로, 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 이중가닥 DNA(dsDNA)에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리할 수 있다. 본 발명에서는 밀의 성숙기 판단을 위하여 HRM 분석을 사용하였다.
상기 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 DNA 칩 키트는 밀의 성숙기 판단용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 밀의 성숙기를 판별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 밀의 성숙기 판단용 DNA 칩 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 밀의 성숙기 판단용 키트일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 밀 시료의 DNA로부터 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 36번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 밀의 성숙기 판별 방법을 제공한다.
상기 판별 방법은 상기 36번째 염기가 T인 경우, 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별할 수 있다.
상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가아제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(Transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.
상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출할 수 있다.
상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(Dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(Mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.
"HRM 분석" 기술은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(Matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.
구체적으로, 상기 (b)단계는 HRM(High resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는, 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명자들은 밀의 성숙기 판별하기 위해 전체 유전체 시퀀싱을 통해 SNP를 탐색하였고 탐색 과정에서 벼의 성숙기와 관계가 있는 QTL 주변의 유전자를 발견하였다. 또한, 해당 유전자의 ORF 서열에서 SNP를 발견했으며, 해당 SNP가 밀의 성숙기를 정확하게 판별 가능한 SNP 마커임을 입증하였다.
본 발명에서 있어서, 상기 밀의 성숙기를 판별하기 위한 정보의 제공은 컴퓨터 프로그램을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 밀의 상기 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기 확인 결과를 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 통하여 출력하고, 그 결과, 판별 대상 밀의 성숙기가 빠른지 또는 느린지 확인할 수 있다. 또는, 검사 대상 밀의 판별된 성숙기에 맞추어 재배 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 분석방법은 밀의 성숙기를 판별할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 밀의 재배 특성을 고려하여 재배 품종을 선택하는데 도움을 줄 수 있고, 밀 품종에 따라 적합한 재배 방법을 제시할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 성숙기에 대한 GWAS 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 BA00470958에 대한 염기서열을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된 BA00470958에 대한 염기서열을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
준비예 1. 밀 품종의 수집 및 전장유전체 연관분석(GWAS) 수행
국립 유전자원센터에서 분양 받은 국내외 재배 및 수집종 밀 1,969점(유전자원센터에서 1,269점, 진흥청 고세대 계통 CB700점)을 대립형질(Allele) 특이적인 SSR마커 37쌍을 이용하여 약 73,000번의 PCR을 수행하고(표 1), Qiagen사의 QIAxcel 프로그램을 이용하여 디지털 전기영동을 수행하여 밴드 양상을 확인하였다.
| primer | forward (5'-3') | Reverse (5'-3') |
| Xgwm2-3A | CTGCAAGCCTGTGATCAACT | CATTCTCAAATGATGGAACA |
| Xgwm5-3A | GCCAGCTACCTCGATACAACTC | AGAAAGGGCCAGGCTAGTAGT |
| Xgwm11-1B | GGATAGTCAGACAATTCTTGTG | GTGAATTGTGTCTTGTATGCTTCC |
| Xgwm44-7D | GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC | AGTGGCATCCACTGAGCTG |
| Xgwm46-7B | GCACGTGAATGGATTGGAC | TGACCCAATAGTGGTGGTCA |
| Xgwm99-1A | AAGATGGACGTATGCATCACA | GCCATATTTGATGACGCATA |
| Xgwm120-2B | GATCCACCTTCCTCTCTCTC | GATTATACTGGTGCCGAAAC |
| Xgwm135-1A | TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG | ACACTGTCAACCTGGCAATG |
| Xgwm149-4B | CATTGTTTTCTGCCTCTAGCC | CTAGCATCGAACCTGAACAAG |
| Xgwm196-6A | ACCACTGCAGAGAACACATACG | GTGCTCTGCTCTAAGTGTGGG |
| Xgwm186-5A | GCAGAGCCTGGTTCAAAAAG | CGCCTCTAGCGAGAGCTATG |
| Xgwm190-5D | GTGCTTGCTGAGCTATGAGTC | GTGCCACGTGGTACCTTTG |
| Xgwm219-6B | GATGAGCGACACCTAGCCTC | GGGGTCCGAGTCCACAAC |
| Xgwm233-7A | TCAAAACATAAATGTTCATTGGA | TCAACCGTGTGTAATTTTGTCC |
| Xgwm234-5B | GAGTCCTGATGTGAAGCTGTTG | CTCATTGGGGTGTGTACGTG |
| Xgwm251-4B | CAACTGGTTGCTACACAAGCA | GGGATGTCTGTTCCATCTTAG |
| Xgwm257-2B | AGAGTGCATGGTGGGACG | CCAAGACGATGCTGAAGTCA |
| Xgwm260-7A | GCCCCCTTGCACAATC | CGCAGCTACAGGAGGCC |
| Xgwm261-2D | CTCCCTGTACGCCTAACGC | CTCGCGCTACTAGCATTG |
| Xgwm272-5D | TGCTCTTTGGCGAATATATGG | GTTCAAAACAAATTAAAAGGCCC |
| Xgwm285-3B | ATGACCCTTCTGCCAAACAC | ATCGACCGCGATCTAGCC |
| Xgwm312-2A | ATCGCATGATGCACGTAGAG | ACATGCATGCCTACCTAATGG |
| Xgwm337-1D | CCTCTTCCTCCCTCACTTAGC | TGCTAACTGGCCTTTGCC |
| Xgwm372-2A | AATAGAGCCCTGGGACTGGG | GAAGGACGACATTCCACCTG |
| Xgwm400-7A | GTGCTGCCACCACTTGC | TGTAGGCACTGCTTGGGAG |
| Xgwm413-1B | TGCTTGTCTAGATTGCTTGGG | GATCGTCTCGTCCTTGGCA |
| Xgwm415-5A | GATCTCCCATGTCCGCC | CGACAGTCGTCACTTGCCTA |
| Xgwm427-6A | AAACTTAGAACTGTAATTTCAGA | AGTGTGTTCATTTGACAGTT |
| Xgwm437-7D | GATCAAGACTTTTGTATCTCTC | GATGTCCAACAGTTAGCTTA |
| Xgwm469-6D | CAACTCAGTGCACACACAACG | CGATAACCACTCATCCACACC |
| Xgwm480-3A | TGCTGCTACTTGTACAGAGGAC | CCGAATTGTCCGCCATAG |
| Xgwm539-2D | CTGCTCTAAGATTCATGCAACC | GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG |
| Xgwm566-3B | TCTGTCTACCCATGGGATTTG | CTGGCTTCGAGGTAAGCAAC |
| Xgwm610-4A | CTGCCTTCTCCATGGTTTGT | AATGGCCAAAGGTTATGAAGG |
| Xgwm626-6B | GATCTAAAATGTTATTTTCTCTC | TGACTATCAGCTAAACGTGT |
| Xgwm642-1D | ACGGCGAGAAGGTGCTC | CATGAAAGGCAAGTTCGTCA |
| Xgwm664-3D | CAGTCAGTGCCGTTTAGCAA | AGCTTTGCTCTATTGGCGAG |
GBS 분석도구로는 GBS-SNP-CROP (Melo et al. 2016)을 사용하였으며, Core Hunter (Crossa et al. 2009), GenoCore (Jeong et al.2017), MSTRAT (Gouesnard et al. 2001)), PowerCore (Kim et al. 2007) 등을 통하여 616점을 밀의 핵심집단으로 선정하였고, 그 중 575점에 대하여 SNP chip 분석을 진행하였다. SNP chip 분석 실험은 Axiom™ BreedWheat 35K Genotyping Array (384HT format)와 Axiom GeneTitan Multi-Channel Instrument를 이용하여 수행하였다.
준비예 2. 616점의 밀 핵심집단에 대한 농업형질 별 단일 염기 다형성 마커 연관 분석
616계통에 대하여 주요농업형질 조사를 진행하였고, GAPIT을 통해 지노타이핑(Genotyping) 데이터와 페노타이핑(Phenotyping) 데이타를 대입하여 전장유전체 연관분석(GWAS)를 수행하였다.
농업형질에 대한 모델 분석은 다음 식 1과 같다:
[식 1]
상기 식 1에서, yi+ 값은 각각의 농업특성 형질을 의미하며, β0 은 방정식의 절편, β1 은 추가효과, x1i는 설명변수, β2 는 우월효과, ei 는 확률오차이다.
밀 유전자원에 대하여 생육조사와 종실 특성 분석을 진행하였으며, 단일 염기 다형성 마커 분석을 통하여 성숙기를 포함한 19개 농업형질에 대하여 LOD 값 5를 컷오프(Cut-off)로 하여 총 1,248개의 연관마커 후보군을 선발하였다.
실험예 1. 성숙기 관련 단일 염기 다형성 마커 탐색
GWAS 분석결과와 GAPIT을 통해 성숙기에 대하여 LOD값 5이상을 선택하였으며 이를 통하여 SNP 탐색 및 NCBI를 통해 SNP와 연관되어 있는 유전자를 탐색하였다.
핵심집단 계통 및 SNP chip data를 활용 하여 SNP 염기서열을 배열하였으며 출수시기에 연관된 SNP를 탐색하였다.
그 중 1개의 SNP를 확보하였고, 밀 염색체 상의 각 SNP의 위치를 표 2에 나타내었다.
| SNP | Chromosom | Position | P.value | maf | effect | LOD |
| AX-94466528 (BA00470958) |
2D | 145,673,728 | 7.32E-08 | NA | 0.520848 | 7.23 |
BA00470958 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호1(TCTAACTCAGCTGCAATCTTACTGCATCTCATCAG[G/T]GATCACACAGACTGACAGACGCATAATCTACGCAT)로 나타낼 수 있다. 상기에서 [G/T]는 해당 SNP 부위에 염기로 G 또는 T가 존재할 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 성숙기 관련 단일 염기 다형성 마커의 특성 규명
실험예 1에서 탐색된 단일 염기 다형성 마커가 밀의 성숙기를 판별할 수 있는지 확인하기 위해서, 밀의 핵심집단 내의 품종에 대하여 임의로 선택하여 AX-94466528(BA00470958)의 유전자형과 성숙기를 확인하였고, 국내 품종(금강, 청계, 다홍, 은파, 그루)에 적용하여 BA00470958 SNP 상 염기를 통해 성숙기의 판별이 가능한지 확인하였다(표 5). 또한, 밀의 핵심집단 내의 품종에 대하여 임의로 선택하여 AX-94466528(BA00470958)에서 유전자형과 성숙기를 확인하여 표 4에 나타내었다.
또한, BA00470958 SNP를 확인하기 위한 HRM프라이머는 5'-AGTCTTCTACGCCTTCACC-3'(서열번호 2)와 5'-CATAGACACACCGATACACG-3'(서열번호 3)를 이용하였다. 분석을 위한 HRM PCR은 95℃에서 5분 유지 후 95℃ 10초(1step), 65℃ 25초(2step)의 조건으로 1step과 2step을 1cycle로 하여 45번 반복 후에 0.1초마다 PCR증폭과정에서 온도에 따른 형광변화를 탐색하여 수행하였다.
하기의 표 3은 단일 염기 다형성 마커의 특성 규명에 사용된 밀을 나타낸 것이다.
| 시료번호 | 밀의 품종 및 계통 | 원산지 |
| 50 | Geuru Mil | Korea, South |
| 57 | Eunpa Mil | Korea, South |
| 69 | Suwon 208 | Korea, South |
| 70 | Bezostaja | Russia |
| 81 | Milyang 17 | Korea, South |
| 88 | Dahong Mil | Korea, South |
| 157 | Cheonggye Mil | Korea, South |
| 409 | Suwon 254 | Korea, South |
| 676 | Keumgang Mil | Korea, South |
| 678 | Suwon 281 | Korea, South |
| 1360 | Bouquet | France |
| 1397 | k3094 | Afghanistan |
| 1632 | Nemerci 301 | Romania |
| 1770 | Cr 15146 | Germany |
| 1814 | AUS 27905 | Spain |
| 시료번호 | 밀 품종 | BA00470958 | 성숙기 (Maturation Date, MD) |
| 69 | Suwon 208 | TT | 5/24 |
| 70 | Bezostaja | TT | 5/26 |
| 81 | Milyang 17 | TT | 5/23 |
| 409 | Suwon 254 | TT | 5/27 |
| 678 | Suwon 281 | TT | 5/24 |
| 1360 | Bouquet | GG | 6/25 |
| 1397 | k3094 | GG | 6/21 |
| 1632 | Nemerci 301 | GG | 6/18 |
| 1770 | Cr 15146 | GG | 6/25 |
| 1714 | CIGM90.412-5Y-3B-7Y-0B-1Y-0B | GG | 6/18 |
표 4에 나타낸 바와 같이, BA00470958 SNP의 유전자형이 TT인 경우, 유전자형이 GG인 경우보다 성숙기가 약 한달 가량 빠른 것을 확인할 수 있다. 즉, 성숙기가 빠르고, 이에 따라 영양생장 기간이 짧아, 식물체의 크기가 작은 것으로 확인되었다.
| 시료번호 | 밀 품종 | 유전자형 | 성숙기 |
| 50 | Geuru Mil | TT | 6/4 |
| 57 | Eunpa Mil | TT | 6/2 |
| 88 | Dahong Mil | TT | 6/4 |
| 157 | Cheonggye Mil | TT | 6/4 |
| 676 | Keumgang Mil | TT | 6/1 |
상기 표 5는 상기 SNP를 통해서 성숙기를 판별할 수 있는지 확인하기 위해서, 국내 품종(금강, 청계, 다홍, 그루)에 적용하여 BA00470958 SNP 상의 유전자형을 통해 성숙기의 판별이 가능한지 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상기 표 5를 참조하면, 그루, 은파, 다홍, 청계, 금강 모두 유전자형은 TT 였고 이의 성숙시기는 모두 6월초로 빠른 것으로 확인되었다. 이는 앞서 확인된 결과 및 SNP를 확인한 각 품종 간의 염기서열을 정렬하여 확인한 결과와도 동일한 경향성을 나타내는 것임을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 단일 염기 다형성 마커는 밀에서 성숙기를 효과적으로 판별할 수 있음을 알 수 있다.
<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION
<120> Biomarkers for determining the maturation date of wheat
<130> DP20210321
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BA00470958
<400> 1
tctaactcag ctgcaatctt actgcatctc atcagngatc acacagactg acagacgcat 60
aatctacgca t 71
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 2
agtcttctac gccttcacc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 3
catagacaca ccgatacacg 20
Claims (11)
- 서열번호 1번의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레이티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속 적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레이드를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 36번째 염기가 T일 경우 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별하는 것인,
밀의 성숙기 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물. - 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 조성물로서,
상기 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 밀의 성숙기 판별용 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브인 것인, 밀의 성숙기 판별용 조성물. - 제4항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것인, 밀의 성숙기 판별용 조성물. - 제3항의 조성물을 포함하는, 밀의 성숙기 판별용 키트.
- 제6항에 있어서,
상기 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 밀의 성숙기 판별용 키트. - (a) 밀 시료의 DNA로부터 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 36번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계로서, 상기 밀의 성숙기 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 36번째 염기가 T 또는 G이고, 상기 36번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 밀의 성숙기 판별 방법. - 제8항에 있어서, 상기 36번째 염기가 T인 경우, 성숙기가 빠른 밀인 것으로 판별하는 것인, 판별 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것인, 판별 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 (b)단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것인, 밀의 성숙기 판별 방법.
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| US20180291471A1 (en) * | 2015-12-18 | 2018-10-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic loci associated with reproductive growth phenotypes in soybean and methods of use |
| KR102315086B1 (ko) * | 2020-09-29 | 2021-10-21 | 부산대학교 산학협력단 | 오이 품종 판별용 snp 마커 세트 및 이의 용도 |
| KR20220050296A (ko) * | 2020-10-15 | 2022-04-25 | 한국생명공학연구원 | 배추 계통 구분을 위한 단일 염기 다형성 기반 마커 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-11-11 KR KR1020210154423A patent/KR102625086B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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| US20180291471A1 (en) * | 2015-12-18 | 2018-10-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic loci associated with reproductive growth phenotypes in soybean and methods of use |
| KR102315086B1 (ko) * | 2020-09-29 | 2021-10-21 | 부산대학교 산학협력단 | 오이 품종 판별용 snp 마커 세트 및 이의 용도 |
| KR20220050296A (ko) * | 2020-10-15 | 2022-04-25 | 한국생명공학연구원 | 배추 계통 구분을 위한 단일 염기 다형성 기반 마커 및 이의 용도 |
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