KR101822390B1 - 국내 육성밀 품종 판별용 마커 및 이를 이용한 판별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 55, 57, 63, 64, 70 내지 75, 93, 94, 118, 119, 및 126 내지 139의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 국내 밀 품종 판별 방법에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트를 이용하면 32종의 모든 국내 밀 품종을 명확히 판별할 수 있다.

Description

국내 육성밀 품종 판별용 마커 및 이를 이용한 판별 방법{Maker for cultivar discrimination in Korean breeding wheat and method for determination using the same}

본 발명은 15개의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 국내 밀 품종 판별 방법에 관한 것이다.

1970년대 이후 국민 1인당 곡물 소비량은 지속적으로 증가하고 있는 추세이나, 1980년대 중반 이후 밀 수요량의 99% 이상이 수입밀에 의존되고 있다. 이에, 현재 국산밀 자급률 확보와 생산량 증대를 위한 노력이 지속적으로 이루어지고 있으며, 용도에 맞는 품종이 개발되고 있다. 국립식량과학원에서 개발된 밀 품종들은 용도별로 다양화되었으며, 구체적 예로 빵용으로 금강밀과 탑동밀, 국수용으로 서둔밀과 알찬밀 등이 개발되었다. 이와 같이 국내 밀 품종들이 다양하게 개발되고 있기 때문에, 이들을 구분할 수 있는 분자 마커 개발이 더욱 필요하게 되었다. 상기 개발된 마커들은 국내 밀 품종 구분뿐만 아니라 국내 품종의 보호와 밀의 유전자원 보호 등에도 유용하게 사용할 수 있다.

한편, 분자 마커들은 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite) 또는 SSR(simple sequence repeat), 유전자 염기서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브, 스카(SCAR; Sequence Characterised Amplified Region) 마커 등이 이용되고 있다. SCAR 마커는 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)나 AFLP(Amplification Fragment Length Polymorphism) 마커 등의 밴드 염기서열을 분석하여 제작한 것으로 ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 의해 증폭 환경에 비교적 둔감하고 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종구별용 분자 마커로 인식되고 있다.

본 발명자들은 국내등록특허 제1546428호에서 32개의 국내 밀 품종 중 13 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트를 발명하였고, 추가적인 프라이머 세트를 개발하여 23종의 국내 밀 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트에 대한 연구를 진행하였다(Plant Breed Biotech 2(3), 224-230, 2014). 다만, 모든 국내 밀 품종을 판별할 수 있는 분자마커는 아직 개발되지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 모든 국내 밀 품종을 효과적으로 구별할 수 있는 분자 마커를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 각 품종의 밀을 구별할 수 있는 프라이머를 포함하는 마커 세트를 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은, 서열번호 55, 57, 63, 64, 70 내지 75, 93, 94, 118, 119, 및 126 내지 139의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 품종을 판별할 국내 밀로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 서열번호 55 내지 57, 및 79 내지 96의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트는, 서열번호 55 및 57의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM001 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM002 프라이머 세트; 서열번호 70 및 72의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM003 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM004 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM005 프라이머 세트; 서열번호 73 및 75의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM006 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM007 프라이머 세트; 서열번호 118 및 119의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM008 프라이머 세트; 서열번호 126 및 127의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM009 프라이머 세트; 서열번호 128 및 129의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM010 프라이머 세트; 서열번호 130 및 131의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM011 프라이머 세트; 서열번호 132 및 133의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM012 프라이머 세트; 서열번호 134 및 135의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM013 프라이머 세트; 서열번호 136 및 137의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM014 프라이머 세트; 및 서열번호 138 및 139의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM015 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트이다. 상기 프라이머 세트는 32개의 국내 모든 밀 품종 판별을 위한 SCAR 마커, ALFP 마커, SSR 마커, 및 SNP 마커를 증폭시키기 위한 프라이머 세트에 해당한다.

상기 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커는 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)이나 AFLP(Amplification Fragment) 등의 분자 마커 밴드의 염기서열을 분석하여 제작한 것이며, ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 비해 증폭 환경에 비교적 둔감하고, 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종 판별용 분자 마커로서, 보다 정확하고 세밀한 마커로 사용이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서는, 국내 밀 품종의 DNA를 추출하여 ISSR 분석, 및 AFLP 분석에 의해 SCAR 마커를 개발하였다. 구체적으로, ISSR 분석에 의해 KWSM001 내지 KWSM006의 SCAR 마커를 개발하였으며, 상기 SCAR 마커를 특이적으로 증폭시키는 서열번호 55, 57, 63, 64, 및 70 내지 75의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 개발하였다. 또한, AFLP 분석에 의해 KWSM007 내지 KWSM009의 SCAR 마커를 개발하였으며, 상기 SCAR 마커를 특이적으로 증폭시키는 서열번호 93, 94, 118, 119, 126, 및 127의 프라이머 세트를 개발하였다.

상기 ISSR(Inter Simple Sequence Repeat) 분석은 2 내지 4bp 크기의 반복 단위가 있는 DNA 염기서열을 프라이머로 사용하여 PCR 분석을 수행하여 DNA를 분석하는 방법으로, 이 기술은 프라이머의 높은 결합 온도와 긴 염기서열 때문에 재현성 및 신뢰성이 높으며, 각 프라이머당 많은 다형성(Polymorphism)을 형성한다. 또한 분석이 매우 신속하고, 개발비용이 많이 들지 않는 커다란 장점을 갖는다.

상기 AFLP(Amplification Fragment) 분석은 제한효소에 의해 절단된 단편을 선택적으로 증폭하여 분석하는 방법을 의미한다. 상기 분석은 분자표지인자로서 염기치환, 역위, 삽입, 및 결실에 의한 변이 분석에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 분석은 유전적 연관관계와 유전자 지도 분석, SCAR 마커의 개발, 유전자 클로닝, 식물의 진화, 및 생물 다양성 연구에 효과적으로 사용될 수 있다.

상기 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커는 단순 반복 염기서열로 이루어진 마커를 의미한다. 상기 마커는 대부분의 군집에서 다중 대립 유전자(multi-allele)로 존재하고 간편성과 높은 재현성으로 고도의 정보를 제공하므로 많은 식물 종의 유전적 다양성 분석에서 활용될 수 있다. 또한, 상기 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커는 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 다형성 부위 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 포함하는 마커를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 국내 밀 품종의 DNA를 추출하여 전이인자와 농업형질 관련 특이적 SSR, 및 SNP 마커를 개발하였다. 구체적으로, KWSM010 내지 KWSM015의 마커를 개발하였으며, 상기 마커를 특이적으로 증폭시키는 서열번호 128 내지 139의 프라이머 세트를 개발하였다.

상기 마커(marker)는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 의미하며, 상기 용어, 유전자좌는 분자 마커의 유전자 지도상의 위치를 의미한다.

본 발명에서 용어, “프라이머(primer)”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 Guanine 및 cytosine의 함량(GC contents), GC배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다.

본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트는, DNA 증폭을 위하여 이용될 수 있으며, 구체적으로 32개의 모든 국내 밀 품종을 판별하기 위한 상기 프라이머 세트는 국내 밀 품종 판별을 위한 SCAR 마커, SSR 마커, 및 SNP 마커의 증폭을 위하여 이용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, KWSM001 내지 KWSM006 마커를 증폭시키는 서열번호 55, 57, 63, 64, 및 70 내지 75의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 조합을 사용하여 국산 밀 품종 중, 올, 다홍, 청계, 조경, 탑동, 남해, 올그루, 고분, 조품, 신미찰 1호, 적중, 및 한백밀의 구분이 가능함을 확인하였다(실시예 2). 또한, 상기 프라이머 세트와 KWSM007 내지 KWSM009 마커를 증폭시키는 서열번호 93, 94, 118, 119, 126, 및 127의 프라이머 세트 조합을 사용하여 국산 밀 품종 중 상기 품종 이외에 은파, 금강, 서둔, 밀성, 조은, 안백, 백중, 수강, 고소, 및 조아의 구분이 추가적으로 가능함을 확인하였다(실시예 3). 나아가, 상기 프라이머 세트들과 KWSM010 내지 KWSM015 마커를 증폭시키는 서열번호 128 내지 139의 프라이머 세트 조합을 사용하여 32종의 국내 모든 밀 품종의 구분이 가능함을 확인하였다(실시예 4).

본 발명에 따른 프라이머 세트에 의해 판별될 수 있는 국내 밀 품종은 국립식량과학원에서 육성된 32개의 모든 품종이며, 상기 판별 가능한 32개의 국내 밀 품종은 올, 그루, 다홍, 청계, 은파, 탑동, 남해, 우리, 올그루, 알찬, 고분, 금강, 서둔, 새올, 진품, 밀성, 조은, 안백, 조품, 신미찰, 조농, 조경, 연백, 신미찰 1호, 백중, 적중, 수강, 한백, 수안, 다중, 고소, 및 조아이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 국내 밀 품종의 DNA를 추출하여 ISSR 분석, 및 AFLP 분석에 의해 품종별 특이 밴드를 검출하였고, 상기 특이 밴드를 클로닝하여 이를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다(실시예 2, 및 3). 또한, 전이인자와 농엽형질 관련 SSR, 및 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다(실시예 4). 그 결과, KWSM001, KWSM002, KWSM003, KWSM004, KWSM005, KWSM006, KWSM007, KWSM008, KWSM009, KWSM010, KWSM011, KWSM012, KWSM013, KWSM014, 및 KWSM015를 증폭시키는 15개 프라이머 세트를 조합하여 상기 32종의 모든 국내 밀 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 품종을 판별할 국내 밀로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 국내 밀의 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (a) 단계에서 프라이머 세트는, 상기 32개의 모든 국내 밀 품종을 구별할 수 있는, 서열번호 55, 57, 63, 64, 70 내지 75, 93, 94, 118, 119, 및 126 내지 139의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 의미한다. 상기 프라이머 세트가 동시에 사용됨으로써 32종의 국내 모든 밀 품종을 정확하게 구별할 수 있다. 구체적으로, 상기 KWSM001 프라이머 세트, KWSM002 프라이머 세트, KWSM003 프라이머 세트, KWSM004 프라이머 세트, KWSM005 프라이머 세트, KWSM006 프라이머 세트, KWSM007 프라이머 세트, KWSM008 프라이머 세트, KWSM009 프라이머 세트, KWSM010 프라이머 세트, KWSM011 프라이머 세트, KWSM012 프라이머 세트, KWSM013 프라이머 세트, KWSM014 프라이머 세트, 및 KWSM015 프라이머 세트를 모두 조합하여 사용될 수 있다.

또한, 상기 (a) 단계에서 게놈 DNA의 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이며, 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용할 수도 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 국내 밀 품종에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및/또는 물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl₂,KCl등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (b) 단계는 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, 대전, 한국)를 사용하여 가시화될 수 있다.

본 발명의 (b) 단계에서는 상기 분석된 증폭 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭 산물과 비교하여 품종을 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 분자 마커에 의해 구별될 수 있는 32개의 모든 국내 밀 품종은 각각 사용되는 분자 마커에 대한 프라이머의 증폭 여부가 상이하게 나타난다(도 1). 상기 상이한 증폭 여부를 비교하여 국내의 밀 품종을 용이하게 구별할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 KWSM001 내지 KWSM015 마커의 증폭여부를 분석한 결과, 밀 품종별로 각 마커의 증폭여부가 상이함을 확인함으로써 국내 32종의 모든 밀 품종을 구별할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, PCR 키트는, 상기 마커에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 32종의 모든 국내 밀 품종을 명확히 판별할 수 있으므로 품종 육성권자에 대한 보호를 강화할 수 있고, 품종혼입 문제를 해결하는데 기여할 수 있으며, 국내 밀 품종의 분자유전학적 연구 및 주요 형태적 특성 분석에도 이용될 수 있다.

도 1은, 54개의 ISSR 프라이머를 사용하여 국내 32개 밀 품종의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 9개의 프라이머로부터 증폭된 16개의 특이적 밴드를 나타낸 사진이다;
A는 UBC807; B는 UBC808; C는 UBC812; D는 UBC813; E는 UBC813; F는 UBC815; G는 UBC819; H는 UBC823; I는 UBC836; J는 UBC840; K는 UBC844; L는 UBC846; M은 UBC849; N는 UBC880을 의미; 화살표는 특이적 밴드를 의미한다.
도 2은, 국내 밀 32개 품종의 판별을 위한 마커 정보와 해당 프라이머를 사용한 PCR 결과 품종별로 증폭된 마커를 나타내는 사진이다.
도 3a는, EA-AGG/MA-CTA 프라이머 조합을 사용하여 국내 32개 밀 품종의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 증폭된 19개의 특이적 밴드를 나타낸 사진이다.
도 3b는, EA-ACG/MA-CAC 프라이머 조합을 사용하여 국내 32개 밀 품종의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 증폭된 21개의 특이적 밴드를 나타낸 사진이다.
도 3c는, EA-AGC/MA-CTG 프라이머 조합을 사용하여 국내 32개 밀 품종의 게놈 DNA를 PCR 증폭시킨 결과 증폭된 18개의 특이적 밴드를 나타낸 사진이다.
도 4는, 기존에 보고된 전이인자 관련 프라이머의 종류를 나타낸 사진이다.
도 5는, 기존에 보고된 SSR 프라이머의 종류를 나타낸 사진이다.
도 6은, KWSM001 내지 KWSM015의 프라이머 세트를 사용하여 모든 국내 밀 품종의 판별 여부를 확인한 사진이다;
KWSM001은 서열번호 55 및 57의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM002는 서열번호 63 및 64의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM003는 서열번호 70 및 72의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM004는 서열번호 71 및 72의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM005는 서열번호 73 및 74의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM006은 서열번호 73 및 75의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM007은 서열번호 93 및 94의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM008은 서열번호 118 및 119의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM009는 서열번호 126 및 127의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM010은 서열번호 128 및 129의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM011은 서열번호 130 및 131의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM012는 서열번호 132 및 133의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM013은 서열번호 134 및 135의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; KWSM014는 서열번호 136 및 137의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트; 및 KWSM015는 서열번호 138 및 139의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트를 의미.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 국내 밀 품종의 DNA 추출

국립식량과학원에서 육성된 하기 표 1에 기재된 32개의 품종의 국내 밀로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다.

번호	품종	번호	품종
1	올	17	조은
2	그루	18	안백
3	다홍	19	조품
4	청계	20	신미찰
5	은파	21	조농
6	탑동	22	조경
7	남해	23	연백
8	우리	24	신미찰 1호
9	올그루	25	백중
10	알찬	26	적중
11	고분	27	수강
12	금강	28	한백
13	서둔	29	수안
14	새올	30	다중
15	진품	31	고소
16	밀성	32	조아

구체적으로 상기 게놈 DNA 추출은 어린잎을 채취하여 마쇄 후 미니 프렙(mini prep)을 하였다. 식물체의 어린잎을 잘라내어 액체질소로 급랭 후에 고운 가루가 될 때까지 분쇄하였다. 분쇄 후 바로 추출 완충액(extraction buffer) 30 ㎕를 넣어주고 분쇄 가루와 잘 섞어주었다. 그 뒤 65 수조(water bath)에 30분간 배양(incubation)한 후 13,000rpm, 4에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 새 시험관(tube)에 옮기고 아이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 300 ㎕를 첨가 후 천천히 뒤집어(invert) 펠렛(pellet)이 뭉치게 하였다. 다시 13,000rpm, 5분간 원심분리 한 뒤 펠렛을 제외한 상층액을 제거 한 뒤 80% 에탄올 50 ㎕를 넣고 세척하였다. 세척 후 13,000rpm, 5분간 원심분리 하고 펠렛을 제외한 에탄올을 제거한 후 펠렛을 상온에서 건조한 후에 멸균 증류수를 넣어 펠렛을 녹였다. 추출한 DNA는 나노 드랍(nano drop)을 이용하여 정량을 하였다.

실시예 2: ISSR 분석에 의한 분자마커를 이용한 밀 품종 구별

ISSR 분석에 의한 SCAR 마커를 증폭시키는 국내 밀 품종 특이적 프라이머 세트를 개발하기 위한 실험을 실시하였다.

실시예 2-1: ISSR 분석에 의한 특이적 밴드의 검출

서열번호	프라이머	염기서열(5'-3')	서열번호	프라이머	염기서열(5'-3')
1	UBC801	ATATATATATATATATT	28	UBC828	TGTGTGTGTGTGTGTGA
2	UBC802	ATATATATATATATATG	29	UBC829	TGTGTGTGTGTGTGTGG
3	UBC803	ATATATATATATATATC	30	UBC830	TGTGTGTGTGTGTGTGC
4	UBC804	TATATATATATATATAA	31	UBC831	ATATATATATATATATYA
5	UBC805	TATATATATATATATAC	32	UBC832	ATATATATATATATATYC
6	UBC806	TATATATATATATATAG	33	UBC831	ATATATATATATATATYA
7	UBC807	AGAGAGAGAGAGAGAGT	34	UBC832	ATATATATATATATATYC
8	UBC808	AGAGAGAGAGAGAGAGC	35	UBC833	ATATATATATATATATYG
9	UBC809	AGAGAGAGAGAGAGAGG	36	UBC834	AGAGAGAGAGAGAGAGYT
10	UBC810	GAGAGAGAGAGAGAGAT	37	UBC835	AGAGAGAGAGAGAGAGYC
11	UBC811	GAGAGAGAGAGAGAGAC	38	UBC836	AGAGAGAGAGAGAGAGYA
12	UBC812	GAGAGAGAGAGAGAGAA	39	UBC837	TATATATATATATATART
13	UBC813	CTCTCTCTCTCTCTCTT	40	UBC838	TATATATATATATATARC
14	UBC814	CTCTCTCTCTCTCTCTA	41	UBC839	TATATATATATATATARG
15	UBC815	CTCTCTCTCTCTCTCTG	42	UBC840	GAGAGAGAGAGAGAGAYT
16	UBC816	CACACACACACACACAT	43	UBC841	GAGAGAGAGAGAGAGAYC
17	UBC817	CACACACACACACACAA	44	UBC842	GAGAGAGAGAGAGAGAYG
18	UBC818	CACACACACACACACAG	45	UBC843	CTCTCTCTCTCTCTCTRA
19	UBC819	GTGTGTGTGTGTGTGTA	46	UBC844	CTCTCTCTCTCTCTCTRC
20	UBC820	GTGTGTGTGTGTGTGTC	47	UBC845	CTCTCTCTCTCTCTCTRG
21	UBC821	GTGTGTGTGTGTGTGTT	48	UBC846	CACACACACACACACART
22	UBC822	TCTCTCTCTCTCTCTCA	49	UBC847	CACACACACACACACARC
23	UBC823	TCTCTCTCTCTCTCTCC	50	UBC848	CACACACACACACACARG
24	UBC824	TCTCTCTCTCTCTCTCG	51	UBC849	GTGTGTGTGTGTGTGTYA
25	UBC825	ACACACACACACACACT	52	UBC850	GTGTGTGTGTGTGTGTYC
26	UBC826	ACACACACACACACACC	53	UBC876	GATAGATAGACAGACA
27	UBC827	ACACACACACACACACG	54	UBC880	GGAGAGGAGAGGAGA

상기 실시예 1에서 추출된 DNA로부터 특이적으로 증폭되는 밴드를 확인하기 위하여 상기 표 2에 기재된 총 54개 ISSR 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 통해 분석하였고, 그 중 특이적으로 증폭되는 밴드가 확인된 14개의 프라이머를 선발하였다.

즉, 상기 54개의 프라이머를 이용한 PCR 증폭은 상기 실시예 1에서 정량 분석된 게놈 DNA(genomic DNA) 3㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5mM dNTPs, 5U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(iNtRON, 한국)를 첨가하여 25㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94, 3분간 pre-denature, 95(30초), 55(30초), 72(1분)을 1 사이클(cycle)로 하여 35 사이클 반복 후, 72에서 5분간 반응시켰다. 증폭된 산물을 확인하기 위하여 5㎕를 electrophoresis 6X loading buffer 5㎕(5:1)로 섞어주어 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 UV 아래에서 확인하였다.

그 결과, 14개 프라이머(UBC807, UBC808, UBC812, UBC813, UBC815, UBC816, UBC819, UBC823, UBC836, UBC840, UBC844, UBC849, 및 ,UBC880) 중 9개 ISSR 프라이머로부터 16개의 특이적 밴드를 확인하였다(도 1).

실시예 2-2: 선발된 특이 ISSR 마커의 클로닝과 염기서열 분석

상기 실시예 2-1에 따라 확인된 16개의 특이적 밴드를 아가로스 겔로부터 분리하여 클로닝하였다. 아가로스 겔로부터 순수 분리된 DNA는 T-easy vector (Promega, 미국)와 연결하여 Competent cell (Ecoli, DH5α)에 삽입하였다. 그 후 LB 배지에서 나타난 백색(white) 콜로니는 다시 액상 배양하여 플라스미드 DNA(plasmid DNA)만을 추출하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI에서 정보를 분석하였고, 그 염기서열을 이용하여 SCAR 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 디자인하였다(표 3). 프라이머 디자인은 primer3 프로그램을 이용하였다.

서열번호	프라이머	염기서열(5'-3')
55	SCAR812-1F1	AAGAAGAAAAAGAAAGAGAGTTGAG
56	SCAR812-1F2	AAATGATATCCACTCAATCTATCG
57	SCAR812-1R	GTTGTGTTTTTATTTGTTTTTGAC
58	SCAR812-2F1	AGTCCACTGGCACTTGCCAAT
59	SCAR812-2R1	ACTCGGCCTACTTGATGTAGT
60	SCAR812-2R2	CTCGTCGAGGCAATCGGAGAGG
61	SCAR812-3F1	GAGAAAGAGGAAGGTGACTGAG
62	SCAR812-3R1	TATAAACCATGTTTCGATATTGTC
63	SCAR812-4F1	GCCGAGATTAAATTTGTTACTACT
64	SCAR812-4R1	AACATTTATGTTTGGTAAATTGAC
65	SCAR813-1F	TACTCACGCGGTCACCAATA
66	SCAR813-1R	CCAGTCGATGTCATTCGTCA
67	SCAR813-2F	GCTATGTGGCGCGGTATTAT
68	SCAR813-2R	AAGTAAGTTTGGCCCCCAGT
69	SCAR816-F	GTCTCGCATAATGGGCAAGT
70	SCAR816-F1	TGCTGAGGGCATATCTCAACA
71	SCAR816-F2	TGCTGAGGGCATATCTCAACG
72	SCAR816-R	GTGTTGCACGACGCTGTACT
73	SCAR808-F	GGCTTACTACCTACACTTGACC
74	SCAR808-R1	GCAACAACAACCTTCTCCCAAT
75	SCAR808-R2	AACAACCTTCTCCCAATCCCCT

실시예 2-3: 품종 특이적 분자마커 개발, 및 밀품종의 구별

상기 실시예 2-2에 따라 총 12쌍의 프라이머를 디자인하여 국내 밀 32개 품종에 PCR 적용하였다. PCR 증폭은 상기 실시예 1에서 정량 분석된 게놈 DNA 3㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5mM dNTPs, 5U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(Intron, 한국)를 첨가하여 25㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94, 3분간 pre-denature, 95(30초), 55~60(30초), 72(1분)을 1 사이클로 하여 35 사이클 반복 후 72에서 5분간 반응시켰다. 특히, 어닐링(annealing) 온도는 프라이머에 따라 55~60까지 각각 다르게 적용하였다. 증폭된 산물을 확인하기 위하여 5㎕를 electrophoresis 6X loading buffer 5㎕(5:1)로 섞어주어 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 하였고, UV 아래에서 확인하였다(도 2).

그 결과, 본 발명의 SCAR 마커를 증폭시키는 서열번호 55, 57, 63, 64, 및 70 내지 75의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 개발하였다(표 4).

마커명	서열번호	프라이머 서열(5’-3’)	어닐링()	산물크기(bp)	다형성유형
KWSM001	55	F: AAGAAGAAAAAGAAAGAGAGTTGAG	55	359	존재/부존재
	57	R: GTTGTGTTTTTATTTGTTTTTGAC
KWSM002	63	F: GCCGAGATTAAATTTGTTACTACT	55	312	존재/부존재
	64	R: AACATTTATGTTTGGTAAATTGAC
KWSM003	70	F: TGCTGAGGGCATATCTCAACA	58	682	존재/부존재
	72	R: GTGTTGCACGACGCTGTACT
KWSM004	71	F: TGCTGAGGGCATATCTCAACG	58	682	존재/부존재
	72	R: GTGTTGCACGACGCTGTACT
KWSM005	73	F: GGCTTACTACCTACACTTGACC	58	392	존재/부존재
	74	R: GCAACAACAACCTTCTCCCAAT
KWSM006	73	F: GGCTTACTACCTACACTTGACC	58	392	존재/부존재
	75	R: AACAACCTTCTCCCAATCCCCT

또한, 상기 프라이머 세트를 이용한 각 SCAR 마커의 증폭 여부를 분석한 결과, 국내 밀 품종 중 12개 품종을 구별할 수 있음을 확인하였다(표 5).

번호	품종	KWSM						구별가부
		001	002	003	004	005	006
1	올	1	1	0	1	0	0	○
2	그루	0	0	0	0	1	1	×
3	다홍	1	0	0	1	0	0	○
4	청계	0	0	1	0	1	1	○
5	은파	0	0	0	1	1	1	×
6	탑동	0	0	0	1	0	0	○
7	남해	1	0	1	1	0	0	○
8	우리	0	0	0	0	1	1	×
9	올그루	0	1	0	0	1	1	○
10	알찬	0	0	0	0	1	1	×
11	고분	0	1	1	1	1	1	○
12	금강	0	0	0	0	0	1	×
13	서둔	0	0	1	1	1	1	×
14	새올	0	0	0	0	1	1	×
15	진품	1	1	0	0	1	1	×
16	밀성	0	0	1	1	1	1	×
17	조은	0	0	0	1	1	1	×
18	안백	1	0	0	0	1	1	×
19	조품	1	1	0	1	1	1	○
20	신미찰	0	0	0	0	1	1	×
21	조농	0	0	0	0	1	1	×
22	조경	1	1	0	0	0	1	○
23	연백	0	0	0	0	0	0	×
24	신미찰1호	1	1	0	0	0	0	○
25	백중	0	0	0	0	0	1	×
26	적중	1	0	0	0	0	1	○
27	수강	0	0	0	0	1	1	×
28	한백	0	0	1	1	0	0	○
29	수안	0	0	0	0	1	1	×
30	다중	1	1	0	0	1	1	×
31	고소	1	0	0	0	1	1	×
32	조아	1	1	0	0	1	1	×

상기 표 5의 결과에서 보듯이, KWSM001은 올, 다홍, 남해, 진품, 안백, 조품, 조경, 신미찰 1호, 적중, 다중 고소, 조아 등 12개 품종에서 증폭되었다. KWSM002는 올, 올그루, 고분, 진품, 조품, 조경, 신미찰 1호, 다중, 조아 등 9개 품종에서 증폭되었다. KWSM003은 청계, 남해, 고분, 서둔, 밀성, 한백 등 6개 품종에서 증폭되었고, KWSM004는 올, 다홍, 은파, 탑동, 남해, 고분, 서둔, 밀성, 조은, 조품, 한백 등 11개 품종에서 증폭되었다. KWSM005는 그루, 청계, 은파, 우리, 올그루, 알찬, 고분, 서둔, 새울, 진품, 밀성, 조은 안백, 조품, 신미찰, 조농 등 21개 품종에서 증폭되었다. KWSM006는 그루, 청계, 은파, 우리, 올그루 등 25개 품종에서 증폭되었다.

상기 6개 프라이머 세트 조합을 사용하였을 경우, 올밀은 KWSM001, KWSM002, KWSM004의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 다홍밀은 KWSM001과 KWSM003에서 증폭되었다. 청계밀은 KWSM003, KWSM005, KWSM006에서 증폭되었다. 남해밀은 KWSM001, KWSM003, KWSM004의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 올그루밀은 KWSM002, KWSM005에서 증폭되었다. 고분밀은 KWSM002, KWSM003, KWSM004, KWSM005의 4개 프라이머에서 증폭되었다. 조품밀은 KWSM001, KWSM002, KWSM004, KWSM005의 4개 프라이머에서 증폭되었다. 조경밀은 KWSM001, KWSM002, KWSM006의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 신미찰 1호밀은 KWSM001과 KWSM002의 2개 프라이머에서 증폭되었다. 적중밀은 KWSM001, 및 KWSM006의 2개 프라이머에서 증폭되었다. 한백밀은 KWSM003과 KWSM004의 2개 프라이머에서 증폭되기 때문에 다른 품종으로부터 구분될 수 있다. 즉, 상기 KWSM001 내지 KWSM006의 SCAR 마커는 사용되는 프라이머 세트에 따라 국내 밀 품종별로 증폭여부가 상이함을 확인하였다.

따라서, 상기 서열번호 55, 57, 63, 64, 및 70 내지 75의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 국산밀 품종 중 올, 다홍, 청계, 조경, 탑동, 남해, 올그루, 고분, 조품, 연백, 신미찰 1호, 적중, 한백밀의 구분이 가능함을 확인하였다.

실시예 3: AFLP 분석에 의한 분자마커를 이용한 밀 품종 구별

AFLP 분석에 의한 SCAR 마커를 증폭시키는 국내 밀 품종 특이적 프라이머 세트를 개발하기 위한 실험을 실시하였다.

실시예 3-1: AFLP 분석에 의한 특이적 밴드의 검출

서열번호	프라이머		염기서열(5'-3')
76	EcoRI-adaptor	EA1	GACTGCGTACC
77		EA2	AATTGGTACGCAGTC
78	MseI-adaptor	MA1	TACTCAGGACTCATC
79		MA2	GATGAGTCCTGAG
80	Anchored EcoRI-adaptor primers		CTGCGTACCAATTCA
81	Anchored MseI-adaptor primers		GATGAGTCCTGAGTAAC
82	EcoRI- selective primers	EA-ACG	CTGCGTACCAATTCACG
83		EA-AGC	CTGCGTACCAATTCAGC
84		EA-AGG	CTGCGTACCAATTCAGG
85		EA-ACT	CTGCGTACCAATTCACT
86	MseI- selective primers	MA-CAC	GATGAGTCCTGAGTAACAC
87		MA-CTA	GATGAGTCCTGAGTAACTA
88		MA-CTG	GATGAGTCCTGAGTAACTG

특이적 밴드가 증폭되는 AFLP 프라이머를 선별하기 위하여, 상기 표 6의 AFLP 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 통해 분석하였다.

PCR 증폭은 상기 실시예 1에서 정량 분석된 genomic DNA 3㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5mM dNTPs, 5U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(iNtRON, 한국)를 첨가하여 25㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94, 3분간 pre-denature, 95(30초), 55(30초), 72(1분)을 1 사이클로 하여 20 사이클 반복 후 72에서 5분간 1차 반응시켰다. 1차 반응을 통해 증폭된 산물을 다시 1/100로 희석하여 94, 3분간 pre-denature, 95(30초), 55(30초), 72(1분)을 1 사이클로 하여 23 사이클 반복 후 72에서 5분간 2차 반응시켰다. 2차 반응을 통해 얻은 산물을 확인하기 위하여 6% 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후 은염색으로 확인하였다.

그 결과, EA-AGG/MA-CTA 프라이머를 조합한 경우 18개의 밴드(도 3a), EA-ACG/MA-CAC 프라이머를 조합한 경우 21개의 밴드(도 3b), 및 EA-AGC/MA-CTG 프라이머를 조합한 경우 19개의 밴드(도 3c)를 분리하여, 상기 6개의 프라이머 조합을 사용하여 총 58개의 특이적 밴드를 확인하였다.

실시예 3-2: 선발된 특이 AFLP 마커의 클로닝과 염기서열 분석

상기 실시예 3-1에 따라 확인된 특이적 밴드를 클로닝하기 위해 T-easy vector (Promega, 미국)와 연결하여 Competent cell (Ecoli, DH5α)에 삽입하였다. 그 후 LB 배지에서 나타난 백색 콜로니는 다시 액상 배양하여 플라스미드 DNA만을 추출하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI에서 정보를 분석하였고, 그 염기서열을 이용하여 SCAR 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 디자인하였다(표 7). 프라이머 디자인은 primer3 프로그램을 이용하였다.

서열번호	프라이머	염기서열(5'-3')
89	A13F	TGTGTCAAATTCTTCCTTGATG
90	A13R	TCAAATTATACCCGTCCAAGAG
91	C1F	AACTGTTCGGTTTACAACTTGG
92	C1R	GTTTTGGATTTCTCTGAGGATG
93	C2F	TAAGGTGGACTCTTCTGGTTGT
94	C2R	ACGACATTGTCATATCGTAAAG
95	C4F	GCAGGTTGTTTCCTGTAGATTT
96	C4R	CATCAAGCTGCTACAACCTAAA
97	C5F	AAAGATAGTGTTCCCATTCATG
98	C5R	GTAAGCTATGGGGCGCTTCTCT
99	C7F	GTGTATTCCAATCCTCCAAAAG
100	C7R	AGAGTTCCGTTGTGAGATCAAT
101	C8F	CAAAACATTGAGTGAATCCAAA
102	C8R	CTGTTGCTTTGATTTTTCCTGT
103	C9F	TACTGGTTAGAATCGCACTGAA
104	C9R	GTAACCTTCAGACTGGCTTTTG
105	C10F	ATGAGTCCTGAGTAACACGACA
106	C10R	ACGACTTTGATGTGGCATAGAT
107	C11F	CCATCTTCTGCTATATGGAGTC
108	C11R	CAACCTACTAGCACCAATCCTG
109	C12F	CAAAGTTGCTCCTGTTTAGGAC
110	C12R	TACTGACGTTACCCACTTATTG
111	C14F	AAGTAGCAAAGTTCCTCCATCC
112	C14R	AGGGCATATTTGCTTCAACTAA
113	C15F	TTATTCAAATCCTTAGTGATTC
114	C15R	TCACTTAGCCATAGGAGTTTTATG
115	C16F	AACCATCATCATCTTGTCCTTC
116	C16TR	CTTACAATCGCCACTTCACA
117	C16CR	CTTACAATCGCCACTTCACG
118	C17F	GAATTCAGGCTTCAGTTGATGG
119	C17R	AAGGATACAATTGAAGGAACAG
120	G6F	GCACCTACAGATTTCCTTTACG
121	G6R	GAATTACAAAGCCCTGAAGATG
122	G7F	GGGTGAAGAACTCTCGAATATG
123	G7R	GTTTGTCGTCCCCTTGAGTAT
124	G8F	CTTCAAGAATCTGATTGACACG
125	G8R	CTACGTCGATCTTCCTCATCAT
126	G10F	CAGAGTATACGAACGAGAACTAAC
127	G10R	TGACACGCGATCTCTGATCCTG

실시예 3-3: 품종 특이적 분자마커 개발, 밀 품종의 구별

총 5개의 프라이머를 디자인하여 국내 밀 32개 품종에 PCR 적용하였다. PCR 증폭은 상기 실시예 1에서 정량 분석된 게놈 DNA 3㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5mM dNTPs, 5U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(Intron, 한국)를 첨가하여 25㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94, 3분간 pre-denature, 95(30초), 55~60(30초), 72(1분)을 1 사이클로 하여 35 사이클 반복 후 72에서 5분간 반응시켰다. 특히, 어닐링 온도는 프라이머에 따라 55~60까지 각각 다르게 적용하였다. 증폭된 산물을 확인하기 위하여 5㎕를 electrophoresis 6X loading buffer 5㎕(5:1)로 섞어주어 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 하였고, UV 아래에서 확인하였다(도 2).

그 결과, 본 발명의 SCAR 마커를 증폭시키는 서열번호 93, 94, 118, 119, 126, 및 127의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 개발하였다(표 8).

마커명	서열번호	프라이머 서열(5‘-3’)	어닐링()	산물크기(bp)	다형성유형
KWSM007	93	F: TAAGGTGGACTCTTCTGGTTGT	56	215	존재/부존재
	94	R: ACGACATTGTCATATCGTAAAG
KWSM008	118	F: GAATTCAGGCTTCAGTTGATGG	58	212	존재/부존재
	119	R: AAGGATACAATTGAAGGAACAG
KWSM009	126	F: CAGAGTATACGAACGAGAACTAAC	58	468/150	단일 또는 이중
	127	R: TGACACGCGATCTCTGATCCTG

또한, 상기 프라이머 세트를 이용한 각 SCAR 마커의 증폭 여부와 상기 실시예 2에서 분석한 각 SCAR 마커의 증폭 여부를 조합한 결과, 국내 밀 품종 중 10개 품종을 추가적으로 구별할 수 있음을 확인하였다(표 9).

번호	품종	KWSM									구별가부
		001	002	003	004	005	006	007	008	009
1	올	1	1	0	1	0	0	0	0	0	○
2	그루	0	0	0	0	1	1	0	0	0	×
3	다홍	1	0	0	1	0	0	0	0	0	○
4	청계	0	0	1	0	1	1	0	0	0	○
5	은파	0	0	0	1	1	1	1	0	0	○
6	탑동	0	0	0	1	0	0	0	0	0	○
7	남해	1	0	1	1	0	0	0	0	0	○
8	우리	0	0	0	0	1	1	0	0	0	×
9	올그루	0	1	0	0	1	1	1	0	0	○
10	알찬	0	0	0	0	1	1	0	0	0	×
11	고분	0	1	1	1	1	1	1	0	0	○
12	금강	0	0	0	0	0	1	0	1	0	○
13	서둔	0	0	1	1	1	1	0	0	0	○
14	새올	0	0	0	0	1	1	1	0	0	×
15	진품	1	1	0	0	1	1	0	0	0	×
16	밀성	0	0	1	1	1	1	1	0	0	○
17	조은	0	0	0	1	1	1	0	1	0	○
18	안백	1	0	0	0	1	1	0	0	0	○
19	조품	1	1	0	1	1	1	0	0	0	○
20	신미찰	0	0	0	0	1	1	1	0	0	×
21	조농	0	0	0	0	1	1	0	0	0	×
22	조경	1	1	0	0	0	1	1	1	1	○
23	연백	0	0	0	0	0	0	0	0	0	×
24	신미찰1호	1	1	0	0	0	0	0	0	0	○
25	백중	0	0	0	0	0	1	0	0	0	○
26	적중	1	0	0	0	0	1	0	0	0	○
27	수강	0	0	0	0	1	1	1	1	0	○
28	한백	0	0	1	1	0	0	0	1	0	○
29	수안	0	0	0	0	1	1	0	0	0	×
30	다중	1	1	0	0	1	1	0	0	0	×
31	고소	1	0	0	0	1	1	1	0	0	○
32	조아	1	1	0	0	1	1	1	0	0	○

구체적으로, KWSM007은 은파, 올그루, 고분, 새올, 밀성, 신미찰, 조경, 수강, 고소, 조아 등 10개 품종에서 증폭되었다. KWSM008은 금강, 조은, 조경, 수강, 한백 등 5개 품종에서 증폭되었다. KWSM009는 조경에서만 증폭되었다.

상기 3개의 프라이머 세트 조합을 사용하였을 경우, 은파, 올그루, 고분, 새올, 밀성, 신미찰, 고소, 및 조아는 KWSM007의 1개 프라이머에서 증폭되었다. 금강, 조은, 및 한백은 KWSM008의 1개 프라이머에서 증폭되었다. 조경은 KWSM007, KWSM008, 및 KWSM009의 3개 프라이머에서 증폭되었다. 수강은 KWSM007, 및 KWSM008의 2개 프라이머에서 증폭되었다. 즉, 상기 KWSM007 내지 KWSM009의 SCAR 마커는 사용되는 프라이머 세트에 따라 국내 밀 품종별로 증폭여부가 상이함을 확인하였다.

따라서, 상기 실시예 2의 분석 결과와 상기 서열번호 93, 94, 118, 119, 126, 및 127의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 분석 결과를 조합하여 국산밀 품종 중 상기 실시예 2에서 구분한 밀품 종 이외에 은파, 금강, 서둔, 밀성, 조은, 안백, 백중, 수강, 고소, 및 조아의 구분이 가능함을 확인하였다.

실시예 4: 전이인자와 농업형질 관련 특이적 SSR, SNP 마커를 이용한 밀 품종 구별

밀의 3B 염색체 염기서열 분석 결과에 의해 기존에 보고된 전이인자 관련 프라이머(도 4)와 밀의 고온에 관련된 기존에 보고된 SSR 프라이머를 탐색하여 품종에 적용하였다(Paux 등, 2006; Sadat 등, 2013; Grag 등, 2012). 탐색된 SSR 프라이머는 PCR 산물의 길이가 300 bp 이상이 되는 프라이머를 선발하여 품종에 적용하였다(도 5). SNP 프라이머는 밀의 고온에 관련된 유전자 HSP16.9 유전자의 염기서열을 이용하여 197 bp의 PCR 산물이 형성되도록 하였다.

PCR 증폭은 상기 실시예 1에서 정량 분석된 게놈 DNA 3㎕에, 5 μM primer, 10X buffer, 2.5mM dNTPs, 5U/㎕ i-StarMAX II Taq DNA polymerase(Intron, 한국)를 첨가하여 25㎕ 부피로 하였고, PCR 반응 조건은 94, 5분간 pre-denature, 95(30초), 55~60(30초), 72(1분)을 1 사이클로 하여 35 사이클 반복 후 72에서 5분간 반응시켰다. 특히, 어닐링 온도는 프라이머에 따라 55~60까지 각각 다르게 적용하였다. 증폭된 산물을 확인하기 위하여 5㎕를 electrophoresis 6X loading buffer 5㎕(5:1)로 섞어주어 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동 하였고, UV 아래에서 확인하였다(도 2).

그 결과, 본 발명의 전이인자, SSR, 및 SNP 마커를 증폭시키는 서열번호 128 내지 139의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 프라이머 세트를 개발하였다(표 10)

마커명	서열번호	프라이머 서열(5’-3’)	어닐링()	산물크기(bp)	다형성유형
KWSM010	128	F: GCATCCCCTCTTTCGTCTC	58	216	존재/부존재
	129	R: GCCGTTTCTCCCTTGAGC
KWSM011	130	F: CGCAAGGAACGTATGGTTTG	58	129	존재/부존재
	131	R: GGTGCTATAGCCCGGTTC
KWSM012	132	F: CCAGCCCCTCTACACATTTT	58	295/260	존재/부존재
	133	R: GGCCCATTTCCCACTTTCCA
KWSM013	134	F: CCAAAAACATGGTTAAAGGGG	58	210/180	존재/부존재
	135	R: AACAAAAGTCGGTGCAGTCC
KWSM014	136	F: AATGGTATCTATTCCGACCCG	58	200/182/169/152/124	존재/부존재
	137	R: CATCCCTAGGCCACTCTGC
KWSM015	138	F: GAGGCGGACGAACGTGTTCA	58	197	존재/부존재
	139	R: TGACCTCCTCCTTCTTCACG

또한, 상기 프라이머 세트를 이용한 각 분자마커의 증폭 여부와 상기 실시예 2, 및 3에서 분석한 각 SCAR 마커의 증폭 여부를 조합한 결과, 국내 밀품종 중 10개 품종을 추가적으로 구별하여, 모든 국내 밀 품종을 구별할 수 있음을 확인하였다(도 6).

구체적으로, KWSM010은 올, 다홍, 남해, 새올, 밀성, 수강, 및 조아 등 7개 품종에서 증폭되었다. KWSM011은 올, 청계, 은파, 탑동, 남해, 우리, 알찬, 고분, 서둔, 진품, 조은, 및 신미찰 등 12개 품종에서 증폭되었다. KWSM012는 그루, 안백, 연백, 적중, 백중, 수강 등 6개 품종에서 295bp로 증폭되었고, 다른 품종은 260bp로 증폭되었다. KWSM0013은 조품에서 210bp의 밴드가 증폭되었고, 다른 품종은 180bp의 밴드가 증폭되었다. KWSM014는 대부분의 품종에서 182와 200bp의 밴드가 증폭되었고, 탑동, 알찬, 신미찰1호, 및 수강은 169bp, 고분은 152bp, 조농은 124bp의 밴드가 증폭되었다. KWSM0015는 우리, 조경에서만 증폭되었다.

따라서, 상기 실시예 2, 및 3의 분석 결과와 상기 서열번호 128 내지 139의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 이용한 분석 결과를 조합하여 32개의 모든 국산 밀 품종의 구분이 가능함을 확인하였다(도 6).

이를 통해, 상기 실시예 1 내지 3의 프라이머 세트의 조합하여 이용하면 32개의 모든 국산 밀 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> EPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Maker for cultivar discrimination in Korean breeding wheat and method for determination using the same <130> KPA151131-KR <160> 139 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC801 primer <400> 1 atatatatat atatatt 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC802 primer <400> 2 atatatatat atatatg 17 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC803 primer <400> 3 atatatatat atatatc 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC804 primer <400> 4 tatatatata tatataa 17 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC805 primer <400> 5 tatatatata tatatac 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC806 primer <400> 6 tatatatata tatatag 17 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC807 primer <400> 7 agagagagag agagagt 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC808 primer <400> 8 agagagagag agagagc 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC809 primer <400> 9 agagagagag agagagg 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC810 primer <400> 10 gagagagaga gagagat 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC811 primer <400> 11 gagagagaga gagagac 17 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC812 primer <400> 12 gagagagaga gagagaa 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC813 primer <400> 13 ctctctctct ctctctt 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC814 primer <400> 14 ctctctctct ctctcta 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC815 primer <400> 15 ctctctctct ctctctg 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC816 primer <400> 16 cacacacaca cacacat 17 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC817 primer <400> 17 cacacacaca cacacaa 17 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC818 primer <400> 18 cacacacaca cacacag 17 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC819 primer <400> 19 gtgtgtgtgt gtgtgta 17 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC820 primer <400> 20 gtgtgtgtgt gtgtgtc 17 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC821 primer <400> 21 gtgtgtgtgt gtgtgtt 17 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC822 primer <400> 22 tctctctctc tctctca 17 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC823 primer <400> 23 tctctctctc tctctcc 17 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC824 primer <400> 24 tctctctctc tctctcg 17 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC825 primer <400> 25 acacacacac acacact 17 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC826 primer <400> 26 acacacacac acacacc 17 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC827 primer <400> 27 acacacacac acacacg 17 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC828 primer <400> 28 tgtgtgtgtg tgtgtga 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC829 primer <400> 29 tgtgtgtgtg tgtgtgg 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC830 primer <400> 30 tgtgtgtgtg tgtgtgc 17 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC831 primer <400> 31 atatatatat atatatya 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC832 primer <400> 32 atatatatat atatatyc 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC831 primer <400> 33 atatatatat atatatya 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC832 primer <400> 34 atatatatat atatatyc 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC833 primer <400> 35 atatatatat atatatyg 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC834 primer <400> 36 agagagagag agagagyt 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC835 primer <400> 37 agagagagag agagagyc 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC836 primer <400> 38 agagagagag agagagya 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC837 primer <400> 39 tatatatata tatatart 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC838 primer <400> 40 tatatatata tatatarc 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC839 primer <400> 41 tatatatata tatatarg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC840 primer <400> 42 gagagagaga gagagayt 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC841 primer <400> 43 gagagagaga gagagayc 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC842 primer <400> 44 gagagagaga gagagayg 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC843 primer <400> 45 ctctctctct ctctctra 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC844 primer <400> 46 ctctctctct ctctctrc 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC845 primer <400> 47 ctctctctct ctctctrg 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC846 primer <400> 48 cacacacaca cacacart 18 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC847 primer <400> 49 cacacacaca cacacarc 18 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC848 primer <400> 50 cacacacaca cacacarg 18 <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC849 primer <400> 51 gtgtgtgtgt gtgtgtya 18 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC850 primer <400> 52 gtgtgtgtgt gtgtgtyc 18 <210> 53 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC876 primer <400> 53 gatagataga cagaca 16 <210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBC880 primer <400> 54 ggagaggaga ggaga 15 <210> 55 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-1F1 <400> 55 aagaagaaaa agaaagagag ttgag 25 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-1F2 <400> 56 aaatgatatc cactcaatct atcg 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-1R <400> 57 gttgtgtttt tatttgtttt tgac 24 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-2F1 <400> 58 agtccactgg cacttgccaa t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-2R1 <400> 59 actcggccta cttgatgtag t 21 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-2R2 <400> 60 ctcgtcgagg caatcggaga gg 22 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-3F1 <400> 61 gagaaagagg aaggtgactg ag 22 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-3R1 <400> 62 tataaaccat gtttcgatat tgtc 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-4F1 <400> 63 gccgagatta aatttgttac tact 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR812-4R1 <400> 64 aacatttatg tttggtaaat tgac 24 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR813-1F <400> 65 tactcacgcg gtcaccaata 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR813-1R <400> 66 ccagtcgatg tcattcgtca 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR813-2F <400> 67 gctatgtggc gcggtattat 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR813-2R <400> 68 aagtaagttt ggcccccagt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR816-F <400> 69 gtctcgcata atgggcaagt 20 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR816-F1 <400> 70 tgctgagggc atatctcaac a 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR816-F2 <400> 71 tgctgagggc atatctcaac g 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR816-R <400> 72 gtgttgcacg acgctgtact 20 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR808-F <400> 73 ggcttactac ctacacttga cc 22 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR808-R1 <400> 74 gcaacaacaa ccttctccca at 22 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SCAR808-R2 <400> 75 aacaaccttc tcccaatccc ct 22 <210> 76 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-adaptor EA1 <400> 76 gactgcgtac c 11 <210> 77 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-adaptor EA2 <400> 77 aattggtacg cagtc 15 <210> 78 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI-adaptor MA1 <400> 78 tactcaggac tcatc 15 <210> 79 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI-adaptor MA2 <400> 79 gatgagtcct gag 13 <210> 80 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anchored EcoRI-adaptor primers <400> 80 ctgcgtacca attca 15 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anchored MseI-adaptor primers <400> 81 gatgagtcct gagtaac 17 <210> 82 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-selective primers EA-ACG <400> 82 ctgcgtacca attcacg 17 <210> 83 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-selective primers EA-AGC <400> 83 ctgcgtacca attcagc 17 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-selective primers EA-AGG <400> 84 ctgcgtacca attcagg 17 <210> 85 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRI-selective primers EA-ACT <400> 85 ctgcgtacca attcact 17 <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI-selective primers MA-CAC <400> 86 gatgagtcct gagtaacac 19 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI-selective primers MA-CTA <400> 87 gatgagtcct gagtaacta 19 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MseI-selective primers MA-CTG <400> 88 gatgagtcct gagtaactg 19 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A13F primer <400> 89 tgtgtcaaat tcttccttga tg 22 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A13R primer <400> 90 tcaaattata cccgtccaag ag 22 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1F primer <400> 91 aactgttcgg tttacaactt gg 22 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1R primer <400> 92 gttttggatt tctctgagga tg 22 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2F primer <400> 93 taaggtggac tcttctggtt gt 22 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2R primer <400> 94 acgacattgt catatcgtaa ag 22 <210> 95 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4F primer <400> 95 gcaggttgtt tcctgtagat tt 22 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4R primer <400> 96 catcaagctg ctacaaccta aa 22 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5F primer <400> 97 aaagatagtg ttcccattca tg 22 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5R primer <400> 98 gtaagctatg gggcgcttct ct 22 <210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7F primer <400> 99 gtgtattcca atcctccaaa ag 22 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7R primer <400> 100 agagttccgt tgtgagatca at 22 <210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C8F primer <400> 101 caaaacattg agtgaatcca aa 22 <210> 102 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C8R primer <400> 102 ctgttgcttt gatttttcct gt 22 <210> 103 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9F primer <400> 103 tactggttag aatcgcactg aa 22 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9R primer <400> 104 gtaaccttca gactggcttt tg 22 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C10F primer <400> 105 atgagtcctg agtaacacga ca 22 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C10R primer <400> 106 acgactttga tgtggcatag at 22 <210> 107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C11F primer <400> 107 ccatcttctg ctatatggag tc 22 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C11R primer <400> 108 caacctacta gcaccaatcc tg 22 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12F primer <400> 109 caaagttgct cctgtttagg ac 22 <210> 110 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C12R primer <400> 110 tactgacgtt acccacttat tg 22 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C14F primer <400> 111 aagtagcaaa gttcctccat cc 22 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C14R primer <400> 112 agggcatatt tgcttcaact aa 22 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C15F primer <400> 113 ttattcaaat ccttagtgat tc 22 <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C15R primer <400> 114 tcacttagcc ataggagttt tatg 24 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C16F primer <400> 115 aaccatcatc atcttgtcct tc 22 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C16TR primer <400> 116 cttacaatcg ccacttcaca 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C16CR primer <400> 117 cttacaatcg ccacttcacg 20 <210> 118 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C17F primer <400> 118 gaattcaggc ttcagttgat gg 22 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C17R primer <400> 119 aaggatacaa ttgaaggaac ag 22 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6F primer <400> 120 gcacctacag atttccttta cg 22 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G6R primer <400> 121 gaattacaaa gccctgaaga tg 22 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G7F primer <400> 122 gggtgaagaa ctctcgaata tg 22 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G7R primer <400> 123 gtttgtcgtc cccttgagta t 21 <210> 124 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G8F primer <400> 124 cttcaagaat ctgattgaca cg 22 <210> 125 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G8R primer <400> 125 ctacgtcgat cttcctcatc at 22 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G10F primer <400> 126 cagagtatac gaacgagaac taac 24 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G10R primer <400> 127 tgacacgcga tctctgatcc tg 22 <210> 128 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM010 F <400> 128 gcatcccctc tttcgtctc 19 <210> 129 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM010 R <400> 129 gccgtttctc ccttgagc 18 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM011 F <400> 130 cgcaaggaac gtatggtttg 20 <210> 131 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM011 R <400> 131 ggtgctatag cccggttc 18 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM012 F <400> 132 ccagcccctc tacacatttt 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM012 R <400> 133 ggcccatttc ccactttcca 20 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM013 F <400> 134 ccaaaaacat ggttaaaggg g 21 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM013 R <400> 135 aacaaaagtc ggtgcagtcc 20 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM014 F <400> 136 aatggtatct attccgaccc g 21 <210> 137 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM014 R <400> 137 catccctagg ccactctgc 19 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM015 F <400> 138 gaggcggacg aacgtgttca 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KWSM015 R <400> 139 tgacctcctc cttcttcacg 20

Claims (5)

1. 서열번호 55 및 57의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM001 프라이머 세트; 서열번호 63 및 64의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM002 프라이머 세트; 서열번호 70 및 72의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM003 프라이머 세트; 서열번호 71 및 72의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM004 프라이머 세트; 서열번호 73 및 74의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM005 프라이머 세트; 서열번호 73 및 75의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM006 프라이머 세트; 서열번호 93 및 94의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM007 프라이머 세트; 서열번호 118 및 119의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM008 프라이머 세트; 서열번호 126 및 127의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM009 프라이머 세트; 서열번호 128 및 129의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM010 프라이머 세트; 서열번호 130 및 131의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM011 프라이머 세트; 서열번호 132 및 133의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM012 프라이머 세트; 서열번호 134 및 135의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM013 프라이머 세트; 서열번호 136 및 137의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM014 프라이머 세트; 및 서열번호 138 및 139의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 KWSM015 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트는 올, 그루, 다홍, 청계, 은파, 탑동, 남해, 우리, 올그루, 알찬, 고분, 금강, 서둔, 새올, 진품, 밀성, 조은, 안백, 조품, 신미찰, 조농, 조경, 연백, 신미찰 1호, 백중, 적중, 수강, 한백, 수안, 다중, 고소, 및 조아로 이루어진 국내 밀 품종 32종을 판별하는 것이 특징인, 프라이머 세트.
   
2. 삭제
3. (a) 품종을 판별할 국내 밀로부터 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 게놈 DNA를 증폭하는 단계; 및
   (b) 상기 증폭된 산물을 국내 밀 품종 표준의 증폭된 산물과 비교하여 품종을 올, 그루, 다홍, 청계, 은파, 탑동, 남해, 우리, 올그루, 알찬, 고분, 금강, 서둔, 새올, 진품, 밀성, 조은, 안백, 조품, 신미찰, 조농, 조경, 연백, 신미찰 1호, 백중, 적중, 수강, 한백, 수안, 다중, 고소, 및 조아로 이루어진 국내 밀 품종 중 하나로 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 국내 밀의 품종 판별 방법.
   
4. 삭제
5. 제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 국내 밀 품종 판별용 키트.
   

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