KR101907825B1 - 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커 - Google Patents

흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커에 관한 것으로서, 국내 주요 토마토 흰가루 병원균의 종을 동정하고, 이 종에 대한 저항성 토마토 유전자원(KNU-12)으로부터 저항성을 조절하는 유전자를 밝혀내어 유전자 기반의 분자마커를 개발하고자 하였다. 그 결과 경남 밀양과 전남 무주 토마토 재배지에서 자연발병된 흰가루병을 유발하는 병원균이 Oidium neolycopersici인 것으로 추정되었으며, ‘KNU-12’의 저항성은 단일 열성 유전자인 ol -2 유전자의 새로운 대립유전자(allele)가 저항성 기작인 것으로 나타났다. 이에 본 발명자들은 ol -2 유전자의 allele variant를 발견하였고 이와 연관된 SCAR와 dCAPS 마커를 개발하였다. 개발된 마커들은 KNU-12을 소재로 한 흰가루 저항성 품종 육성을 위한 마커이용선발(Marke-assisred selection)에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

Description

흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커{Molecular marker for selecting tomato plants resistant to powdery mildew disease}
본 발명은 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커에 대한 것이다.
흰가루병은 Erysiphales 목에 속하는 활물기생의 자낭진균(obligate biotrophic Ascomycete fungi)에 의해 야기된다. 토마토에 흰가루병을 일으키는 것으로 알려져 있는 병원체로는 Oidium spp.과 Leveillula taurica가 있다. Oidium spp.은 유럽, 북미 뿐 만 아니라 일본세계 전역의 다양한 지역에서 발생되는 Oidium neolycopersici과, 호주에서 보고된 Oidium lycopersici 로 크게 분류된다. 이 두 병원균의 형태학적 구분은 포자체의 발달과정에서 단일 포자가 형성될 경우 O. neolycopersici, 연결 포자들이 형성될 경우 O. lycopersici로 알려져 있다. 병징으로는 O. neolycopersici 와 O. lycopersici는 잎의 앞면과 잎자루, 줄기에 가루가 덮힌 듯 한 흰색 병반이 생기나 잎 뒷면에는 가시적인 병반이 나타나지 않는 반면, L. taurica의 병징은 잎의 뒷면에서도 병반이 보이는 것이 특징이다. 국내의 토마토 흰가루 발병 사례는 1995년 진주에서 Levillula taurica 가 발병 보고 된 바 있으나, 현재 세계적으로 문제가 되고 있는 O. neolycopersici 나 O. lycopersici 대한 국내 연구는 미흡한 실정이다.
Oidium spp.에 의한 흰가루병 저항성 토마토 유전자원과 저항성 유전양상은 수 차례 보고된 바 있다. 토마토 야생종 Solanum habrochaites (former L. hirsutum)의 염색체 6번의 long arm에서 dominant gene인 Ol -1과 Ol -3, 그리고 이들 유전자위와 매우 근접하여 연관되어 있는 Ol -5가 보고되었다. 또 다른 야생종인 S. peruvianum (former L. peruvianum, accession: LA2172)에서는 염색체 6번의 short arm에서 dominant gene인 Ol -4가 발견된 바 있다. 이들 single dominant gene 들의 저항성 기작에는 hypersensitive reaction(HR) 반응이 관여하는 것으로 알려져 있다. 저항성 QTL(Quantitative trait loci)로서는 S. neorickii (former L. parviflorum, accession:G1.1601)에서 Ol - qtl1이 Ol -1과 Ol -3, Ol - 5이 존재하는 영역에서 탐색된 바 있다. 또한 염색체 12번에서는 L. taurica 저항성 유전자위 Lv 부근으로부터 Ol - qtl2와 Ol - qtl3가 보고 된 바 있다. 반면 열성 단일 유전자로서 ol-2 유전자가 S. pimpinelliforum의 염색체로부터 클로닝(SlMlo1) 되었는데 Arabidopsis의 흰가루 저항성 유전자 Mlo1와 homology가 존재하며 broad spectrum resistance를 보인다. ol -2는 HR 반응을 일으키지 않고, papilla 형성과 관련되어 있는 저항성으로 ABA 및 JA 경로가 관여하는 것으로 알려져 있다.
한국등록특허 제10-1677714호 (2016.11.14 등록)
본 발명의 목적은 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 DNA 마커 조성물, 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 DNA 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 DNA 마커 조성물을 검출하기 위한 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발 방법을 제공한다.
본 발명은 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커에 관한 것으로서, 국내 주요 토마토 흰가루 병원균의 종을 동정하고, 이 종에 대한 저항성 토마토 유전자원(KNU-12)으로부터 저항성을 조절하는 유전자를 밝혀내어 유전자 기반의 분자마커를 개발하고자 하였다. 그 결과 경남 밀양과 전남 무주 토마토 재배지에서 자연발병된 흰가루병을 유발하는 병원균이 Oidium neolycopersici인 것으로 추정되었으며, ‘KNU-12’의 저항성은 단일 열성 유전자인 ol -2 유전자의 새로운 대립유전자(allele)가 저항성 기작인 것으로 나타났다. 이에 본 발명자들은 ol -2 유전자의 allele variant를 발견하였고 이와 연관된 SCAR와 dCAPS 마커를 개발하였다. 개발된 마커들은 KNU-12을 소재로 한 흰가루 저항성 품종 육성을 위한 분자마커이용선발(Marker-assisted selection; MAS)에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 Ol -1, ol -2, Ol -3, Ol -4, Ol -6, Ol - qtl1과 Ol - qtl3에 연관된 12개의 보고되어 있는 분자표지 검정 결과를 나타낸다. 첫번째 lane과 마지막 lane은 100bp DNA size marker이며 각 primer당 'KNU-12'와 'PMS' 순으로 두 반복하여 검정하였다. GP79L 마커 검정 시 'KNU-12'와 'PMS' 사이에서 다형성(붉은 화살표)을 보였지만 F2 집단 분석결과 KNU-12의 흰가루 저항성과 연관되지는 않았다.
도 2는 토마토 SlMlo1 (NC_015441.2) 유전자(gDNA ref.)의 13번 Exon과 15번 Exon 사이 영역을 확대하여 제작한 2-1 prime의 증폭산물을 PMS와 KNU-12 계통으로부터 클로닝한 결과를 나타낸다. 염기서열의 회색 배경은 엑손을 나타낸 것이고, 배경색이 없는 것은 인트론을 나타낸다. 회색 배경색 위의 숫자는 엑손의 순서를 나타낸다. PMS와 KNU-12 계통간 14번 Exon과 15번 Exon 사이의 intron에서 14bp Indel과 15번 Exon에서 1bp Indel이 존재함을 확인하였다. 이들 염기서열변이를 기반으로 SCAR_SlMlo1.1과 dCAPS_SlMlo1.1 두 마커를 개발하였다.
도 3은 ‘KNU-12’와 ‘PMS’간 ol -2 gene의 full-length cDNA 서열 비교 결과를 나타낸다.
도 4는 ol -2 유전자의 전사(transcription)시 어느 정도의 빈도로 alternative splicing이 일어나는지 유추하기 위해, Exon9의 양측 exon인 Exon8과 Exon10으로부터 forword와 reverse primer를 제작하여 두 계통의 접종 후 0, 12, 24, 48시간 별로 합성한 cDNA를 증폭한 결과를 나타낸다.
도 5는 총 96개 상용 토마토 F1 품종에 대해 SCAR_SlMlo1.1 마커에 대해 유전자형을 검정한 결과를 나타낸다.
도 6은 총 96개 상용 토마토 F1 품종에 대해 dCAPS_SlMol1.1 마커에 대해 유전자형을 검정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 DNA 마커 조성물을 제공한다.
서열번호 1은 흰가루병 저항성 토마토 개체인 'KNU-12'의 흰가루병 저항성 유전자 ol -2 gene (SlMlo1.1로 명명)의 exon13 내지 exon15에 해당하는 마커의 염기서열이다.
또한, 본 발명은 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 프라이머 세트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트 는 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR) 마커를 증폭하기 위한 것이다.
바람직하게는, 상기 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트는 파생된 제한 증폭 다형성 서열(derived cleaved amplified polymorphic sequence; dCAPS) 마커를 증폭하기 위한 것이다.
본 발명에 있어서, “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다.
본 발명에 있어서, "분자 마커" 또는 "DNA 마커"는 작물의 재배 환경이나 성장 시기에 영향을 받지 않고 신속하게 품종을 구별할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다. 분자 마커 또는 DNA 마커는 유전현상의 본질인 DNA의 염기서열 차이를 대상으로 개체간 다형성(polymorphism)을 나타내는 방법으로, 주로 반복 단순 염기서열로 이루어진 마이크로새털라이트(microsatellite)나 유전자 염기 서열을 이용한 마커 또는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 프로브나 SCAR(Sequence Characterised Amplified Region) 마커가 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, 서열-특징화된 증폭 다형성(sequence-characterized amplified polymorphism; SCAR)은 유전자 내 Indel 염기서열 변이를 분석하여 제작한 것이며, ASAP(Allele-Specific Associated Primer) 방식으로 밴드의 유무를 확인하는 방식으로 이용된다. SCAR 마커는 다른 분자 마커에 비해 증폭 환경에 비교적 둔감하고, 용이하게 결과를 판독할 수 있기 때문에, 재현성, 보편성 및 간편성을 갖춘 효율적인 품종구별용 분자 마커로 인식되고 있다. 즉, 보다 정확하고 세밀한 프라이머로 사용이 가능하다.
본 발명에 있어서, "파생된 CAPS(derived CAPS; dCAPS)"는 SNP가 제한효소 사이트 내에 원래부터 존재하지 않아, 인위적으로 single bp substitution을 일으켜 제한효소 사이트를 도입하여 제작된 CAPS 마커를 말한다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 키트를 제공한다.
상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2+와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다.
한편, 프라이머 세트가 dCAPS 마커를 포함하는 경우에는 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 외에 제한효소를 필요로 한다. 즉, dCAPS 마커는 증폭 반응을 수행한 후에, 해당하는 제한효소로 절단해야 증폭 산물을 구별할 수 있기 때문이다.
본 발명은 (1) 토마토에서 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계는 상기 PCR 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 분석할 수 있다.
토마토에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 또한, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 젤 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 젤 전기영동을 수행할 수 있으며, 젤 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 젤 전기영동 또는 아크릴아미드 젤 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 식물 재료
토마토 흰가루병 저항성 계통 'KNU-12'과 감수성 엘리트 계통 'PMS'을 부모계로 하여 F1을 작성하였다. 이후 F1을 인공수분으로 자가수정 하여 F2 집단을 생산하였다. 생산된 F2 개체 중 111 개체를 자가수정하여 F3 111 계통(family)을 진전시켰다. 세대 진전 및 채종은 부산대학교 유리온실(밀양, 경남) 내에서 수행되었다. 본 발명에서 개발된 SCAR와 dCAPs 분자표지검정(marker genotyping)에 사용된 96개 상용 F1 품종은 직접 구입하거나 세종대학교에서 분양 받았다.
2. 흰가루 병원균 동정
2014년 무주 토마토 연구 온실(전남 무주 무풍면 덕지리)과 2015년 부산대 유리온실 내 (경남 밀양시 삼랑진읍) 여름작기에서 자연발병한 흰가루 병원균을 채취하여 병원균 동정에 사용하였다. 감염된 'PMS'의 잎 병반 부위를 붓으로 쓸어내려 균사체 및 포자를 채취한 후 형태학적 분석과 DNA 분석에 사용하였다. 균사체 및 포자의 형태적 특징은 광학 현미경(DFC295, LEICA, Wetzlar, Germany) 하에서 관찰하였으며, ITS 염기서열 분석을 위한 genomic DNA의 추출은 GenExTM Plant KIT (GenExTM Plant, GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 수행하였다.
ITS 영역의 PCR 증폭은 genomic DNA 1 μL, 10X buffer (SolgTM, SolGent, Daejeon, Korea) 1 μL, 10mM dNTPs (SolgTM, SolGent, Daejeon, Korea) 0.2 μL, PMITS1 forward primer(5-TCGGACTGGCCTCAGGGAGA-3)와 PMITS2 reverse primer(5-TCACTCGCCGTTACTGAGGT-3) 각 0.5 μL, Taq polymerase (5U·μL-1, eTaqSolgTM, SolGent, Daejeon, Korea) 0.1 μL를 총 10 μL로 혼합하여, 94℃에서 10분간 denaturation 후: 94℃ 에서 1분, 53℃에서 1분, 72℃에서 1분간 40 cycle 처리하고 72℃에서 1분간 extension을 수행하였다. PCR 증폭 산물을 2% agarose gel에서 확인 후 Gel extraction kit (ExpinTM Gel SV, GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제하고 T-Easy Vector System (pGEM, Progma, Madison, WI, USA)을 사용하여 cloning 하였다. 재조합 플라스미드(Recombinant plasmid)의 염기서열분석은 Genotech (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 dye terminator method로 수행하였다. 토마토에 흰가루병을 일으킨다고 보고된 병원균종들의 ITS 정보를 NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 획득한 후 분석된 염기서열(MJ_PMS-1)과 함께 ClustalW(http:// www.genome.jp/tools-bin/clustalw)를 이용해 상호 비교하였다.
3. 흰가루병 병리검정
2014년도 흰가루병 생물검정은 F3 계통당 10개체를 1반복으로 총 2반복 수행하였고, 2015년도에는 동일한 F3 계통당 5개체를 1반복으로 총 3반복 수행하였다. 흰가루 병원균의 동정에 사용한 병원균 시료를 9.75ⅹ104 conidia·mL-1 농도로 ddH2O에 희석하여 포자현탁액을 만들어 본엽 3~4 매 시기에 간이 분무기로 유묘 전체가 완전히 젖도록 3일 간격으로 3차례 반복 접종 하였다. 접종 후 2 주간 부산대학교 유리온실 내 밤 11℃, 낮 26~28℃의 일교차를 유지하면서 병징을 관찰하였다. 저항성 정도는 병징의 수준에 따라 Disease symptom index (DSI) = 0 ; 병징없음, 1; 전체 엽면적의 10% 미만, 2; 전체 엽면적의 10-30% , 3; 전체엽면적의 30% 이상을 기준으로 평가하였다.
4. 기존 흰가루 내병성 연관 분자마커 검정
'KNU-12'와 'PMS'에 대하여 기존 보고된 토마토 흰가루 내병성 연관 마커 [dct136 (Ol-qtl1, Bai et al., 2004), Y258, tg111(Ol-qtl3, Bai et al., 2004), Tom316, Tom332, U3-2, M/SlMlo1 (ol-2, Pavan et al., 2008), GP79L, 32.5Cla (Ol-4, Ol-6, Bai et al., 2005), tg25-1, tg25-2, H9A11 (Ol-1, Ol-5, Bai et al., 2005)를 검정하였다. Genomic DNA는 본엽 2-3매인 시기의 개체 별 어린 잎에서 SDS extraction buffer를 이용하여 추출되었다(Kim et al., 2010). 마커 유전자형 분석을 위한 PCR reaction은 1 μL의 Template DNA (10 ng), 0.5 μL의 forward와 reverse primer (10 pmol), 0.1 μL의 Taq polymerase(5U·μL-1, eTaqSolgTM, SolGent, Daejeon, Korea), 0.2 μL 10mM dNTPs (SolgTM , SolGent, Daejeon, Korea), 1 μL 10X buffer(SolgTM, SolGent, Daejeon, Korea)와 6.7 μL 의 ddH2O를 합하여 총 10 μL의 volume을 사용하였다. 반응은 PCR(T100TM, BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 사용하여 95℃에서 2분 처리 후 다음에 따라 35 cycle을 반복하였다: Denaturation을 94℃에서 15초, Annealing을 58℃에서 30초, Extension을 72℃에서 1분 동안 처리하였다.
5. ol -2 gene ( SlMlo1 ) allele variation 분석 및 SCAR 마커 개발
'KNU-12'와 'PMS'로부터 ol -2 유전자의 genomic DNA sequence를 분석하기 위해 primer3 software(http://frodo.w i.mit.edu/cgi-bin/primer3/ primer3.cgi/)를 사용하여 NCBI로부터 얻은 SlMlo1 gene (NC_015441.2)에서 1-1 forward primer(5-AACATGTGTGCCTATTTGTTCG-3), 1-1 reverse primer (5-GTTGGCACAAAACTTCAAATGA-3), 1-2 forward primer (5-CGTATCTTTGGGTGCCATTT-3), 1-2 reverse primer (5-AATGCTGCAGACCTAGCCAT-3), 1-3 forward primer(5-GGCAGAATGCGTTTCAAGTT-3)와 1-3 reverse primer(5-TGTCAGATTTTACTTTTGGAAACAA-3)를 제작하였다. ol -2 유전자 기반 SCAR 마커는 intron 영역의 indel를 기반으로 제작하였다. Primer의 PCR 증폭, cloning, 염기서열 분석 방법은 상기 '흰가루 병원균 동정'에서와 동일하다.
6. ol -2 gene의 full-length cDNA cloning과 dCAPS 마커 개발
본엽 6~7매 시기의 'KNU-12'와 'PMS'의 잎 조직을 모아 액체질소를 이용하여 시료를 갈아냈다. Total RNA는 RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Germantown, MD, USA)를 사용하여 추출하였고, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 농도를 확인하였다. ol -2 gene의 full-length cDNA의 합성은 추출된 RNA를 10 ng·μL-1의 농도로 희석한 후 SMARTer® RACE 5'/3' kit (Takara, Kusatsu, Japan)를 이용하여 User manual에 따라 수행하였다. RACE PCR을 위한 gene specific primer (5' reverse primer: 5-GATTACGCCAAGCTTTCACCCCCATGGTTAGCCTTATGGCT-3, 3' forward primer: 5-GATTACGCCAAGCTTGCATTTCTGGAGCAAGTCCCCCGTGTT-3)는 SlMlo1 CDS (NC_015441.2)로부터 제작되었다. RACE PCR 증폭산물의 cloning과 sequencing은 Kim et al. (2017)의 방법과 동일하다. 얻어진 Full-length cDNA 염기서열들은 ClustalX 1.83을 이용하여 비교분석 하였다.
ol-2 유전자 기반 dCAPs 마커 (dCAPS_SlMlo1.1)는 dCAPs finder software (http://helix.wustl.ed u/dcaps/dcaps.html)를 이용하여 제작하였다. 증폭된 산물을 BclI enzyme으로 digestion 할 경우, 'KNU-12' 증폭 산물은 199 bp의 단일 밴드(uncut), 'PMS' 증폭 산물은 175 bp 와 24 bp의 두 개 밴드를 나타내도록 마커를 디자인하였다. dCAPS 마커 유전자형 분석을 위한 PCR reaction은 1 μL의 Template DNA (10ng), 0.5 μL의 forward와 reverse primer (10pmol), 0.1 μL의 Taq polymerase(5U·μL-1, eTaqSolgTM, SolGent, Daejeon, Korea), 0.2 μL 10mM dNTPs (SolgTM, SolGent, Daejeon, Korea), 1 μL 10X buffer(SolgTM , SolGent, Daejeon, Korea)와 6.7 μL의 ddH2O를 합하여 총 10 μL의 volume을 사용하였다. 반응은 PCR(T100TM, BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 사용하여 95℃에서 2분 처리 후 다음에 따라 35 cycle을 반복하였다: Denaturation을 94℃에서 15초, Annealing을 58℃에서 30초, Extension을 72℃에서 1분 동안 처리하였다. Cycle이 모두 끝나면 72℃에서 3분간 처리하고 4℃까지 온도를 내렸다. 이 후 PCR product를 제한효소 0.5 μL FokI (1,000U·mL-1, Time-SaverTM, NEB®, Ipswich, USA), 1.5 μL 10X buffer (CutsmartTM, NEB®, Ipswich, Massachussetts, USA)와 3 μL의 ddH2O을 이용하여 37℃를 1시간 처리하였다. PCR product는 6x loading dye를 첨가하고 3 μL의 2.5% Agarose gel에 분주하여 130V로 1시간 전기영동을 수행하였다. 이는 EtBr로 염색하여 Gel image analysis system(CoreBio-MAXTM, Davinch-K, Seoul, Korea)을 사용하여 결과를 확인하였다.
< 실시예 1> 흰가루병 병원균 동정
무주와 밀양에서 'PMS' 계통에 발병한 흰색의 mycelial mat를 채취하여 병원균의 형태학적 특징을 분석하였다. 본 발명의 광학 현미경 분석 결과, 분생자자루와 피브로신체를 관찰할 수 없었고, 반원통형을 띄며 바깥쪽 세포벽은 각이 지고 망상형인 분생포자들이 관찰되어 본 발명에서 분리한 병원체가 흰가루병을 일으키는 Oidium spp. 의 특징을 보였다(Kiss et al., 2001). 하지만 O . lycopersici와 O. nelycopersici 를 구분하는 중요한 특징은 발견할 수 없어 rDNA ITS 영역의 염기서열 분석을 수행하였다. 무주(MJ_PM-1)와 밀양(MR_PM-2)에서 채취한 병원체의 ITS rDNA 영역 염기서열을 Erisiphe family의 여러 종들의 염기서열과 비교분석한 결과 O. neolycopersici와 가장 유사한 것으로 나타났다. NCBI의 AF229021(O. lycopersici), AF229019와 AF229015(O. neolycopercisi)과의 비교분석에서 MJ_PM-1과 MR_PM-1의 rDNA ITS는 AF229019과 100% 동일하고, AF229015와는 1bp의 다형성이 발견되었다. 반면 AF229021와는 Insertion과 Deletion을 포함하는 다양한 차이를 나타냈다(도 1). 이러한 형태적 특성과 rDNA의 ITS 분석 결과를 미루어 볼 때, 무주와 밀양에서 발병한 흰가루 병원균 종은 O. neolycopercisi인 것으로 짐작된다.
< 실시예 2> 내병성 검정
F1과 111 F3 계통을 이용하여 'KNU-12'의 흰가루병 저항성 유전양상을 분석하였다. 1차 병리검정(2014년, 무주) 결과, F1과 87개 F3 계통은 감수성 (DSI=1-3), 22개 계통은 저항성 (DSI 0-0.9)으로 관찰되었다. F3 계통에 대한 병리검정 결과는 두 개 계통 (F3-25, F3-121) (표 1 및 표 2)을 제외하고 두 반복 (2014년과 2015년) 간 일치하였다. 따라서 두 반복의 평균 DSI 값을 각 F3 계통의 최종 DSI 값으로 평가하였다. 최종적으로 저항성(R)과 감수성(S) F3 계통의 비율은 21:90으로서 멘델의 단일열성유전자위의 유전비율인 1:3(X 2 =0.68, P=0.41)과 일치하였다(표 1 및 표 2).
F3 Phenotype Genotype F3 Phenotype Genotype
　 2014 2015 aver 　 F2 F3 　 　 2014 2015 aver 　 F2 F3
1 1.2 2.3 S H Seg 56 0.2 0.1 R R R
2 1.3 1.9 S H Seg 58 0.0 0.0 R R R
3 1.1 1.7 S H Seg 59 1.6 1.6 S H Seg
7 1.4 1.9 S H Seg 60 1.5 2.6 S S S
8 0.1 0.2 R R R 61 1.4 1.7 S H Seg
9 0.0 0.0 R R R 62 1.8 2.3 S H Seg
10 1.0 2.1 S H Seg 64 0.1 0.1 R R R
11 1.1 2.6 S H Seg 66 1.9 2.2 S H Seg
12 1.6 1.6 S H Seg 67 2.1 1.0 S S S
13 1.7 3.0 S S S 68 2.8 2.9 S S S
14 1.5 1.9 S H Seg 69 1.9 2.1 S H Seg
15 0.0 0.1 R R R 70 0.0 0.1 R R R
17 1.4 2.3 S H Seg 72 2.5 2.8 S S S
19 1.6 1.8 S H Seg 74 2.1 1.9 S H Seg
20 0.0 0.2 R R R 75 2.6 2.0 S H Seg
21 1.0 1.8 S H Seg 76 0.0 0.0 R R R
25 0.9 2.3 S H Seg 77 0.0 0.4 R R R
26 0.0 0.0 R R R 80 2.1 2.6 S S S
28 1.5 1.8 S S S 81 2.3 2.9 S S S
30 0.0 0.1 R R R 82 1.8 2.1 S H Seg
32 2.3 2.9 S S S 83 1.7 2.4 S H Seg
35 2.5 2.6 S S S 84 2.1 1.7 S H Seg
36 2.4 2.7 S S S 85 1.7 2.8 S S S
37 1.5 1.4 S H Seg 86 1.9 2.8 S S S
38 1.2 2.5 S H Seg 87 2.3 2.9 S S S
41 1.1 2.0 S H Seg 88 2.0 1.5 S H Seg
42 1.9 2.9 S S S 91 2.1 2.9 S S S
43 1.0 2.0 S H Seg 94 1.8 2.1 S H Seg
44 1.2 2.3 S H Seg 95 1.9 1.8 S H Seg
45 1.6 2.5 S H Seg 96 1.7 1.7 S H Seg
46 1.9 2.8 S S S 97 1.7 2.0 S H Seg
48 1.8 2.6 S S S 99 0.0 0.0 R R R
49 2.1 3.0 S S S 101 1.6 2.6 S H Seg
50 2.2 2.6 S S S 102 1.6 2.5 S S S
52 0.0 0.0 R R R 103 1.6 2.5 S H Seg
53 1.5 2.1 S H Seg 104 0.0 0.0 R R R
54 2.0 2.6 S H Seg 105 1.5 2.7 S H Seg
55 1.4 2.0 S 　 H Seg 　 106 1.8 2.5 S 　 S S
F3 Phenotype Genotype
　 2014 2015 aver 　 F2 F3
107 1.2 2.1 S H Seg
109 2.5 2.4 S H Seg
110 0.0 0.0 R R R
112 1.4 2.2 S H Seg
114 1.5 2.0 S H Seg
115 2.6 3.0 S S S
116 2.2 2.6 S S S
117 1.6 1.5 S H Seg
119 1.3 2.4 S H Seg
120 1.9 2.6 S S S
121 0.6 2.5 S H Seg
122 1.9 2.8 S S S
123 0.0 0.0 R R R
124 1.5 2.2 S H Seg
125 1.1 1.8 S H Seg
126 1.5 1.8 S H Seg
127 0.0 0.0 R R R
128 1.6 2.1 S H Seg
131 1.5 1.6 S H Seg
132 1.8 2.0 S H Seg
133 1.4 2.1 S H Seg
134 1.6 2.7 S H Seg
135 1.6 3.0 S S S
136 1.7 2.0 S H Seg
137 0.0 0.0 R R R
138 1.6 2.9 S S S
139 1.9 2.8 S S S
140 2.1 1.3 S H Seg
141 2.0 2.0 S H Seg
142 1.4 2.6 S S S
143 2.5 2.4 S S S
144 1.7 2.7 S S S
145 0.0 0.0 R R R
147 2.6 2.8 S S S
150 - 0.0 R R R
< 실시예 3> 저항성 연관 분자표지 개발
기존 보고된 12개의 흰가루 저항성 유전자 (Ol -1, ol -2, Ol -3, Ol -4, Ol -6, Ol-qtl1, Ol - qtl3) 연관 마커를 이용하여 'KNU-12' 과 'PMS'의 마커 유전자형을 분석하였다(도 1). 분석결과, 우성 유전자인 Ol -4와 연관된 GP79L를 제외한 나머지 분자표지들은 두 계통간 다형성을 보이지 않았다. 다형성을 보인 GP79L 마커를 이용하여 111개 F2:3 (유전자형은 F2, 표현형은 F3 집단으로 분석할 경우 표현 방식임)계통의 유전자형을 분석한 결과, 표현형과의 분리가 일치하지 않아 'KNU-12'의 저항성은 Ol -4와 연관성이 없음을 알 수 있었다. 이는 'KNU-12' 저항성이 단일열성 유전임을 감안할 때 당연한 결과라 생각되었다. 저항성 유전양상(표 1 및 표 2)을 감안할 때, ol -2 유전자의 관련성이 유력하였으나 기존 보고된 ol -2 유전자 마커에서는 'KNU-12'와 'PMS' 간 다형성이 발견되지 않았기에(도 1), 'KNU-12'는 마커개발에 사용된 LA1230(S. lycopersicum var. cerasiforme)과 상이한 ol -2 allele을 지닐 것으로 가정하였다.
이에 'KNU-12'의 ol -2 gene(Solyc04g049090, 5344bp)의 gDNA 염기서열분석을 위해 9개의 primer set을 디자인하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, exon13~exon15 영역을 증폭하는 primer set (1-3 primer)에서 'KNU-12'와 'PMS'간 증폭산물 크기에서 다형성을 관찰할 수 있었다. 이어 1-3 primer 영역 양측에서 다시 2-1 forward primer(5-CAGGGTGATCATACAGGTCCA-3)과 2-1 reverse primer (5-AGAAGCTGGCACCATACAGC-3)를 제작해 증폭산물을 클로닝한 결과, exon14와 exon15 사이의 intron에서 14-bp indel과 exon15 내에서 1-bp Indel이 존재함을 확인하였다 (도 2). 이들 염기서열 변이를 이용하여 'KNU-12'와 'PMS' 간 ol -2 allele의 유전자형 분석이 가능한 SCAR 마커와 dCAPS를 개발하였다. SCAR 마커(SCAR_SlMlo1.1) 는 14-bp indel 양측으로 forward primer (SCAR_SlMlo1.1_F: 5-GCAGCTATGTGACTCTCCCTCTTTATG-3; 서열번호 2)와 reverse primer (SCAR_SlMlo1.1_R: 5-GAGCTGTTGCCACATTATCACCA-3; 서열번호 3)로 PCR 증폭시 'KNU-12'에서 172-bp, 'PMS'에서 186-bp의 크기로 다형성을 나타내도록 제작하였으며, dCAPS 마커(dCAPS_SlMlo1.1)는 1-bp indel을 타겟으로 forward primer (dCAPS_SlMlo1.1_F: 5-TATATAGAGAAATTCTGTAGATGTGATC-3; 서열번호 4)와 reverse primer (dCAPS_SlMlo1.1_R: 5-TGGATAACCGCGTAATAAGT-3; 서열번호 5)로 증폭 후 BclI enzyme 처리시 'KNU-12'는 199-bp, 'PMS'는 175-bp와 24-bp 크기의 밴드로 allele 구분이 가능하도록 제작하였다(도 4).
< 실시예 4> 병 저항성과 ol -2 마커 간 연관분석
'KNU-12'와 'PMS'의 111 F3 계통 생산에 사용된 F2 개체 대한 SCAR_SlMlo1.1 분석 결과, F3 계통에서 저항성으로 scoring된 F2 개체들은 모두 'KNU-12'의 마커형(저항성, R)을 보인 반면, 감수성으로 scoring 된 F2 개체들은 모두 'PMS'의 마커형(감수성, S)을 보였다(표 1 및 표 2). 또한 F3에서 저항성과 감수성 개체가 분리되는 경향을 보였던 F2의 경우 모두 이형접합의 마커형 (Heterozygosity, H)을 보였다. 이 결과는 이들 F3로부터 10개의 종자를 다시 파종하여 잎으로부터 추출된 DNA를 혼합(pooling)하여 SCAR_SlMlo1.1 마커검정 하였을 경우 ‘KNU-12와 ’PMS’ 특이적 마커형이 동시에 관찰됨을 확인함으로서 ol-2 유전자가 이들 F2:3 계통에서 실제 분리되고 있음을 재입증 하였다. dCAPS_SlMlo1.1 마커 검증에서도 SCAR_SlMlo1.1 마커에서와 동일한 결과를 얻었다. 따라서 연구결과는 ‘KNU-12의 흰가루병 저항성이 단일열성유전자에 의해 조절되며 ol-2 유전자와 공동분리됨을 보여주었다.
< 실시예 5> SlMlo1 .1의 full length cDNA 서열분석
'KNU-12'와 'PMS'의 ol-2 유전자의 coding sequence 간 또 다른 변이의 존재를 알아보기 위하여 RACE를 통해 ol-2 gene의 full-length cDNA 서열을 분석하였다(도 3). 각 계통에서 3개의 cDNA 분자를 서열분석 하였으며, 그 결과 모든 서열에서 15번째 Exon의 1-bp Indel을 재확인 하였다. 하지만, 특이하게 'KNU-12'의 한 cDNA 분자에서 9번째 exon (Exon9) 전체에 deletion이 일어났음을 발견하였다. 이 cDNA 분자가 게놈 상에 존재할 수 있는 또 다른 ol -2 gene copy에서 발생한 것인지 아니면 RNA processing 단계에서 일어난 alternative splicing에 기인한 것인지 유추하기 위하여 Exon9 양측 intron에서 exon indel test forward primer(5-GCACATTTAACTCCACAAAATCA-3)과 exon indel test reverse primer(5-CTCGTATCTTTGGGTGCCAT-3)를 디자인하여 두 계통의 gDNA를 증폭 시켰다. 그 결과 deletion이 일어나지 않은 wild-type allele의 PCR band(172-bp)만 확인되어, ol-2 gene의 RNA processing 단계에서 일어난 alternative splicing에 기인했을 가능성을 보여 주었다. 따라서 ol-2 유전자의 전사(transcription)시 어느 정도의 빈도로 alternative splicing이 일어나는지 유추하기 위해 Exon9의 양측 exon인 Exon8과 Exon10으로부터 forword와 reverse primer를 제작하여 두 계통의 접종 후 0, 12, 24, 48시간 별로 합성한 cDNA를 증폭하였다. 증폭시킨 모든 cDNA samples에서 deletion이 일어나지 않은 allele size의 강한 PCR 밴드와 더불어 deletion이 일어난 allele size의 매우 희미한 band가 동시에 관찰되었다(도 4). 이는 alternative splicing이 'KNU-12'의 저항성 allele에서 특이적으로 일어나는 것이 아니라 감수성 allele에서도 매우 낮은 빈도이지만 유사한 수준으로 일어남을 보여주며 흰가루병 저항성과는 무관함을 암시한다.
< 실시예 6> 마커의 MAS 유용성 검증
총 96개 상용 토마토 F1 품종에 대해 SCAR_SlMlo1.1과 dCAPS_SlMol1.1 마커에 대해 유전자형을 검정하였다. 이들 F1 품종의 판매회사들의 정보에 따르면 흰가루 저항성으로 표기된 품종이 없으며, 따라서 대부분 감수성이라고 판단되는 품종들이라 할 수 있다. 두 마커의 검정결과 SCAR_SlMlo1.1의 경우 ‘KNU-12의 유전자형을 보인 품종이 다수 존재하였으며,‘KNU-12’와 ‘PMS’의 유전자형과는 다소 차이가 나는 PCR band를 보여주는 여러 품종들이 존재하였다(도 5). 반면 dCAPS_SlMlo1.1의 경우, KNU-12의 유전자형을 보인 두 품종(PPS, PCJ-2)을 제외하고 94 품종 모두 ‘PMS’의 유전자형을 보였다(도 6). 이는 ol -2 유전자 exon14와 exon15 사이의 intron 내 14-bp Indel의 경우 토마토 유전자원의 흰가루 저항성과 무관하게 변이가 존재하는 반면 exon15 내에서 1-bp Indel은 흰가루 저항성과 연관성이 매우 높으며 이를 기반한 마커를 다양한 육종소재의 MAS에 활용할 경우 선발의 정확도를 높일 수 있음을 보여 준다. 다만 저항성 유전자형을 보였던 PPS, PCJ-2 품종에 대해서는 흰가루병 병리검정을 통해 마커-표현형 간 일치성을 확인할 필요가 있다.
결론적으로, 'KNU-12'의 intron에 존재하는 14-bp indel의 경우 ol-2 유전자의 기능에 직접적 영향을 주지 않는 반면, exon15에 존재하는 1-bp deletion이 frame shift mutation을 유도하여 유전자의 기능을 상실시키는 causative mutation이라는 사실을 유추하게 한다. 또한, 많은 감수성 품종들에서 intron Indel allele이 발견된 반면, exon15의 Indel은 두 품종에서만 발견되었다는 점은 ol-2 유전자의 진화적인 측면에 있어서도 exon 15의 mutation이 intron mutation 이후에 일어난 event일 가능성을 유추할 수 있다. 저항성이 dCAPS_SlMlo1.1과 일치하지 않는 유전자원들에 있어서는 ol-2 이외에 다른 저항성 유전자가 관여할 수 있음을 짐작할 수 있으며 이에 대한 연구가 필요하다. 그럼에도 불구하고 dCAPS_SlMlo1.1 마커와 저항성 간의 높은 일치성은 이 마커가 'KNU-12'를 육종소재로 이용하여 ol-2 유전자를 선발할때 매우 효과적인 MAS가 이루어질 수 있음을 보여준다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Molecular marker for selecting tomato plants resistant to powdery mildew disease <130> ADP-2018-0042 <150> KR 10-2017-0146703 <151> 2017-11-06 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 279 <212> DNA <213> tomato KNU-12 <400> 1 tgtcaagtca aaacattatg gaagttgatg catatatata ttcagggtga tcatacaggt 60 ccattgcagc tatgtgactc tccctcttta tgccttagtt acacaggtag gtactctgat 120 ctacattatg aaaatgttat atatatatat atatatatat atatacttat atagagaaat 180 tctgtagatg ggttctcaat gaagcctatc atctttggtg ataatgtggc aacagctctt 240 agaagctggc accatacagc gaaaaaacgg gtgaaacat 279 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcagctatgt gactctccct ctttatg 27 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagctgttgc cacattatca cca 23 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tatatagaga aattctgtag atgtgatc 28 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggataaccg cgtaataagt 20

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 프라이머 세트.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트는 파생된 제한 증폭 다형성 서열(derived cleaved amplified polymorphic sequence; dCAPS) 마커를 증폭하기 위한 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 프라이머 세트.
  5. 제2항 또는 제4항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 키트.
  6. (1) 토마토에서 DNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 제2항 또는 제4항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (3) 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함하는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PCR 증폭 산물을 분석하는 단계는 상기 PCR 증폭 산물을 제한효소로 절단하여 분석하는 것을 특징으로 하는 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발 방법.
KR1020180032146A 2017-11-06 2018-03-20 흰가루병 저항성 토마토 개체 선발용 분자마커 KR101907825B1 (ko)

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