KR20140007635A - 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 역병 저항성 고추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.

Description

역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primer for selecting Phytophthora blight resistant pepper and uses thereof}
본 발명은 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로, 서열번호 1 내지 6으로 표시된 프라이머 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 역병 저항성 고추 품종을 선별하는 방법에 관한 것이다.
고추의 역병은 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 의해 발병하는데, 전 세계적으로 고추 생산량 감소에 가장 큰 피해를 주는 병해 중 하나이다. 고추의 역병의 피해를 줄이기 위해서 많은 화학적인 방제법이 개발되었지만, 최근 환경오염을 막기 위한 움직임 속에서, 그리고 건강한 먹거리에 대한 소비자들의 관심이 높아지면서 저항성 품종 육성이 활발하게 진행되고 있다. 여러 작물에서 육종 가치가 높은 형질은 단일 유전자좌에 조절되는 질적 형질보다 둘 이상의 유전자 즉, 양적 형질 유전자좌에 의해 유전되는 경우가 많다. 고추의 역병 저항성 역시 양적 형질 유전자좌(Quantitative trait locive, QTL)에 의해 유전되는 대표적인 저항성 중 하나이다.
전세계적으로 다양한 연구 그룹은 역병 저항성 유전자원 선발, 역병 저항성 유전 연구를 수행했다. CM334, PI201234, AC2258, Perrenial 등 다양한 역병 저항성 유전자원이 발견되었고, 유전 분석을 통해 다양한 QTL이 발견되었다(Bonnet et al., 2007, Theor Appl Genet 115:253-264). 그러나 QTL의 정확한 위치가 분석되지 않았고, 또한 환경에 의한 영향 및 QTL에 의한 영향을 구별하거나 QTL 간의 상호작용을 규명하기 어렵기 때문에 QTL 연구 결과를 실제 품종 육성에 적용하기는 쉽지 않다.
역병 저항성은 연구 그룹 또는 식물 재료에 따라 양적 형질 유전자좌 수 및 위치가 다르지만 염색체 5번에 한 개의 주동유전자좌가 공통적으로 존재한다는 연구 결과가 보고되었다. 실제 육종에 활용할 수 있는 저항성 연관 분자표지를 개발하기 위하여 복잡한 QTL에 의한 유전을 단순화시켜 염색체 5번에 위치하는 주동유전자좌의 효과를 극대화시키고자 했다. 본 발명에서는 염색체 5번에 위치하는 주동유전자좌와 연관된 분자표지를 개발하기 위하여 YT RIL, 일당백 F2 집단에 낮은 접종 농도의 역병균을 접종하여 주동유전자좌의 병 저항성 기여도를 극대화하고, 2개의 집단을 이용하여 주동유전자좌 연관 분자표지를 개발하고자 했다. 또한 개발된 분자표지를 실제 육종에 활용할 수 있는지 검토하기 위하여 시판중인 역병 저항성 및 이병성 품종과 역병 저항성 육성 계통을 이용해 검증했다.
한편, 한국등록특허 제0560996호에서는 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 진단용 디엔에이표지인자가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0119404호에서는 고추역병 균에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 이를 이용한 가지과 또는 박과 작물의 역병 진단방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 고추의 염색체 5번에 위치하는 주동유전자좌와 연관된 분자표지를 이용한 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 특이 프라이머 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 고추 역병 저항성은 연구 그룹 또는 식물 재료에 따라 양적 형질 유전자좌 수 및 위치가 다르지만 염색체 5번에 한 개의 주동유전자좌(major QTL)가 공통적으로 존재한다는 연구 결과를 바탕으로, 실제 육종에 활용할 수 있는 역병 저항성 연관 분자표지를 개발하기 위하여 일당백 F2 분리집단과 QTL 분석 및 고밀도 지도 작성에 유리한 “YCM334XTean” RIL 집단(이후 YT-RIL로 명기)에 낮은 접종 농도의 역병균을 접종하여 주동유전자좌 연관 분자표지 3개를 개발하였고, 이를 이용하여 시판중인 역병 저항성 및 이병성 품종을 정확히 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종 선별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 역병 저항성 고추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분자표지를 많은 고추 작물들에 적용하면 고추 역병에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명에 따른 분자표지 및 본 발명에서 제공하는 고추 품종 선별 방법은 고추 역병의 피해를 막고자 고추 역병 저항성 품종을 육성하기 위해 많은 노력을 해온 고추 육종업자들에게 매우 유용할 것이다.
도 1은 낮은 농도로 접종한 F2 분리집단과 YT RIL 집단에서의 역병 저항성 평가를 나타낸다. A, 일당백 F2 집단의 병 지수별 개체수; B, YT RIL집단에서의 병 지수별 개체수
도 2는 SAR8.2의 세개의 상동체인 SAR8.2A, SAR8.2B 및 SAR8.2C의 cDNA 서열과 2개의 분자표지 PhytoSNP5 및 SAR8.2AS 프라이머의 위치를 나타낸다. 개시 코돈에서 정지 코돈까지의 코딩영역과 개시 코돈 왼쪽의 5'UTR(untranlated region), 정지 코돈 오른쪽의 3'UTR을 포함한다. PhytoSNP5는 SAR8.2A, SAR8.2B 및 SAR8.2C의 코딩 영역 가운데 공통적인 염기에서 디자인했고, SAR8.2AS는 SAR8.2A만을 증폭할 수 있도록 3'UTR의 SAR8.2B의 삽입된 염기서열(점선으로 표시)을 제외하도록 디자인했다.
도 3은 PhytoSNP5 및 SAR8.2AS 분자표지의 HRM 분석 결과이다. A, PhytoSNP5 분자표지에서 저항성 동형접합체(R), 이병성 동형접합체(S), 이형접합체(H) 유전형의 서로 다른 용융곡선(melting curve) 그래프 양상; B. SAR8.2AS 분자표지로 분석했을 때 용융곡선 그래프 양상
도 4는 3개의 방법을 통해 개발된 10개의 분자표지를 이용하여 YT RIL 집단 염색체 5번 연관지도를 작성하고, CIM(composite interval mapping) 결과 각 빈(bin) 별로 역병 저항성을 설명하는 LOD 피크를 나타낸다.
도 5는 역병 저항성 계통 및 이병성 계통의 PhytoSNP5 분자마커 HRM 분석 결과를 나타낸다. A, 역병 저항성 계통인 YCM334, CM334, PI201234 및 AC2258과 이병성 계통인 TEAN 및 Chilsung의 HRM 해리 곡선; B, 6개의 저항성 및 이병성 계통의 염기서열을 분석(Y= C or T; W=A or T; M=A or C)
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 5의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위해, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6 및 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있고, 특히, 이들 중 2개 이상을 동시에 이용할 경우 역병 저항성 고추 품종을 비교적 쉽고 정확하게 선별할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 농도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 완충용액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, 중합효소연쇄반응이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 중합효소연쇄반응 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 중합효소연쇄반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 중합효소연쇄반응 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 중합효소연쇄반응 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 중합효소연쇄반응을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 중합효소연쇄반응 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 중합효소연쇄반응 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
식물 재료
역병 저항성에 관여하는 major QTL 연관된 분자표지를 개발하기 위하여 일당백 F2 분리집단과 QTL 분석 및 고밀도 지도 작성에 유리한 YCM334XTean RIL 집단을 사용하였고, 분자표지의 유용성을 검정하기 위해 F1 상업품종과 역병 육종계통들을 사용했다. 일당백 F2 분리집단은 F1 상업품종인 일당백을 자가 수분시켜 얻은 200체로 구성했고, F7~9세대의 YT RIL 집단은 Yolo Wonder와 CM334로부터 교배하여 얻은 F6 세대의 역병 저항성인 YCM334와 Taiwan의 재래종인 역병 감수성 TEAN을 교배하여 얻은 143개의 YT RIL 계통을 원예연구소로부터 분양 받아서 구성했다. F1 상업품종은 3개 회사의 53종류의 역병 저항성 및 이병성 상업품종을 사용하였다.
게놈 DNA 추출과 유전자형의 결정
식물체의 게놈 DNA는 CTAB(Hexadecyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 추출하였다. 96개의 1.4 ml 튜브에 각각 2장의 잎과 2개의 비드, CTAB 핵산 추출 완충액(2% CTAB, 20mM EDTA, 100mM Tris-Cl pH 8.0, 1.4M NaCl) 500㎕, PVP(PolyVinylPirroliodone) 0.5g, β-머켑토 에탄올 20㎕을 넣은 후 조직분쇄기(tissue lyser, QIAGEN)를 이용하여 분쇄하였다. 그 다음 1시간 동안 65℃ 수조에서 가열하면서 20분 간격으로 잘 섞이게 흔들어 주었다. 반응이 끝나면 잠시 식힌 후, 클로로포름(chloroform)과 이소아밀알코올(isoamylalcohol)을 24:1로 섞은 CI 용액을 500㎕ 넣고 잘 섞고, comti-514R 원심분리기를 이용하여 3,000rpm으로 30분간 원심분리한다. 이후 상징액을 96개의 v-bottom 플레이트로 옮기고 동량의 이소프로필(isopropyl) 알코올을 넣은 다음 -20℃에서 1~2시간 보관한다. 반응이 끝난 뒤 3,000rpm으로 30분간 원심분리한 다음 상징액을 버리고, 이 후 펠렛을 두 번 3000rpm에서 20분간 70% 에탄올로 씻은 후 상온에서 말리고 TDW에 용해시켰다. 추출한 DNA는 NanoDrop® ND-1000 (Nanodrop Technologies, USA)을 이용하여 농도를 측정한 뒤 20ng/ul 농도로 희석했다.
SNP 분자표지를 이용한 유전자형의 결정은 Rotorgene-Q(Qiagen) real-time PCR 장비를 이용하여 HRM 분석을 수행하였다. PCR 반응액은 1X PCR 완충액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl pH 8.3, 15mM의 MgCl2), 프라이머 0.5pM, 주형 핵산 60ng, dNTPs 0.25mM, SYTO9 0.25mM, 핵산중합효소 0.5U으로 구성하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 4분 동안 유지시킨 다음 45 사이클(95℃ 20초, 58℃ 20초, 72℃ 30초)을 반복한 뒤, 70~90℃ 온도 범위에서 0.1℃마다 형광을 측정하였다. C. annuum cv. YCM의 그래프와 유사한 식물체를 저항성 동형접합체로(R), C. annuum cv. TEAN의 그래프와 유사한 식물체를 이병성 동형접합체(S)로, 두 지표식물과 다른 형태의 그래프를 보이는 식물체는 이형접합체(H)로 분류했다.
역병 균주 재료 및 저항성의 평가
고추 역병 균주는 한국화학연구소의 파이토프토라 캡사이시 JHAI 1-7을 사용하였다. 접종농도에 따라 저항성이 달라지는 역병 저항성의 특징을 고려하여 병 저항성에 주동유전자좌만이 관여할 수 있는 3 x 104 zoospore/ml 의 낮은 농도로 접종했다.
종자 파종 후 5주 후에 5ml/pot 접종했다. 병 저항성은 약 10일 후 줄기 지저부의 병징을 관찰한 뒤 0-3으로 4단계의 병 지수로 나누어 평가했다. 평가 기준은 다음과 같다; (0) 병징이 나타나지 않은 경우, 1)잎이 처지고 줄기의 지저부에 병징이 나타나기 시작한 경우, 2)잎이 마르고, 줄기의 병징이 진전되어 식물체의 60%가 시들은 경우, 3)식물체가 완전히 고사한 경우. 일당백 F2 집단에서는 병 저항성 지수 0을 저항성으로, 나머지 1, 2, 3을 이병성으로 분류했다. YT RIL 집단은 한 계통 당 10개체를 검정하여, 모든 개체에서 0이 나오는 계통은 고정된 저항성으로 모든 개체에서 3이 나오는 계통은 고정된 이병성으로, 여러 병 저항성 지수가 섞여 있는 계통은 분리하는 저항성 계통으로 분류했다.
염색체 5번 주동유전자좌 연관 SNP 분자표지 개발
염색체 5번 주동유전자좌와 연관된 분자표지를 개발하기 위하여 AC99 유전자 지도의 염색체 5번에 위치한 4개의 Intron-based 분자표지와 FA-COSII 유전자 지도의 염색체 5번에 위치한 8개의 COSII 분자표지를 이용하여 역병 저항성개체인 YCM334와 이병성 개체인 TEAN의 gDNA를 대조구로 사용하여 HRM 분석을 수행하여 다형성을 확인하였다.
YT RIL 집단을 사용하여 UC DAVIS의 pepper Affymetrix chip을 이용한 BSA-SFP(bulk segregation analysis-single feature polymorphism) 방법을 통해 새로운 분자표지의 개발을 시도했다. YT RIL 집단의 유전형이 저항성으로 고정된 20개체와 YCM334의 gDNA를 동비율로 섞어 저항성 벌크를 만들고, 유전형이 이병성으로 고정된 20개체와 TEAN의 gDNA를 동비율로 섞어 이병성 벌크를 만들었다. 각 벌크에 DNase를 처리하고 Affymetrix chip에 처리하여 유의성 있게 차이가 나는 EST 서열을 확보한 뒤 분자표지를 개발했다. 더 많은 분자표지를 개발하기 위하여 저항성 개체인 YCM334와 이병성 개체인 TEAN의 전사체(transcriptome)를 분석하였다. 분석된 전사체 데이터는 UC DAVIS 유전자 지도 상의 콘티그 염기서열을 참조(reference)로 BWA 프로그램(Li and Durbin, 2009, Bioinformatics 25:1754-1760)을 이용하여 쇼트 리드 맵핑(short reads mapping)을 수행했고, samtools 프로그램(Li et al., 2009, Bioinformatics 25:2078-2079)을 이용하여 SNP calling을 실시하였다.
연관 분석 및 유전자 지도 작성
개발된 분자표지는 일당백 F2 집단과 YT RIL 집단에서 공분리분석(co-segregation analysis)을 수행했다. 그 결과를 토대로 염색체 5번의 주동유전자좌와 연관된 유전자 지도를 작성하였다. 유전자 지도 작성은 CarthaGene software 1.0(Givry et al. 2004, Bioinformatics 21:1703-1704) 소프트웨어를 이용하였으며 Kosambi function을 이용하여 LOD 값은 5, 최대유전적 거리를 30cM 조건으로 유전적 거리 분석을 하였다. 또한 염색체 5번 주동유전자좌와 밀접하게 연관된 분자표지와 표현형과의 관계를 알아보기 위하여 WinQTL Cartographer v2.5(Wang et al., 2011, Department of statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC)을 이용한 CIM (composite interval mapping)을 수행하였다.
실시예 1. 역병 저항성의 표현형 조사 및 유전분석
염색체 5번의 주동유전자좌의 역할을 극대화하고자 상용품종 일당백의 자가 수분을 통해 작성한 일당백 F2 집단, YT RIL 집단에 낮은 접종 농도(3×104 유주자/ml)의 역병균을 접종하여 병 반응을 관찰하였다.
일당백 F2 집단에서 발아가 제대로 되지 않은 6 개체를 제외한 149 개체는 병 지수가 0으로(저항성), 45 개체는 병 지수가 1~3으로(이병성) 나타났다. 일당백 F2는 저항성 : 이병성 분리비가 3:1(X2=0.3367, P=0.5617)로 나타났다. YT RIL 집단에서는 총 143개체 중에서 여러 병 저항성 지수가 섞여있는 8개체를 제외한 65개체에서는 저항성이 고정되었고(병 지수 0), 70개체는 이병성이 고정되어(병 지수 3), 이들의 유전비율은 1:1(X2=0.1818, P=0.6698)로 나타났다. 두 집단 모두 표현형에서 단일 우성 저항성 유전자에 의해 분리되는 멘델의 분리비(Mendelian segregation)에 부합하는 결과를 얻을 수 있었다(도 1). 이러한 결과는 낮은 농도로 접종한 이 집단에는 역병 저항성이 단일 유전자에 의해 조절된다는 것을 의미한다. 두 집단은 염색체 5번의 단일유전자좌가 저항성에 기여하는 정도가 극대화된 집단으로 판단하여 이후의 분자표지 개발에 활용했다.
실시예 2. 염색체 5번의 주동유전자좌와 연관된 SNP 분자표지 개발
기존에 보고된 AC99 유전자 지도의 염색체 5번에 위치한 12개의 SNP 분자표지를 이용하여 저항성 개체인 YCM334와 이병성 개체 TEAN에서의 HRM 분석을 수행하여 다형성을 확인하였다. 이를 통해 4개의 Intron-based 분자표지인 IB1558, IB1556, IB809 및 IB1429에서 다형성을 확인하였다. 상기 4개의 분자표지를 이용해 일당백 F2 집단과 YT-RIL 집단에서 공분리분석(co-segregation analysis)를 수행했다 (표 2). 일당백 F2 집단에서는 IB1558은 162개체 중 32개체, IB1429는 176개체에서 77개, IB809는 176개체에서 65개체가 재조합형으로 분석되었다. YT RIL 집단에서는 128개체에 네 개의 분자표지가 분석되었다. 그 결과 IB1558에서 16개체, IB1556에서 17개체, IB809에서 53개체, IB1429에서는 50개체가 재조합형으로 분석되었다. 기존의 AC99 유전자지도에서 검정한 분자표지 가운데 IB1558이 일당백 F2 집단에서는 19cM, YT RIL집단에서는 12cM으로 염색체 5번에 있는 주동유전자와 가장 가깝게 연관되었다.
본 발명에 사용된 분자표지 이름 및 염기서열
분자표지 이름 염기서열 (5'-3')(서열번호)
IB1558 F TGGCTGAAACCAGGAGGTCT (1)
IB1558 R TACCGATCTGGATGCGTCAC (2)
PhytoSNP5 F GGCACAACAATAGTCACAACGG (3)
PhytoSNP5 R GAGACTAAGAAAGTTGGACGCC (4)
SAR8.2AS F CCATAGAGGTTCATATGGAA (5)
SAR8.2AS R AATCCTAAAAAAGAGTGCAT (6)
PhytoSNP5, SAR8.2AS, IB1558, IB1556, IB809 및 IB1429 분자표지의 일당백 F2 집단과 YT RIL 집단에서의 공분리 분석 결과
분자표지 재조합체수 /집단 크기
일당백 F 2 집단 YT RIL
PhytoSNP5 28/170 11/128
SAR8.2AS - 15/128
IB1558 32/162 16/128
IB1556 - 17/128
IB809 65/176 53/128
IB1429 77/176 50/128
주동유전자좌와 더 가까이 연관된 분자표지를 개발하기 위하여 마이크로어레이 칩 분석(microarray chip analysis)을 수행하였다. 저항성 벌크와 이병성 벌크에서 10개의 EST에서 유의미한 차이가 나타났고, BLAST 검색을 통해 주석화(annotation)했다. 그 결과 10개 중 8개는 고추의 유전정보가 아닌 난균, 곰팡이, 조류 등의 유전정보로 annotation 되었고, 단 2개의 CAPS_CONTIG.11101과 CAPS_CONTIG.3667 EST만이 고추의 유전정보로 annotation 되었다(표 3). 이 2개의 프로브는 각각 리셉터-유사 단백질 키나아제(receptor-like protein kinase)와 SAR8.2A 유전자 프로모터 영역과 높은 상동성(homology)을 보였는데, 모두 병 저항성과 연관이 있다는 연구 결과가 발표된 바 있다(Yi et al., 2010. New Phytol 701-715).
마이크로어레이 칩 분석 결과 저항성 및 이병성 벌크 사이에 유의미한 차이를 보이는 10개의 EST의 유전체 정보
EST Annotation 결과 유전체 기원
KS01002A01 Fungi rRNA 병원체
KS13044H11 Phytophthora rRNA intergenic spacer region 병원체
KS13069H05 Oomycetes and algae rRNA 병원체
KS13071A09 Oomycetes mitochondrion 병원체
KS13072H02 Oomycetes rRNA 병원체
KS13073A10 Oomycetes rRNA 병원체
CAPS_CONTIG.3688 Oomycetes rRNA 병원체
CAPS_CONTIG.3394 Phytophthora cytochrome oxidase subunit II (cosII) 병원체
CAPS_CONTIG.11101 Receptor-like protein kinase mRNA (C. annuum) 식물
CAPS_CONTIG.3667 SAR82A gene promoter region 식물
이 2개의 EST를 이용해 분자표지를 개발하기 위하여 고추의 전체 유전체 서열 DB에 BLAST 검색을 하여 상동성이 높은 고추 유전체 서열을 찾았다. CAPS_CONTIG.11101 EST로는 2개의 고추 유전체 서열인 CONTIG049087과 CONTIG000716을 찾았고, CAPS_CONTIG.3667로는 1개의 고추 유전체 서열인 CONTIG002466을 찾았다. 세 개의 콘티그를 통해 CONTIG049087에서 049087-1, 049087-2를, CONTIG00076에서 049087, CONTIG002466에서 002466인 총 4개의 SNP 분자표지를 개발했고, 저항성 개체 YCM334와 이병성 개체 TEAN간의 HRM분석을 수행하여 다형성을 확인하였다. 그 결과 CONTIG002466 염기서열에서 개발한 002466 분자표지만이 다형성을 나타내었다. 002466 분자표지를 일당백 F2 집단과 YT RIL 집단에서 공분리분석(co-segregation analysis)한 결과 F2 분리집단에서 170개체 중 28개, RIL 집단에서는 135개체 중 11개가 재조합형으로 분석되어 이 분자표지가 주동유전자에서 약 8cM 떨어진 곳에 위치하는 것을 알 수 있었다. 그 결과 이 분자표지는 AC99 유전자지도에 있던 어떤 분자표지들보다 가깝게 연관된 것을 확인했고, 이 분자표지의 이름은 “PhytoSNP5”로 명명하였다.
PhytoSNP5는 3가지 SAR8.2 상동체인 SAR8.2A, SAR8.2B 및 SAR8.2C의 공통적인 엑손의 염기서열에서 디자인했기 때문에, PhytoSNP5는 3개의 상동체를 모두 증폭할 가능성이 있다. 따라서 역병 저항성에 연관된 SAR8.2 상동체를 찾기 위한 실험을 수행했다. SAR8.2A와 SAR8.2B는 3'UTR이 상대적으로 길어 SAR8.2C와 구별할 수 있고, 또한 3'UTR에 SAR8.2B에 특이적인 삽입이 있어 SAR8.2A 및 SAR8.2B을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인할 수 있다(도 2). SAR8.2B를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 병 저항성 계통과 이병성 계통을 HRM 분석한 결과 저항성과 이병성 계통 사이의 다형성이 없어 SAR8.2B는 역병 저항성과 연관되지 않는다는 결론을 얻었다. 이와는 반대로 SAR8.2A 특이적인 프라이머 세트에서는 저항성과 이병성 사이의 다형성이 있어 SAR8.2AS로 명명했다(도 3). SAR8.2AS를 YT-RIL 집단에 적용한 결과 PhytoSNP5와는 다른 유전형을 보였고, 전체 집단 중 15개체가 재조합형으로 분석되었다(표 2).
마지막으로 YT RIL집단을 이용한 염색체 5번의 연관지도를 작성하기 위하여 더 많은 분자표지를 개발하기 위해 SNP calling을 실시하였다. 그 결과 염색체 5번에 위치한 20개의 기준(reference) 콘티그에서 저항성과 이병성 사이에서 유의성 있는 SNP를 확인할 수 있었다. 이 정보를 이용하여 총 30개의 분자표지를 개발하여 저항성 개체와 이병성 개체에서 HRM을 통한 다형성을 확인하였다. 그 결과 5개의 다형성 있는 분자표지 CONTIG9303, CONTIG1896, CONTIG5473, CONTIG6473 및 KS17054를 얻을 수 있었다(데이터 미제시).
실시예 3. 염색체 5번에서의 역병 저항성 주동유전자 위치 확인
3개의 방법을 통해 총 11개의 분자표지를 개발했고 이 분자표지를 포함한 연관지도작성을 작성하기 위해 YT RIL을 이용하여 공분리분석을 수행했다. 그 결과 YT RIL 집단에서 가장 적은 재조합형을 나타낸 PhytoSNP5 분자표지를 중심으로 상위(north direction)에 1개의 분자표지가 하위(south direction)에 8개의 분자표지가 위치했다(도 4). CIM(Composite interval mapping) 결과 또한 PhytoSNP5와 IB1558 분자표지 사이에서의 역병 저항성에 대한 LOD 스코어는 19.55 값을 나타내었고 PhytoSNP5와 IB1558 분자표지 interval의 역병 저항성에 대한 표현형적 변이(Phenotypic variation)는 49.3%의 범위에서 설명되었다(표 4). CIM(Composite interval mapping)을 통한 QTL 분석 결과 역시 PhytoSNP5 분자표지가 주동유전자에 매우 가까이 연관되었다는 것을 알 수 있다.
개발된 분자표지와 역병 저항성의 주동유전자좌의 CIM 결과
분자표지 interval CIM ( Composite interval mapping ) 결과
LOD Phenotypic variation
PhytoSNP5-IB1558 19.55 49.3
IB1558-IB1556 11.98 23.9
IB1556-CONTIG1896 12.5 23.7
CONTIG1896-CONTIG5473 6.52 16.29
실시예 4. PhytoSNP5 분자표지의 유용성 확인
염색체 5번 major QTL과 가깝게 연관된 분자표지인 IB1558 및 PhytoSNP5가 육종 계통에서도 활용가능한지 알아보기 위하여 3개 육종회사 신젠타종묘, 농우바이오, 사카타코리아에서 시판중인 역병 저항성 34품종 및 이병성 19품종으로 총 53품종을 수집하여 2개의 분자표지로 검정했다. IB1558 분자표지로는 53품종 중 6품종이 재조합형으로, PhytoSNP5 분자표지로는 53품종 가운데 2품종이 재조합형으로 나타났다. PhytoSNP5 분자표지로 확인한 재조합형 2개는 모두 이병성 품종에서만 확인되었고, 저항성 품종에서는 단 하나의 재조합형도 확인되지 않았다. 반면 IB1558은 저항성 2 품종과 이병성 4 품종에서 모두 재조합형이 확인되었다(표 5).
PyhtoSNP5와 IB1558 분자표지를 이용한 상업품종 유전형 분석 결과
번호 품종명 회사명 병 저항성 유전형
SNP -002466 IB1558
1 군계일학 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
2 금빛 신젠타종묘 바이러스 S S
3 금향 신젠타종묘 바이러스 S S
4 기립박수 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
5 대장부 신젠타종묘 바이러스 S S
6 독야청청 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
7 만사형통 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
8 무한질주 신젠타종묘 역병,바이러스,청고병 H H
9 박장대소 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
10 불맛 신젠타종묘 바이러스 S S
11 선구자 신젠타종묘 역병 H H
12 일등공신 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
13 일송정 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
14 일인자 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
15 천년만년 신젠타종묘 역병,바이러스 H H
16 축제 신젠타종묘 바이러스 S S
17 한손 신젠타종묘 바이러스 S S
18 행운 신젠타종묘 바이러스 S S
19 강력태양 농우바이오 바이러스(TMV-P3,CMV-fny) S -
20 당찬 농우바이오 바이러스(TMV-P4,CMV-fny) S H
21 마니따 농우바이오 바이러스(TMV-P6,CMV-fny) S S
22 배로따 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
23 슈퍼마니따 농우바이오 바이러스(CMV-fny) S H
24 영양맛 농우바이오 바이러스(CMV-fny) H S
25 오복 농우바이오 바이러스(CMV-fny) S S
26 조생辛탑 농우바이오 역병 H S
27 진미 농우바이오 바이러스(TMV-P3,CMV-fny) S S
28 탄탄대목 농우바이오 역병 H H
29 태산 농우바이오 역병, H S
30 참마니 농우바이오 바이러스(TMV-Po) S H
31 참조은 농우바이오 바이러스(CMV-fny) S S
32 한반도 농우바이오 바이러스(TMV-Po) S S
33 한판승 농우바이오 역병 R R
34 홍미인 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
35 홍진주 농우바이오 바이러스(CMV-fny) S S
36 희망봉 농우바이오 바이러스(CMV-fny) H H
37 PR금맥 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
38 PR대촌 농우바이오 역병 H H
39 PR마니따 농우바이오 역병 H H
40 PR만세 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
41 PR상생 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
42 PR썬 농우바이오 역병 H R
43 PR신나라 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
44 PR어울림 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
45 PR열정 농우바이오 역병,바이러스(CMV-fny) H H
46 PR파워 농우바이오 역병 H H
47 독불왕 사카타코리아 역병 H H
48 불세출 사카타코리아 역병,바이러스 H H
49 미팅(대목) 사카타코리아 역병,청고병,바이러스(TMV-L1) H H
50 수비역 사카타코리아 역병 H H
51 신세계 사카타코리아 역병,바이러스 H H
52 안전벨트 사카타코리아 역병,바이러스 H H
53 카타구루마 사카타코리아 역병,바이러스(TMV) H H
시판 품종을 분석한 결과를 통해 IB1558 보다 PhytoSNP5가 역병 저항성을 선발하는 정확도가 높은 것을 확인할 수 있었다. PhytoSNP5 분자표지가 저항성 계통 선발에 정확성이 있는지 알아보기 위하여 두 개의 종묘회사의 역병 저항성 육성계통에 대한 맹검시험(Blind test)를 진행하였다. A회사의 34개 육성계통에 대해 적용한 결과 PhytoSNP5는 완벽하게 공분리되었고, B회사의 경우에는 576개체의 분리집단에서 60개의 재조합형이 나타나 90% 개체의 역병 저항성을 선별했다(표 6). 상업품종 검정 결과와 역병저항성 육성 계통를 분석한 결과 PhytoSNP5가 역병 저항성 검정에 매우 효율적인 분자표지임을 검증했다.
PhytoSNP5을 이용한 종묘회사의 역병 저항성 육종계통에 대한 분자표지 유효성 맹검시험 (R:저항성 동형접합유전형, H:이형접합유전형, S:이병성 동형접합유전형)
육종회사 표현형 개체수 유전형
R H S
A 회사 저항성 34 23 11 0
감수성 0 0 0 0
재조합체수 /
총 개체수 (정확도)		 0/34 (100%)
B 회사 저항성 507 223 263 21
감수성 69 4 35 30
재조합체수 /
총 개체수 (정확도)		 60/576 (89.5%)
실시예 5. PhytoSNP5 분자표지의 다양한 역병 저항성 계통에의 적용
육종가는 역병 저항성 육종을 하기 위하여 CM334, AC2258, PI201234 등 다양한 유전자원을 사용하기 때문에, 연관 분자표지 역시 다양한 병 저항성 유전자원에 적용되어야 어떠한 역병 저항성 육종 프로그램에도 활용 가능하다. 서로 다른 유전자원에서의 다형성을 검정하기 위하여 저항성 계통으로는 YCM334, CM334, AC2258 및 PI201234를, 이병성 계통으로는 TEAN과 Chilsung을 선발하여 PhytoSNP5 분자표지를 이용하여 HRM 분석을 수행했다. TEAN과 Chilsung은 같은 해리 곡선을 보여 하나의 그룹으로 모였고, 다른 병 저항성 계통인 YCM334, CM334, AC2258 및 PI201234는 서로 다른 해리 곡선을 보였다(도 5). 3 종류의 병 저항성 계통이 서로 다른 해리 곡선을 보였고, 이병성 해리 곡선과 구별되므로 다양한 역병 저항성 유전자원을 사용한 육종 프로그램에 PhytoSNP5는 폭넓게 적용될 수 있을 것으로 기대한다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Specific primer for selecting Phytophthora blight resistant pepper and uses thereof <130> PN12148 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tggctgaaac caggaggtct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taccgatctg gatgcgtcac 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggcacaacaa tagtcacaac gg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagactaaga aagttggacg cc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccatagaggt tcatatggaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aatcctaaaa aagagtgcat 20

Claims (9)

  1. 서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 키트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  7. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 역병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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CN108243942A (zh) * 2017-12-18 2018-07-06 北京市农林科学院 辣椒cms三系杂交砧木的选育方法
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