CN108243942B - 辣椒cms三系杂交砧木的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了辣椒CMS三系杂交砧木的选育方法。本发明提供了辣椒CMS三系杂交砧木的选育方法，包括如下步骤：以甜椒雄性不育系2016‑99A为不育系，甜椒保持系2016‑99B为保持系，辣椒恢复系2016‑99C为恢复系，进行三系配套选育，得到抗辣椒疫病、抗青枯病、抗南方根结线虫的砧木品种，实现辣椒CMS三系杂交砧木的选育。本发明的实验证明，利用辣椒CMS雄性不育“三系”配套配制的杂交一代种子格拉夫特2号，不仅可以简化制种程序、降低制种成本，而且可以提高种子纯度，具有明显的优越性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辣椒CMS三系杂交砧木(兼抗辣椒疫病、南方根结线虫和青枯病)的选育方法。
背景技术
辣椒疫病是由疫霉菌Phytophthora capsici引起的一种真菌性土传病害。在病原菌适宜生长的环境下，疫霉菌可以对热带及亚热带地区辣椒造成高达100％的产量损失(Liu et al.2014)。辣椒材料CM334和PI 201234被证实对不同地区分离的许多疫霉菌表现出稳定的抗性(Bartual et al.1991；Oelke et al.2003；Truong et al., 2012)。Rehrig等(2014)以抗辣椒疫病材料CM334为抗源，构建了三个不同的遗传定位群体，结果在5号染色体定位到两个SNP标记CA_011264和CA_004482与疫病抗性有很强的相关性(R2＝42-49.4％)，并且这两个标记的基因型在CM334和包括PI 201234 在内的其他抗辣椒疫病材料中是保守的，推测标记CA_011264所在的高丝氨酸激酶 -CaDMR1-为疫病主效QTL的候选基因。Liu等(2014)利用一个低毒性的疫霉菌为接种病原物，发现5号染色体一个编码NBS-LRR基因上的标记Phyto5NBS1与抗性表型有 90％的一致性。根据标记CA_011264和Phyto5NBS1所在基因的序列在辣椒参考基因组 (http://peppersequence.genomics.cn/)上进行比对，发现两标记在5号染色体相聚非常近，物理距离为2.82Mb。
根结线虫(Meloidogyne spp.)是辣椒的主要病虫害之一,它广泛分布于世界各地，温带、亚热带和热带地区受害尤其严重。国际上报道的根结线虫有80多种，其中最常见的种有南方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫及北方根结线虫，其中南方根结线虫的危害最大。1957年，Hare首次报道了辣椒对南方根结线虫的抗性是由显性单基因控制的，并将他发现的第一个抗根结线虫的基因命名为N，该基因抗南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫。甜椒材料Charleston Belle对南方根结线虫表现出稳定的抗性，该材料携带纯和的抗病N基因(Fery et al.1998)。
目前大量应用的辣椒杂交种均是人工去雄、授粉，由于辣椒花器官小，人工去雄授粉的方法存在费时费工、制种成本高、杂交率不稳定等缺点。利用辣椒CMS雄性不育“三系”配套配制的杂交一代种子，不仅可以简化制种程序、降低制种成本，而且可以提高种子纯度，具有明显的优越性。辣椒CMS雄性不育遗传模式认为雄性不育性是核基因与细胞质共同作用的结果，只有不育的细胞质(S)与不育的核基因(msms) 结合在一起才表现不育。植株若含有可育的细胞质(N)或可育的核基因(Ms)则表现可育，Ms对ms为显性。不育系的基因型为(S)msms，保持系为(N)msms，恢复系的基因型为(S)MsMs或(N)MsMs。
发明内容
本发明一个目的是提供一种辣椒CMS三系杂交砧木的选育方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：以甜椒雄性不育系2016-99A为不育系，甜椒保持系2016-99B为保持系，辣椒恢复系2016-99C为恢复系，进行三系配套选育，得到抗辣椒疫病、抗青枯病、抗南方根结线虫的砧木品种，实现辣椒CMS三系杂交砧木的选育。
上述方法中，
所述辣椒恢复系2016-99C按照包括如下步骤的方法转育：
a)以辣椒CM334作母本，恢复系受体亲本辣椒N1508作父本，杂交，得到F1代群体；
b)以a)得到的所述F1代群体单株为母本，与所述恢复系受体亲本辣椒N1508 进行4次回交，且每次回交产物进行抗辣椒疫病基因型检测和标记背景选择，分别从第1-3次回交产物中选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为下一次回交的亲本，从第4次回交产物中选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC4单株；
c)将所述中选BC4单株自交2次，且每次自交产物进行抗辣椒疫病抗性鉴定、所述抗辣椒疫病基因型检测和辣椒青枯病抗性鉴定，分别从第1-2次自交产物中选取抗辣椒疫病、抗青枯病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株作为下一次自交的亲本，从第2次自交产物中选取抗辣椒疫病、抗青枯病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株进行第3次自交，得到辣椒恢复系2016-99C。
上述方法中，
所述抗辣椒疫病基因型检测的方法为用标记CA_011264对应的引物和标记Phyto5NBS1对应的引物分别对待测单株的基因组DNA进行KASP检测，所述标记 CA_011264检测基因型为AA或AG或GG,所述Phyto5NBS1检测基因型为CC或CT或TT, 若所述标记CA_011264检测的基因型是AG，且所述标记Phyto5NBS1检测的基因型为 CT，则所述待测植株为杂合抗辣椒疫病基因型的单株；若所述CA_011264检测的基因型是AA，且所述标记Phyto5NBS1检测的基因型为CC，则所述待测植株为纯合抗辣椒疫病基因型的单株；其他基因型排除。
标记CA_011264检测基因型为AA为序列159第50位的基因型为TT；
标记CA_011264检测基因型为AG为序列159第50位的基因型为T/C
标记CA_011264检测基因型为GG为序列159第50位的基因型为CC
序列159：
CCGTTGGGTAGTGGACTTGGGTCTAGTGCTGCTAGTGCTGCTGCGGCTG[T/C]CGTGGCGGTGAATGAGATTT TTGGTAGGAAATTGAGTGTTGATCAGCTTGT
标记Phyto5NBS1检测基因型为CC为序列160第43位的基因型为GG；
标记Phyto5NBS1检测基因型为CT为序列160第43位的基因型为G/A；
标记Phyto5NBS1检测基因型为TT为序列160第43位的基因型为AA.
序列160：
TTGATAGCCCCTGGTAAAGAATGCAATATAGAGCTTCTGCTG[G/A]AATTATTCTGGCAAACCAGACAGTTGT CACCACTATAAGTTTGCCC
和/或，所述标记背景选择的方法包括如下步骤：
先用多个筛选标记对应的引物对对所述待测植株、其对应的供体亲本和受体亲本的基因组DNA进行PCR扩增，选取该待测植株扩增产物中带型仅与受体亲本相同且与供体亲本不同的引物对对应的标记，记作受体亲本带型的分子标记；将多个筛选标记记作所参与分析的分子标记；
再计算待测植株分子标记的遗传背景回复率，公式如下：G(g)＝[L+X(g)]/(2L)；其中，g指回交世代数，G(g)指在g代的遗传背景回复率；X(g)指在回交g代的待测植株的受体亲本带型的分子标记数量；L指所参与分析的分子标记数量；
再选取所有待测植株中分子标记的遗传背景回复率最高的10株为目标植株。
上述方法中，
所述CA_011264标记对应的引物由序列1所示的引物、序列2所示的引物和序列 3所示的引物组成；所述标记Phyto5NBS1对应的引物由序列4所示的引物、序列5所示的引物和序列6所示的引物组成。
上述方法中，
所述辣椒恢复系2016-99C转育中的多个筛选标记及其对应的引物对如下：
标记1593985，对应的引物对由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成；
200077523，对应的引物对由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成；
266029224，对应的引物对由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；
51404476，对应的引物对由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；
130877292，对应的引物对由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；
220908123，对应的引物对由序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子组成；
250470863，对应的引物对由序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子组成；
23028330，对应的引物对由序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子组成；
121754965，对应的引物对由序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子组成；
140543222，对应的引物对由序列25所示的单链DNA分子和序列26所示的单链DNA分子组成；
142287175，对应的引物对由序列27所示的单链DNA分子和序列28所示的单链DNA分子组成；
61166842，对应的引物对由序列29所示的单链DNA分子和序列0所示的单链DNA分子组成；
140111523，对应的引物对由序列31所示的单链DNA分子和序列32所示的单链DNA分子组成；
221317860，对应的引物对由序列33所示的单链DNA分子和序列34所示的单链DNA分子组成；
120217416，对应的引物对由序列35所示的单链DNA分子和序列36所示的单链DNA分子组成；
160338879，对应的引物对由序列37所示的单链DNA分子和序列38所示的单链DNA分子组成；
867375，对应的引物对由序列39所示的单链DNA分子和序列40所示的单链DNA分子组成；
31526898，对应的引物对由序列41所示的单链DNA分子和序列42所示的单链DNA分子组成；
127310066，对应的引物对由序列43所示的单链DNA分子和序列44所示的单链DNA分子组成；
250256837，对应的引物对由序列45所示的单链DNA分子和序列46所示的单链DNA分子组成；
22384316，对应的引物对由序列47所示的单链DNA分子和序列48所示的单链DNA分子组成；
91744100，对应的引物对由序列49所示的单链DNA分子和序列50所示的单链DNA分子组成；
140748909，对应的引物对由序列51所示的单链DNA分子和序列52所示的单链DNA分子组成；
239579046，对应的引物对由序列53所示的单链DNA分子和序列54所示的单链DNA分子组成；
30159980，对应的引物对由序列55所示的单链DNA分子和序列56所示的单链DNA分子组成；
180144914，对应的引物对由序列57所示的单链DNA分子和序列58所示的单链DNA分子组成；
200516195，对应的引物对由序列59所示的单链DNA分子和序列60所示的单链DNA分子组成；
220424570，对应的引物对由序列61所示的单链DNA分子和序列62所示的单链DNA分子组成；
440172，对应的引物对由序列63所示的单链DNA分子和序列64所示的单链DNA分子组成；
10370491，对应的引物对由序列65所示的单链DNA分子和序列66所示的单链DNA分子组成；
132135721，对应的引物对由序列67所示的单链DNA分子和序列68所示的单链DNA分子组成；
171268339，对应的引物对由序列69所示的单链DNA分子和序列70所示的单链DNA分子组成；
222783681，对应的引物对由序列71所示的单链DNA分子和序列72所示的单链DNA分子组成；
130633，对应的引物对由序列73所示的单链DNA分子和序列74所示的单链DNA分子组成；
30174286，对应的引物对由序列75所示的单链DNA分子和序列76所示的单链DNA分子组成；
69139981，对应的引物对由序列77所示的单链DNA分子和序列78所示的单链DNA分子组成；
200217991，对应的引物对由序列79所示的单链DNA分子和序列80所示的单链DNA分子组成；
181780249，对应的引物对由序列81所示的单链DNA分子和序列82所示的单链DNA分子组成；
229391206，对应的引物对由序列83所示的单链DNA分子和序列84所示的单链DNA分子组成；
270094271对应的引物对由序列85所示的单链DNA分子和序列86所示的单链DNA分子组成。
上述方法中，
所述甜椒雄性不育系2016-99A按照包括如下步骤的方法转育：
1)以甜椒胞质雄性不育系09-313A为母本，保持系亲本甜椒材料CharlestonBelle 为父本，杂交，得到F1代群体；
2)将所述F1代群体单株与受体亲本所述甜椒材料Charleston Belle进行6次回交，且除第一次回交外，每次回交产物进行所述标记背景选择，分别从第2-5次回交产物中选取遗传背景回复率最高的10个单株作为下一次回交的供体亲本，从第6次回交产物即为甜椒雄性不育系2016-99A。
上述方法中，
所述辣椒恢复系2016-99C转育中的多个筛选标记及其对应的引物对如下：
1593985，对应的引物对由序列87所示的单链DNA分子和序列88所示的单链DNA 分子组成；
60468681，对应的引物对由序列89所示的单链DNA分子和序列90所示的单链DNA分子组成；
266029224，对应的引物对由序列91所示的单链DNA分子和序列92所示的单链 DNA分子组成；
51404476，对应的引物对由序列93所示的单链DNA分子和序列94所示的单链DNA分子组成；
95383212，对应的引物对由序列95所示的单链DNA分子和序列96所示的单链DNA分子组成；
220908123，对应的引物对由序列97所示的单链DNA分子和序列98所示的单链 DNA分子组成；
23028330，对应的引物对由序列99所示的单链DNA分子和序列100所示的单链 DNA分子组成；
135384459，对应的引物对由序列101所示的单链DNA分子和序列102所示的单链DNA分子组成；
61166842，对应的引物对由序列103所示的单链DNA分子和序列104所示的单链DNA分子组成；
140111523，对应的引物对由序列105所示的单链DNA分子和序列106所示的单链DNA分子组成；
221317860，对应的引物对由序列107所示的单链DNA分子和序列108所示的单链DNA分子组成；
110046784，对应的引物对由序列109所示的单链DNA分子和序列110所示的单链DNA分子组成；
120217416，对应的引物对由序列111所示的单链DNA分子和序列112所示的单链DNA分子组成；
160338879，对应的引物对由序列113所示的单链DNA分子和序列114所示的单链DNA分子组成；
867375，对应的引物对由序列115所示的单链DNA分子和序列116所示的单链DNA分子组成；
173124821，对应的引物对由序列117所示的单链DNA分子和序列118所示的单链DNA分子组成；
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140748909，对应的引物对由序列125所示的单链DNA分子和序列126所示的单链DNA分子组成；
230556909对应的引物对由序列127所示的单链DNA分子和序列128所示的单链DNA分子组成；
30159980，对应的引物对由序列129所示的单链DNA分子和序列130所示的单链DNA分子组成；
194455352，对应的引物对由序列131所示的单链DNA分子和序列132所示的单链DNA分子组成；
220424570，对应的引物对由序列133所示的单链DNA分子和序列134所示的单链DNA分子组成；
3445950，对应的引物对由序列135所示的单链DNA分子和序列136所示的单链 DNA分子组成；
60294885，对应的引物对由序列137所示的单链DNA分子和序列138所示的单链DNA分子组成；
110018496，对应的引物对由序列139所示的单链DNA分子和序列140所示的单链DNA分子组成；
180711669，对应的引物对由序列141所示的单链DNA分子和序列142所示的单链DNA分子组成；
69139981，对应的引物对由序列143所示的单链DNA分子和序列144所示的单链DNA分子组成；
160731790，对应的引物对由序列145所示的单链DNA分子和序列146所示的单链DNA分子组成；
194117420，对应的引物对由序列147所示的单链DNA分子和序列148所示的单链DNA分子组成；
233046411，对应的引物对由序列149所示的单链DNA分子和序列150所示的单链DNA分子组成；
229391206，对应的引物对由序列151所示的单链DNA分子和序列152所示的单链DNA分子组成；
3075317，对应的引物对由序列153所示的单链DNA分子和序列154所示的单链 DNA分子组成；
120139731，对应的引物对由序列155所示的单链DNA分子和序列156所示的单链DNA分子组成；
270094271，对应的引物对由序列157所示的单链DNA分子和序列158所示的单链DNA分子组成。
上述方法中，
所述甜椒保持系2016-99B为甜椒材料Charleston Belle自交7代，得到的产物。
上述中辣椒恢复系2016-99C的制备方法也是本发明保护的范围；
上述中甜椒雄性不育系2016-99A的制备方法也是本发明保护的范围。
上述甜椒雄性不育系2016-99A、甜椒保持系2016-99B和辣椒恢复系2016-99C在三系配套制种中的应用也是本发明保护的范围；
或上述甜椒雄性不育系2016-99A、甜椒保持系2016-99B和辣椒恢复系2016-99C在三系配套获得抗辣椒疫病、抗南方根结线虫和/或抗青枯病的砧木品种中的应用也是本发明保护的范围；
或上述方法得到的所述砧木品种在培育抗辣椒疫病、抗青枯病和/或抗南方根结线虫嫁接苗中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，利用辣椒CMS雄性不育“三系”配套配制的杂交一代种子格拉夫特2号，不仅可以简化制种程序、降低制种成本，而且可以提高种子纯度，具有明显的优越性。以格拉夫特2号为砧木的嫁接苗，田间表现为兼抗疫病、青枯病和南方根结线虫，避免了辣椒种植过程中受以上三种土传病害的危害，减少了防病、治病农药的使用量，降低辣椒种植成本，提高了经济效益。同时，格拉夫特2号是由雄性不育“三系”配套配制的杂交一代种子，制种手续简单、成本低廉，可以确保一代杂种的纯度。
附图说明
图1为2016-99A选育路线图。
图2为2016-99C选育路线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用辣椒(Capsicum annuum)CM334为高抗辣椒疫病，引种于美国种质资源库。
灯笼形甜椒(Capsicum annuum)09-313A已于2011年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5325。灯笼形甜椒(Capsicumannuum)09-313A CGMCC No.5325简称灯笼形甜椒09-313A，植株开花后无正常花粉，不育性达100％，为胞质雄性不育系。
辣椒(Capsicum annuum)N1508为抗青枯病材料，已于2017年1月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.13597。辣椒(Capsicum annuum)N1508和灯笼形甜椒(Capsicum annuum)09-313A杂交，F1 代的育性恢复度达100％，证明辣椒(Capsicum annuum)N1508可以作为恢复系。
Charleston Belle(记载在如下文献中：Fery RL,Dukes PD,Sr,Thies JA.‘Carolina Wonder’and‘Charleston Belle’:Southern root-knot nematode resistantbell peppers.HortScience.1998；33:900–902.)是一份被证实抗南方根结线虫的甜椒材料。甜椒材料Charleston Belle与灯笼形甜椒(Capsicum annuum) 09-313A进行杂交，获得F1代植株为100％雄性不育，所以Charleston Belle可以作为保持系。
下述实施例中所使用的实验方法具体如下：
一、抗辣椒疫病分子标记辅助筛选、标记背景选择和抗病性鉴定时材料种植方法
将种子浸于4％的次氯酸钠溶液中消毒3～5min中，灭菌水冲洗3～4次；55℃浸种5min。将消毒后的种子用湿润的纱布包裹，放入培养皿中，在25℃培养箱中暗培养7～10d，待大部分种子露白时，立即播种于草炭、蛭石体积比为2:1的72孔穴盘中，置于28℃，光照为14h的培养室中管理。待植株长至4叶展开，取一片新叶利用CTAB法提取DNA，进行抗辣椒疫病分子标记检测。
对中选的植株如有需要再进行后续的青枯病或疫病抗病性评价。
二、辣椒南方根结线虫抗性接种鉴定方法
试验所用南方根结线虫来源于中国农业大学植病系。用感病番茄品种农大1号(张维，方源，沈火林.辣椒抗南方根结线虫基因的定位及标记辅助选择.中国农业大学学报，2012，17(2)：102-107)进行繁殖。接种前，从感病番茄根部挑取卵块，并将其置于28℃培养箱中，使其孵化成二龄幼虫。辣椒植株定植后1周(4～5片叶时)进行接种，以感病材料茄门为对照。在植株根附近插2个深2cm左右的小孔,将南方根结线虫二龄幼虫悬浮液接于孔中，每株3000条幼虫。接种6周后进行抗性鉴定。统计每株根结数及卵块数，分级标准为：0级为无根结或卵块；1级为1～2个根结或卵块； 2级为3～10个根结或卵块；3级为11～30个根结或卵块；4级为31～100个根结或卵块；5级为100个以上根结或卵块。级数小于或等于2为抗病，大于2为感病。
三、辣椒青枯病抗性鉴定方法
本试验所用青枯菌Rs-SY1(记载在如下文献中：Du,H.S.,Chen,B.,Zhang,X.F.,Zhang,F. L.,Miller,S.A.,Rajashekara,G.,Xu,X.L.,and Geng,S.S.2017.Evaluationof Ralstonia solanacearum infection dynamics in resistant and susceptiblepepper lines using bioluminescence imaging.Plant Dis.101:1-7.) 分离自海南三亚辣椒病株,纯化鉴定后的青枯菌Rs-SY1保存于常温下。青枯病接种及抗性评价方法参照(Evaluation of Ralstonia solanacearum infection dynamics in resistant andsusceptible pepper lines using bioluminescence imaging.Plant Dis.101:1-7.)，具体如下：将保存于常温下青枯菌Rs-SY1用接种环涂于TZC培养基， 28℃培养2～3d，挑取单菌落涂于NA培养基中进行扩繁，用无菌水悬浮菌体并稀释成2×108CFU/ml的菌液。将长至4-6叶的辣椒幼苗从穴盘中轻轻拔出，自来水冲净根部后，将根部浸于制备好的菌液中20min，然后定植于8cm(高度)×10cm(直径) 营养钵内，置于28℃，光照为14h的培养室中管理。在接种后30d记录植株的病害严重度,以感病材料茄门作为对照。青枯病病害级别分为5级：0级＝无症状；1级＝轻微萎蔫；2级＝中度萎蔫；3级＝严重萎蔫；4级＝植株死亡。根据每个植株的病害严重度计算病害指数(DSI)。DSI＝∑(病害级别×各病害级别的植株数)/调查总植株数。当DSI<2为抗病(R)，当DSI≧2为感病。
四、辣椒疫病抗性鉴定方法
采用的病原菌为辣椒疫霉菌Phytophthora capsici L.(记载在如下文献中：张晓芬，韩华丽，陈斌，耿三省，耿丽华.甜椒育种材料N1345的疫病抗性遗传分析.植物遗传资源学报,2011,12(5):816-819.)。辣椒疫病接种及抗病性评价方法参照中华人民共和国农业部2011年发布的辣椒抗辣椒疫病鉴定技术规程(NY/T 2060.1-2011)，具体如下：待辣椒幼苗长至4片真叶时，采用灌根法向根系周围基质中灌入3ml浓度为2x 103孢子/ml的辣椒疫霉菌Phytophthora capsici L.菌液，接种后7天调查病情。以茄门作为感病对照。依据鉴定材料3次重复的病情指数(DI) 平均值确定其抗性水平。当DI＝0为免疫；0<DI≦10为高抗；10<DI≦30为抗病；30< DI≦50为中抗；50<DI≦70为感病；DI＞70为高感。
五、抗辣椒疫病基因型检测
1)抗辣椒疫病分子标记
根据Rehrig等(2014)发表的与辣椒疫病抗病候选基因CaDMR1紧密连锁SNP位点CA_011264的侧翼序列，以及Liu等(2014)公布的辣椒疫病连锁标记Phyto5NBS1 的序列信息，分别设计KASP引物并在5'端添加接头(表2)，得到标记CA_011264和标记Phyto5NBS1，在抗病材料CM334和感病材料Early Jalapeno上检测基因型分别为A和G，标记Phyto5NBS1在抗病材料YCM334和感病材料Tean上检测基因型分别为 C和T。引物序列在北京三博远志生物技术有限责任公司合成。利用北京市农林科学院蔬菜研究中心的KASP技术对待检测样品进行抗辣椒疫病分子标记辅助筛选，筛选出抗病基因型的植株，淘汰感病基因型的植株。
2)抗辣椒疫病基因型检测的方法
提取待检测植株的DNA作为模板，分别用CA_011264标记和标记Phyto5NBS1进行扩增，所用的仪器为Hydrocycler水浴PCR热循环仪；利用Pherastar SNP分型检测仪确定扩增产物的基因型。
上述扩增体系如下表1：
表1为扩增体系
| 体积 | 终浓度 | |
| DNA样品(20ng/ul) | 3uL | 9.93ng/uL |
| 引物A1序列(10uM) | 1/72uL | 0.023uM |
| 引物A2序列(10uM) | 1/72uL | 0.023uM |
| 引物C序列(10uM) | 1/72uL | 0.023uM |
| KASP 2x Master Mix | 3uL | - |
| 总体积 | 6.04uL |
上述扩增的程序为如下：
page1：94℃15min
page2：94℃20s，61-55℃1min,10cycles
page3：94℃20s，55℃1min，27cycles
标记CA_011264检测基因型为AA或AG或GG,Phyto5NBS1检测基因型为CC或CT 或T；若CA_011264检测的基因型是AG，且标记Phyto5NBS1检测的基因型为CT，则待测植株为杂合抗辣椒疫病基因型的单株；若CA_011264检测的基因型是AA，且标记 Phyto5NBS1检测的基因型为CC，则待测植株为纯合抗辣椒疫病基因型的单株。其他基因型排除。
表2辣椒抗辣椒疫病连锁标记
注：下划线为引物接头序列。
五、标记背景选择
1)标记背景开发
利用辣椒(Capsicum annuum)N1508的基因组重测序数据与文献公开的辣椒(Capsicum annuum L.)CM334基因组数据进行比对，开发InDel标记，筛选在辣椒(Capsicum annuum L.)N1508和辣椒(Capsicum annuum L.)CM334之间具有多态性且分布于12条染色体的40个标记的引物作为辣椒(Capsicum annuum)2016-99C选育背景选择引物，具体序列如表3所示：
表3辣椒(Capsicum annuum)2016-99C选育背景选择引物及扩增片段大小
利用辣椒(Capsicum annuum)N1508的基因组重测序数据与文献公开的辣椒(Capsicum annuum L.)CM334基因组数据进行比对，开发InDel标记，筛选在灯笼形甜椒(Capsicum annuum)09-313A和甜椒材料Charleston Belle之间具有多态性且分布于12条染色体的36个标记的引物作为甜椒(Capsicum annuum)2016-99A选育背景选择标记，具体序列如表4。
表4为辣椒(Capsicum annuum)2016-99A选育背景选择引物及扩增片段大小
2)标记背景选择
(1)2016-99C选育中，对亲本CM334、N1508和待检测植株的基因组DNA用表3所示的40对引物进行PCR扩增，选取待检测植株中40对引物扩增产物带型含有受体亲本 N1508带型且不含有供体亲本CM334带型所用引物对对应的标记，记作受体亲本带型的分子标记；将40对引物对应的标记，记作所参与分析的分子标记数量。
计算所有待检测植株分子标记的遗传背景回复率，公式如下：G(g) ＝[L+X(g)]/(2L)；其中，g指回交世代数，G(g)指在g代的遗传背景回复率；X(g) 指在回交g代的待测植株的受体亲本带型的分子标记数量；L指所参与分析的分子标记数量(2016-99C选育中数量为40对)；
选取所有待检测植株分子标记的遗传背景回复率最高的10株为目标植株。
(2)2016-99A选育中，对亲本09-313A、Charleston Belle和待检测植株的基因组DNA用表4所示的36对引物进行PCR扩增，选取待检测植株中36对引物扩增产物带型含有受体亲本Charleston Belle带型且不含有供体亲本09-313A带型所用引物对对应的标记，记作受体亲本带型的分子标记；将36对引物对应的标记，记作所参与分析的分子标记数量。
计算所有待检测植株分子标记的遗传背景回复率，公式如下：G(g) ＝[L+X(g)]/(2L)；其中，g指回交世代数，G(g)指在g代的遗传背景回复率；X(g) 指在回交g代的待测植株的受体亲本带型的分子标记数量；L指所参与分析的分子标记数量(2016-99A选育中数量为36对)；
选取所有待检测植株分子标记的遗传背景回复率最高的10株为目标植株。
实施例1、辣椒CMS三系杂交砧木的选育方法
一、辣椒恢复系2016-99C的选育流程
图2为2016-99C选育路线图。
1、杂交F1代群体
2013年夏，在北京市农林科学院四季青农场将抗辣椒疫病供体亲本辣椒(Capsicum annuum L.)CM334和抗青枯病、恢复系受体亲本辣椒(Capsicum annuum L.)N1508 进行杂交，获得F1代群体，有100粒以上种子。
2、回交获得BC1代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC1代分离群体
2013年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地将F1代继续与受体亲本辣椒(Capsicum annuum L.)N1508回交，获得BC1代分离群体，有1000粒以上种子。
2)筛选中选单株
2014年夏，在北京市农林科学院四季青农场对250株BC1代分离群体取样提取DNA后，先进行抗辣椒疫病基因型检测，挑选BC1代群体中具有杂合抗辣椒疫病基因型的单株，再将这些单株进行标记背景选择，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC1 单株。
3、回交获得BC2代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC2代分离群体
将中选的10株BC1单株与受体亲本辣椒(Capsicum annuum L.)N1508回交，获得BC2代分离群体。
2)筛选中选单株
2014年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地对250株BC2代分离群体取样提取DNA后，先进行抗辣椒疫病基因型检测，挑选BC2代群体中具有杂合抗辣椒疫病基因型的单株，再将这些单株进行标记背景选择中，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC2单株。
4、回交获得BC3代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC3代分离群体
10株中选BC2单株继续与受体亲本辣椒(Capsicum annuum L.)N1508回交，获得BC3代抗病分离群体。
2)筛选中选单株
2015年夏，在北京市农林科学院四季青农场对BC3代分离群体取样提取DNA后，先进行抗辣椒疫病基因型检测，挑选BC3代群体中具有杂合抗辣椒疫病基因型的单株，再将这些单株进行标记背景选择中，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC3单株。
5、回交获得BC4代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC4代分离群体
10株中选BC3单株继续与受体亲本辣椒(Capsicum annuum L.)N1508回交，获得BC4代分离群体。
2)筛选中选单株
2015年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地对BC4代分离群体取样提取DNA后，先进行抗辣椒疫病基因型检测，挑选BC4代群体中具有杂合抗辣椒疫病基因型的单株，再将这些单株进行标记背景选择中，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC4 单株。
6、自交获得BC4F1代群体并筛选中选单株
1)自交获得BC4F1代群体
将上述中选BC4单株自交获得BC4F1代群体。
2)筛选中选单株
2016年夏，在北京市农林科学院四季青农场对BC4F1代分离群体取样提取DNA后，先进行抗辣椒疫病基因型检测和抗辣椒疫病抗性检测，挑选抗辣椒疫病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株；再对抗辣椒疫病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株进行辣椒青枯病抗性鉴定，选择抗青枯病单株，即为抗辣椒疫病、抗青枯病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株，记作中选BC4F1单株。
7、自交获得BC4F2代群体并筛选中选单株
1)自交获得BC4F2代群体
将抗青枯病单株(中选BC4F1单株)进行自交获得BC4F2高度纯和自交系。
2)筛选中选单株
2016年冬，对三亚育种基地BC4F2代分离群体取样提取DNA后，先进行抗辣椒疫病基因型检测，挑选纯合抗辣椒疫病基因型的单株；再对纯合抗辣椒疫病基因型的单株进行辣椒青枯病抗性鉴定，选择抗青枯病单株，即为抗辣椒疫病、抗青枯病的单株，记作中选BC4F2单株。
8、自交获得BC4F3代群体并筛选中选单株
1)自交获得BC4F3代群体
将中选的BC4F2进行自交获得BC4F3高度纯和自交系，该自交系即为辣椒恢复系2016-99C。
将该辣椒恢复系2016-99C进行抗辣椒疫病抗性鉴定、基因型检测以及青枯病抗性鉴定，结果该品系抗辣椒疫病且具有纯合抗辣椒疫病基因型且抗青枯病。
二、甜椒雄性不育系2016-99A的选育流程
图1为2016-99A选育路线图。
1、杂交F1代群体
2013年夏，在北京市农林科学院四季青农场将甜椒胞质雄性不育系(Capsicumannuum)09-313A和抗南方根结线虫且为保持系受体亲本甜椒材料Charleston Belle 进行杂交，获得F1代群体。
2、回交获得BC1代分离群体
2013年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地将F1代继续与受体亲本甜椒材料Charleston Belle回交，获得BC1代分离群体。
3、回交获得BC2代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC2代分离群体
2014年夏，在北京市农林科学院四季青农场，BC1代分离群体与受体亲本甜椒材料Charleston Belle进行回交，获得BC2分离群体。
2)筛选中选单株
2014年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地对BC2代分离群体取样提取DNA后，进行标记背景选择，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC2单株。
4、回交获得BC3代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC3代分离群体
2014年冬，中选BC2单株与受体亲本甜椒材料Charleston Belle进行回交，获得BC3 分离群体。
2)筛选中选单株
2015年夏，在北京市农林科学院四季青农场对BC3代分离群体取样提取DNA后，进行标记背景选择，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC3单株。
5、回交获得BC4代分离群体并筛选中选单株
1)回交获得BC4代分离群体
2015年夏，中选BC3单株与受体亲本甜椒材料Charleston Belle进行回交，获得BC4 分离群体。
2)筛选中选单株
2015年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地对BC4代分离群体取样提取DNA后，进行标记背景选择，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC4单株。
6、回交获得BC5代分离群体
1)回交获得BC5代分离群体
2015年冬，中选BC4单株与受体亲本甜椒材料Charleston Belle进行回交，获得BC5 分离群体。
2)筛选中选单株
2016年夏，在北京市农林科学院四季青农场对BC5代分离群体取样提取DNA后，进行标记背景选择，按照回复率公式计算分子标记的遗传背景回复率，选取遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC5单株。
7、回交获得BC6代分离群体甜椒雄性不育系2016-99A
2016年夏，中选BC5单株与受体亲本甜椒材料Charleston Belle进行回交，获得BC6 分离群体，即为甜椒雄性不育系2016-99A。
2016年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地对甜椒雄性不育系2016-99A苗期进行辣椒南方根结线虫抗性检测，结果表现为甜椒雄性不育系2016-99A抗南方根结线虫；将该植株定植于田间，植株表现为不育。
三、甜椒保持系2016-99B的选育流程
2013年夏至2016年夏，甜椒材料Charleston Belle在北京市农林科学院四季青农场和在北京市农林科学院海南三亚育种基地连续自交6代，得到F6代，即为高度纯和的甜椒保持系2016-99B。
2016年冬，在北京市农林科学院海南三亚育种基地种植甜椒保持系2016-99B和甜椒雄性不育系2017-99A。甜椒雄性不育系2017-99A田间表现为不可育。将甜椒保持系2016-99B的花粉与甜椒雄性不育系2017-99A进行杂交，甜椒雄性不育系2017-99A授粉的花可以结果，结果收获的种子于2017年夏种植于北京农林科学院四季青农场，植株表现为不可育，证实甜椒保持系2016-99B为辣椒雄性不育保持系。
四、辣椒CMS三系配套获得杂交抗病砧木品种‘格拉夫特2号’
1、辣椒CMS三系配套获得杂交抗病砧木品种‘格拉夫特2号’
以甜椒雄性不育系2016-99A作为不育系，辣椒恢复系2016-99C作为恢复系，甜椒保持系2016-99B为保持系，进行三系配套，获得兼抗辣椒疫病、青枯病、南方根结线虫砧木品种‘格拉夫特2号’。
2、砧木品种‘格拉夫特2号的抗性鉴定
以格拉夫特2号为砧木，其他辣椒材料为接穗获得的嫁接苗，田间表现为抗辣椒疫病、抗青枯病和抗南方根结线虫，鉴定方法同前，具体结果如下：
1)辣椒南方根结线虫抗病性鉴定结果
结果如表5，甜椒材料Charleston Belle和感病对照茄门接种南方根结线虫后，三次生物学重复共计60株，接种6周后甜椒材料Charleston Belle平均病级为0，感病对照茄门平均病级为3.87，表明甜椒材料Charleston Belle抗南方根结线虫。
以感病对照茄门(记载在如下文献中：张宇，张晓芬，陈斌，耿三省，李焕秀.与辣椒抗根结线虫基因Me1紧密连锁的EST-SSR标记开发.核农学报,2011,25(5): 0933-0938.)为接穗，辣椒砧木格拉夫特2号为砧木获得的嫁接苗对南方根结线虫表现为高抗。
表5为辣椒抗南方根结线虫病鉴定结果
嫁接苗：以茄门为接穗，格拉夫特2号为砧木。
2)辣椒材料青枯病抗性鉴定结果
结果如表6，对辣椒(Capsicum annuum)N1508、感病对照茄门、辣椒恢复系2016-99C 和砧木格拉夫特2号嫁接苗浸根接种青枯菌Rs-SY1，三次生物学重复共计60株，接种30天进行病害调查，辣椒(Capsicum annuum)N1508平均病指0.4，感病对照平均病指为4，辣椒2016-99C平均病指为0.43，砧木格拉夫特2号嫁接苗平均病指为0.73，结果表明辣椒砧木格拉夫特2号抗青枯病。
表6为辣椒抗青枯病鉴定结果
嫁接苗：以茄门为接穗，格拉夫特2号为砧木。
3)辣椒材料疫病抗性鉴定结果
结果如表7，对辣椒(Capsicum annuum)CM334、辣椒恢复系2016-99C、感病对照茄门和砧木格拉夫特2号嫁接苗接种疫霉菌Pc-sy，三次生物学重复共计60株，接种7天进行病害调查，辣椒(Capsicum annuum)CM334平均病指0，感病对照平均病指为99.67，辣椒2017-99C平均病指为0，砧木格拉夫特2号嫁接苗平均病指为0，结果表明辣椒砧木格拉夫特2号抗辣椒疫病。
表7为辣椒抗辣椒疫病鉴定结果
嫁接苗：以茄门为接穗，格拉夫特2号为砧木。
综上，格拉夫特2号是由甜椒雄性不育系2016-99A、甜椒保持系2016-99B和辣椒恢复系2016-99C“三系”配套选育的杂交一代砧木品种，兼抗辣椒疫病、南方根结线虫和青枯病。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120>辣椒CMS三系杂交砧木的选育方法
<160> 160
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tcaaaaatct cattcaccgc cacg 44
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tccaaaaatc tcattcaccg ccaca 45
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ttgggtagtg gacttgggtc tagt 24
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tagaatgcaa tatagagctt ctgctga 47
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgaatgcaat atagagcttc tgctgg 46
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
atagtggtga caactgtctg gtttgc 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
acaacatttc ttattcacgg ca 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
aactgtgcca gcagattcaa aa 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
tacacagaaa ggaaagggaa g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
gaggtgattt tgggtcatta c 21
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
cacatcatcg tcatcaataa caa 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
aggtggattc cgaaaaacaa 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
aataccaagt ttgtaacatc cca 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
ggactatcag tttctttgac cag 23
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
cggaagaacc taataaagac c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
ttgtccccct tacagttcta t 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
tgtagcaagt aactcaacag gaag 24
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
atttgttttg tatttgtgta tgttgt 26
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
cgggtttggg acttggtaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
cagaaccgac tttcgcaca 19
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
gcatagtaac aagcatacaa agaa 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
tcaaatgtag gttgtaagaa aagg 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
gggtgttgaa gaactaataa tgg 23
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
tatcattcac cgaacctctg t 21
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
acatctgtct ttcactcttt ttc 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
atcagataat acagtccgca tag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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tctttatttt gacggtgcat ttg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tggaagatgt tgttgatgag a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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gtgttctttc cacgccattt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 33
cgttattctt tagcgacttc at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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taaacgatta cacacatcca aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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tctgcttgtc ttcagtttgt agt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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atttattgtc cgcagcctta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ttagaaaaac gtccacacaa aac 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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gacagtaacc agatcaaagg cat 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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acaagtggta tcattctgag ttt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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cgaataggaa ggtgttgaga a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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gttgaccttt gtcggttgtt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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ttgtcgcaca tcaatcaaat a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cacaagccta ctgaactaac ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ggggtcttct tgtcttccta t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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ttagtcaatg aatgtggtag gtg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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agggggttca gcctctatta t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctggtcctg atacaagatt t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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cttttatcta tggttttgaa tcg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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catttcatct ctctttttcc ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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ctacaactca acaagaagca tacg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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ttactgatag gataagacac ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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attagtcaga aaacattagg gta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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tgttccgtag ttgtatgtgt gc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 69
aaagatacga gaaaaggacg ct 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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attttcgtcc ataccaaaca ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 71
atgctaaaaa tgattgaatg acg 23
<210> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 72
gtttgattct tctgttttga ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 73
ccaaatcgtc aatgtgactc taa 23
<210> 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 74
tgtttctacc atgaatctac cca 23
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 75
tcttgagatt tatggcattt tgt 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 76
atggatgatg tcacactcaa aag 23
<210> 77
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 77
tgaatcatac gcaaaaagag a 21
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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cctaaaagtc caggagacaa a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 79
gctgcgtact accagattgt gact 24
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 80
taggagctaa acgggaatag gaaa 24
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 81
aactaataga gtgtgtttgg ggta 24
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 82
taaggttatc acatcatttt tccg 24
<210> 83
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 83
ttgtttatgt tattgttttg tcttact 27
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 84
gatttcacct ctaccttttt gga 23
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 85
gcaatggagt tgagcaataa ga 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 86
cgatggacga taaatacgac tg 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 87
acaacatttc ttattcacgg ca 22
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 88
aactgtgcca gcagattcaa aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 89
taaagcaggt aggagaaggt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 90
attcagattt ttgttggcgt t 21
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 91
cacatcatcg tcatcaataa caa 23
<210> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 92
aggtggattc cgaaaaacaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 93
aataccaagt ttgtaacatc cca 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 94
ggactatcag tttctttgac cag 23
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 95
tgttcacgca tgatttatcc at 22
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 96
gccgacacta ctttaccttt tc 22
<210> 97
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 97
tgtagcaagt aactcaacag gaag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 98
atttgttttg tatttgtgta tgttgt 26
<210> 99
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 99
gcatagtaac aagcatacaa agaa 24
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 100
tcaaatgtag gttgtaagaa aagg 24
<210> 101
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 101
ttgaagaaag agactacaaa gaaat 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 102
ctttattatt tcagatggtg atgta 25
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 103
tggaagatgt tgttgatgag a 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 104
tagtggttga gcaaacggta g 21
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 105
ggtttgcctc ccttcgtaga 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 106
gtgttctttc cacgccattt 20
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 107
cgttattctt tagcgacttc at 22
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 108
taaacgatta cacacatcca aa 22
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 109
gtggaataaa aaaatagagg gc 22
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 110
ctaccagaag gatgattgga aa 22
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 111
tctgcttgtc ttcagtttgt agt 23
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 112
atttattgtc cgcagcctta 20
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 113
ttagaaaaac gtccacacaa aac 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 114
gacagtaacc agatcaaagg cat 23
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 115
caacgaaaaa tcaatcaaaa a 21
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 116
acaagtggta tcattctgag ttt 23
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 117
aagtccaata accatctctc cc 22
<210> 118
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 118
ctgaatttga ccagctctca ca 22
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 119
cacaagccta ctgaactaac ca 22
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 120
ggggtcttct tgtcttccta t 21
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 121
tgtcaatggt attacttcac ggt 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 122
taacaggatt gggttttcat tct 23
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 123
cgtccattta gcctctaccg a 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 124
atttacccca ctccgacact t 21
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 125
cctggtcctg atacaagatt t 21
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 126
cttttatcta tggttttgaa tcg 23
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 127
gacacaccca agttcttcat tt 22
<210> 128
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 128
cacagaaccc ttgctcaaca ta 22
<210> 129
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 129
ctacaactca acaagaagca tacg 24
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 130
ttactgatag gataagacac ccc 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 131
acatttctct cgcatttagt agt 23
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 132
ttgtataggt gaatctagca tctt 24
<210> 133
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 133
tgttccgtag ttgtatgtgt gc 22
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 134
attttcctca aaccccactt a 21
<210> 135
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 135
attaccgcac tctttaccac at 22
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 136
ttctcataca gatgaagctc ttg 23
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 137
ccttcaggtt ctcagacttt g 21
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 138
cctatctctg accaaatctc g 21
<210> 139
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 139
ttgtagtcct ttggggtcat aa 22
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 140
gcattaccct caacatcttc tc 22
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 141
aaaggatggt ttagatggac gc 22
<210> 142
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 142
ttatgggagc accacgactt ac 22
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 143
tgaatcatac gcaaaaagag a 21
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 144
cctaaaagtc caggagacaa a 21
<210> 145
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 145
aagaaatgag ccaaatagaa tg 22
<210> 146
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 146
tcctttactg actgatacca gg 22
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 147
tcacttcaca tactaggata aagat 25
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 148
gagtccttct agcaaggtaa taa 23
<210> 149
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 149
gaagtgagtg cgataaacat ac 22
<210> 150
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 150
aagtgctcgg actctctaaa ta 22
<210> 151
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 151
ttgtttatgt tattgttttg tcttact 27
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 152
gatttcacct ctaccttttt gga 23
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 153
atgactattt taccacacta tttct 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 154
atgtagccat gattgtcacc tatac 25
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 155
tcccaaatcc taatcactca a 21
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 156
gaatcccgaa tgactttgaa c 21
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 157
gcaatggagt tgagcaataa ga 22
<210> 158
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 158
cgatggacga taaatacgac tg 22
<210> 159
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(50)
<223>n=t或c
<400> 159
ccgttgggta gtggacttgg gtctagtgct gctagtgctg ctgcggctgn cgtggcggtg 60
aatgagattt ttggtaggaa attgagtgtt gatcagcttg t 101
<210> 160
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)
<223>n=g或a
<400> 160
ttgatagccc ctggtaaaga atgcaatata gagcttctgc tgnaattatt ctggcaaacc 60
agacagttgt caccactata agtttgccc 89
Claims (7)
1.一种辣椒CMS三系杂交砧木的选育方法，包括如下步骤：以甜椒雄性不育系2016-99A为不育系，甜椒保持系2016-99B为保持系，辣椒恢复系2016-99C为恢复系，进行三系配套选育，得到抗辣椒疫病、抗青枯病、抗南方根结线虫的砧木品种，实现辣椒CMS三系杂交砧木的选育；
所述辣椒恢复系2016-99C按照包括如下步骤的方法转育：
a）以辣椒CM334作母本，恢复系受体亲本辣椒N1508作父本，杂交，得到F1代群体；
b）以a）得到的所述F1代群体单株为母本，与所述恢复系受体亲本辣椒N1508进行4次回交，且每次回交产物进行抗辣椒疫病基因型检测和标记背景选择，分别从第1-3次回交产物中选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为下一次回交的亲本，从第4次回交产物中选取具有杂合抗辣椒疫病基因型且遗传背景回复率最高的10个单株作为中选BC4单株；
c）将所述中选BC4单株自交2次，且每次自交产物进行抗辣椒疫病抗性鉴定、所述抗辣椒疫病基因型检测和辣椒青枯病抗性鉴定，分别从第1-2次自交产物中选取抗辣椒疫病、抗青枯病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株作为下一次自交的亲本，从第2次自交产物中选取抗辣椒疫病、抗青枯病且具有纯合抗辣椒疫病基因型的单株进行第3次自交，得到辣椒恢复系2016-99C；
所述甜椒雄性不育系2016-99A按照包括如下步骤的方法转育：
1）以甜椒胞质雄性不育系09-313A为母本，保持系亲本甜椒材料Charleston Belle为父本，杂交，得到F1代群体；
2）将所述F1代群体单株与受体亲本所述甜椒材料Charleston Belle进行6次回交，且除第一次回交外，每次回交产物进行所述标记背景选择，分别从第2-5次回交产物中选取遗传背景回复率最高的10个单株作为下一次回交的供体亲本，第6次回交产物即为甜椒雄性不育系2016-99A；
所述甜椒保持系2016-99B为甜椒材料Charleston Belle自交6代，得到的产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述辣椒恢复系2016-99C转育方法中，所述抗辣椒疫病基因型检测的方法为用标记CA_011264对应的引物和标记Phyto5NBS1对应的引物分别对待测单株的基因组DNA进行KASP检测，所述标记CA_011264检测基因型为AA或AG或GG,所述Phyto5NBS1检测基因型为CC或CT或TT,若所述标记CA_011264检测的基因型是AG，且所述标记Phyto5NBS1检测的基因型为CT，则所述待测植株为杂合抗辣椒疫病基因型的单株；若所述CA_011264检测的基因型是AA，且所述标记Phyto5NBS1检测的基因型为CC，则所述待测植株为纯合抗辣椒疫病基因型的单株。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述标记背景选择的方法包括如下步骤：
先用多个筛选标记对应的引物对对所述待测植株、其对应的供体亲本和受体亲本的基因组DNA进行PCR扩增，选取该待测植株扩增产物中带型仅与受体亲本相同且与供体亲本不同的引物对对应的标记，记作受体亲本带型的分子标记；将多个筛选标记记作所参与分析的分子标记；
再计算待测植株分子标记的遗传背景回复率，公式如下：G（g）=[L+X(g)]/(2L)；其中，g指回交世代数，G（g）指在g代的遗传背景回复率；X（g）指在回交g代的待测植株的受体亲本带型的分子标记数量；L指所参与分析的分子标记数量；
再选取所有待测植株中分子标记的遗传背景回复率最高的10株为目标植株。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述CA_011264标记对应的引物由序列1所示的引物、序列2所示的引物和序列3所示的引物组成；所述标记Phyto5NBS1对应的引物由序列4所示的引物、序列5所示的引物和序列6所示的引物组成。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述辣椒恢复系2016-99C转育中的多个筛选标记及其对应的引物对如下：
标记1593985，对应的引物对由序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子组成；
200077523，对应的引物对由序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子组成；
266029224，对应的引物对由序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子组成；
51404476，对应的引物对由序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子组成；
130877292，对应的引物对由序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子组成；
220908123，对应的引物对由序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子组成；
250470863，对应的引物对由序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子组成；
23028330，对应的引物对由序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子组成；
121754965对应的引物对由序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子组成；
140543222对应的引物对由序列25所示的单链DNA分子和序列26所示的单链DNA分子组成；
142287175对应的引物对由序列27所示的单链DNA分子和序列28所示的单链DNA分子组成；
61166842对应的引物对由序列29所示的单链DNA分子和序列0所示的单链DNA分子组成；
140111523对应的引物对由序列31所示的单链DNA分子和序列32所示的单链DNA分子组成；
221317860对应的引物对由序列33所示的单链DNA分子和序列34所示的单链DNA分子组成；
120217416对应的引物对由序列35所示的单链DNA分子和序列36所示的单链DNA分子组成；
160338879对应的引物对由序列37所示的单链DNA分子和序列38所示的单链DNA分子组成；
867375对应的引物对由序列39所示的单链DNA分子和序列40所示的单链DNA分子组成；
31526898对应的引物对由序列41所示的单链DNA分子和序列42所示的单链DNA分子组成；
127310066对应的引物对由序列43所示的单链DNA分子和序列44所示的单链DNA分子组成；
250256837对应的引物对由序列45所示的单链DNA分子和序列46所示的单链DNA分子组成；
22384316对应的引物对由序列47所示的单链DNA分子和序列48所示的单链DNA分子组成；
91744100对应的引物对由序列49所示的单链DNA分子和序列50所示的单链DNA分子组成；
140748909对应的引物对由序列51所示的单链DNA分子和序列52所示的单链DNA分子组成；
239579046对应的引物对由序列53所示的单链DNA分子和序列54所示的单链DNA分子组成；
30159980对应的引物对由序列55所示的单链DNA分子和序列56所示的单链DNA分子组成；
180144914对应的引物对由序列57所示的单链DNA分子和序列58所示的单链DNA分子组成；
200516195对应的引物对由序列59所示的单链DNA分子和序列60所示的单链DNA分子组成；
220424570对应的引物对由序列61所示的单链DNA分子和序列62所示的单链DNA分子组成；
440172对应的引物对由序列63所示的单链DNA分子和序列64所示的单链DNA分子组成；
10370491对应的引物对由序列65所示的单链DNA分子和序列66所示的单链DNA分子组成；
132135721对应的引物对由序列67所示的单链DNA分子和序列68所示的单链DNA分子组成；
171268339对应的引物对由序列69所示的单链DNA分子和序列70所示的单链DNA分子组成；
222783681对应的引物对由序列71所示的单链DNA分子和序列72所示的单链DNA分子组成；
130633对应的引物对由序列73所示的单链DNA分子和序列74所示的单链DNA分子组成；
30174286对应的引物对由序列75所示的单链DNA分子和序列76所示的单链DNA分子组成；
69139981对应的引物对由序列77所示的单链DNA分子和序列78所示的单链DNA分子组成；
200217991对应的引物对由序列79所示的单链DNA分子和序列80所示的单链DNA分子组成；
181780249对应的引物对由序列81所示的单链DNA分子和序列82所示的单链DNA分子组成；
229391206对应的引物对由序列83所示的单链DNA分子和序列84所示的单链DNA分子组成；
270094271对应的引物对由序列85所示的单链DNA分子和序列86所示的单链DNA分子组成。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述甜椒雄性不育系2016-99A转育中的多个筛选标记及其对应的引物对如下：
1593985对应的引物对由序列87所示的单链DNA分子和序列88所示的单链DNA分子组成；
60468681对应的引物对由序列89所示的单链DNA分子和序列90所示的单链DNA分子组成；
266029224对应的引物对由序列91所示的单链DNA分子和序列92所示的单链DNA分子组成；
51404476对应的引物对由序列93所示的单链DNA分子和序列94所示的单链DNA分子组成；
95383212对应的引物对由序列95所示的单链DNA分子和序列96所示的单链DNA分子组成；
220908123对应的引物对由序列97所示的单链DNA分子和序列98所示的单链DNA分子组成；
23028330对应的引物对由序列99所示的单链DNA分子和序列100所示的单链DNA分子组成；
135384459对应的引物对由序列101所示的单链DNA分子和序列102所示的单链DNA分子组成；
61166842对应的引物对由序列103所示的单链DNA分子和序列104所示的单链DNA分子组成；
140111523对应的引物对由序列105所示的单链DNA分子和序列106所示的单链DNA分子组成；
221317860对应的引物对由序列107所示的单链DNA分子和序列108所示的单链DNA分子组成；
110046784对应的引物对由序列109所示的单链DNA分子和序列110所示的单链DNA分子组成；
120217416对应的引物对由序列111所示的单链DNA分子和序列112所示的单链DNA分子组成；
160338879对应的引物对由序列113所示的单链DNA分子和序列114所示的单链DNA分子组成；
867375对应的引物对由序列115所示的单链DNA分子和序列116所示的单链DNA分子组成；
173124821对应的引物对由序列117所示的单链DNA分子和序列118所示的单链DNA分子组成；
250256837对应的引物对由序列119所示的单链DNA分子和序列120所示的单链DNA分子组成；
282748632对应的引物对由序列121所示的单链DNA分子和序列122所示的单链DNA分子组成；
22384316对应的引物对由序列123所示的单链DNA分子和序列124所示的单链DNA分子组成；
140748909对应的引物对由序列125所示的单链DNA分子和序列126所示的单链DNA分子组成；
230556909对应的引物对由序列127所示的单链DNA分子和序列128所示的单链DNA分子组成；
30159980对应的引物对由序列129所示的单链DNA分子和序列130所示的单链DNA分子组成；
194455352对应的引物对由序列131所示的单链DNA分子和序列132所示的单链DNA分子组成；
220424570对应的引物对由序列133所示的单链DNA分子和序列134所示的单链DNA分子组成；
3445950对应的引物对由序列135所示的单链DNA分子和序列136所示的单链DNA分子组成；
60294885对应的引物对由序列137所示的单链DNA分子和序列138所示的单链DNA分子组成；
110018496对应的引物对由序列139所示的单链DNA分子和序列140所示的单链DNA分子组成；
180711669对应的引物对由序列141所示的单链DNA分子和序列142所示的单链DNA分子组成；
69139981对应的引物对由序列143所示的单链DNA分子和序列144所示的单链DNA分子组成；
160731790对应的引物对由序列145所示的单链DNA分子和序列146所示的单链DNA分子组成；
194117420对应的引物对由序列147所示的单链DNA分子和序列148所示的单链DNA分子组成；
233046411对应的引物对由序列149所示的单链DNA分子和序列150所示的单链DNA分子组成；
229391206对应的引物对由序列151所示的单链DNA分子和序列152所示的单链DNA分子组成；
3075317对应的引物对由序列153所示的单链DNA分子和序列154所示的单链DNA分子组成；
120139731对应的引物对由序列155所示的单链DNA分子和序列156所示的单链DNA分子组成；
270094271对应的引物对由序列157所示的单链DNA分子和序列158所示的单链DNA分子组成。
7.权利要求1-6中任一所述的方法中的甜椒雄性不育系2016-99A、甜椒保持系2016-99B和辣椒恢复系2016-99C在三系配套制种中的应用；
或权利要求1-6中任一所述的方法中的甜椒雄性不育系2016-99A、甜椒保持系2016-99B和辣椒恢复系2016-99C在三系配套获得抗辣椒疫病、抗南方根结线虫和/或抗青枯病的砧木品种中的应用；
或权利要求1-6中任一所述的方法得到的所述砧木品种在培育抗辣椒疫病、抗青枯病和/或抗南方根结线虫嫁接苗中的应用。
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