KR20200112852A - 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16에 대해 저항성인 시금치 식물 - Google Patents

적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16에 대해 저항성인 시금치 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 페로노스포라 파리노사(Peronospora farinosa) 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 새로운 저항성을 갖는 재배 시금치 식물, 상기 식물의 종자, 세포 배양물 및 자손, 저항성을 갖는 식물의 용도, 및 이러한 식물을 생성시키고 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16에 대해 저항성인 시금치 식물
발명의 분야
본 발명은 페로노스포라 파리노사(Peronospora farinosa) 레이스에 대한 새로운 저항성을 갖는 재배 시금치 식물, 상기 식물의 종자, 세포 배양물 및 자손, 저항성을 갖는 식물의 용도, 및 이러한 식물을 생성시키는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
시금치 (스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea))는 아마란타세아에(Amaranthaceae) 과, 스피나시아(Spinacia) 속의 식용 식물 중 하나이다. 이의 원산지는 서부 및 중앙 아시아이다. 이러한 세계 지역에서, 시금치의 야생 근연종인 스피나시아 투르케스타니카(Spinacia turkestanica) 및 스피나시아 테트란드라(Spinacia tetrandra)가 발견된다.
시금치는 많은 세계 지역에서 중요한 채소 작물이 되었고, 최고 시금치 생산 국가는 중국이고 (2012년 19500000 Mt 생산), 미국, 일본 및 터키가 뒤를 잇는다 (FAOSTAT). 전세계적으로, 약 1백만 ha의 시금치가 아시아에서 자라고, 약 35,000 ha가 EU, 미국 및 일본 각각에서 자란다 (문헌 [Correll et al., 2011, Eur J Plant Pathol 129: 193-205] 참조). 시금치 수요 증가의 일부분은 소비자의 건강 의식 증가 및 시금치의 이로운 성질의 인식에 기인할 수 있다. 시금치 잎은 베타-카로틴, 루테인, 엽산, 비타민 C, 칼슘, 철 및 항산화제가 풍부하다 (미국 농무부 국립 영양소 데이터베이스). 최근 몇년에 걸쳐 신선한 시금치에 대한 수요가 상당히 증가하였다.
지난 수십년에 걸친 이러한 생산 증가로 인해, 난균강(oomycete) 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에(Peronospora farinosa f.sp. spinaciae) (Pfs; 동의어 피. 에푸사(P. effusa))의 레이스(race)에 의해 야기되는, 시금치의 가장 해로운 병원체 중 하나인 시금치 노균병의 발생률 및 심각도가 동반적으로 증가하였다. 1990년에는, 3개의 Pfs 레이스만 공지되어 있었지만, 1990년 내지 2017년 사이에 13개의 새로운 레이스가 확인되었다. 새로운 Pfs 레이스의 출현은 이러한 병원체를 전세계적으로 시금치 생산에 대한 주요한 위협물로 만들고, 따라서 새로운 저항성 공급원을 확인하는 것이 필요하다.
역사적으로, Pfs 레이스 1 (Pfs:01 또는 Pfs1)이 1824년에 최초로 보고되었고, 이후에 레이스 1에 대한 저항성이 2개의 이란 수탁물 (PI140467 및 PI140464)에서 확인되었으며, 상업용 잡종 변종, 예컨대 캘리플레이(Califlay) 내로 혼입되었다 (Smith and Zahara, California Agriculture, July 1956). 1958년에는, Pfs 레이스 2가 나타났고, 몇년 후 레이스 1 및 2에 대한 저항성을 부여하는 단일 우성 유전자가 확인되었다 (Smith et al. 1961 and 1962). 1976년에 레이스 3이 나타났고, 레이스 4가 1990년에 확인되었으며, 두 균주에 대한 저항성이 빠르게 발견되었다. 그 후, 새로운 레이스의 급속한 출현이 추가의 새로운 저항성 유전자의 확인, 및 상업용 변종 내로의 혼입, 뿐만 아니라 표준화된 테스트 예컨대 차등물 모종 테스트의 개발로 이어졌다 (문헌 [International Seed Federation - Guidelines for Spinach Downy Mildew, Dec 2015] 및 ["Differential Sets - Peronospora farinosa f.sp. spinaciae", Aug 2016]; worldseed.org/isf/differential_hosts.html의 월드와이드웹을 참조한다). 이러한 변종들 중 일부는 하기 표 1에 지시된 바와 같이 Pfs의 분리주의 레이스를 결정하기 위한 숙주 차등물로서 또한 사용된다.
<표 1>
2015년 12월 및 2016년 8월 기준의 시금치 노균병 병원체 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에의 분리주의 레이스 확인을 결정하기 위한 시금치 차등물의 질병 반응
Figure pct00001
2016년에, 새로운 노균병 레이스가 확인되었다 (문헌 [Plantum press release, March 15th, 2016]). 2015년 3월에 미국 캘리포니아의 살리나스에서 분리주가 최초로 확인되었고, 초기에는 UA201519B (UA1519B로도 지칭됨)로 지정되었다. 분리주를 차등물 변종의 표준 세트에 대한 테스트에서 질병 발달에 대해 평가하였고, <International Working Group on Peronospora> (IWGP)에서 분리주가 새로운 레이스였음이 결정되었다. 다수의 장소에서 동일한 반응 패턴의 분리주가 발생한 것이 명확해지자, IWGP는 이를 Pfs: 16으로 명명하였다. 이는 본 출원에서 표 1로 제시된 표준 차등물 표에 추가되었다.
2018년에, IWGP가 또 다른 새로운 레이스 Pfs17 (UA1014, 또는 US1602)을 명명하였다. 분리주 Pfs 1 내지 Pfs 17을 구별짓도록 새로운 숙주 차등물 세트 또한 국제 종자 연맹(International Seed Federation (ISF))에 의해 출시되었다. "Spinach-downy-mildew_April2018.pdf"로 지칭되는, 월드와이드웹 worldseed.org/our-work/plant-health/differential-hosts/의 "Downy Mildew" 링크 하의 문서를 참조한다.
일부 개방 수분 변종도 존재하지만, 상업용 시금치 변종은 대부분 자성 및 웅성 순계 계통을 교배함으로써 생산된 잡종이다. 자성 및 웅성 양친 계통은 일반적으로 각각 상이한 저항성 유전자를 보유한다. 예를 들어, 잡종 변종 안드로메다(Andromeda) (눈헴스(Nunhems)에 의해 육종됨; 특허 출원 US8563807 참조)는 Pfs 1-12 및 Pfs14에 대해 저항성이다. 이러한 변종에서, Pfs 1, 3, 5, 8, 9, 11, 12 및 14에 대한 저항성은 하나의 순계 양친 계통으로부터의 저항성 유전자에 의해 부여되는 한편, Pfs 1-10에 대한 저항성은 다른 순계 양친 계통으로부터의 저항성 유전자에 의해 부여된다. 둘 모두의 양친 계통은 저항성 유전자에 대해 동형접합이다. 저항성의 최적의 조합은 어려운 퍼즐이며, 특히 일부 저항성 유전자가 우성이 아니고/아니거나 동일한 유전자좌에 맵핑되어, 모든 공지된 저항성 유전자를 잡종 내에 적층하는 것을 불가능하게 하기 때문에 그러하다. 따라서, 추가적인 저항성 유전자가 시금치 육종 분야에서 지속적으로 요구된다.
WO2015054339는 "페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에에 대하여 광역 저항성을 부여하는 스피나시아 테트란드라로부터의 이입 유전자좌를 게놈 내에 포함하는 스피나시아 올레라세아 시금치 식물"을 기술하고, 상기 광역 저항성은 "페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 (Pfs)의 레이스 7, 10, 11, 12, 13, 및 14, 또는 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 (Pfs)의 레이스 1-14 및 UA4712에 대한 저항성"을 포함하고 (분리주 UA4712는 이후에 IWGP에 의해 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 (Pfs) 레이스 15로 명명되었다), 여기서 "이입된 유전자좌는 스피나시아 테트란드라 게놈에서 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 2에 적어도 95% 동일한 서열이 플랭킹되는 것으로 정의되고", 또한 "에스. 테트란드라(S. tetrandra)로부터의 DM 저항성은 공공 지도의 6번 염색체 상의 0.0 cM의 E33/M62-231과 10.3 cM의 E39/M47-203 마커 사이에 있었다" (Khattak et al., Euphytica 148:311-318, 2006). 저항성-부여 유전자좌에 플랭킹된 WO2015054339의 서열식별번호: 1 및 2는 각각 서열식별번호: 4 및 5로서 본 출원에 추가되었다.
WO2013064436 (EP2586294)은 "노균병 레이스 Pfs 1, Pfs 2, Pfs 3, Pfs 4, Pfs 5, Pfs 6, Pfs 9, Pfs 11, Pfs 12, Pfs 13 및 UA4410에 대해 시금치 식물에 저항성을 부여하는 새로운 저항성 유전자 (R6으로 명명됨)"를 기술한다 (WO2013/064436의 19면의 표 1을 또한 참조한다; 균주 UA4410 유형은 2011년부터 IWGP에 의해 Pfs14로 지명되었다). 마커는 제공되지 않았다. R6은 Pfs 레이스 7, 8 및 10에 대한 저항성을 부여하는 것으로 기술되지 않는다.
EP2912940 (US2015240256)은 "대립유전자 A, 대립유전자 Vt, 및 대립유전자 C로 이루어진 군으로부터 선택된 대립유전자의 조합"에 의해 부여된, 페로노스포라 파리노사에 대해 저항성인 식물 ... "대립유전자의 조합이 대립유전자 A 및 C를 포함하고, 식물이 적어도 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 7, 8, 10, 11, 12, 14, 및 분리주 UA4712에 대해 저항성이거나; 대립유전자의 조합이 대립유전자 A 및 Vt를 포함하고, 식물이 적어도 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 7, 8, 10, 11, 12, 13, 및 14에 저항성이거나; 또는 대립유전자의 조합이 대립유전자 C 및 Vt를 포함하고, 식물이 적어도 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 7, 8, 10, 11, 12, 13, 및 분리주 UA4712에 대해 저항성이다"라고 기술한다 (밑줄 추가). 분리주 UA4712는 현재 Pfs 15로 알려져 있다. 따라서, EP2912940에 개시된 저항성은 대립유전자의 조합에 관한 것이다.
US9402363은 "R15 대립유전자를 포함하는 시금치 식물을 확인하는 방법으로, 상기 대립유전자가 적어도 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 Pfs:1, Pfs:2, Pfs:3, Pfs:4, Pfs:5, Pfs:6, Pfs:9, Pfs:11, Pfs:12, Pfs:13, Pfs:14, Pfs:15 및 분리주 UA1014에 대한 저항성을 부여하고, 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 Pfs:7에 대한 저항성을 부여하지 않으며, 상기 대립유전자가 대표적인 샘플이 NCIMB에 NCIMB 수탁 번호 42466 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물에서 발견되는 바와 같은 방법", 및 이와 같이 행하기 위한 20 cM (센티모건) 이내의 4개의 마커 서열을 기술한다. 또한, "동형접합 상태에서, ...에서 발견된 바와 같은 R15 대립유전자는 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 Pfs:8에 대한 저항성 및 Pfs:10에 대한 적어도 중등도의 저항성을 또한 부여한다". 분리주 UA1014는 현재 IWGP가 인정하는 번호가 매겨진 Pfs 레이스가 아니다. US9402363은 "레이스 Pfs:8, Pfs:10에 대한 적어도 중등도의 저항성 및 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 Pfs:7에 대한 저항성을 부여하지 않는다"고 개시한다. Pfs:8, Pfs:10에 대한 저항성은 하기와 같이 기능하는 것으로 추가로 기술된다: "R15 저항성 부여 대립유전자의 동형접합 또는 이형접합 존재가 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 Pfs:8 및 Pfs:10에 대한 본 발명의 형질의 발현에 영향을 미친다".
US20170127641은 "페로노스포라 파리노사 레이스 1-9, 11-15 및 분리주 UA1014APLP에 대한 저항성을 포함하는 시금치 식물"을 기술한다. 분리주 UA1014APLP는 현재 IWGP가 인정하는 번호가 매겨진 Pfs 레이스가 아니다. US20170127641은 Pfs 레이스 10에 대한 저항성을 개시하지 않는다. US20170127641은 Pfs 레이스 3-5에 대한 저항성을 개시하지 않는다. 저항성 유전자 또는 유전자들에 대한 마커가 개시되지 않았다.
US20170127642는 "페로노스포라 파리노사 레이스 1-9, 11-15 및 분리주 UA1014APLP에 대한 저항성을 포함하는 시금치 식물"을 기술한다. 분리주 UA1014APLP는 현재 IWGP가 인정하는 번호가 매겨진 Pfs 레이스가 아니다. US20170127642는 Pfs 레이스 10에 대한 저항성을 개시하지 않는다. US20170127642는 Pfs 레이스 3-5에 대한 저항성을 개시하지 않는다. 저항성 유전자 또는 유전자들에 대한 마커가 개시되지 않았다.
WO2017194073은 "적어도 공식적으로 인정되는 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 Pfs: 1, Pfs:2, Pfs:3, Pfs:4, Pfs:5, Pfs:6, Pfs:7, Pfs:8, Pfs:9, Pfs: 10, Pfs: 11, Pfs: 12, Pfs: 13, Pfs: 14, Pfs: 15 및 Pfs: 16에 대한, R-유전자에 의해 매개되지 않는 광역 저항성으로, 저항성이 p10으로 지정된 새로운 유전자좌에 의해 야기되고, p10 유전자좌에 의해 야기되는 저항성이 적어도 중등도의 수준인 저항성", 및 "우성 R-유전자에 의해 매개되는 저항성에 대조적으로, 본 발명의 p10 유전자좌는 동형접합으로 존재하는 경우에만 저항성을 제공한다"고 기술한다.
문헌 [Correll et al., 2013]은 Pfs 1-15, 및 UA1414, UA1012 및 UA1312를 포함하는 피. 파리노사(P. farinosa)의 몇몇 다른 분리주에 대해 저항성인 코아티(Coati) 및 미어캣(Meerkat) 변종을 기술한다. 코아티 및 미어캣은 F1 잡종이다. 미어캣은 추후에 Pfs 레이스 16에 대해 감수성인 것으로 나타났다 (Plantum press release, March 15th, 2016).
칼리스토(Callisto) 변종 F1은 눈헴스에 의해 육종된 시금치 변종이고, HR 또는 고-저항성으로 기술되는 Pfs 레이스 1-14 및 Pfs 16에 대해 저항성이다. 이는 잡종이고, Pfs 저항성은 다양한 우성 유전자를 적층시키는 것으로부터 수득된다. 언급된 문헌 [Correl et al., 2011]에 기술된 유전자인 Rpf3 (일명 R3)이 Pfs 16에 대한 저항성을 부여한다.
노비코(Novico) 변종 F1은 눈헴스에 의해 육종된 산업 유형의 시금치이고, HR (고-저항성)로 기술된 Pfs 레이스 1-12 및 14-16에 대해 저항성이다. 이는 잡종이고, Pfs 저항성은 다양한 우성 유전자를 적층시키는 것으로부터 수득된다. 언급된 문헌 [Correl et al., 2011]에 기술된 유전자인 Rpf3이 Pfs 16에 대한 저항성을 부여한다.
팔코(Palco) 변종 F1은 눈헴스에 의해 육종된 산업 유형 시금치이고, HR로 기술된 Pfs 레이스 1-5, 8, 9, 11, 12, 14 및 16에 대해 저항성이다. 이는 잡종이고, Pfs 저항성은 다양한 우성 유전자를 적층시키는 것으로부터 수득된다. Rpf3이 Pfs 16에 대한 저항성을 부여한다.
스코르피어스(Scorpius) 변종 F1은 눈헴스에 의해 육종된 신선 시장용 시금치이고, HR로 기술된 Pfs 레이스 1-14 및 16에 대해 저항성이다. 이는 잡종이고, Pfs 저항성은 다양한 우성 유전자를 적층시키는 것으로부터 수득된다. Rpf3이 Pfs 16에 대한 저항성을 부여한다.
상기 언급된 안드로메다(Andromeda) 변종 F1은 눈헴스에 의해 육종된 신선 시장용 시금치이고, HR로 기술된 Pfs 레이스 1-12 및 14-16에 대한 저항성을 함유한다. 이는 잡종이고, Pfs 저항성은 다양한 우성 유전자를 적층시키는 것으로부터 수득된다. Rpf3이 Pfs 16에 대한 저항성을 부여한다.
여러 다른 회사들도 저항성 유전자의 적층물을 함유하는 시금치 변종을 또한 판매한다. 새롭게 도입된 시금치 변종은 대체로 배타적으로 잡종이다.
WO2015036378은 "RPF13으로 지정된, 새로운 우성 저항성 유전자"를 개시한다. 이러한 유전자는 "단일 유전자에 의해 부여되는 ..., 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 7-14에 대한 저항성을 제공한다. 이러한 유전자는 ... 추가로 임의적으로 페로노스포라 파리노사 레이스 1-6 중 하나 이상 또는 모두 또는 적어도 Pfs 1-2 및 Pfs 4-6에 대한 저항성을 부여한다...". 분리주 UA4712는 현재 Pfs 15로 알려져 있다. RPF13은 본 출원의 실시예에서 또한 제시된 바와 같이 Pfs16에 대한 저항성을 부여하지 않는다.
WO2015036469는 "RPF12로 지정된, 새로운 우성 저항성 유전자"를 개시한다. 이러한 식물은 "단일 유전자에 의해 부여되는 ..., 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 7-14에 대한 저항성을 제공한다. ...RPF12는 ... 추가로 임의적으로 페로노스포라 파리노사 레이스 1-6 중 하나 이상 또는 모두, 또는 적어도 Pfs 1 -2 및 Pfs 4-6에 대한 저항성을 부여한다". RPF12는 본 출원의 실시예에서 또한 제시된 바와 같이 Pfs16에 대한 저항성을 부여하지 않는다. 또한 페가숨(Pegasum) 변종이 RPF12를 함유하고, Pfs16 레이스에 대해 감수성인 것으로 기술된다 (문헌 [Correll and Koike, Race diversity and the biology of spinach downy mildew pathogen, CLGRB Annual Report, April 1 2016 to March 31 2017]의 표 3을 참조한다).
EP2848114에는 "본 발명은 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 7-14에 대한 저항성을 포함하고, 상기 저항성이 단일 유전자에 의해 부여되는 시금치 식물을 제공한다. ... RPF11은 ... 임의적으로 추가로 페로노스포라 파리노사 레이스 1-6 중 하나 이상에 대한 저항성을 부여한다. 따라서, 한 측면에서, RPF11 유전자는 식물 내에서 동형접합 또는 이형접합 형태일 때 모든 현재 공지되어 있는 병원성 Pfs 레이스인 레이스 1-14에 대한 저항성을 부여한다 ..."고 개시되어 있다. RPF11은 본 출원의 실시예에서 또한 제시된 바와 같이 Pfs16에 대한 저항성을 부여하지 않는다. 또한 비르고(Virgo), 볼란스(Volans) 및 안탈리아(Antalia) 변종이 RPF11을 함유하고, Pfs16에 대해 감수성인 것으로 기술된다 (문헌 [Correll and Koike, Race diversity and the biology of spinach downy mildew pathogen, CLGRB Annual Report, April 1 2016 to March 31 2017]의 표 3을 참조한다).
문헌 [Xu, C. et al. (2017, Nat. Commun. 8, 15275 doi: 10.1038/ncomms15275) "Draft genome of spinach and transcriptome diversity of 120 Spinacia accessions" (2017)]에서, 시금치의 차이니즈 재배종인 Sp75의 게놈 서열이 발표되었다. 이러한 서열을 spinachbase.org의 월드와이드웹 상에서 확인되는 온라인 데이터베이스 "SpinachBase" 상에서 분석할 수 있다. 여기에서, 예를 들어, Blast 분석에 의해, 시금치의 6개의 염색체가 질의될 수 있다.
육종자가 모든 IWGP-인정 Pfs 레이스, 즉 Pfs 레이스 1 내지 16에 대한 저항성을 포함하는 시금치 변종, 또는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 저항성을 갖는 변종을 생성시키기를 원하면, 육종자는 공지된 저항성 유전자 중 몇몇을 조합하여야 한다. 모든 공지된 페로노스포라 파리노사 레이스, 또는 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자, 특히 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 우성 저항성을 부여하는 단일 유전자가 공지되어 있지 않다. 또한, 모든 저항성 유전자를 조합하는 것 (완전 적층)이 가능하지 않은데, 일부 Pfs 저항성 유전자가 대립유전자이기 때문이다. 이는 저항성 유전자들의 가능한 조합을 제한하고, 따라서 새로운 조합을 허용하는 새로운 유전자가 많이 추구된다.
참고문헌, 예컨대 상기 문헌 [Correll and Koike] 및 문헌 [Feng et al. (2014), Plant Disease, Vol. 96 No. 1, page 145-152]을 기초로, 상이한 RPF 저항성 유전자들이 제공하는 Pfs 레이스에 대한 저항성이 하기와 같이 요약될 수 있다 (- = 저항성, + = 감수성):
Figure pct00002
새로운 저항성 유전자, 특히 새로운 레이스 예컨대 Pfs16 및 Pfs17, 또는 심지어 새로운 레이스 Pfs 8 내지 Pfs 17 모두에 대한 것을 제공할 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 시금치의 야생 근연종으로부터의 이입 단편을 포함하고, 상기 단편에, 즉, 저항성 유전자가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에, 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 부여하는 단일 유전자가 있는 재배 시금치 식물을 제공하는 것이다. 추가적으로, 유전자는, 적어도 유전자가 동형접합 형태인 경우에, Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성을 부여한다. 추가 측면에서, 유전자는 Pfs 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주, 특히 또한 새로운 레이스 Pfs17에 대한 저항성을 부여한다. 새로운 레이스 Pfs17에 대한 저항성은 또한 우성인 것으로 보인다. 또 다른 측면에서, 유전자는 이형접합 형태에서도 또는 동형접합 형태에서도 Pfs 레이스 3, 4, 및 5에 대한 저항성을 부여하지 않는다.
유전자를 포함하는 이입 단편은 시금치의 야생 근연종으로부터의 것이다. 한 바람직한 측면에서, 시금치의 야생 근연종은 스피나시아 투르케스타니카이다.
저항성 유전자는 RPF14로 지정된다. 동형접합 형태 (2개의 카피)에서, 이는 레이스 Pfs 1, Pfs2 및 Pfs 6 내지 Pfs17에 대한, 즉, 17개의 공지된 공식 레이스 중 14개에 대한 저항성을 부여한다. 중요하게, 저항성은 레이스 Pfs 8 및 Pfs 10 내지 Pfs 16과 관련하여 우성이고 (즉, RPF14 유전자 또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편의 1개의 카피가 특정 레이스에 대한 저항성을 부여하는데 충분하다), Pfs17에 대해서도 그러하다. 우성을 테스트 또는 확인하기 위해, RPF14 유전자가 감수성 시금치 식물에서 이형접합 형태로 존재할 필요가 있고, 그 후, 상이한 Pfs 레이스들, 예컨대 Pfs17에 대한 저항성을 테스트할 수 있다. 시금치 게놈에 이입 단편의 1개의 카피만 존재하는 경우에 RPF14 유전자가 여전히 특정 레이스에 대한 저항성을 부여하면, 이러한 레이스에 대한 저항성이 우성이다.
한 실시양태에서, RPF14는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 부여하고, 적어도 RPF14 유전자가 동형접합 형태인 경우, Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9, 및 또한 Pfs 분리주 UA0514 및/또는 가능하게는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 추가로 부여한다. 따라서, 본 발명의 목적은 이러한 병원체의 공식적으로 명명된 레이스 중 적어도 8개, 바람직하게는 9개 (적어도 레이스 Pfs 8 및 Pfs10 내지 Pfs 16, 바람직하게는 Pfs 8 및 Pfs10 내지 Pfs17)에 대한 우성 저항성을 부여하고, 적어도 RPF14가 동형접합 형태인 경우에 (그러나 가능하게는 이형접합 형태인 경우에도), 공식적으로 명명된 레이스 Pfs 1 내지 Pfs17 중에서, 이러한 병원체 중 적어도 14개의 레이스 (즉, 적어도 Pfs1, Pfs2, Pfs 6 내지 Pfs17)에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서, RPF14는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 부여하고, 적어도 RPF14가 동형접합으로 존재하는 경우에, 그러나 가능하게는 이형접합 형태에서도, Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9에 대한 저항성을 추가로 부여한다. Pfs 1, 2, 6, 7 및/또는 9 중 하나 이상에 대해 부여된 저항성이 우성 저항성 (RPF14 유전자의 1개의 카피가 존재하는 경우에 나타남)인지 또는 열성 저항성 (RPF14 유전자의 2개의 카피가 존재하는 경우에만 나타남)인지 여부를 1개의 카피 내의 RPF14 유전자를 Pfs1, 2, 6, 7 및/또는 9 중 하나 이상에 대한 저항성이 결여된 시금치 식물 내로 전달한 후, 식물을 이러한 레이스들에 대한 저항성에 대해 테스트함으로써 결정할 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, RPF14는 유전자가 동형접합으로 존재하는 경우에 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상에 대한 것 뿐만 아니라 유전자가 동형접합으로 존재하는 경우에 Pfs 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 부여한다.
한 측면에서, RPF14는 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 내지 17에 대한 저항성을 부여한다. 한 측면에서, 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 형태인 경우에 유전자는 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 1, 2 및 6 내지 17에 대한 저항성을 부여한다. 한 측면에서, RPF14 유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A)을 포함하거나 또는 (엠보스(Emboss) 프로그램 니들(Needle)을 예를 들어 사용하여 쌍별 정렬된 경우) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다. 따라서, 한 측면에서, 시금치 식물, 또는 상기 시금치 식물의 일부분, 또는 종자, 또는 세포, 또는 시금치 식물 세포의 세포 배양물은 이의 게놈 내에 공여자 식물로부터의 이입 단편을 포함하는 재조합 염색체를 포함하고, 상기 이입 단편은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌을 포함하는 SNP_01, 또는 상기 저항성 공여자 SNP 뉴클레오티드를 유지하는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열에 연결된 RPF14 유전자를 포함한다. 시금치는 이배체이기 때문에, SNP_01을 포함하는 이입 단편이 동형접합 형태로 존재하면, SNP_01, 즉 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 식물의 유전자형은 AA이다. SNP_01을 포함하는 이입 단편이 이형접합 형태로 존재하면, SNP_01, 즉 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 식물의 유전자형은 AC, AG 또는 AT이다.
한 측면에서, 이입 단편은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114, 또는 예를 들어 엠보스 프로그램 니들을 사용하여 쌍별 정렬된 경우의 동등한 뉴클레오티드에 아데닌이 있는, 서열식별번호: 1, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함한다.
본원에서 특정 위치, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114, "또는 이러한 서열식별번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 것"에서의 SNP 유전자형을 언급할 때, 이는 이러한 SNP 유전자형이 변이체 서열 내에서 변이체 서열, 즉 언급된 서열식별번호에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동일한 뉴클레오티드와 동등한 (예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114와 동등한) (이에 상응하는) 뉴클레오티드에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 변이체 서열이 뉴클레오티드 1개 또는 수 개가 더 짧은 것일 수 있지만, 변이체 서열을 언급된 서열식별번호와 쌍별 정렬했을 때, 변이체 서열의 어떤 뉴클레오티드가 동일한 뉴클레오티드와 동등한지 (이에 상응하는지)를 볼 수 있다. 변이체 서열에서, 이는, 예를 들어, 언급된 서열의 뉴클레오티드 114와 동등한 이러한 변이체 서열의 뉴클레오티드 번호 113 또는 115 또는 120일 수 있다.
시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 상기 단편이 새로운 저항성 유전자 RPF14를 포함하며, 이에 의해 식물이 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 갖는, 재배 시금치 식물, 또는 상기 식물의 일부분, 또는 이의 종자를 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다. 재배 시금치 식물, 또는 상기 식물의 일부분, 또는 이의 종자는, 적어도 RPF14 유전자가 동형접합 형태로 존재하는 경우, Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상, 및 또한 Pfs 분리주 UA0514에 대해 추가로 저항성이다. 재배 시금치 식물 내로 이입된 상기 단편은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01을 포함한다.
따라서, 한 측면에서, 시금치의 야생 근연종, 특히 에스. 투르케스타니카(S. turkestanica)인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함하고, 이입 단편이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에 아데닌을 포함하고, 이에 의해 이입 단편에 대해 동형접합인 시금치 식물이 SNP_01에 대해 유전자형 'AA'를 포함하는 것인 시금치 식물이 제공된다.
새로운 저항성 유전자 RPF14를 포함하는, 재배 시금치 식물, 또는 상기 식물의 일부분, 또는 이러한 식물로 성장할 수 있는 종자, 또는 세포, 또는 시금치 세포의 세포 배양물을 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이고, 여기서 상기 일부분 또는 상기 세포는 식물로 재생될 수 있고, 상기 재배 식물, 또는 재생 식물은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10-17에 대한 우성 저항성을 갖고, 바람직하게는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 (엠보스 프로그램 니들을 예를 들어 사용하여, 디폴트 파라미터를 사용하여 쌍별 정렬된 경우) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01을 포함한다. 적어도 RPF14 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 형태인 경우에, 재배 시금치 식물, 이의 식물의 일부분 또는 상기 종자는 Pfs 레이스 1, 2 및 6 내지 7 및 9에 대해, 또는 추가의 옵션에서 Pfs 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대해 추가로 저항성이다.
추가의 목적에서, 본 발명은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 저항성, 및 임의적으로 추가로 RPF14 유전자가 동형접합 형태인 경우의 Pfs 레이스 1-2 및 6 내지 7 및 9에 대한 저항성 및 Pfs 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 포함하는 재배 시금치 식물을 생성시키는 방법이고, 여기서 식물이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 (엠보스 프로그램 니들을 예를 들어 사용하여 쌍별 정렬된 경우) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
따라서, 한 측면은 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 이형접합 및 동형접합 형태에서 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자를 포함하고, 상기 유전자가 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에 아데닌을 포함하는 서열식별번호: 1, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하고 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114와 동등한 뉴클레오티드 위치에 아데닌을 포함하는 서열에 연결된 것인 재배 시금치 식물을 제공한다.
서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에서의 아데닌, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114와 동등한 뉴클레오티드 위치에서의 아데닌의 존재를 결정하는 것
을 포함하는, 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 이형접합 및 동형접합 형태에서 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자를 포함하는 것인 시금치 식물, 식물의 일부분 또는 세포를 확인 또는 선별하는 방법이 또한 제공된다.
방법은 RPF14 유전자에 의해 부여되는 바와 같은 본원에서 언급된 Pfs 레이스 중 하나 이상에 대한 저항성 표현형을 테스트하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
뉴클레오티드 114 또는 변이체 서열의 동등한 뉴클레오티드에 아데닌이 존재하는 것을 관련 분야에 공지되어 있는 다양한 방법, 예컨대 SNP 유전자형결정 방법, 시퀀싱 등에 의해 결정할 수 있다.
또한, 본 발명은 새로운 저항성 유전자 RPF14를 포함하고, 여기서 상기 유전자가 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 재배 시금치 종자 또는 상기 종자로부터 유래된 자손에 존재하거나, 이로부터 수득될 수 있거나 유래될 수 있는 바와 같은 유전자인, 재배 시금치 식물, 이의 식물의 일부분, 또는 이러한 식물로 성장할 수 있는 종자, 뿐만 아니라 세포 또는 세포 배양물을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 시금치의 야생 근연종, 특히 에스. 투르케스타니카인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 유전자가 이형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하고, 유전자가 동형접합 형태인 경우 레이스 1, 2 및 6 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함하고, 이입 단편이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에 아데닌을 포함하고, 상기 유전자가 대표적인 종자 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물에 존재하는 유전자인 시금치 식물이 제공된다.
페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 포함하고, 여기서 상기 저항성이 단일 유전자를 포함하는 이입 단편에 의해 부여되고, 상기 이입 단편이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 SNP_01에 대해 아데닌을 포함하고, 상기 유전자가 대표적인 종자 샘플이 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물에 존재하는 유전자인 스피나시아 올레라세아 종의 시금치 식물이 제공된다.
상기 시금치 식물의 자손 식물이고, 상기 자손 식물이 저항성 유전자를 포함하고 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 SNP_01에 대해 아데닌을 포함하는 이입 단편을 유지하고, 이러한 유전자가, 유전자가 이형접합 형태인 경우에, 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 것인 자손 식물이 또한 제공된다.
추가로, 본 발명은 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 상기 단편이 새로운 저항성 유전자 RPF14를 포함하고, 상기 이입 단편이 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 재배 시금치 종자에 존재하거나 또는 이로부터 수득될 수 있거나 유래될 수 있는 바와 같은 단편이거나, 또는 RPF14를 유지하는 상기 이입 단편의 하위-단편을 포함하는 것인, 재배 시금치 식물, 이의 식물의 일부분 또는 이러한 식물로 성장할 수 있는 종자, 뿐만 아니라 세포 또는 세포 배양물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 이입 단편 또는 하위-단편은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A)을 포함하거나 또는 (엠보스 프로그램 니들을 예를 들어 사용하여 쌍별 정렬된 경우) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성, 및 추가로 적어도 저항성 유전자가 동형접합 형태인 경우의 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9에 대한 저항성, 및 Pfs 분리주 UA0514에 대한 저항성을 포함하는 재배 시금치 식물, 또는 이의 종자, 식물의 일부분 또는 세포 또는 세포 배양물을 생성시키거나 또는 확인하는 방법도 제공한다. 본 발명은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A)을 포함하거나 또는 (엠보스 프로그램 니들을 예를 들어 사용하여 쌍별 정렬된 경우) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 임의적으로 사용하는, RPF14 유전자 또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편의 확인, 선별 또는 검출을 위한 방법을 또한 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 저항성 유전자 RPF14는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다.
한 측면에서, 저항성 유전자 RPF14는 재조합 염색체 상의 이입 단편, 또는 이러한 단편의 일부분 상에 위치한다. 한 실시양태에서, 이입 단편은 시금치 게놈의 3번 염색체 상에 있고, 여기서 3번 염색체는 SpinachBase 데이터베이스에 확인되고 상기 문헌 [Xu et al. (2017)]에 기술된 바와 같은 염색체이다. SNP_01은 데이터베이스 내의 3번 염색체의 뉴클레오티드 607778에 위치한다. 이는 RPF14를 포함하는 이입 단편을 포함하지 않는, 재배 시금치 변종의 서열이기 때문에, SNP_01은 뉴클레오티드 607778에 구아닌을 갖는다. 한 측면에서, RPF14 유전자는 3번 염색체 상에서 뉴클레오티드 607778 (0.6 Mb)에서의 SNP_01과 3번 염색체의 뉴클레오티드 1219930 (1.2 Mb) 사이에 위치한다. 따라서, RPF14 유전자가 발견되는 3번 염색체 영역은 비교적 작다 (0.6 Mb 영역). 시퀀싱 또는 정밀 맵핑이 이러한 영역을 추가로 좁힐 수 있고, 이러한 영역에서 발견되는 유전자의 Crispr/Cas 유전자 편집을 사용하여, 영역 내에 존재하는 야생 공여자로부터 이입된 유전자 중 어느 것이 저항성 표현형을 담당하는지를 나타낼 수 있다.
'단일 유전자'에 대한 본원에서의 언급은 저항성의 분리가 단일 유전자 또는 유전자좌의 분리 비를 갖는 것을 의미한다는 것을 주지한다 (실시예 참조). 이는 '단일 유전자' 또는 유전자좌로서 분리되는 이입 단편 상의 여러 밀접하게 연결된 유전자들이 있을 수 있다는 것을 배제하지 않는다
따라서, 본 발명의 한 측면에서, 재배 시금치 식물 또는 이러한 식물로 성장할 수 있는 종자 또는 식물의 일부분 또는 재배 시금치 세포 / 세포 배양물은 시금치의 야생 근연종으로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 단편은 RPF14를 포함하고, SNP_01에 대해 야생 공여자 SNP 뉴클레오티드를 포함한다. RPF14를 포함하는 DNA 단편은 시금치의 야생 근연종 (저항성 유전자의 공여자)으로부터 이입되고, 한 바람직한 측면에서, 시금치의 야생 근연종은 스피나시아 투르케스타니카이다. 재배 시금치 (반복친) 내로 유전자가 이입되었다. 따라서, 본 발명은 상기 시금치의 야생 근연종으로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 이입 단편이 RPF14 유전자, 및 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01을 포함하는 것인, 재배 시금치 식물, 또는 이러한 식물이 이로부터 성장할 수 있는 종자, 식물의 일부분 또는 이의 세포 배양물을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 식물은 이입 단편에 대해 이형접합이고, 서열식별번호: 1의 위치 114 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에 뉴클레오티드 A를 갖는 염색체 1개를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 식물은 이입 단편에 대해 동형접합이고, 서열식별번호: 1의 위치 114 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에 뉴클레오티드 A를 갖는 염색체 2개를 포함한다. 바람직하게는, 2개의 염색체는 동일한 이입 단편을 갖고, 즉, 이입 단편의 뉴클레오티드 서열 및 단편의 크기 및 위치가 동일하다.
추가의 목적은 RPF14 저항성 유전자를 포함하는 식물 또는 식물의 일부분 또는 세포의 선별에서 사용될 수 있는 하나 이상의 DNA 마커를 제공하는 것이다. 본원에서 제공되는 한 마커는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01이다. 공여자의 에스. 투르케스타니카 단편을 확인하기 위해, 예를 들어, 이입 단편 (예를 들어 NCIMB 42607에 존재하는 바와 같음)을 포함하는 3번 염색체 영역을 시퀀싱함으로써, RPF14 유전자 및/또는 이입 단편에 연결된 다른 DNA 마커가 통상의 기술자에 의해 개발될 수 있다. 예를 들어, 에스. 투르케스타니카 단편과 에스. 올레라세아(S. oleracea) 사이의 임의의 다형성이 RPF14를 포함하는 이입 단편을 선별 또는 확인하기 위한 마커로서 사용될 수 있다.
기탁된 종자의 게놈을 시퀀싱함으로써, 단일 특정 에스. 투르케스타니카 공여자 식물 / 수탁물의 이입 단편 (특정 뉴클레오티드 서열을 갖고, 이는 다형성이고, 3번 염색체 상에서 교체하는 에스. 올레라세아 서열과 상이하며, 다른 에스. 투르케스타니카 식물 / 수탁물과도 상이함)이 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있다. 또한, 이입 단편은 임의의 다른 시금치 식물로부터, 이러한 시금치 식물이 동일한 저항성 표현형을 갖더라도, 본 발명의 식물을 구별하는 것에 사용될 수 있다. 예를 들어, RPF14를 포함하고 기탁된 종자 NCIMB42607에서와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는, 본원에서 사용된 단일 특정 공여자 식물은 NCIMB 42608 (RPF15를 포함함), NCIMB 42159 (RPF12를 포함함), NCIMB 42158 (RPF11을 포함함)을 생성시키는데 사용된 공여자 식물과 상이한 공여자 식물이다. 따라서, 저항성 유전자가 상이할 뿐만 아니라, 각각의 이입 단편은 이의 크기, 염색체의 영역 및 뉴클레오티드 서열 면에서도 독특하다.
또한, 상기 저항성 유전자를 포함하는 식물 또는 식물의 일부분 또는 세포를 생성시키거나 확인하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, RPF14로 지정된 저항성 유전자 또는 유전자에 연결된 DNA 마커, 예컨대 SNP_01 또는 서열식별번호: 1을 선별하고/하거나, 확인하고/하거나 검출하는 방법은, 예를 들어, 하나 이상의 핵산 프로브 (예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하고 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114 또는 동등한 위치에 아데닌을 포함하는 서열에 혼성화함)를 RPF14를 포함하는 것으로 추정되는 식물의 핵산에 혼성화시키거나, 또는 RPF14를 포함하는 것으로 추정되는 식물의 핵산을 하나 이상의 핵산 프라이머를 사용하여 증폭시키는 것을 포함한다. 프라이머는, 예를 들어, SNP_01을 검출하도록, 그리고 SNP_01의 SNP 유전자형을 결정하도록 제조될 수 있다.
RPF14는 시금치의 야생 근연종 (공여자 또는 저항성 유전자 공여자)으로부터, 바람직하게는 에스. 투르케스타니카로부터 재배 시금치 (반복친 또는 수용자로 또한 지칭됨) 내로 이입된다. 한 측면에서, 시금치의 야생 근연종으로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 이입 단편이 RPF14 유전자를 포함하고, 임의적으로 RPF14 유전자가 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01에 연결된, 재배 시금치 식물 또는 식물의 일부분이 제공된다.
RPF14를 포함하는 식물 또는 식물의 일부분 또는 종자 또는 세포 또는 세포 배양물의 확인을 위한 유전자의 용도 및/또는 유전자에 물리적으로 연결된 분자 마커 (특히 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP, 더욱 구체적으로는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01)의 용도, 및 RPF14를 포함하는 식물 또는 식물의 일부분 또는 종자 또는 세포 또는 세포 배양물을 확인하거나 또는 생성시키는 것에서 이러한 마커를 사용하는 방법이 또한 제공된다.
한 측면에서, 재배 시금치는 재조합 염색체, 특히 재조합 3번 염색체 (상기 문헌 [Xu et al., 2017]에서 지칭된 바와 같음)를 포함하고, 상기 염색체는 이입 단편을 포함하며, 이는 차례로 RPF14를 포함하고, 임의적으로, 한 측면에서, 이입 단편은 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드 (즉 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A)를 포함한다. 추가 측면에서, 상기 식물의 나머지 염색체는 재배 시금치 염색체이다. 한 실시양태에서, 재조합 염색체는 3번 염색체 (상기 문헌 [Xu et al., 2017]에서 지칭된 바와 같음)이다.
한 측면에서, 이입 단편 (RPF14를 포함함)은 3번 염색체 (SpinachBase에 존재하는 바와 같음)의 상부에 존재하고, 여기서 상부는 3번 염색체의 0 Mb 내지 2.0 Mb이다. 한 측면에서, RPF14는 3번 염색체의 0.4 Mb에서 시작하여 1.5 Mb에서 끝나는 영역에 위치한다. 한 측면에서, 이입 단편은 크기가 2 Mb 이하이고, RPF14 유전자를 포함한다. 한 측면에서, 이입 단편은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자에 존재하는 단편과 동일한 뉴클레오티드 서열 및 동일한 크기를 갖고, RPF14 유전자 (본원에 기술된 바와 같은 저항성 표현형을 부여함)를 포함한다. 한 측면에서, 이입 단편은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자에 존재하는 단편과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고, RPF14 유전자 (본원에 기술된 바와 같은 저항성 표현형을 부여함)를 포함하지만, 기탁된 종자에서 발견되는 단편보다 크기가 더 작다. 따라서, 예를 들어, 전체 크기 단편의 일부분이, 예를 들어 RPF14 유전자의 어느 한쪽 측면 상에서, 재조합에 의해 제거되었을 수 있다. 한 측면에서, 이입 단편은 RPF14 및 서열식별번호: 1을 포함한다.
한 측면에서, RPF14 유전자 및/또는 이입 단편 및/또는 재조합 염색체는 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자, 또는 상기 종자로부터 성장된 식물 종자, 또는 자신의 게놈 내에 RPF14 유전자를 유지하는 이의 자손, 예컨대 임의적으로 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01에 연결된 RPF14 유전자를 유지하는 자손에 존재하는 유전자 및/또는 이입 단편 및/또는 재조합 염색체이다. 한 측면에서, 통상의 기술자가 RPF14 유전자를 유지하지만 공여자의 SNP_01가 결여되고, 따라서 더 짧은 이입 단편을 포함하는 식물을 또한 선택할 수 있지만, 자손은 공여자의 SNP_01 뉴클레오티드를 유지한다. 따라서, 한 측면에서, RPF14 유전자가 여전히 존재하면서, SNP_01의 SNP 뉴클레오티드 또한 반복친의 뉴클레오티드일 수 있다. 통상의 기술자는 기탁된 종자에 존재하고/하거나 자손에 존재하는 이입 단편을 시퀀싱하여, 식물의 저항성 표현형이 본 발명의 RPF14 유전자에 의해 부여되는지 여부를 결정할 수 있다. 이입 단편 (및 재조합에 의해 생성된 이의 임의의 하위단편)은 특정 공여자로부터 유래된 특정 게놈 서열이고, 따라서 독특하다.
정의
본원에서 인용된 모든 특허 및 비-특허 문서는 전문이 참고로 포함된다.
1개 및 오직 1개의 요소만 있는 것이 문맥에서 명확하게 요구되지 않는 한, 단수 형태는 1개를 초과하는 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 단수 형태는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
"식물 변종"은 공지된 가장 낮은 등급의 동일한 식물 분류군 내의 식물들의 군이고, 이는 (식물 육종가의 권리의 인식을 위한 조건이 충족되는지 또는 그렇지 않은지 여부과 관계 없이) 특정 유전자형 또는 유전자형들의 조합으로부터 초래되는 특성의 발현을 기초로 정의될 수 있고, 이러한 특성들 중 적어도 하나의 발현에 의해 임의의 다른 군의 식물로부터 구별될 수 있으며, 실체로 간주될 수 있는데, 어떠한 변화도 없이 증식될 수 있기 때문이다. 따라서, 일군의 식물 모두가 1개 또는 2개의 유전자좌 또는 유전자의 존재 (또는 이러한 특정 유전자좌 또는 유전자로 인한 표현형 특성)에 의해 특성화되지만, 다른 유전자좌 또는 유전자와 관련하여 서로 크게 다를 수 있다면, 이들이 동일한 종류의 것이라도, 일군의 식물을 표시하는 데 용어 "식물 변종"이 사용될 수 없다.
본원에서 "시금치" 또는 "재배 시금치" 또는 "재배 스피나시아 올레라세아"는 식품용으로 인간에 의해 육종되고 양호한 작물학적 특성이 있는, 스피나시아 올레라세아 종의 식물 (또는 이로부터 식물이 성장될 수 있는 종자), 및 이러한 식물의 일부분을 지칭한다. 이는 임의의 재배 시금치, 예컨대 육종 계통 (예를 들어, 역교배 계통, 순계), 재배종 및 변종 (개방 수분 또는 잡종)을 포함한다. 이는 임의 유형의 시금치, 예컨대 사보이(savoy), 플랫(flat)- 또는 스무드(smooth)-리프(leaf) 시금치 또는 세미-사보이(semi-savoy) 유형을 포함한다. 야생 시금치 (즉 비-재배 시금치) 또는 시금치의 야생 근연종, 예컨대 스피나시아 테트란드라 및 스피나시아 투르케스타니카는 이러한 정의에 포함되지 않는다.
"시금치의 야생 근연종"은 재배되지 않은 스피나시아(Spinacia) 과의 식물, 특히 스피나시아 테트란드라 및 스피나시아 투르케스타니카를 포함한다. 이러한 종들은 RPF14 유전자, 및 임의적으로, RPF14 유전자에 연결된 DNA 마커, 예컨대 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A를 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01의 공여자 식물로서 또한 지칭되고, 즉, RPF14 유전자, 및 임의적으로 SNP_01을 포함하는 단편이 상기 공여자 식물로부터 수득되거나 또는 수득될 수 있다. "스피나시아 투르케스타니카"는 언급된 문헌 [Acta Inst. Bot. Acad. Sc. URSS, Ser. I. Fasc. 2, 123 (1936)]에 기술된 시금치의 야생 근연종이다. 본 발명의 한 측면에서, RPF14 유전자의 공여자 식물은 스피나시아 투르케스타니카 식물이다; 한 측면에서, 이입 단편은 NCIMB 42607 내로 이입된 바와 같은 에스. 투르케스타니카 공여자 수탁물의 단편 (SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함함), 또는 이러한 이입 단편의 하위단편 (예를 들어 감수분열 재조합에 의해 생성된 더 작은 단편)이고, 이러한 하위단편은 RPF14 저항성 표현형을 부여하고, 바람직하게는 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "식물"은 종자 (이로부터 식물이 성장될 수 있음), 전체 식물 또는 임의의 일부분 예컨대 식물 기관 (예를 들어, 수확된 잎 또는 비-수확 잎 등), 식물 세포, 식물 원형질체, 이로부터 전체 식물이 재생될 수 있는 식물 세포- 또는 조직 배양물, 번식 또는 비-번식 식물 세포, 조직 배양물 내에 있지 않은 (그러나, 예를 들어, 식물 또는 식물의 일부분 내에서 생체 내에 있는) 식물 세포, 단리된 식물 세포, 식물 캘러스, 원형질체, 소포자, 식물 세포 클럼프, 식물 이식물, 모종, 식물 내의 무손상 식물 세포, 식물 클론 또는 미세-번식물, 또는 식물의 일부분 (예를 들어, 수확된 조직 또는 기관), 예컨대 식물 절단물, 영양 번식물, 클론 번식 식물, 자엽, 배축, 잎, 가공된 잎, 줄기, 대, 출아물, 싹, 뿌리, 뿌리 끝부분, 잎자루, 꽃, 꽃잎, 수술, 꽃밥, 암술머리, 암술대, 씨방, 꽃가루, 배주, 배아, 배낭, 열매, 분열조직, 형성층, 종자 (자가-수정 또는 타가 수정 후에 식물 상에서 생산됨), 모계 조직인 종자의 일부분, 접목물, 접순물, 대목, 이들 중 임의의 것의 일부분 등을 포함하고, 바람직하게는 이들은 자신이 수득되는 식물과 동일한 유전적 구성 (또는 매우 유사한 유전적 구성)을 갖는다. 임의의 발달 단계, 예컨대 모종, 뿌리내리기 전 또는 후의 절단물, 성숙 및/또는 미성숙 식물 또는 성숙 및/또는 미성숙 잎 또한 포함된다. "식물의 종자"가 언급되는 경우, 이는 이로부터 식물이 성장될 수 있는 종자, 또는 자가-수정 또는 타가 수정 후에 식물에서 생산된 종자를 지칭한다.
"조직 배양물" 또는 "세포 배양물"은 동일하거나 상이한 유형의 단리된 세포 또는 식물 조직으로 조직된 이러한 세포의 선집을 포함하는 시험관내 조성물을 지칭한다. 시금치의 조직 배양물 및 세포 배양물, 및 이로부터의 시금치 식물의 재생이 널리 공지되어 있고, 광범위하게 공개되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nguyen et al., 2013, Plant Biotechnology Reports, Vol. 7 Issue 1, p99]을 참조한다).
본원에서 "수확된 식물 물질"은 추가 보관 및/또는 추가 사용을 위해 수집된 식물의 일부분 (예를 들어, 전체 식물로부터 분리된 잎)을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "수확된 잎"은 시금치 잎, 즉, 뿌리 시스템이 없는 식물, 예를 들어 실질적으로 모든 (수확된) 잎을 지칭한다. 수확된 잎은 가공될 수 있다. "수확된 종자"는 계통 또는 변종으로부터 수확된, 예를 들어, 자가-수정 또는 타가 수정 후에 생산되고 수집된 종자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "자손" 또는 "자손들" 또는 "후손"은 동형접합 또는 이형접합 형태의 RPF14 저항성 유전자를 포함하고/하거나 (유지하고/하거나) 본원에 기술된 RPF14 저항성 표현형을 포함하는, 본 발명의 식물로부터 수득된 (수득될 수 있는) 자식, 또는 1세대 및/또는 모든 추가 후손을 지칭한다. 자손은 세포 배양물 또는 조직 배양물, 또는 식물의 일부분의 재생, 또는 식물의 자가수정, 또는 식물의 종자를 생산하는 것에 의해 수득될 수 있다. 추가 실시양태에서, 자손은 적어도 하나의 시금치 식물과 동일한 또는 또 다른 변종 또는 (육종) 계통의 또 다른 시금치 식물의 교배, 및/또는 역교배, 및/또는 식물 내로의 유전자좌의 삽입 및/또는 돌연변이로부터 수득된 시금치 식물을 또한 포함할 수 있다. 자손은, 예를 들어, 1세대 자손, 즉, 예를 들어, 전통적인 육종 방법 (자가수정 및/또는 교배) 또는 재생에 의해, 양친 식물로부터 직접적으로 유래되거나, 수득되거나, 수득될 수 있거나 또는 유래될 수 있는 자손이다. 그러나, 일반적으로 용어 "자손"은 추가 세대 예컨대 2세대, 3세대, 4세대, 5세대, 6세대, 7세대 또는 이를 초과하는 세대, 즉, 예를 들어, 전통적인 육종 방법, 재생 또는 유전적 형질전환 기술에 의해, 이전 세대로부터 유래되거나, 수득되거나, 수득될 수 있거나 또는 유래될 수 있는 식물 세대를 포함한다. 예를 들어, 상기 언급된 방법 중 임의의 것에 의해 제1세대 자손으로부터 제2세대 자손이 생산될 수 있다. 이중 반수체 식물 또한 자손이다.
"식물 계통"은, 예를 들어, 하나 이상의 변종을 개발하는데 사용될 수 있는 육종 계통이다. "순계" 또는 "순계 양친"은 수 세대 동안 식물의 자가수정에 의해 개발된 식물 계통이고, "F1 잡종" (또는 웅성 양친 계통과 자성 양친 계통을 교배함으로써 제조된 단일-교배 잡종)에 대한 양친으로서 사용될 수 있다. "웅성 육종 계통" 또는 "웅성 양친" 또는 "웅성 양친 계통"은 웅성 양친, 즉 꽃가루 공여자이다. "자성 육종 계통" 또는 "자성 양친" 또는 "자성 양친 계통"은 자성 양친, 즉 배주 공여자이다. 시금치 육종에서, 자성 양친은 전형적으로 웅성 꽃보다 적어도 3주 전에 자성 꽃을 생산한다. 이는 F1 잡종 종자 생산에서 자가수정된 자성 양친 계통의 존재를 방지하거나 또는 강하게 감소시킨다.
"엘리트 시금치 식물"은 재배자가 상업적으로 바람직한 생성물을 수확하도록 허용하는 바람직한 작물학적 형질을 초래하는 유전자형을 갖는 식물, 전형적으로는 잡종이다. "엘리트 양친 계통"은 이의 잡종 자손에서 바람직한 작물학적 형질을 초래하는 유전자형을 갖는 순계 양친이다. "엘리트 자성 양친"은 또한 우수한 종자 생산자이다.
"F1, F2, F3 등"은 2개의 양친 식물 또는 양친 계통 사이의 교배 후의 연속적인 관련된 세대를 지칭한다. 2개의 식물 또는 계통을 교배시킴으로써 생산된 종자로부터 성장된 식물을 F1 세대로 칭한다. F1 식물의 자가수정이 F2 세대를 초래하는 등이다.
"잡종"은 하나의 식물 계통 또는 변종을 또 다른 식물 계통과 교배시킴으로써 수확된 종자, 및 상기 종자로부터 성장된 식물 또 식물의 일부분을 지칭한다.
"교배"는 2개의 양친 식물을 짝지우는 것을 지칭한다. 마찬가지로, "타가-수분"은 상이한 식물들로부터의 2개의 생식자의 결합에 의한 수정을 지칭한다.
"자가수정"은 식물의 자가-수분, 즉 동일한 식물로부터의 생식자의 결합을 지칭한다.
본원에서 용어 "전통적인 육종 기술"은 예를 들어, 이에 의해 RPF14-저항성 유전자가 수득, 확인, 선별 및/또는 전달될 수 있는, 육종자에게 공지되어 있는 바와 같은 교배, 역교배, 자가수정, 선별, 염색체 배가, 이중 반수체 생산, 배아 구제, 가교 종의 사용, 원형질체 융합, 마커 보조 선별, 돌연변이 육종 등 (즉, 유전적 변형/형질전환/트랜스제닉 방법 이외의 방법)을 포함한다.
"역교배"는 (단일) 형질, 예컨대 RPF14 저항성 유전자에 의해 부여되는 Pfs 저항성이 하나의 유전적 배경 ("공여자"로도 지칭됨; 필수적이지는 않지만 일반적으로, 이는 열등한 유전적 배경이다)에서 또 다른 유전적 배경 ("반복친" 또는 "수용자"로도 지칭됨; 필수적이지는 않지만 일반적으로, 이는 우월한 유전적 배경이다)으로 전달될 수 있는 육종 방법을 지칭한다. 교배물의 자식 (예를 들어, 공여자, 예를 들어 시금치의 야생 근연종을 수용자, 예를 들어 재배 시금치 계통과 교배시킴으로써 수득된 F1 식물; 또는 F1의 자가수정으로부터 수득된 F2 식물 또는 F3 식물 등)이 우월한 유전적 배경이 있는 양친 (또는 수용자), 예를 들어 재배 양친에 "역교배"된다. 반복된 역교배 후, 공여자 유전적 배경의 형질, 예를 들어 RPF14 유전자가 반복친 유전적 배경 내로 혼입되었을 것이다. 이러한 맥락에서의 "유전자가 전환된" 또는 "전환 식물" 또는 "단일 유전자좌 전환"이라는 용어는 공여자 양친으로부터 전달된 하나 이상의 유전자 (예를 들어 RPF14 저항성 유전자)에 더하여 반복친의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및/또는 생리학적 특성이 회복된, 역교배에 의해 개발된 식물을 지칭한다.
"재생"은 시험관내 세포 배양 또는 조직 배양 또는 영양 번식으로부터의 식물의 발달을 지칭한다.
"영양 번식", "영양 생식" 또는 "클론 번식"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 식물의 일부분을 취하고, 이러한 식물의 일부분이 적어도 뿌리를 형성하게 허용하는 방법을 의미하며, 여기서 식물의 일부분은, 예를 들어, 잎, 잎의 일부분, 줄기, 줄기의 일부분, 대, 대의 일부분, 출아물, 출아물의 일부분, 싹 또는 싹의 일부분, 절단물, 뿌리, 뿌리의 일부분, 뿌리 끝부분, 잎자루, 잎자루의 일부분, 자엽, 자엽의 일부분, 꽃, 꽃의 일부분, 꽃잎, 꽃잎의 일부분, 수술, 수술의 일부분, 꽃밥, 꽃밥의 일부분, 꽃가루, 암술머리, 암술머리의 일부분, 암술대, 암술대의 일부분, 씨방, 씨방의 일부분, 배주, 배주의 일부분, 종자, 종자의 일부분, 종자 외피, 배아, 배아의 일부분, 배축, 배낭, 열매, 열매의 일부분, 세포, 원형질체, 캘러스, 소포자, 분열조직, 형성층으로 정의되거나, 또는 (예를 들어, 절단하는 것에 의해) 이로부터 유래된다. 전체 식물이 영양 번식에 의해 재생성되는 경우, 이는 "영양 번식물" 또는 "영양 번식 식물"로 또한 지칭된다.
"단일 유전자좌가 전환된 식물 (단일 유전자좌 전환 식물)"은 역교배를 포함하거나 또는 역교배로 이루어지는 식물 육종 기술에 의해 개발된 식물을 지칭하고, 여기서 역교배 기술을 통해 및/또는 유전적 형질전환에 의해 식물 내로 전달된 단일 유전자좌 (예를 들어, 공여자로부터의 RPF14 유전자를 포함하는 유전자좌)의 특성에 더하여 시금치 식물의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및/또는 생리학적 특성이 회복된다.
"트랜스진" 또는 "키메라 유전자"는 형질전환에 의해 시금치 식물의 게놈 내로 도입된 DNA 서열을 포함하는 유전적 유전자좌를 지칭한다. 자신의 게놈 내로 안정적으로 통합된 트랜스진을 포함하는 식물을 "트랜스제닉 식물"로 지칭한다.
"Pfs" 또는 "페로노스포라 파리노사" 또는 "피. 에푸사" 또는 "노균병"은 난균강 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에의 레이스를 지칭한다. 이러한 정의는 적어도 공식적으로 인정된 레이스 및 분리주를 포함한다. Pfs1-Pfs17은 나크투인보우(Naktuinbouw) (네덜란드 뢸로파렌드스빈 2370 에이에이 피.오. 박스 40)로부터 또는 ISF (국제 종자 연맹)가 제공하는 기준물을 통해 수득될 수 있는 차등적인 시금치 숙주들 상에서 구별될 수 있는, 공식적으로 인정된 레이스를 지칭한다. 공식적으로 인정되는 병원성 레이스들이 널리 확산되어 있다. "차등물 숙주" 또는 "차등물"은 언급된 나크투인보우 (네덜란드 뢸로파렌드스빈 2370 에이에이 피.오. 박스 40)로부터 또는 ISF (국제 종자 연맹)가 제공하는 기준물을 통해 수득될 수 있는, Pfs 레이스 1-17을 구별하기 위한 차등적인 시금치 숙주들을 지칭한다. 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 16은 미국 캘리포니아주 살리나스에서 최초로 확인되었고 (2015년 3월), 이후에 널리 확산된 것으로 발견되었다. 이의 원래의 명칭은 UA201519B였고, 이는 "차등물 변종들의 표준 세트 상에서의 질병 발달을 기초로 특성화되었다". "Pfs: 16 레이스는 차등물 바이로플레이, 레시스토플레이, 클레몬트, 라지오, 피전, 및 미어캣을 감염시킬 수 있지만, 캘리플레이, 캠파니아, 보잉 (어벤저(Avenger)), 라이언, 웨일 및 칼라도니아는 감염시킬 수 없다". 공식적으로 인정되는 레이스가 될 수 있는 다수의 다른 분리주들이 있다. 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에의 중요한 분리주는 UA0514이다.
"Pfs 저항성 식물" 또는 "노균병 저항성 식물", 또는 "Pfs 저항성" 또는 "Pfs 저항성 표현형"을 갖는 식물은, 예를 들어, 제어된 환경 조건 하의 정성적 저항성 검정법에서 결정된 바와 같이, Pfs의 하나 이상의 병원성 레이스 (및 병원성 분리주)에 대해 저항성인 시금치 식물을 지칭한다. 이러한 저항성 검정법에서, 한 유전자형의 복수의 식물 (예를 들어, 적어도 10개의 식물의 적어도 2회의 반복)에 레이스 또는 분리주의 포자낭 현탁액을 접종하고, 적절한 조건 하에 인큐베이션한다. 적절한 인큐베이션 기간 (예를 들어, 접종 후 7, 8, 9, 10, 11일 또는 이를 초과하는 일수) 후, 식물을 증상에 대해 평가한다. 감수성 대조군은 증상 평가 시점에 포자형성을 나타내야 한다. 자엽 상에서 (및/또는 진엽/잎 상에서) 포자형성을 나타내는 식물은 "감수성"으로 간주되는 한편, 자엽 상에서 (및/또는 진엽/잎 상에서) 어떠한 포자형성도 나타내지 않는 식물은 "저항성"으로 간주된다. 접종된 식물의 85% 초과 (바람직하게는 90% 또는 95% 초과)가 "저항성" 식물로 분류되는 식물 유전자형은 이러한 레이스 또는 분리주에 대해 저항성인 것으로 간주된다. 테스트에서, 감수성 대조군 식물, 예컨대 바이로플레이 재배종의 접종된 식물의 85% 초과 (바람직하게는 식물의 90% 또는 95% 초과)가 포자형성을 나타내야 한다. 적절한 테스트가 본원의 실시예에서, 또는 문헌 [Irish et al. 2007, Plant Disease Vol 91 No. 11]의 1392 - 1394면의 <Materials and Methods>에서, 또는 ISF (국제 종자 연맹)의 웹사이트에서 확인되는 문헌 [Correll et al. 2010, "Guidelines for Spinach Downy Mildew: Peronspora ferinosa f.sp. spinaciae (Pfs)"]에서 기술된다.
본원에서 "RPF14"는 (유전자가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에) 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성 (상기 정의된 바와 같음)을 부여하고, 적어도 유전자가 동형접합 형태인 경우에 (그러나 가능하게는 유전자가 이형접합 형태인 경우에도) Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9에 대한 저항성, 및 분리주 UA0514 및/또는 Pfs의 다른 병원성 분리주에 대한 저항성을 추가로 부여하는, 시금치의 야생 근연종으로부터의 단일 유전자를 지칭한다. 본 발명의 한 측면에서, RPF14에 의해 부여되는 저항성은 적어도 Pfs 레이스 8 내지 16 (한 측면에서, 적어도 레이스 8 내지 17)에 대한 것이고, 적어도 유전자가 동형접합 형태인 경우에 부여된다. 본 발명의 한 측면에서, RPF14에 의해 부여되는 저항성은 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17에 대한 것이고, 추가로 다른 병원성 분리주 예컨대 UA0514에 대한 것이며, 적어도 유전자가 동형접합 형태인 경우에, 그리고 가능하게는 유전자가 이형접합 형태인 경우에 부여된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, Pfs 레이스 1, 2, 6, 7, 및 9 중 하나 이상, 및 추가로 분리주 UA0514 및/또는 다른 병원성 분리주에 대한 저항성은 유전자가 동형접합 형태인 경우에 부여된다. 저항성 표현형은 본원에서 "RPF14 유전자에 의해 부여되는 Pfs 저항성 표현형"으로도 지칭된다. 본 발명의 추가 측면에서, RPF14는 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편 상에 또는 이입 단편의 일부분 상에 위치한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, RPF14는 시금치의 야생 근연종으로부터 이입되고, 한 측면에서 시금치의 야생 근연종은 에스. 투르케스타니카이다. 본 발명의 추가 측면에서, RPF14는 제1 DNA 마커와 제2 DNA 마커 사이에 위치한다. 또 다른 측면에서, RPF14는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 물리적으로 연결된다.
용어 "유전자좌" (유전자좌들)는 예를 들어 유전자 (예를 들어 RPF14 유전자) 또는 유전적 마커가 발견되는 염색체 상의 특정 장소 또는 장소들 또는 부위를 의미한다. 본 발명에 따른 시금치에서, RPF14 유전자를 포함하는 저항성 유전자좌가 시금치의 야생 근연종, 예를 들어 에스. 투르케스타니카의 저항성 수탁물 (즉, 공여자 식물)로부터 재배 시금치 내로 이입된다. RPF14 유전자가 발견되는 유전자좌는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 물리적 및 유전적으로 연결된다.
용어 "대립유전자(들)"는 특정 유전자좌에서의 유전자의 하나 이상의 대안적인 형태들 중 임의의 것을 의미하고, 모든 대립유전자는 특정 유전자좌에서의 하나의 형질 또는 특성에 관련된다. 생물의 이배체 세포에서, 소정의 유전자의 대립유전자들이 염색체 상의 특정 위치 또는 유전자좌 (유전자좌들) 상에 위치한다. 하나의 대립유전자가 상동 염색체 쌍의 각각의 염색체 상에 존재한다. 이배체 식물 종은 특정 유전자좌에 다수의 상이한 대립유전자를 포함할 수 있다. 이들은 유전자의 동일한 대립유전자 (동형접합) 또는 2개의 상이한 대립유전자 (이형접합)일 수 있다.
용어 "유전자"는 세포에서 메신저 RNA 분자 (mRNA)로 전사되는 영역 (전사 영역), 및 작동가능하게 연결된 조절 영역 (예를 들어 프로모터)을 포함하는 (게놈) DNA 서열을 의미한다. 따라서, 유전자의 상이한 대립유전자는 이러한 유전자의 상이한 대안적인 형태이고, 이는, 예를 들어, 게놈 DNA 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 프로모터 서열, 엑손 서열, 인트론 서열 등), mRNA 및/또는 코딩되는 단백질의 아미노산 서열에서의 차이의 형태일 수 있다.
"대립유전자성 테스트"는 2개의 식물에서 보이는 2개의 표현형이 동일한 유전자에 의해 결정되는지 또는 상이한 유전자에 의해 결정되는지 여부를 테스트할 수 있는 유전자 테스트를 지칭한다. 예를 들어, 테스트될 식물을 서로 교배시키고, F1을 자가수정시키고, F2 자손 사이에서의 표현형의 분리를 결정한다. 분리 비가 유전자가 대립유전자성인지 아닌지를 지시한다. 예를 들어, HMBN 대립유전자가 dw-1 및 dw-2 대립유전자에 대해 대립유전자성이지 않고, 상이한 유전자좌에 있다는 것을 나타내도록 대립유전자성 테스트가 사용된 EP1816908B1을 참조한다.
"이입 단편" 또는 "이입 절편" 또는 "이입 영역"은 교배 또는 전통적인 육종 기술, 예컨대 역교배에 의해 동일하거나 관련된 종의 또 다른 식물 내로 도입된 염색체 단편 (또는 염색체의 일부분 또는 영역)을 지칭하고, 즉, 이입된 단편은 "이입하다"라는 동사에 의해 지칭되는 육종 방법 (예컨대 역교배)의 결과이다. 시금치에서, 시금치의 야생 근연종 예컨대 스피나시아 투르케스타니카가 야생 게놈의 단편을 재배 시금치의 게놈 내로 이입하는 데 사용될 수 있다. 따라서 이러한 시금치 식물은 "스피나시아 올레라세아의 게놈"을 갖지만, 게놈 내에 시금치의 야생 근연종의 단편, 즉 공여자 식물의 이입 단편을 포함한다. 용어 "이입 단편"은 결코 전체 염색체를 포함하지 않고, 염색체의 일부분만 포함하는 것으로 이해된다. 이입 단편은 대형, 예를 들어 심지어 염색체의 절반일 수 있지만, 바람직하게는 더 작고, 예컨대 약 15 Mb 이하, 예컨대 약 10 Mb 이하, 약 9 Mb 이하, 약 8 Mb 이하, 약 7 Mb 이하, 약 6 Mb 이하, 약 5 Mb 이하, 약 4 Mb 이하, 약 3 Mb 이하, 약 2 Mb 이하, 약 1 Mb (1,000,000개의 염기쌍과 같음) 이하, 또는 약 0.7 Mb, 0.6 Mb, 0.5 Mb (500,000개의 염기쌍과 같음) 이하, 예컨대 약 200,000 bp (200 킬로 개의 염기쌍과 같음) 이하, 약 100,000 bp (100 kb) 이하, 약 50,000 bp (50 kb) 이하, 약 25,000 bp (25 kb) 이하이다. 통상의 기술자는 원하는 형질을 부여하는 유전자를 유지하는 이러한 단편을 공여자 식물로부터의 수용자 식물 내로 이입할 수 있다. 이입 단편을 포함하는 식물의 전체 게놈의 시퀀싱이 이러한 이입 단편을 특정 공여자 종으로부터 유래되는 것으로 식별할 것이고, 이는 구체적인 공여자를 특정 공여자에 독특한 서열로서 확인하는 것을 허용할 것이다.
"RPF14 저항성 유전자를 포함하는 이입 단편" 또는 "RPF14 이입 단편"은 공여자로부터 유래되고 RPF14 유전자를 포함하는 염색체의 일부분을 지칭한다. 본 발명의 한 측면에서, 이입 단편은 이입 단편의 확인을 허용하는, 공여자와 재배 시금치 식물 사이에서 다형성인 하나 이상의 마커, 예컨대 SNP_01을 추가로 포함한다. 따라서, 한 측면에서, RPF14 유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다.
"SNP_01 공여자 뉴클레오티드"는 SNP 위치, 즉 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 위치 114에서 발견되는 뉴클레오티드 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 지칭한다.
"서열 동일성"은 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하는 2개의 뉴클레오티드 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다. 그 후, 서열들이 예를 들어 프로그램 GAP 또는 BESTFIT 또는 엠보스 프로그램 "니들" (디폴트 파라미터를 사용함, 하기 참조)에 의해 최적으로 정렬되었을 때 적어도 특정 최소 백분율의 서열 동일성 (하기에서 추가로 정의됨)을 공유하면, 서열들을 "실질적으로 동일하다" 또는 "본질적으로 동일하다"고 지칭할 수 있다. 이러한 프로그램들은 니들맨 및 분쉬 정렬 알고리즘을 사용하여 2개의 서열을 이들의 전체 길이에 걸쳐 정렬하여, 매치의 수를 최대화하고, 갭의 수를 최소화한다. 일반적으로, 갭 생성 페널티 = 10 및 갭 확장 페널티 = 0.5 (뉴클레오티드 및 단백질 정렬 둘 모두)로, 디폴트 파라미터가 사용된다. 뉴클레오티드의 경우, 사용된 디폴트 채점 행렬은 DNAFULL이다. 서열 정렬 및 백분율 서열 동일성에 대한 점수를, 예를 들어, 컴퓨터 프로그램, 예컨대 ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ 하에 월드와이드웹 상에서 입수가능한 EMBOSS를 사용하여 결정할 수 있다. 대안적으로, 서열 유사성 또는 동일성을 데이터베이스 예컨대 FASTA, BLAST 등에 대해 검색함으로써 결정할 수 있지만, 히트를 검색하고 쌍별 정렬하여 서열 동일성을 비교하여야 한다. (핵산에 대한 채점 행렬 DNAFULL을 사용하여, 디폴트 파라미터, 즉 갭 생성 페널티 = 10, 갭 확장 페널티 = 0.5를 사용하여 엠보스 "니들"에 의해 결정되었을 때) 백분율 서열 동일성이 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이면 2개의 핵산 서열이 "실질적인 서열 동일성"을 갖는다.
동일한 염색체 상의 유전자좌들 사이 (예를 들어, 분자 마커들 사이 및/또는 표현형 마커들 사이)의 "물리적 거리"는 염기쌍 (bp), 킬로 염기쌍 (kb) 또는 메가 염기쌍 (Mb)으로 표현되는 실제 물리적 거리이다.
동일한 염색체 상의 유전자좌들 사이 (예를 들어, 분자 마커들 사이 및/또는 표현형 마커들 사이)의 "유전적 거리"는 교차 빈도, 또는 재조합 빈도 (RF)에 의해 결정되고, 센티모건 (cM)으로 지시된다. 1 cM은 1%의 재조합 빈도에 상응한다. 재조합체가 발견될 수 없으면, RF가 0이고, 유전자좌들이 물리적으로 극도로 가깝거나 또는 동일하다. 2개의 유전자좌가 멀수록, RF가 더 높다.
"분자 마커"는 관심 유전자에 가까운, 바람직하게는 RPF14에 가까운 염색체 상에서 발견되는, 특정 게놈 또는 염색체 위치 또는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)과 연관된 DNA 조각이다. 분자 마커는 특정 DNA 서열, 또는 게놈 또는 염색체에서의 특정 위치를 확인하는 데, 또는 이입 단편을 확인하는 데 사용될 수 있다. 하나 이상의 분자 마커가 분자 마커 검정법에 의해 "검출가능"한 것으로 본원에서 언급되는 경우, 이는 물론 식물 또는 식물의 일부분이 하나 이상의 마커를 이의 게놈 내에 포함한다는 것을 의미하는데, 그렇지 않으면 마커가 검출가능하지 않을 것이기 때문이다. 한 측면에서, 마커는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이지만, 다른 분자 마커 예컨대 RFLP, AFLP, RAPD, INDEL, DNA 시퀀싱 등이 동일하게 사용될 수 있다. 한 측면에서, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드), 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌이 RPF14 유전자 및 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편에 연결되고, 여기서 상기 저항성 공여자 뉴클레오티드는 이입 단편 (RPF14 유전자를 포함함)을 포함하는 것인 식물, 식물 조직 또는 식물의 일부분을 선별하는 데, 따라서 저항성 식물 또는 식물의 일부분 (상기 정의된 바와 같음)을 선별하고/하거나 생성시키는 데 사용될 수 있다. 이입 단편과 재배 시금치 사이에서 다형성인 다른 SNP가 예를 들어 시퀀싱 또는 정밀 맵핑에 의해 통상의 기술자에 의해 개발될 수 있다.
"플랭킹 마커"는 RPF14 유전자의 어느 한쪽 측면 상의 염색체 상에 위치하는 분자 마커이다. 정밀 맵핑 또는 시퀀싱을 사용하여 플랭킹 마커, 또는 본원에서 제공되는 SNP_01에 추가적인 적어도 제2의 마커를 확인할 수 있다.
RPF14에 연결되고/되거나, RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편 상에 있는, 예를 들어 SNP_01과 RPF14 사이에 있거나 또는 RPF14 유전자좌에 플랭킹되거나 또는 상기 유전자좌에 물리적으로 연결된 다른 분자 마커가 개발될 수 있다. 이는 예를 들어 유전자의 정밀 맵핑 또는 염색체 또는 염색체 영역의 시퀀싱에 의해 행해질 수 있다. 그 후, 이러한 마커를 유전자가 이형접합 또는 동형접합 형태인 경우에 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17)에 대한 Pfs 저항성 (상기 정의된 바와 같음)을 부여하는, RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편의 확인 및/또는 선별에 사용할 수 있다. 예를 들어, 정밀-맵핑을 수행하여, 이입 단편 상의 RPF14 유전자에 더욱 더 가깝게 연결된 마커를 찾을 수 있다. 정밀 맵핑은 RPF14 유전자가 위치하는 염색체의 상이한 재조합 이벤트들을 포함하는 재조합 식물 (예를 들어, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자를 감수성 식물, 예를 들어 감수성 계통 또는 변종과 교배시키는 것으로부터 유래됨)의 집단을 제조하고, 이러한 재조합 식물 (예를 들어, 이입 단편의 상이한 크기의 하위단편들을 포함함)을 RPF14 유전자가 부여하는 저항성 표현형 및 DNA 마커에 대해 분석하는 것을 수반한다. 이에 의해, RPF14 유전자의 위치를 더욱 정확하게 결정할 수 있고, 유전자에 더욱 가깝게 연결된 마커를 확인할 수 있다. 동일한 방식으로, NCIMB 수탁 번호 42607 하에 기탁된 종자에서 발견되는 단편보다 더 작은 (즉, 하위단편인) 이입 단편을 포함하는 식물이 생성될 수 있다. 대안적으로, 시퀀싱을 수행하여, RPF14 유전자에 가깝게 연결되거나 또는 심지어 유전자 내에 있는 마커를 확인할 수 있다.
용어 "마커 검정법" 또는 "유전자형결정 검정법"은 마커 유전자형, 예를 들어 SNP 유전자형을 결정하는 데 사용될 수 있는 검정법을 지칭한다. 예를 들어, KASP-검정법 (kpbioscience.co.uk의 월드와이드웹 참조) 또는 통상의 기술자에게 공지된 다른 검정법을 사용하여 SNP 마커를 검출할 수 있다.
"마커 보조 선별" 또는 "MAS" 또는 "마커 보조 육종" 또는 "MAB"는 특정 유전자좌 또는 특정 염색체 영역 (예를 들어 이입 단편)에 유전적 및 물리적으로 연결된 분자 마커의 존재를 사용하여, 구체적인 유전자좌 또는 영역 (예를 들어 이입 단편)의 존재에 대해 식물 (예를 들어 자손)을 선별하는 공정이다. 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 A인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드, 또는 RPF14 유전자 근처의 임의의 마커를 MAS에서 사용하여 RPF14 유전자를 포함하는 시금치 식물 또는 식물의 일부분을 선별할 수 있다.
기준 서열에 대한 "실질적인 서열 동일성"을 갖거나 또는 기준 서열에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 (예를 들어 DNA 또는 게놈 DNA)을 언급할 때, 한 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 소정의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 간주되고, 엄격한 혼성화 조건을 사용하여 확인될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 핵산 서열은 소정의 뉴클레오티드 서열에 비교하여 교체, 삽입 또는 결실된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하지만, 여전히 엄격한 혼성화 조건을 사용하여 확인될 수 있다.
"엄격한 혼성화 조건"을 사용하여 소정의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 확인할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 매칭되는 프로브에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하의 온도)이다. 전형적으로, 염 농도가 pH 7에서 약 0.02 몰 농도이고, 온도가 적어도 60℃인 엄격한 조건이 선택될 것이다. 염 농도를 낮추고/낮추거나 온도를 증가시키면 엄격도가 증가된다. RNA-DNA 혼성화 (예를 들어 100 nt의 프로브를 사용하는 노던 블롯)에 대한 엄격한 조건은, 예를 들어, 20분 동안 63℃에서 0.2X SSC에서 적어도 1회 세정하는 것을 포함하는 조건 또는 동등한 조건이다. DNA-DNA 혼성화 (예를 들어 100 nt의 프로브를 사용하는 서던 블롯)에 대한 엄격한 조건은, 예를 들어, 20분 동안 적어도 50℃, 일반적으로는 약 55℃의 온도에서 0.2X SSC에서 적어도 1회 (일반적으로 2회) 세정하는 것을 포함하는 조건 또는 동등한 조건이다. 문헌 [Sambrook et al. (1989)] 및 [Sambrook and Russell (2001)]을 또한 참조한다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호: 1은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 SNP_01에 대해 아데닌을 포함하는 에스. 투르케스타니카 서열을 도시한다. 서열식별번호: 1은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에 존재한다.
서열식별번호: 2는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 114에 구아닌 (G)을 포함하는, SNP_01에 대한 에스. 올레라세아 (반복친) 서열을 도시한다.
서열식별번호: 3은 서열식별번호: 3과 서열식별번호: 1의 쌍별 정렬로부터 볼 수 있는 바와 같이, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 대한 동등한 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 120에 SNP_01을 포함하는 감수성 계통의 에스. 올레라세아를 도시한다 (뉴클레오티드 120에 구아닌 (G)을 포함함). 서열식별번호: 3은 SNP_01의 상류에 뉴클레오티드 6개의 삽입물을 포함하고, 이에 의해 SNP가 114 대신 위치 120에 위치한다.
서열식별번호: 4는 WO2015054339에 기술된 노균병 QTL에 플랭킹된, 에스. 테트란드라로부터의 플랭킹 서열 중 하나를 도시한다 (WO2015054339에서의 서열식별번호: 1에 상응함).
서열식별번호: 5는 WO2015054339에 기술된 노균병 QTL에 플랭킹된, 에스. 테트란드라로부터의 다른 플랭킹 서열을 도시한다 (WO2015054339에서의 서열식별번호: 2에 상응함).
서열식별번호: 6은 대표적인 샘플이 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 본 발명의 종자에 존재하는 바와 같은, 서열식별번호: 4에 상응하는 영역에서의 에스. 올레라세아 서열을 도시한다.
서열식별번호: 7은 대표적인 샘플이 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 본 발명의 종자에 존재하는 바와 같은, 서열식별번호: 5에 상응하는 영역에서의 에스. 올레라세아 서열을 도시한다.
서열식별번호: 8은 도 2의 SpinachBase 서열을 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 식물 및 방법
한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 갖는 재배 시금치 식물을 제공하고, 여기서 저항성은 단일 우성 유전자에 의해 부여된다.
단일 유전자는 페로노스포라 파리노사에 대한 저항성 유전자 14(Resistance to P eronospora f arinosa gene 14)를 따서 RPF14로 지정된다. 따라서, 본 발명은 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 부여하는 RPF14를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, RPF14는 적어도 RPF14 유전자가 동형접합 형태인 경우에 페로노스포라 파리노사 레이스 1, 2, 6, 7 및 9에 대한 저항성을 추가로 부여한다. 본 발명의 추가 측면에서, RPF14는는 분리주 UA0514 및/또는 잠재적으로 페로노스포라 파리노사의 다른 병원성 분리주에 대한 저항성을 부여한다. 이러한 다른 분리주는 관련 분야에서 발달되는 추후의 분리주를 잠재적으로 포함한다. 유전자는 레이스 3, 4 및 5에 대한 저항성을 부여하지 않는다. RPF14 유전자는 시금치의 야생 근연종에서 확인되었고, 역교배를 통해 스피나시아 올레라세아, 바람직하게는 재배 시금치 내로 도입되었다. RPF14 유전자는 단일 유전자이다. 유전자는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 저항성에 대해 우성으로 유전된다; 즉, 동형접합 형태의 RPF14를 포함하는 식물이 감수성 식물, 예컨대 바이로플레이 변종과 교배되는 경우, F1 자손은 모두 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 나타낼 것이고, F2 자손에서는 상기 저항성이 3 (저항성): 1 (감수성) 비로 분리될 것이다. RPF14 유전자는 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에서 동형접합 형태로 존재하고, 즉 RPF14를 포함하는 이입 단편이 동형접합 형태로 존재한다. RPF14 유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에 아데닌을 포함하는 저항성 공여자 뉴클레오티드 SNP_01에 연결된다. 따라서, 기탁된 종자 내에 존재하는 이입 단편은 서열식별번호: 1을 포함하고, 즉 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌을 포함하며, 아데닌 (및 서열식별번호: 1)은 기탁된 종자 내에서 동형접합 형태로 존재한다 (기탁된 종자의 SNP_01 유전자형이 'AA'이다).
본 발명의 한 측면에서, 유전자가 에스. 올레라세아 종의 재배 시금치 식물의 게놈 내에서 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에, 에스. 투르케스타니카로부터의 RPF14 유전자는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여한다.
본 발명의 추가 측면에서, 에스. 투르케스타니카로부터의 RPF14 유전자는 적어도 유전자가 에스. 올레라세아 종의 재배 시금치 식물의 게놈 내에서 동형접합 형태인 경우에 적어도 Pfs 레이스 8 내지 17, 또는 적어도 레이스 6 내지 17, 또는 적어도 레이스 1, 2 및 6 내지 17에 대해, 또한 이형접합 형태에서도 이러한 레이스 몇몇에 대해 저항성을 부여한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, RPF14는 적어도 레이스 8 및 10-16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하고, 재배 시금치 식물의 게놈에서 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 형태인 경우에 레이스 1, 2, 6, 7 및 9로부터 선택된 Pfs 레이스 중 하나 이상에 대해, 그리고 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)가 이형접합 형태인 경우에도 이러한 레이스 중 몇몇에 대해 저항성을 추가로 부여한다.
본 발명의 추가 측면에서, RPF14는 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 적어도 레이스 8 및 10-16, 바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하고, 재배 시금치 식물의 게놈에서 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 Pfs 레이스 1에 대해, 및/또는 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 Pfs 레이스 2에 대해, 및/또는 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 Pfs 레이스 6에 대해, 및/또는 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 Pfs 레이스 7에 대해 및/또는 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 Pfs 레이스 9에 대해 저항성을 추가로 부여한다. 본 발명의 추가 측면에서, RPF14는 재배 시금치 식물의 게놈에서 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)가 동형접합 또는 이형접합 형태인 경우에 분리주 UA0514 및/또는 또 다른 병원성 Pfs 분리주에 대한 저항성을 부여한다.
본 발명의 추가 측면에서, RPF14 이입은 재배 시금치 식물에서 적어도 Pfs 레이스 8 및 10-16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하고, 여기서 RPF14 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다 (이를 포함한다). 레이스 8 및 10 내지 16, 또는 8 및 10 내지 17에 대한 저항성은, 이러한 레이스들에 대한 저항성이 우성이기 때문에, 적어도 이입 단편이 동형접합 형태 또는 이형접합 형태인 경우에 부여된다. Pfs 1, 2, 6, 7, 9 및 UA0514에 대한 저항성의 경우, 저항성이 RPF14 유전자가 동형접합 형태인 경우에만 나타나는지 또는 (이러한 레이스들 중 하나 이상에 대해) RPF14 유전자가 이형접합 형태인 경우에도 나타나는지가 명확하지 않다; 이는 레이스에 대한 저항성이 우성인지 또는 열성인지 여부에 좌우된다. 레이스에 대한 저항성이 우성인지 또는 열성인지 여부를 예를 들어 RPF14에 대해 이형접합이고/이거나 RPF14에 대해 분리되는 식물에서 저항성 검정법에서 테스트할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에서, RPF14 이입 단편은 재배 시금치 식물에서 적어도 Pfs 레이스 7 내지 16, 7 내지 17, 또는 8 내지 17에 대한 저항성을 부여하고, 여기서 RPF14 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다 (이를 포함한다). 이러한 레이스들에 대한 저항성은 적어도 이입 단편이 동형접합 형태인 경우에 부여되고, 레이스에 대한 저항성이 우성인지 또는 열성인지 여부에 따라, 임의적으로는 이입 단편이 이형접합 형태인 경우에도 부여된다. 레이스에 대한 저항성이 우성인지 또는 열성인지 여부를 예를 들어 RPF14에 대해 이형접합이고/이거나 RPF14에 대해 분리되는 식물에서 저항성 검정법에서 테스트할 수 있다.
본 발명의 추가 측면에서, RPF14 이입물은 재배 시금치 식물에서 적어도 Pfs 레이스 6 내지 16, 또는 6 내지 17에 대한 저항성을 부여하고, 여기서 RPF14 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다 (이를 포함한다). 이러한 레이스들에 대한 저항성은 적어도 이입 단편이 동형접합 형태인 경우에 부여되고, 레이스에 대한 저항성이 우성인지 또는 열성인지 여부에 따라, 임의적으로는 이입 단편이 이형접합 형태인 경우에도 부여된다. 레이스에 대한 저항성이 우성인지 또는 열성인지 여부를 예를 들어 RPF14에 대해 이형접합이고/이거나 RPF14에 대해 분리되는 식물에서 저항성 검정법에서 테스트할 수 있다.
Pfs 레이스 8 및 10-16 및 17에 대한 저항성은 우성 방식으로 부여되는 것으로 밝혀졌다. RPF14가 레이스 1, 2, 6, 7, 9 및/또는 UA0514에 대한 저항성을 우성 방식으로 부여하는지 또는 열성 방식으로 부여하는지 여부는 결정되어야 한다. 언급된 바와 같이, 통상의 기술자는 이를 쉽게 결정할 수 있다. 알려진 것은 RPF14 (또는 RPF14를 포함하는 이입 단편)이 동형접합 형태로 존재하는 경우, 재배 시금치 식물이 이러한 레이스들에 대해 저항성이라는 것이다. 기탁된 종자에서, 이입 단편은 동형접합 형태로 존재한다. 따라서, 부여된 저항성이 RPF14가 이형접합 형태인 경우에 나타나는지 (우성) 또는 RPF14가 동형접합 형태인 경우에만 나타나는지 (열성)를 결정하기 위해, 상기 종자로부터 성장된 식물을 RPF14 유전자가 결여된 식물과 교배시켜 F1 식물을 생성시킬 수 있고, F1 및/또는 F2 및/또는 F3 집단을 각각의 Pfs 레이스에 대한 저항성에 대해 테스트할 수 있다.
동형접합 형태의 RPF14 유전자 (즉, RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편)를 포함하는 재배 시금치 계통의 종자의 대표적인 샘플을 부다페스트 조약 하에 눈헴스 비.브이(Nunhems B.V)가 2016년 7월 12일에 NCIMB 리미티드(NCIMB Ltd.)에 수탁 번호 42607 하에 기탁하였다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, RPF14 저항성 유전자는 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자에서, 또는 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물 또는 이의 일부분으로부터, 또는 상기 종자 또는 상기 식물 또는 상기 일부분으로부터 유래된 세포 배양물로부터 발견되는 바와 같은 유전자이다. 명백하게, NCIMB 42607의 자손 또한 포함되고, 자손은 자신의 핵 게놈 내에 RPF14 유전자를 포함한다.
본원에서 "RPF14 유전자를 포함하는" 재배 시금치 식물 또는 식물의 일부분을 언급하는 경우, 이는 시금치 식물 또는 식물의 일부분이 이입 단편을 포함하고, 이러한 단편이 염색체 상의 RPF14 유전자좌에 야생 에스. 투르케스타니카 공여자로부터의 RPF14 유전자를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 한 측면에서, 야생 에스. 투르케스타니카 공여자는 기탁된 종자 내에 있는 것과 동일한 공여자이고, 즉 RPF14 유전자 및 RPF14 유전자를 포함하는 단편의 에스. 투르케스타니카 서열은 기탁된 종자 내의 것과 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이는 예를 들어 전체 게놈 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 야생 에스. 투르케스타니카 공여자는 RPF14 유전자 (예를 들어 동일한 Pfs 저항성을 부여함)를 포함하지만 기탁된 종자의 RPF14 유전자 또는 기탁된 종자의 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 상이한 수탁물일 수 있다.
동형접합 형태의 RPF14를 보유하는 에스. 투르케스타니카 이입 단편을 포함하는, 종자의 대표적인 샘플이 NCIMB 42607 하에 기탁된 재배 시금치 계통은 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 UA0514에 대해 저항성이다.
RPF14 유전자는 시금치의 야생 근연종으로부터의 이입 단편 상에 위치한다. 본 발명의 한 측면에서, 이입 단편은 스피나시아 투르케스타니카로부터의 것이고, RPF14 유전자에 더하여, RPF14 유전자에 연결되고 RPF14를 포함하는 단편을 선별하는 데 사용될 수 있는 분자 마커를 포함한다. 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드)이 이입 단편 상에서 RPF14 유전자에 연결된 것으로 발견되었다. 쌍별 정렬 (엠보스 프로그램 니들을 사용함)로부터 볼 수 있는 바와 같이, 이입 단편이 결여된 감수성 계통은 (서열식별번호: 2에 나타난 바와 같이) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 구아닌 또는 서열식별번호: 3의 뉴클레오티드 120 (이러한 뉴클레오티드는 서열식별번호: 1 또는 2의 뉴클레오티드 114에 대한 동등한 뉴클레오티드이다)에 구아닌을 함유하는 것으로 발견되었다. 따라서, 감수성 에스. 올레라세아 식물 계통의 서열은 SNP 마커 영역에서 변이를 나타낼 수 있다. 따라서, 한 측면에서, RPF14 유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌에 연결된다. 본 발명의 한 측면에서, 저항성 유전자 RPF14는 에스. 투르케스타니카 수탁물로부터 수득되거나 또는 수득될 수 있고, 이러한 수탁물은 RPF14가 부여하는 것과 (예를 들어 기탁된 종자와) 동일한 Pfs 저항성 표현형을 갖고, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌 (SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에 아데닌을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, RPF14를 포함하는 이입 단편은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 시금치 종자 내에 존재하는 바와 같은 (그리고, 이로부터 수득될 수 있거나, 수득되거나, 유래될 수 있거나 또는 유래된 바와 같은) 이입물, 또는 이의 하위단편 (RPF14를 유지함)이고, 여기서 상기 이입 단편 (또는 하위단편)은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 RPF14 유전자를 포함한다. 한 측면에서, 이입 단편은 서열식별번호: 1을 또한 포함한다.
기탁된 종자 내에 존재하는 이입 단편은 특정 공여자 수탁물로부터의 것이고, 따라서 독특한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 기탁된 종자로부터 성장된 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시키고, 이입 단편을 포함하는 후손을 선별함으로써, 전체 단편이 다른 시금치 계통 또는 변종 내로 쉽게 전달될 수 있다. Pfs 저항성 표현형 및/또는 서열식별번호: 1을 포함하는 자손을 선별하는 것 및/또는 시퀀싱, SNP 유전자형결정 (SNP_01에 대해 아데닌을 포함하는 자손을 선별하는 것 등)에 의해 다양한 방법으로 선별될 수 있다.
단편은 하나 이상의 분자 마커 (예를 들어 SNP 마커, AFLP 마커, RFLP 마커 등), 특히 재배 시금치와 야생 공여자로부터의 이입 단편 사이에서 다형성인 분자 마커에 의해 또한 확인될 수 있다. 전형적으로, 맵핑 집단이 마커를 생성시키는 데 사용된다. 예를 들어, RPF14 유전자로부터 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM 이내 및/또는 RPF14 유전자로부터 1 Mb, 0.9 Mb, 0.8 Mb, 0.7 Mb, 0.6 Mb, 0.5Mb, 0.4 Mb, 0.3 Mb, 0.2 Mb, 0.1 Mb 미만 이내인, 이입 단편에 대해 특이적인 마커가 생성될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, NCIMB 42607의 종자를 식물로 성장시키는 단계를 포함하는 방법을 통해 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편이 수득된다.
또 다른 실시양태에서, NCIMB 42607의 종자 내에 존재하는 이입 단편의 하위-단편 상의 RPF14 유전자를 포함하는 재배 시금치 식물이 제공된다. 이러한 식물은 NCIMB 42607의 종자로부터 성장된 식물을 자가수정시키거나 또는 또 다른 시금치 식물과 교배시키고, 더 짧은 이입 단편을 갖는, 즉 단편의 일부분이 제거되어 재조합되도록 이입 단편 내의 상동 염색체들 사이에서 재조합 이벤트가 발생한 후손을 선별함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, NCIMB 42607의 종자 내에 존재하는 원래의 전체-크기 이입 단편의 상이한 하위-단편들을 갖는 재조합 순계 계통이 생성될 수 있다. 에스. 투르케스타니카 공여자로부터의 원래의 이입 단편은 3.0 Mb 이하의 크기, 특히 2.0 Mb 이하의 크기인 것으로 추정된다. 따라서, RPF14를 포함하는 하위-단편은 3.0 Mb 미만, 2.0 Mb 미만, 예컨대 1.0 Mb, 0.7 Mb, 0.6 Mb, 0.5 Mb, 0.4 Mb, 0.3 Mb, 0.2 Mb, 0.1 Mb 또는 이보다 낮은 값 미만일 수 있고, 여전히 RPF14 유전자를 포함할 수 있다. 임의적으로, 하위-단편은 서열식별번호: 1을 또한 유지한다.
앞서 언급된 바와 같이, RPF14에 대한 맵핑 집단에서, 에스. 투르케스타니카 공여자로부터의 SNP_01의 SNP 뉴클레오티드는, 서열식별번호: 2의 위치 114 또는 서열식별번호: 3의 위치 120 (서열식별번호: 3의 위치 120은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 위치 114에 대한 동등한 위치이다)에 나타난 바와 같은 반복친 (이입이 결여된 에스. 올레라세아)의 SNP 뉴클레오티드인 구아닌 대신, 서열식별번호: 1의 위치 114에서의 아데닌이다. 서열식별번호: 2 및 서열식별번호: 3은 감수성 계통에서 발견된다 (실시예의 도 1을 또한 참조한다).
따라서, RPF14를 포함하는 이입 단편에 대해 동형접합인 이배체 시금치 식물은 각각의 상동 염색체의 SNP_01 위치에 아데닌이 있다 (즉 'AA' 유전자형). 이입 단편에 대해 이형접합인 시금치 식물은 한 염색체의 SNP_01 위치에는 아데닌이 있고, 반복친 배경에 의존적으로, 다른 염색체의 동등한 위치에는 구아닌, 시토신 또는 티민이 있다 (즉 'AG' 또는 'AC' 또는 'AT' 유전자형).
본 발명은 기탁된 종자 내에 존재하는 바와 같은 에스. 투르케스타니카 공여자로부터의 이입 단편 (RPF14를 포함하고, 임의적으로, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌을 포함함)을 포함하고, 시금치 게놈의 3번 염색체 상의 동일한 염색체 유전자좌 상에 RPF14를 포함하지만, 이입 단편이 기탁된 종자 내에 존재하는 이입 단편의 서열에 100% 동일하지 않은 뉴클레오티드 서열을 갖는 (예를 들어, 기탁된 종자 내에 존재하는 이입 단편에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 서열 동일성을 가질 뿐임), 다른 에스. 투르케스타니카 공여자로부터의 이입 단편을 또한 포함한다. 이러한 이입 단편은, 한 측면에서, SNP_01을 포함할 수 있고, 여기서 SNP_01은 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열에 아데닌이 있다. 따라서, 서열식별번호: 1의 마커 서열은 이러한 상이한 에스. 투르케스타니카 공여자에서 100% 동일하지 않을수도 있다. 본 발명은 RPF14 및 임의적으로 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 뉴클레오티드 114에 아데닌을 포함하는, 다른 에스. 투르케스타니카 공여자로부터의 이러한 이입 단편의 하위-단편을 추가로 또한 포함한다.
따라서, 본 발명은 RPF14 유전자를 포함하는 상기 언급된 이입 단편의 하위-단편을 또한 포함하고, 여기서 상기 하위-단편은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 Pfs 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 RPF14 유전자를 포함하고, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에 존재하는 바와 같은 이입 단편의 일부분이거나 또는 기탁된 종자 내에 존재하는 이입 단편에 대한 실질적인 서열 동일성을 갖는 상이한 에스. 투르케스타니카 공여자의 이입 단편의 일부분이다. 본 발명은 RPF14 유전자를 포함하고, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드를 포함하는 상기 하위-단편을 포함한다. 따라서, 한 측면에서, 이입 하위-단편은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 재배 시금치 종자에서 발견되는 바와 같은 단편으로부터 수득되고 (수득될 수 있거나, 유래될 수 있거나, 또는 유래되고), 하위-단편은 RPF14 유전자 (및 유전자가 부여하는 Pfs 저항성 표현형, 및 임의적으로는 서열식별번호: 1)을 유지하며, 또 다른 측면에서, 이입 단편은 3번 염색체 상의 동일한 유전자좌에 RPF14 유전자를 포함하는 또 다른 에스. 투르케스타니카 공여자로부터 수득된다. 이러한 더 짧은 이입 단편을 포함하는 시금치 식물은 본 발명의 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시키고, RPF14 유전자가 부여하는 저항성 표현형을 유지하지만 더 짧은 이입 단편을 포함하는 재조합 자손을 선별함으로써 생성될 수 있다. 통상의 기술자는, 예를 들어, 기탁된 종자로부터 성장된 식물을 또 다른 재배 시금치 식물 (예를 들어, Pfs 레이스 8 및 10 내지 17 중 하나 이상에 대해 감수성인 식물)과 교배시킨 후, F1 자손을 자가수정시켜, F2 집단을 생산하고, 이입 단편에서 발생한 재조합체 (교차 이벤트)를 확인할 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, WO2015054339는 6번 염색체 상의 QTL을 기술한다. 이러한 유전자좌는 에스. 테트란드라로부터 이입되었고, 광역 Pfs 저항성, 특히 "페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 (Pfs)의 레이스 7, 10, 11, 12, 13, 및 14, 또는 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 (Pfs)의 레이스 1-14 및 UA4712에 대한 저항성"을 부여한다. (UA4712는 Pfs 레이스 15이다). 6번 염색체는 실제로는 SpinachBase에서의 3번 염색체에 상응한다. 본원에서 서열식별번호: 4 및 5로 제공되는, QTL에 플랭킹된 2개의 에스. 테트란드라 서열은 1.4 Mb (서열식별번호: 4) 및 0.7 Mb (서열식별번호: 5)에 위치한다. 반면에, 에스. 투르케스타니카로부터의 본 발명의 SNP_01 마커는 3번 염색체의 0.6 Mb에 위치한다.
본 발명가들은 에스. 테트란드라에서 QTL에 플랭킹되는 이러한 서열들이 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에 존재하는지 여부를 또한 테스트하였다. 실시예에서 추가로 기술되는 바와 같이, 왼쪽 또는 오른쪽 플랭킹 서열 (즉 서열식별번호: 4 및 5)이 기탁된 종자 내에 존재하지 않았다. 대신, 에스. 올레라세아 DNA가 상응하는 염색체 영역에서 기탁된 종자 내에 존재하였다 (서열식별번호: 6 및 7로 제공됨).
따라서, 한 측면에서, RPF14를 포함하는 이입물을 포함하는 본 발명의 재배 시금치 식물은 WO2015054339에 기술된 광역 저항성 유전자좌를 포함하지 않는다. 물론, 이러한 유전자좌는 3번 염색체의 상이한 영역 내에 있기 때문에, RPF14 및 QTL 둘 모두가 동형접합 형태이더라도, 이는 과도한 부담 없이 RPF14와 조합될 수 있다.
NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에 존재하는 바와 같은, RPF14 유전자를 포함하는 본 발명의 이입 단편은 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 5를 포함하지 않는다. 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 5는 WO2015054339에 기술된 에스. 테트란드라로부터의 저항성-부여 이입물에 연결된다. 서열식별번호: 4 및 서열식별번호: 5는 본 발명의 이입 단편 또는 NCIMB 42607 하에 기탁된 바와 같은 본 발명의 종자 내에 존재하지 않는다. RPF14 유전자를 포함하는 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자는 서열식별번호: 4에 동등한 영역에 서열식별번호: 6을 포함한다. RPF14 유전자를 포함하는 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자는 서열식별번호: 5에 동등한 영역에 서열식별번호: 7을 포함한다.
여러 병원성 페로노스포라 파리노사 레이스, 즉 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 부여하는 단일 유전자이기 때문에 RPF14 유전자가 유용하다. RPF14는 저항성 시금치 변종을 생성시키는 것에서 사용될 수 있다. 관련 분야에서, 저항성 유전자들은 다수의 페로노스포라 파리노사 레이스에 대한 저항성을 제공하기 위해 통상적으로 적층된다 (다른 보완적인 저항성 유전자와 조합된다). 잡종 변종에서 저항성 유전자들을 적층시키기 위해서, 유전자는 우성 저항성을 부여하여야 한다. 이는 이배체 시금치에서 페로노스포라 파리노사 저항성을 부여하는 데 특히 중요한데, 이는 일부 저항성 유전자가 대립유전자성이어서, 가능한 조합의 수를 제한하기 때문이다. 따라서, 본원에 기술된 생성물 (예를 들어, 식물, 식물의 일부분, 자손 식물 등)은 종래 기술에 비해 유의한 개선을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 한쪽 양친이 동형접합 형태의 본 발명의 RPF14 유전자를 포함하는 순계 계통인 시금치 F1 잡종 식물 및 식물의 일부분 (및 이로부터 F1 잡종이 성장될 수 있는 종자)을 제공한다. 다른쪽 양친은 감수성일 수 있거나, 또는 RPF1, RPF2, RPF3, RPF4, RPF5, RPF6, RPF7, RPF8, RPF9, RPF11, RPF12, RPF15, R6 유전자 (WO2013/064436), p10 유전자 (WO2017/194073), R15 유전자 (WO2017/084724) 또는 US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자의 군으로부터 선택된 피. 파리노사 저항성 유전자를 포함하는 순계 양친 계통일 수 있다.
제1 양친 시금치 식물을 제2 양친 시금치 식물과 교배시키고, 생성된 잡종 시금치 종자를 수확하는 것을 포함하고, 여기서 제1 양친 시금치 식물이 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성을 부여하는 RPF14 유전자를 포함하고, 레이스 3, 4 및/또는 5에 대한 저항성을 갖고/갖거나 레이스 1, 2, 6, 7 및/또는 9에 대한 저항성을 갖기 위해 또 다른 노균병 저항성 유전자와의 적층을 필요로 하는, 잡종 시금치 종자를 생산하는 방법이 또한 제공된다. 따라서, 한 측면에서, 다른쪽 양친은 RPF1, RPF2, RPF3, RPF4, RPF5, RPF6, RPF7, RPF8, RPF9, RPF11, RPF12, R6 유전자 (WO2013/064436), p10 유전자 (WO2017/194073), R15 유전자 (WO2017/084724) 또는 US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자의 군으로부터 선택된 피. 파리노사 저항성 유전자를 포함하는 순계 양친 계통이다. 이러한 방법에 의해 생산된 F1 잡종 시금치 종자, 및 이러한 종자로부터 성장된 잡종 시금치 식물 또는 식물의 일부분 또한 포함된다.
레이스 3, 4 및/또는 5에 대한 추가적인 저항성을 제공하기 위해, 하기의 유전자가 가장 적절하다: RPF1, RPF2, RPF3, RPF4, RPF6, RPF7, RPF8, RPF9, RPF11, RPF12, R6, R15 및 US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자.
레이스 1, 2, 6, 7 및 9에 대한 추가적인 저항성을 제공하기 위해, 하기의 유전자가 가장 적절하다: RPF1, RPF2, RPF8, RPF9, RPF11 및 RPF12 및 US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자. 따라서, 바람직한 측면에서, F1 잡종 식물 (또는 식물로 성장할 수 있는 종자)은 한쪽 양친으로부터의 RPF14 유전자, 및 다른쪽 양친으로부터의 RPF1, RPF2, RPF8, RPF9, RPF11, RPF12, US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자로부터 선택된 유전자를 포함한다.
한쪽 양친으로부터의 RPF14 유전자와 다른쪽 양친으로부터의 하기의 유전자의 조합은 Pfs 1 내지 Pfs 17에 대해 저항성인 시금치 식물을 제공한다: RPF1, RPF2, RPF8, RPF9, RPF12, US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자. 본 발명의 한 측면에서, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 시금치 식물을 또 다른 시금치 식물, 예를 들어 Pfs 저항성 유전자가 결여된 시금치 식물 (감수성 식물) 또는 하나 이상의 상이한 Pfs 저항성 유전자를 포함하는 시금치 식물과 교배시킴으로써 RPF14 저항성 유전자를 포함하는 시금치 식물이 수득될 수 있다 (또는 수득되거나, 또는 유래될 수 있거나, 또는 유래된다). 적절한 감수성 식물의 예는 바이로플레이 변종이다.
본 발명의 시금치 식물은, 예를 들어, 동형접합 형태의 RPF14를 포함하는 순계 계통, 또는 동형접합 또는 이형접합 형태의 RPF14 유전자를 포함하는 F1 잡종일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 RPF14 저항성 유전자는 다른 페로노스포라 파리노사 저항성 유전자 또는 저항성 유전자좌 (예를 들어 RPF1-RPF9, RPF11 또는 RPF12, R6, R15, 또는 WO2015054339 및 EP2912940에 개시된 저항성 등) 또는 다른 형질, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 슈도모나스 시린가에 병원종 스피나세아(Pseudomonas syringae pv. spinacea); 에르위니아 캐로토보라(Erwinia carotovora)), 진균 (예를 들어, 알부고 오시덴탈리스(Albugo occidentalis); 콜레토트리쿰 데마티움 분화형 스피나시아에(Colletotrichum dematium f. sp. spinaciae); 스템필리움 보트리오숨 분화형 스피나시아(Stemphylium botryosum f. sp. spinacia)), 바이러스 (예를 들어, 컬리 탑(Curly top) 질병, 스펙클(Speckle), 또는 시금치 마름병, 또는 시금치 모자이크병을 야기하는 바이러스) 또는 선충 (예를 들어, 클로버 씨스트 선충 (헤테로데라 트리폴리이(Heterodera trifolii)), 뿌리썩이 선충 (프라틸렌쿠스(Pratylenchus) 종), 뿌리혹 선충 (멜로이도기네(Meloidogyne) 종) 또는 사탕무 씨스트 선충 (헤테로데라 스카크티이이(Heterodera schachtii))에 대한 저항성과 조합될 수 있다. 조합은, 예를 들어, 전통적인 육종 기술에 의해, 예를 들어, 하나 이상의 형질을 본 발명의 식물 내로 도입하기 위해 또는 본 발명의 식물의 RPF14 유전자를 이러한 하나 이상의 추가적인 형질을 포함하는 또 다른 시금치 식물 내로 도입하기 위해 역교배시킴으로써 또는 유전자 편집 또는 형질전환을 포함하는 다른 기술에 의해 행해질 수 있다. 한 측면에서는 본 발명의 식물이 RPF14 유전자의 공여자로서 사용되는 한편, 또 다른 측면에서는 본 발명의 식물이 하나 이상의 다른 형질의 수용자로서 사용된다. 통상의 기술자는 RPF14 유전자를 다른 적절한 저항성 유전자와 조합함으로써 모든 현재 공지된 Pfs 레이스, 즉 Pfs 1 내지 16, 또는 1 내지 17에 대해 저항성인 잡종 식물을 수득할 수 있다. 예를 들어, RPF14를 RPF12 또는 RPF1, 또는 RPF2, 또는 RPF8, 또는 RPF9, 또는 US20170127641 또는 US20170127642에 기술된 유전자와 조합하여 모든 현재 공지된 Pfs 레이스에 대한 저항성을 수득할 수 있다.
RPF14 저항성 유전자, 또는 이러한 유전자가 위치하는 이입 단편, 또는 RPF14를 포함하는 단편의 하위-단편은 통상의 기술자에게 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 본 발명의 식물로부터 또 다른 시금치 식물로 전달될 수 있다. 따라서, RPF14 저항성 유전자의 공여자는, 예를 들어, 기탁된 종자로부터 성장된 식물, 또는 이의 자손 식물일 수 있다.
따라서, RPF14 저항성 유전자의 공여자는 NCIMB 42607 또는 상기 기탁물로부터 성장된 식물의 자손, 상기 식물의 자손, 또는 상기 식물로부터 유래된 세포 배양물로부터 성장된 식물일 수 있다. 전달된 RPF14 유전자는 수용자 식물에서 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성, 그리고 또한 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성 및 Pfs 분리주 UA0514에 대한 저항성을 부여할 수 있다.
RPF14 저항성 유전자, 또는 이러한 유전자가 위치하는 이입 단편, 또는 유전자를 포함하는 단편의 하위-단편을 사용하여, 잡종 식물 (예를 들어 F1 잡종), 또는 순계 식물 또는 동형접합 식물, 임의적으로는 이중 반수체 식물을 제조할 수 있다. 추가 측면에서, 순계 또는 동형접합 식물은 웅성 양친 계통, 바람직하게는 웅성 엘리트 양친이다. 추가 측면에서, 순계 또는 동형접합 식물은 자성 양친 계통, 바람직하게는 자성 엘리트 양친이다. 웅성 양친 계통을 자성 양친 계통과 교배시켜, 동형접합 형태의 RPF14 (또는 RPF14를 포함하고, 임의적으로 서열식별번호: 1을 포함하는 이입 단편)를 포함하는 F1 잡종 종자를 제조할 수 있다.
한 실시양태에서, 양친 계통은 RPF14 저항성 유전자의 공여자로서 기능한다. 상기 공여자 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시킬 수 있고, F1, F2, F3, 또는 추가 세대의 자가수정 자손, 역교배 자손 (예를 들어 BC1, BC2, BC1S1, BC2S1, BC1S2 등) 등을 포함하는 자손을 수득할 수 있다. 자손 중에서 본 발명의 초기 식물과 동일한 Pfs 저항성 표현형을 갖는 식물을 확인 및 선별할 수 있다. 마찬가지로, 예를 들어 이입 단편을 지시하는 마커 (예를 들어 SNP_01)의 검출 또는 시퀀싱 등에 의해, 이입 단편을 자손에서 검출할 수 있다.
한 측면에서, 순계 계통은 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하는 스피나시아 올레라세아 종의 재배 식물이고, 여기서 상기 저항성은 스피나시아 투르케스타니카로부터 이입된 단일 유전자 (RPF14)에 의해 부여되고, 상기 유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다.
RPF14 저항성 유전자, 또는 이러한 유전자가 위치하는 이입 단편, 또는 이의 하위-단편은 또한 다양한 유형의 시금치, 예컨대 사보이, 세미-사보이, 플랫- 또는 스무드 리프 또는 오리엔탈 시금치에 전달될 수 있다. 바람직하게는, 사보이, 세미-사보이, 플랫- 또는 스무드 리프 또는 오리엔탈 유형의 재배 시금치 식물은 잡종 식물이다.
한 실시양태에서, Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 저항성을 포함하고, 여기서 상기 저항성이 시금치의 야생 근연종, 바람직하게는 에스. 투르케스타니카로부터 이입된 단일 우성 유전자 RPF14에 의해 부여되고, 이러한 유전자가 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열에 연결된 재배 시금치 식물이 포함된다. 한 측면에서, 이러한 서열 중 임의의 것의 위치 114의 뉴클레오티드 (또는 쌍별 정렬에서의 동등한 뉴클레오티드)는 아데닌이다. RPF14 유전자는 시금치의 야생 근연종의 상이한 수탁물들, 특히 에스. 투르케스타니카 종의 수탁물에서 확인될 수 있고, 재배 시금치 내로 이입될 수 있다. 이와 같이 하기 위해, 통상의 기술자는, 예를 들어, 이러한 수탁물을 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드의 존재에 대해 스크리닝하고/하거나, Pfs 저항성 표현형 및 임의적으로 유전 (단일 유전자로서)을 테스트하여, 이러한 수탁물이 RPF14를 함유하는지를 결정할 수 있다. 임의적으로, 수탁물 내의 유전자가 실제로 RPF14 유전자인지를 결정하기 위해 시퀀싱, 정밀 맵핑, 대립유전자성 테스트 등을 또한 행할 수 있다.
구체적 측면에서, 재배 식물 내의 페로노스포라 파리노사에 대한 저항성은 스피나시아 투르케스타니카로부터의 이입 단편에 의해 부여된다. 따라서, 재배 시금치 식물은 에스. 투르케스타니카로부터 유래된 RPF14 유전자를 포함하고, 임의적으로, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다.
저항성 유전자 RPF14의 존재를 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성 테스트, 임의적으로는 또한 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성 및/또는 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성에 의해 결정할 수 있다. 대안적 실시양태에서, Pfs 레이스에 대한 저항성, 또는 Pfs 레이스의 선별이 유전자가 공여자로부터 수용자 식물로 전달되는지를 지시하도록 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 교배에서의 수용자 양친에 특정 Pfs 레이스에 대한 저항성이 결여되면, 이러한 레이스에 대해 저항성인 자손 식물의 선별은 RPF14 유전자의 전달을 지시한다.
재배 시금치 식물 (즉 시금치 계통 또는 변종) 내의 저항성 유전자의 존재에 대한 테스트는, 예를 들어, 제어된 환경 조건 하에서의 정성적 질병 저항성 검정법을 포함한다. 통상의 기술자는 이러한 검정법들에 대한 상이한 프로토콜을 적용하는 것에 익숙하다. 간단하게, 테스트될 식물 유전자형의 복수의 식물 (예를 들어, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 식물)의 모종에 테스트될 Pfs 레이스의 접종원을 접종하고, 모종을 병원체에 유리한 조건 하에 인큐베이션한다. 인큐베이션 수일 후, 식물을 감염 증상, 특히 자엽 및/또는 잎 (예를 들어, 최초의 진엽) 상에서의 포자형성에 대해 평가하고, 각각의 식물을 "저항성" (포자형성 징후를 나타내지 않음) 또는 "감수성" (포자형성을 나타냄)으로 카테고리화한다. 한 유전자형의 모든 식물의 특정 백분율, 예를 들어 약 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 초과 (또는 심지어 100%)가 "저항성"으로 분류되면, 이러한 시금치 식물 유전자형은 테스트된 레이스에 대해 저항성이다. 명백하게, 검정법이 예상대로 작동한다는 것을 확실히 하기 위해, 하나 이상의 대조군 식물 (예를 들어, 감수성 계통 또는 변종, 저항성 계통 또는 변종) 또한 동일한 처리(들) 및 환경 조건을 사용하여 검정법에 포함되어야 한다.
RPF14의 존재에 대한 이러한 테스트는 Pfs의 임의의 분리주 또는 레이스를 사용하여, 유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합인 식물 상에서 행해질 수 있다. 유전자가 이형접합 형태로 존재하는 경우에 식물이 테스트에 따라 저항성으로 카테고리화되면, 이러한 저항성은 우성이다. 간단한 테스트는 저항성 유전자를 포함하는 식물을 적어도 하나의 Pfs 레이스에 대해 감수성인 (즉, 배경 저항성이 없는) 식물과 교배시키고, F1 자손을 이러한 Pfs 레이스에 대한 저항성에 대해 테스트하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 F1 자손이 이러한 Pfs 레이스에 대해 저항성이면, 저항성이 우성인 것으로 결론지을 수 있다. 이러한 테스트는 RPF14가 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 그리고 바람직하게는 17에 대한 우성 저항성을 부여한다는 결론을 초래하였다. 우성 단일유전자 유전에 대한 또 다른 적절한 테스트는 저항성 유전자를 포함하는 식물을 모든 Pfs 레이스에 대해 감수성인 식물과 교배시키고, 이러한 교배로부터의 자손을 자가수정시켜 F2 세대를 생성시키고, Pfs 레이스에 대한 저항성의 분리를 관찰하는 것이다. 분리가 3:1 비의 저항성 대 감수성 식물이면, 저항성이 우성 단일유전자성이다. 유전자가 동형접합 형태로 존재하는 경우에만 식물이 이러한 테스트에 따라 저항성으로 카테고리화되면, 이러한 저항성은 열성으로 유전되었다.
시금치 식물 또는 식물의 일부분 (예를 들어 세포) 내의 RPF14 저항성 유전자 (또는 유전자를 포함하는 이입 단편)의 존재를 직접적으로 결정할 수도 있다. 통상의 기술자는 본 발명의 RPF14를 포함하는 재배 시금치 식물 (예를 들어 자손 식물) 또는 시금치 식물의 일부분, 또는 세포 또는 세포 배양물을 스크리닝, 선별 또는 확인하는 방법이 RPF14 유전자 또는 유전자좌에 연결된 하나 이상의 분자 마커, 예컨대 SNP_01을 검출함으로써 달성될 수 있다는 것을 인지한다. 따라서, 한 측면에서, RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드, 및/또는 RPF14 및/또는 RPF14 유전자를 포함하는 에스. 투르케스타니카 이입 단편에 연결된 임의의 다른 분자 마커의 존재에 의해 검출가능하다. 따라서, 통상의 기술자에 의해, 이입 단편을 포함하는 게놈, 특히 게놈의 3번 염색체가 이입 단편이 결여되고, 대신 에스. 올레라세아 게놈 서열을 포함하는 게놈, 특히 게놈의 3번 염색체로부터 구별될 수 있다.
RPF14 유전자는 3번 염색체의 시작부에서 염색체의 0 Mb에서 시작하여 2.0 Mb까지의 영역, 특히 3번 염색체 (SpinachBase 게놈에서 발견되는 바와 같음)의 0.4 Mb에서 시작하여 1.5 Mb에서 끝나는 영역 내에 위치한다. 따라서, 이러한 영역이 시퀀싱되고, 에스. 투르케스타니카 서열, 임의적으로는 또한 유전자에 연결된 SNP_01 마커를 포함하고, 식물이 RPF14 유전자가 부여하는 바와 같은 저항성 표현형을 포함하면, 식물 또는 식물의 일부분 (예를 들어 세포)이 본 발명의 RPF14 유전자를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 수탁 번호 NCIMB 42607 하의 기탁물에 존재하는 바와 같은, 이입 단편 또는 이입 단편의 하위-단편의 일부분으로서의 RPF14를 포함하는 재배 시금치 종자를 제공한다. 본 발명은 바람직하게는 용기 내의, RPF14를 포함하는 복수의 재배 시금치 종자를 또한 제공한다.
본 발명은 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성, 및 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 및 분리주 UA0514에 대한 저항성 (잠재적으로는 단편이 동형접합 형태인 경우에만)을 부여하는 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하는 재배 시금치 식물을 추가로 제공한다. 본 발명의 한 측면에서, 단편은 에스. 투르케스타니카로부터 이입된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 이입 단편은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에 존재하는 바와 같은 이입물, 또는 이러한 단편의 짧은 단편이다. 따라서 본 발명은 상기 언급된 이입 단편의 하위-단편을 포함하고, 여기서 상기 하위-단편이 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 레이스 8 및 10 내지 17에 대한 우성 저항성, 및 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 및 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성 (잠재적으로는 단편이 동형접합 형태인 경우에만)을 부여하는 재배 시금치 식물을 또한 포함한다. 본 발명은 상기 하위-단편을 포함하고, 여기서 상기 하위-단편이 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자 내에 존재하는 바와 같은 이입 단편의 일부분인 재배 시금치 식물을 추가로 포함한다. 더 짧은 하위-단편은 RPF14 유전자를 유지한다.
본 발명의 재배 시금치 식물은 잡종 식물, 특히 F1 잡종, 또는 순계 식물, 예를 들어 F1 잡종 종자 생산을 위한 양친으로서 사용될 수 있는 순계 계통 또는 동형접합 식물, 임의적으로는 이중 반수체 식물일 수 있다.
RPF14 유전자는 임의의 시금치 계통 또는 변종 내로 전달될 수 있다.
달리 말하면, RPF14 유전자는 대표적인 샘플이 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 식물, 또는 이로부터 유래되고 RPF14 유전자를 유지하는 임의의 시금치 식물로부터의 이입에 의해 임의의 다른 시금치 식물 내로 도입될 수 있다. 따라서, 기탁된 종자는 본 발명의 RPF14 저항성 유전자의 공급원이고, 기탁물로부터 직접적으로 수득되지는 않지만, 간접적으로 (예를 들어, 추후에 출시되는 상업용 변종을 통해) 수득되고, 본 발명의 RPF14 유전자를 포함하는 시금치 식물도 그러하다.
RPF14 유전자의 다른 공급원이, 예를 들어, 시금치의 야생 근연종 (특히, 동일한 Pfs 저항성 표현형을 갖고/갖거나 본원에서 제공되는 RPF14에 연결된 마커 (SNP_01)를 포함하는 다른 에스. 투르케스타니카 수탁물)에서 확인될 수 있고, 예를 들어, 대립유전자성 테스트를 사용하여, 동일한 Pfs 저항성 표현형을 부여하는 또 다른 유전자가 동일한 유전자인지 또는 상이한 유전자인지 여부를 결정할 수 있다. 마찬가지로, 시퀀싱을 사용하여 RPF14 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 또 다른 유전자가 동일한 유전자인지 여부를 결정하기 위한 대안적인 방법은 본 발명의 RPF14 유전자에 연결된 적어도 하나의 분자 마커의 개발, 및 상기 마커가 다른 유전자를 포함하는 식물에서 발생하는지 여부를 분석하는 것을 포함한다. 적절한 마커의 예는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 갖는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드이다.
한 측면에서,
a) 본원에 기술된 바와 같은 RPF14 유전자를 포함하는 시금치 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시켜 자손 식물을 생산하는 단계;
b) 임의적으로, 단계 a의 자손 식물을 1회 이상 자가수정시켜 추가 세대의 자가수정 자손을 생산하고, 임의적으로 종자를 생산하는 단계
를 포함하는, RPF14 유전자를 포함하는 재배 시금치 식물을 생성시키는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 단계 a)의 다른 시금치 식물은 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 또는 17 중 적어도 하나에 대해 감수성이다. 추가 실시양태에서, 단계 a)의 다른 시금치 식물은 순계 식물 또는 동형접합 식물 또는 웅성 양친 계통 또는 자성 양친 계통, 또는 바람직하게는 엘리트 웅성 양친 계통 또는 엘리트 자성 양친 계통이다.
또 다른 측면에서,
c) 자손 식물이 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하고/포함하거나, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에 아데닌을 포함하고/하거나, RPF14 유전자를 포함하는 에스. 투르케스타니카로부터의 이입 단편을 포함하는지 여부를 결정함으로써, RPF14 저항성 유전자를 포함하는 단계 a 또는 b의 자손 식물을 확인하는 단계,
d) 임의적으로, 단계 c의 확인된 자손 식물을 또 다른 시금치 식물에 교배시켜, 자손 식물 또는 자손 종자를 생산하는 단계
가 이어지는, 단계 a) 및 임의적으로 b)를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서,
a) NCIMB 42607 하에 기탁된 바와 같은 종자로부터 수득될 수 있는 (또는 이러한 종자 내에 존재하는 바와 같은) 이입 단편이며 서열식별번호: 1을 포함하는 이입 단편을 포함하는 시금치 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시키는 단계;
b) 임의적으로, 단계 a의 자손 식물을 1회 이상 자가수정시켜 추가 세대의 자가수정 자손을 생산하고, 임의적으로 식물 상에서 생산된 종자를 수집하는 단계
를 포함하는, RPF14 유전자 (적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 부여하고, 임의적으로 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상 및/또는 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 추가로 부여함)를 포함하는 시금치 식물을 생성시키는 방법이 제공된다.
한 실시양태에서, 단계 a)의 다른 시금치 식물은 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 또는 17 중 적어도 하나에 대해 감수성이다. 추가 실시양태에서, 단계 a)의 다른 시금치 식물은 순계 식물 또는 동형접합 식물 또는 웅성 양친 계통 또는 자성 양친 계통, 또는 바람직하게는 엘리트 웅성 양친 계통 또는 엘리트 자성 양친 계통이다.
또 다른 측면에서,
c) 자손 식물이 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 저항성을 포함하고/하거나 서열식별번호: 1을 포함하는지 여부를 결정함으로써, RPF14 저항성 유전자를 포함하는 단계 a 또는 b의 자손 식물을 확인하는 단계;
d) 임의적으로, 단계 c의 확인된 자손 식물을 또 다른 시금치 식물에 교배시켜, 자손 식물 또는 종자를 생산하는 단계
가 이어지는, 단계 a) 및 임의적으로 b)를 포함하는 방법이 제공된다.
둘 모두의 방법과 관련하여, 하기가 본원에 포함된다: 한 측면에서, 단계 a)의 식물은 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자에서 발견되는 바와 같은 RPF14 유전자를 포함한다. 시금치 식물은 기탁물의 종자로부터 성장된 식물, 또는 종자 기탁물을 사용하여 제조되었거나 이를 사용하였고, Pfs 저항성 표현형 (및 이를 부여하는 RPF14 유전자)을 유지하며, 임의적으로는 서열식별번호: 1을 유지하는 임의의 시금치 식물일 수 있다. 이는 종자 기탁물을 사용하여 제조된 상업용 시금치 변종을 포함한다. 따라서, a)의 시금치 식물은 예를 들어 NCIMB 42607에서 확인되는 바와 같은 (또는 이로부터 수득될 수 있는, 수득되는, 유래될 수 있는, 유래되는 바와 같은) 본 발명에 따른 RPF14 유전자를 포함한다.
단계 c)에서의 선별 (또는 확인)은 표현형을 기초로 (즉, Pfs 저항성 검정법을 사용하여), 및/또는 분자적인 방법, 예컨대 RPF14 유전자 또는 유전자좌에 연결된 분자 마커, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드의 검출, 또는 다른 방법 예컨대 시퀀싱을 기초로 이루어질 수 있다.
상기 방법에서, 단계 (a)의 시금치 식물은 바람직하게는 동형접합 형태의 RPF14 유전자 (즉, RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편 또는 이의 하위-단편)를 포함한다. 단계 a)에서, 저항성을 포함하는 시금치 식물은, 한 측면에서, a)의 식물이 이에 대해 저항성인 Pfs 레이스 중 적어도 하나에 대해 감수성인 또 다른 시금치 식물과 교배된다. b)에서의 제2 양친이 a)의 식물이 이에 대해 저항성인 Pfs 레이스 중 적어도 하나에 대해 감수성인 시금치 식물이면, 단계 (d) 및/또는 (f)에서의 선별은 이제 이러한 레이스에 대해 저항성인 식물을 선별하는 것을 기초로 할 수 있다.
상기 방법에서, RPF14 유전자가 부여하는 Pfs 저항성 표현형을 유지하지만, 기탁된 종자 내에 존재하는 것보다 더 작은 이입 단편을 갖는 식물이 또한 선별 및/또는 확인될 수 있다. 이는 유리할 수 있는데, 이입 단편에 커플링된 에스. 투르케스타니카의 부정적인 형질이 이에 의해 제거될 수 있기 때문이다. 따라서, 재조합에 의해 이입 단편의 크기를 감소시키고, 더 작은 이입 단편을 포함하지만 저항성-부여 유전자를 유지하는 식물을 선별하는 것이 바람직하다. 따라서, 한 측면에서, Pfs 저항성 부여 일부분 (즉 RPF14 유전자)이 시금치 식물에서 유지되는 한, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 기원하는 (또는 유래되는, 또는 유래될 수 있는, 또는 수득되는, 또는 수득될 수 있는) 모든 크기의 이입 단편이 있는 시금치가 본원에 포함된다. 언급된 바와 같이, 표현형에 의해 및/또는 관련 분야에 공지되어 있는 분자적인 방법을 사용하여 존재를 테스트/선택할 수 있다.
a) 스피나시아 올레라세아 종의 제1 시금치 식물을 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 또는 17 중 하나 이상에 대해 감수성인 제2 시금치 식물과 교배시키고, 여기서 제1 시금치 식물이 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하고, 상기 저항성이 에스. 투르케스타니카로부터 이입된 단일 유전자에 의해 부여되고, 이러한 유전자가 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 갖는 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된 단계;
b) 상기 교배의 자손으로부터 성장된 식물을 1회 이상 자가수정시켜 추가 세대의 자가수정 자손을 생산하고/하거나, 상기 교배의 자손으로부터 성장되거나 또는 추가 세대의 자가수정 자손으로부터 성장된 식물을 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 또는 17 중 하나 이상에 대해 감수성인 시금치 식물과 역교배시키는 단계; 및
c) 단계 b)의 자손 식물 중에서 단계 a)의 제1 양친 식물의 단일 유전자를 포함하는 시금치 식물을 확인하는 단계
를 포함하는, 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 우성 저항성을 포함하는 시금치 식물을 생성시키는 방법이 또한 제공된다.
한 측면에서, SNP_01 (RPF14 유전자에 연결됨)의 유전자형이 단계 c)에서 식물을 확인하는 데 사용된다. SNP_01의 뉴클레오티드는 아데닌, 즉 공여자 뉴클레오티드이다. 따라서, 한 측면에서, 식물은 공여자 SNP_01 뉴클레오티드를 포함하는 이입 단편을 포함한다.
상기 방법에 의해 생산된 식물 또한 본 발명의 실시양태이다.
또한,
a) i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 갖는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드;
ii) RPF14 유전자 또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편에 연결된 또 다른 마커
로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 SNP 마커를 검출하는 분자 마커 검정법을 사용하여 재배 시금치 식물 또는 식물의 일부분 또는 이러한 식물 또는 식물의 일부분의 DNA를 스크리닝하는 단계, 및 임의적으로
b) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01에 대한 저항성 공여자 SNP 뉴클레오티드; 및/또는 RPF14 유전자 또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편에 연결된 또 다른 마커를 포함하는 식물 또는 식물의 일부분을 확인 또는 선별하는 단계
를 포함하는, 시금치 식물 또는 식물의 일부분 내의 본원에 기술된 바와 같은 RPF14 유전자의 존재를 스크리닝, 확인 또는 검출하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서,
a) i) 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 갖는 SNP_01에 대한 저항성 공여자 뉴클레오티드; 및/또는
ii) RPF14 유전자 또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편에 연결된 또 다른 마커
로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 SNP 마커를 검출하는 분자 마커 검정법을 사용하여 식물 또는 식물의 일부분 (또는 상기 식물 또는 식물의 일부분으로부터 수득된 DNA)을 스크리닝하는 단계
를 포함하는, 재배 시금치 식물이 본원에 기술된 바와 같은 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편을 포함하는지 여부를 검출하는 방법이 제공된다.
상기 방법 중 임의의 것으로부터 유래되거나, 수득되거나, 수득될 수 있거나 또는 유래될 수 있는, 또는 상기 방법 중 임의의 것에서 확인 또는 검출되는 재배 시금치 식물 또는 식물의 일부분 또한 본 발명의 실시양태이고, 상기 식물은 RPF14가 부여하는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하거나, 또는 상기 식물의 일부분은 RPF14 유전자 (또는 유전자, 및 임의적으로 유전자에 연결된 마커를 포함하는 이입 단편)를 포함한다.
본 발명의 식물은 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 수득될 수 있는 바와 같은 (이에 존재하는 바와 같은, 이로부터 수득될 수 있는 바와 같은, 이로부터 수득되는 바와 같은 또는 이로부터 유래되는 바와 같은) 본 발명의 Pfs 저항성 유전자를 유지하는 자손을 생성시키는 데 사용될 수 있다. 자손을 생성시키기 위해, 본 발명에 따른 시금치를 1회 이상 자가수정시키고/시키거나 또 다른 시금치 식물과 교배시킬 수 있고, 종자를 수집할 수 있다. Pfs 저항성 표현형 및/또는 분자적인 방법, 예컨대 RPF14 유전자 또는 유전자좌에 연결된 분자 마커 (예를 들어 SNP 마커)에 의해 자손 식물 내의 RPF14 유전자의 존재를 결정할 수 있다 (즉, RPF14 유전자를 포함하는 자손 식물을 확인/선별할 수 있다).
본 발명은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 부여하고, 임의적으로 추가로 레이스 1, 2, 6, 7, 9 및 분리주 UA0514에 대한 저항성을 부여하기 위한 RPF14 유전자의 용도 (및 유전자를 포함하는 이입 단편의 용도)를 추가로 구상한다.
한 실시양태에서, 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하고, 임의적으로 추가로 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성, 및/또는 임의적으로 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 포함하는 재배 시금치 식물을 생성시키기 위한, 시금치 식물, 또는 상기 식물의 자손 (예를 들어, 자가수정에 의해 수득됨), 또는 재생가능한 세포 또는 세포 배양물, 또는 영양 번식될 수 있는 식물의 일부분의 용도가 제공되고, 여기서 상기 식물의 대표적인 종자가 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁되었다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하고, 임의적으로 추가로 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성 및/또는 임의적으로 분리주 UA0514 및/또는 Pfs 분리주에 대한 저항성을 포함하는 재배 시금치 식물을 생성시키기 위한, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자, 또는 이의 자손 (예를 들어, 자가수정에 의해 수득됨)으로부터 수득될 수 있는 이입 단편이 부여하는 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하는 시금치 식물의 용도를 구상한다.
종자
본 발명은 임의의 본 발명의 식물로 성장할 수 있는 종자를 제공한다. 추가로, 본 발명은 복수의 이러한 종자를 제공한다. 표현형적으로 (RPF14 저항성 표현형을 갖는 식물을 기초로) 및/또는 분자적인 방법을 사용하여, 본 발명의 종자를 RPF14 저항성 유전자의 존재로 인해 다른 종자로부터 구별할 수 있다.
한 측면에서, 복수의 종자가 용기 (예를 들어, 백, 지함, 캔 등) 내로 포장될 수 있다. 용기는 임의의 크기일 수 있다. 종자를 (정제 또는 펠릿을 형성하도록) 포장 전에 펠릿화시킬 수 있고/있거나, 종자 코팅물을 포함하는 다양한 화합물로 처리할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 시금치 종자가 프라이밍된다. 프라이밍은 토양으로부터의 발아 및 출아의 균일성을 증가시키기 위해 종자 상에 수행되는 물-기반 공정이고, 따라서 식물 입목 확립을 강화한다. 프라이밍은 첫 모종과 마지막 모종의 출아 사이의 시간을 감소시킨다. 시금치 종자를 프라이밍하는 방법이 관련 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al. 2010, Seed Sci. & Technol. 38: 45-57]을 참조한다). 또 다른 실시양태에서, 시금치 종자가 작물 보호로 처리되거나, 필름 코팅되거나, 또는 펠릿화된다. 필름 코팅 및 작물 보호 처리는 통상적으로 조합되고, 예를 들어 US20170127670을 참조한다.
식물의 일부분 및 영양 생식
추가 측면에서, 본 발명의 식물로부터 수득되는 (수득될 수 있는) 식물의 일부분, 및 상기 식물의 일부분을 포함하는 용기 또는 패키지가 본원에서 제공된다.
바람직한 실시양태에서, 식물의 일부분은 본 발명의 시금치 식물의 잎, 또는 복수의 잎, 또는 잎의 일부분, 바람직하게는 수확된 잎이다. 이러한 잎은 고정되어 있지 않거나, 다발로 묶이거나, 신선하거나 (예를 들어, 용기, 예를 들어 백 내에 있음), 냉동되거나, 데쳐지거나 또는 삶아질 수 있다. 이러한 잎은 신선하거나 또는 가공될 수 있고, 식품 또는 사료 제품의 일부분일 수 있다. 잎은 이의 발달 중 임의의 단계에서 수확될 수 있고, 바람직한 단계는 어린 잎 및 성숙한 잎이다.
본 발명의 식물의 다른 식물 일부분은 잎, 잎의 일부분, 줄기, 줄기의 일부분, 대, 대의 일부분, 출아물, 출아물의 일부분, 싹 또는 싹의 일부분, 절단물, 뿌리, 뿌리의 일부분, 뿌리 끝부분, 잎자루, 잎자루의 일부분, 자엽, 자엽의 일부분, 꽃, 꽃의 일부분, 꽃잎, 꽃잎의 일부분, 수술, 수술의 일부분, 꽃밥, 꽃밥의 일부분, 꽃가루, 암술머리, 암술머리의 일부분, 암술대, 암술대의 일부분, 씨방, 씨방의 일부분, 배주, 배주의 일부분, 종자, 종자의 일부분, 종자 외피, 배아, 배아의 일부분, 배축, 배낭, 열매, 열매의 일부분, 세포, 원형질체, 캘러스, 소포자, 분열조직, 형성층 등을 포함한다. 상기 언급된 식물의 일부분의 발달의 다양한 단계가 본 발명에 포함된다.
종자는, 예를 들어, 자가-수분 후에 본 발명의 식물로부터 생산된 종자, 또는 타가-수분, 예를 들어 본 발명의 식물과 또 다른 시금치 식물로부터의 꽃가루의 수분 또는 또다른 시금치 식물과 본 발명의 식물의 꽃가루의 수분 후에 생산된 종자를 포함한다.
한 측면에서, 식물의 일부분 또는 종자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에 아데닌을 갖는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 대한 공여자 SNP 뉴클레오티드의 존재에 의해 확인될 수 있다.
추가 측면에서, 식물의 일부분은 식물 세포이다. 추가 측면에서, 식물의 일부분은 재생불능 세포 또는 재생가능 세포이다. 또 다른 측면에서, 식물 세포는 체세포이다. 한 측면에서, 세포는 이의 천연 위치로부터 단리된다.
재생불능 세포는 시험관내 배양을 통해 전체 식물로 재생될 수 없는 세포이다. 재생불능 세포가 본 발명의 식물 또는 식물의 일부분 (예를 들어 잎) 내에 있을 수 있다. 재생불능 세포는 종자, 또는 상기 종자의 종자-외피 내의 세포일 수 있다. 성숙된 잎, 성숙된 줄기 또는 성숙된 뿌리를 포함하는 성숙된 식물 기관이 적어도 하나의 재생불능 세포를 포함한다. 성숙 중인 식물 기관 예컨대 어린 잎 시금치 잎 또한 적어도 하나의 재생불능 세포를 포함한다.
또한, 세포- 또는 조직 배양물이, 예를 들어 그리고 비제한적으로, 잎, 잎의 일부분, 줄기, 줄기의 일부분, 대, 대의 일부분, 출아물, 출아물의 일부분, 싹 또는 싹의 일부분, 절단물, 뿌리, 뿌리의 일부분, 뿌리 끝부분, 잎자루, 잎자루의 일부분, 자엽, 자엽의 일부분, 꽃, 꽃의 일부분, 꽃잎, 꽃잎의 일부분, 수술, 수술의 일부분, 꽃밥, 꽃밥의 일부분, 꽃가루, 암술머리, 암술머리의 일부분, 암술대, 암술대의 일부분, 씨방, 씨방의 일부분, 배주, 배주의 일부분, 종자, 종자의 일부분, 종자 외피, 배아, 배아의 일부분, 배축, 배낭, 열매, 열매의 일부분, 세포, 원형질체, 캘러스, 소포자, 분열조직, 형성층, 체세포, 비-생식 세포 또는 생식 세포와 같은 상기 기술된 식물의 일부분으로부터 유래되는 본 발명의 시금치 식물의 시험관내 세포 배양물 또는 조직 배양물이 제공된다.
따라서, 한 측면은 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하는 스피나시아 올레라세아 종의 시금치 식물의 일부분으로부터 유래된 세포 또는 조직을 포함하는 세포 배양물 또는 조직 배양물이고, 여기서 상기 저항성이 스피나시아 투르케스타니카로부터 이입된 단일 유전자에 의해 부여되고, 이러한 유전자가 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된 세포 배양물 또는 조직 배양물을 제공한다.
한 측면에서, 이러한 세포 또는 조직은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01에 대한 공여자 유전자형의 존재에 의해 확인될 수 있다.
상기 기술된 식물의 일부분 중 임의의 것으로부터 재생되거나 또는 상기 기술된 세포 또는 조직 배양물로부터 재생된 시금치 식물이 또한 제공되고, 상기 재생 식물은 Pfs 저항성 표현형 (RPF14 유전자가 부여하는 바와 같음)을 갖고, 즉, 본 발명의 RPF14 유전자 (또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편)를 유지한다. 이러한 식물은 본 발명의 식물의 영양 번식물로서 또한 지칭될 수 있다.
본 발명의 식물의 수확된 잎, 및 본 발명의 하나 이상의 식물의 복수의 잎을 포함하는 패키지 또한 제공된다. 따라서, 이러한 잎은 (원래 사용된 전체 식물 및/또는 재생 식물에 대해) 예를 들어 연결된 분자 마커에 의해 또는 표현형에 의해 검출될 수 있는 본 발명의 RPF14 유전자를 포함한다. 잎은 임의의 발달 단계에 수확될 수 있다. 잎을 수확하기 위한 바람직한 발달 단계는 성숙 단계 및 어린 잎 단계이다.
본 발명은 본원에 기술된 식물의 일부분을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 식품 또는 사료 제품을 또한 제공한다. 식품 또는 사료 제품은 신선하거나 또는 가공될 수 있고, 예를 들어, 이를 캔에 담고/담거나, 찌고/찌거나, 삶고/삶거나, 튀기고/튀기거나, 데치고/데치거나 냉동하는 것 등이 가능하다. 예는 본 발명의 식물의 잎 또는 잎의 일부분을 포함하는 샐러드 또는 샐러드 혼합물, 또는 포장된 냉동 시금치이다.
서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 임의적으로 연결된 RPF14 유전자가 부여하는 Pfs 저항성 표현형을 유지하고/하거나, NCIMB 42607에 존재하는 바와 같은, RPF14 유전자 및 임의적으로 상기 SNP_01 (또는 서열식별번호: 1)을 포함하는 이입 단편 또는 하위-단편을 유지하는 본 발명의 시금치 식물 또는 이의 자손, 및 상기 언급된 식물의 일부분은 운송을 위해 적절하게 포장될 수 있고/있거나 신선하게 판매될 수 있다. 이러한 일부분은 잎, 절단물, 꽃가루, 잎의 일부분 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 모종 또는 식물로부터 수득될 수 있는 임의의 세포, 조직 및 기관을 포함한다.
잎은 어린 잎 또는 어린 시금치로서 미성숙한 상태로 또는 성숙한 상태로 수확될 수 있다. 식물, 식물들 또는 이의 일부분이 용기 (예를 들어, 백, 지함, 캔 등)에 단독으로 또는 다른 식물 또는 물질과 함께 포장될 수 있다. 일부분이 저장되고/되거나 추가로 가공될 수 있다. 따라서, 본 발명의 식물, 이의 자손 및 상기 언급된 식물의 일부분으로부터 수득될 수 있는, 이러한 일부분, 이러한 잎 또는 이의 일부분 중 하나 이상을 포함하는 식품 또는 사료 제품이 또한 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 식물 (신선하고/하거나 가공됨)의 식물 일부분을 포함하는 용기, 예컨대 캔, 박스, 크래이트, 백, 카톤, 가스 치환 포장, 필름 (예를 들어 생분해성 필름) 등이 본원에서 또한 제공된다.
식물 및 자손
또 다른 실시양태에서, 재생 (종자 번식되거나, 또는 재생되거나, 또는 영양 번식된) 식물이 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 임의적으로 연결된 RPF14 유전자에 의해 부여되는 바와 같은 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16, 바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17에 대한 저항성 (임의적으로 추가로 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7, 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성, 및/또는 임의적으로 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성)을 포함하는, 예를 들어, 종자로부터 성장되거나, 유성 또는 영양 생식에 의해 생산되거나, 상기 기술된 식물의 일부분으로부터 재생되거나, 또는 세포 또는 조직 배양물로부터 재생된, 본 발명의 시금치 식물의 식물 및 일부분, 및 본 발명의 시금치 식물의 자손이 제공된다.
한 측면에서, 본 발명의 시금치 식물의 자손 식물은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌을 갖는 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된 RPF14 저항성 유전자를 유지하는 자손 식물이다.
또 다른 측면에서, 자손 식물은 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성을 포함하는 스피나시아 올레라세아 종의 시금치 식물이고, 여기서 상기 저항성은 스피나시아 투르케스타니카로부터 이입된 단일 유전자 RPF14에 의해 부여되고, 한 측면에서, 이러한 유전자는 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (A) 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 동등한 위치에서의 아데닌인 SNP_01의 저항성 공여자 뉴클레오티드에 연결된다. 바람직하게는, RPF14의 존재를 상기 언급된 SNP_01에 대한 공여자 뉴클레오티드 및/또는 RPF14 또는 이입 단편에 연결된 또 다른 마커에 의해 확인할 수 있다.
전에 언급된 바와 같이, 식물, 자손 또는 영양 번식물이 RPF14 유전자가 부여하는 바와 같은 Pfs 저항성 표현형을 포함하는지 여부를, 예를 들어, 상기에서 또는 실시예에 기술된 바와 같은 Pfs 질병 저항성 검정법을 사용하여 표현형적으로, 및/또는 분자적인 기술 예컨대 분자 마커 분석, DNA 시퀀싱 (예를 들어, 이입을 확인하기 위한 전체 게놈 시퀀싱), 염색체 페인팅 등을 사용하여 테스트할 수 있다.
추가로, 본 발명은 Pfs 저항성 표현형 (RPF14 유전자에 의해 부여됨)을 포함하거나 또는 유지하는 자손, 예컨대 예를 들어 본 발명의 식물을 1회 이상 자가수정시키고/시키거나 상이한 변종 또는 육종 계통의 또 다른 시금치 식물 또는 본 발명의 시금치 식물과 1회 이상 타가-수분시킴으로써 수득되는 자손을 제공한다. 특히, 본 발명은 NCIMB 42607의 (NCIMB 42607에서 발견되는 바와 같은) RPF14 유전자 (Pfs 저항성 표현형을 부여함)를 유지하는 자손을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 RPF14 저항성을 포함하는 자손 식물, 예컨대 자가수정, 교배, 돌연변이, 이중 반수체 생산 또는 형질전환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 RPF14 저항성을 포함하는 시금치 식물로부터 생산된 자손 식물을 제공한다. 돌연변이는 자발적 돌연변이 또는 인간에 의해 유도된 돌연변이 또는 소마클로날(somaclonal) 돌연변이일 수 있다. 한 실시양태에서, 식물의 하나 이상의 특성을 변화시키기 위해 본 발명의 식물 또는 종자가 (예를 들어, 방사선조사, 화학적돌연변이유발, 열 처리, 틸링(TILLING) 등에 의해) 또한 돌연변이될 수 있고/있거나, 돌연변이된 종자 또는 식물이 선별될 수 있다 (예를 들어, 천연 변이체, 소마토클로날 변이체 등). 유사하게, 본 발명의 식물이 형질전환 및 재생될 수 있고, 이에 의해 하나 이상의 키메라 유전자가 식물 내로 도입된다. 형질전환은 표준 방법, 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개 형질전환 또는 생물탄도를 사용하여 수행될 수 있고, 형질전환된 세포의 선별 및 식물 내로의 재생이 이어진다. 원하는 형질 (예를 들어, 해충 또는 질병 저항성, 제초제, 진균제 또는 살충제 내성 등을 부여하는 유전자)이 본 발명의 식물 또는 이의 자손을 원하는 형질을 부여하는 트랜스진으로 형질전환시킴으로써 식물 또는 이의 자손 내로 도입될 수 있고, 형질전환된 식물은 RPF14 유전자 및 이에 의해 부여되는 Pfs 저항성 표현형을 유지하고, 원하는 형질을 갖는다.
한 측면에서, RPF14 유전자 또는 RPF14 유전자를 포함하는 이입 단편이 부여하는 바와 같은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성, 임의적으로 추가로 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7, 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성, 및/또는 임의적으로 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 포함하는, 본 발명의 식물의 반수체 식물 및/또는 이중 반수체 식물이 본원에 포함된다. 반수체 및 이중 반수체 (DH) 식물은, 예를 들어, 꽃밥 또는 소포자 배양 및 전체 식물로의 재생에 의해 생산될 수 있다. DH 생산을 위해, 염색체 배가가 공지된 방법, 예컨대 콜히친 처리 등을 사용하여 유도될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 이중 반수체 식물인, 본원에 기술된 바와 같은 Pfs 저항성 표현형을 포함하는 시금치 식물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 식물을 자신과 또는 상이한 시금치 식물과 교배시키고, 생성된 종자를 수확하는 것을 포함하는, 시금치 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생산된 종자, 및/또는 이러한 종자를 성장시킴으로서 생산된 시금치 식물에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 식물은 시금치 종자의 생산에서 웅성 및/또는 자성 양친으로서 사용될 수 있고, 이에 의해 상기 종자로부터 성장된 식물은 RPF14 유전자의 존재로 인해 적어도 Pfs 8 및 10 내지 16 (바람직하게는 적어도 8 및 10 내지 17)에 대한 저항성, 임의적으로 추가로 Pfs 레이스 1, 2, 6, 7, 및 9 중 하나 이상에 대한 저항성, 및/또는 임의적으로 분리주 UA0514 및/또는 다른 Pfs 분리주에 대한 저항성을 포함한다.
따라서, 한 측면에서, 예를 들어, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 시금치 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시킴으로써 수득될 수 있는, 자손 식물이 자가수정, 교배, 돌연변이 이중 반수체 생산 또는 형질전환에 의해 생산되고, 자손이 본원에 기술된 RPF14 저항성 유전자 (및 이에 의해 부여되는 표현형)를 유지하는, 본 발명의 시금치 식물의 자손이 제공된다. 달리 말하면, 한 측면에서, 종자 기탁물 NCIMB 42607에 존재하거나 / 이러한 기탁물에서 확인되거나 / 이러한 기탁물로부터 유래되는 (또는 유래될 수 있는) 바와 같은 저항성 유전자 또는 유전자좌 (또는 유전자 또는 유전자좌를 포함하는 이입 단편)가 자손 식물에서 유지된다.
분자 마커는 RPF14 저항성 유전자 또는 유전자좌를 포함하는 식물 (또는 이로부터 수득되는 식물의 일부분 또는 핵산)의 확인을 보조하는 데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, RPF14 저항성 유전자 또는 유전자좌에 밀접하게 유전적으로 물리적으로 연결된 하나 이상의 분자 마커가 개발될 수 있다. 이는 저항성 시금치 식물 (RPF14를 포함함)을 감수성 시금치 식물과 교배시키고, 이러한 교배로부터 분리 집단 (예를 들어, F2 또는 역교배 집단)을 발달시킴으로써 행해질 수 있다. 그 후, 분리 집단을 Pfs 저항성에 대해 표현형결정하고, 예를 들어 분자 마커 예컨대 SNP (단일 뉴클레오티드 다형성), AFLP (증폭 단편 길이 다형성; 예를 들어, EP 534 858 참조) 등을 사용하여 유전자형결정하고, 소프트웨어 분석에 의해, 분리 집단에서 Pfs 저항성 형질과 함께 공동-분리되는 분자 마커를 확인할 수 있으며, RPF14 저항성 유전자 또는 유전자좌에 대한 이들의 순서 및 유전적 거리 (센티모건 거리, cM)를 확인할 수 있다. SpinachBase에 대한 BLAST 분석에 의해, 3번 염색체 상에서의 물리적 위치를 결정할 수 있다. 플랭킹 마커가 확인되면 (RPF14 유전자의 어느 한쪽 측면), 마커들 사이에서 RPF14가 위치하는 3번 염색체의 물리적인 영역을 확인할 수 있다.
그 후, RPF14 저항성 유전자좌에 밀접하게 연결된 분자 마커, 예를 들어, 5 cM 이하의 거리의 마커를 RPF14 저항성 유전자 또는 유전자좌를 포함하는 이입 단편을 포함하거나 또는 유지하는 식물 (예를 들어, 본 발명의 식물 또는 본 발명의 식물의 자손) 또는 식물의 일부분을 검출 및/또는 선별하는데 사용할 수 있다. 이러한 밀접하게 연결된 분자 마커는 육종 프로그램에서, 즉 마커 보조 선별 (MAS)에서 표현형 선별을 대체할 수 있다 (또는 표현형 선별에 더하여 사용될 수 있다). 바람직하게는, 연결된 마커가 MAS에서 사용된다. 마커로 사용될 수 있는 한 서열은 기술된 바와 같은 SNP_01을 포함하는 서열이다. 더욱 바람직하게는, 플랭킹 마커, 즉 RPF14 유전자 또는 유전자좌의 어느 한쪽 측면 상의 하나의 마커가 MAS에서 사용된다.
서열식별번호: 1, 및 본원에 개시된 기탁된 종자를 사용하여, 통상의 기술자는 RPF14 유전자 자체의 서열을 관련 분야에 공지된 방법을 사용하여 확인할 수도 있다. 예를 들어, 3번 염색체 영역을 시퀀싱하고 서열을 예를 들어 SpinachBase 내의 서열에 비교하는 것을 사용하여, RPF14 유전자 자체의 서열을 확인하기 위해 이입 단편의 오픈 리딩 프레임을 확인할 수 있다. RPF14 유전자의 변형, 예를 들어 CRISPR-Cas9에 의한 변형을 사용하여, 유전자의 기능을 입증할 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 RPF14 유전자 내 (예를 들어, 프로모터, 단백질 코딩 서열, 기타 조절 서열 내)의 유도된 돌연변이를 포함하는 식물을 또한 생성시킬 수 있다. RPF14 유전자 내의 유도된 돌연변이를 포함하는 식물이 본원에 포함된다.
한 측면에서, 시금치 종자, 식물 또는 식물의 일부분, 또는 이러한 종자, 식물 또는 식물의 일부분으로부터의 DNA를 RPF14 유전자에 연결된 하나 이상의 마커의 존재에 대해 스크리닝하고, 임의적으로는 선별하는 방법이 제공된다.
다른 측면에서, 하나 이상의 핵산 프로브, 핵산 프라이머들, 또는 이의 조합물을 사용하여 RPF14 유전자가 검출될 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 엄격한 혼성화 조건을 사용하여, RPF14 유전자를 포함하는 식물 또는 식물의 일부분으로부터 수득된 게놈 DNA에 혼성화하는 하나 이상의 핵산 프로브에 의해 RPF14 유전자가 검출될 수 있다.
핵산 프로브는, 예를 들어, 서열식별번호: 1을 포함하는 (또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열의 114와 동등한 위치에 아데닌을 포함하는) DNA 분자, 또는 이의 보체 서열일 수 있다. 또 다른 측면에서, RPF14 유전자에 연결된 게놈 DNA를 증폭시키는 하나 이상의 핵산 프라이머에 의해 RPF14 유전자가 검출될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 상기 언급된 서열식별번호: 1 또는 114와 동등한 위치에 아데닌이 있는 서열식별번호: 1에 대한 90%, 91%, 92,%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 적절한 프라이머는, 예를 들어, 70 내지 100 bp 상류일 수 있고, SNP 마커의 70 내지 100 bp 상류가 마커를 증폭시키는 전방향 및 역방향 프라이머를 디자인하기 위해 선택될 수 있다. 프라이머는, 예를 들어, SNP 유전자형결정에, 예를 들어 SNP_01에 대한 SNP 유전자형을 검출하기 위한 KASP-검정법에서 사용될 수 있다.
식물 또는 식물의 일부분 내의 관심 형질 (즉 RPF14 유전자 또는 유전자좌)의 상대적인 존재 또는 부재를 확인할 수 있는 임의의 다른 유형의 분자 마커 및/또는 다른 검정법 또한 육종 목적에 유용할 수 있다.
기탁 정보
대표적인 개수의 스피나시아 올레라세아 NCIMB 42607을 눈헴스 B.V.가 부다페스트 조약 하에 2016년 7월 12일에 NCIMB 리미티드 (영국 AB21 9YA 애버딘 벅스번 크레이브스톤 에스테이트 퍼거슨 빌딩) (NCIMB)에 기탁하였다. 요청 시 미국 특허청장에 의해 이에 대한 자격이 있는 것으로 결정된 사람에게 기탁물에 대한 접근이 본 출원의 계류 동안 이용가능할 것이다. 37 C.F.R. § 1.808(b)에 적용되어, 기탁된 물질의 일반인에 대한 이용가능성에 대한 기탁자에 의해 부과된 모든 제한은 특허의 승인 시 취소불능으로 제거될 것이다. 기탁물은 30년 또는 가장 최근의 요청 후 5년의 기간, 또는 특허 존속 기간 중 어느 쪽이든 더 긴 기간 동안 유지될 것이고, 그러한 기간 동안 생존가능하지 않게 되는 경우 대체될 것이다. 출원인은 본 출원에 대한 본 특허 하에 또는 식물 변종 보호법 (7 USC 2321 이하 참조) 하에 승인된 어떠한 권리도 포기하지 않는다.
기술된 본 발명의 생성물 및 방법의 다양한 변형 및 변동이 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않으면서 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명이 구체적이고 바람직한 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 청구된 바와 같은 발명은 이러한 구체적인 실시양태에 과도하게 제한되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 실제로, 식물 육종, 화학, 생물학, 식물 병리학 또는 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형이 하기 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
예시의 목적으로만 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는 하기 실시예에서 본 발명이 추가로 예시될 것이다.
실시예
1 - 야생 공여자의 선별 및 야생 공여자로부터의 RPF14 유전자의 재배 시금치 내로의 교배
여러 야생 수탁물을 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에 레이스 1 내지 16 및 분리주 UA0514로의 감염에 대한 저항성에 대해 테스트하였다. 스피나시아 투르케스타니카 수탁물이 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대해 저항성인 것으로 발견되었고, 이를 선별하였다.
선별된 식물 (저항성 공여자)을 Pfs에 대한 어떠한 공지된 배경 저항성도 없는 재배 시금치 식물과 교배시켰다. 자손 식물을 선별된 식물 (공여자)이 나타내는 바와 같은 적어도 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 Pfs 저항성에 대해 테스트하였고, 저항성 자손 식물을 선별하고, 상기 재배 시금치 식물과 역교배시키고, 여러 세대 동안 자가수정시켜, 동형접합 형태의 이입 단편을 포함하는 계통을 생성시켰다. 따라서, 스피나시아 투르케스타니카 공여자로부터의 저항성이 재배 시금치 식물 내로 이입되었다. 이와 같이 수득된 식물 계통의 종자를 NCIMB에 번호 NCIMB 42607 하에 기탁하였다.
2 - RPF14 유전자를 포함하는 재배 시금치의 Pfs 저항성 표현형
페로노스포라 파리노사 감염에 대한 저항성을 차등물 세트 (상기 언급된 네덜란드의 나크투인보우로부터 수득될 수 있음)의 도움으로 테스트하였다.
NCIMB 42607 종자 (RPF14 유전자를 포함함)로부터 성장된 시금치 식물을 차등물 세트 및 점검물로서의 역할을 하는 다른 유전자형으로부터의 시금치 식물과 함께 BVB 기질 (유로빈(Euroveen), 그루벤보스트)을 함유하는 트레이에 심고, 아그라-버미큘라이트(Agra-vermiculite) (풀(Pull), 레넨)로 덮었다. 테스트 당 하나의 유전자형 각각으로부터의 적어도 10개의 식물을 1 또는 2회의 반복으로 테스트하였다. 트레이를 12시간 광주기로 12℃/15℃ (낮/밤)의 클라이메이트 셀 내에 놓았다. 파종 14일 후 페로노스포라 파리노사 분화형 스피나시아에의 병원성 레이스의 포자낭 현탁액 (2.5×105개/m1)을 분무함으로써 식물에 접종시켰다. 이러한 방식으로, 병원성 레이스를 검정하였다. 접종된 식물을 100% 상대 습도로 24시간 동안 투명한 플라스틱 물질로 덮었고, 이러한 기간 후 플라스틱을 상부에서 제거하여 상대 습도를 80%로 낮췄다.
10일 후, 문헌 [Irish et al., 2007; Plant Dis. 91: 1392-1396]에 기술된 바와 같이, 자엽 및 진엽 상에서의 병원체 포자형성의 증상을 기초로 식물을 '저항성' 또는 '감수성'으로 채점하였다. 포자형성의 증거를 나타내는 식물 계통은 '감수성'으로 간주되었다. 계통의 적어도 85%의 개체가 포자형성을 나타내지 않은 식물 계통이 '저항성'으로 간주되었다. 초기에 저항성으로 채점된 식물에 감염 탈출이 있었는지 여부 또는 이들이 진정하게 저항성인지 여부를 평가하기 위해 저항성 식물에 재접종하였다. 이러한 식물을 2차 접종 10일 후에 다시 채점하였다. 식물의 <15%이 '감수성'으로 카테고리화되는 (즉, 식물의 85% 초과가 포자형성을 나타내지 않는) 임의의 유전자형이 저항성 유전자형으로서 간주되었다.
동형접합 형태로 NCIMB 42607에 존재하는 바와 같은, 새로운 저항성 유전자인 RPF14가 Pfs 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16 및 분리주 UA0514에 대한 저항성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 표 2는 Pfs 레이스 1-16 및 분리주 UA0514에 대한 NCIMB 42607 종자 (RPF14를 동형접합적으로 포함함)로부터 성장된 시금치 식물의 저항성을 나타낸다.
RPF11, RPF12 또는 RPF13에 대해 동형접합인 계통은 Pfs 레이스 16에 대해 저항성이지 않은 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00003
표 1의 감수성 및 저항성 차등물 변종이 점검물로 사용되었고, 표 1에서 제공된 바와 같은 기준에 따라 예상대로 거동하였다 (데이터는 제시되지 않음).
<표 2>
RPF14의 질병 저항성
Figure pct00004
3 - 다른 시금치 식물 내로의 RPF14 저항성 형질의 이입
또 다른 실험에서, NCIMB 42607 종자로부터 성장된 시금치 식물을 (부친으로서) 테스트될 레이스에 대해 감수성인 상이한 시금치 식물과 교배시켰다. F1 집단의 식물을 실시예 2에 기술된 바와 같이 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 Pfs 저항성에 대해 테스트하였다. 이형접합 F1 식물이 Pfs 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 저항성을 유지하였음이 관찰되었고, 따라서 이러한 레이스에 대한 저항성이 우성인 것으로 결론지어졌다. F2 집단에서, 이러한 레이스에 대한 저항성이 3 (저항성) : 1 (감수성) 비로 분리된다.
4- RPF14 에 연결된 마커의 개발 및 정렬
NCIMB 42607의 시금치 식물 (RPF14 유전자를 포함함)을 RPF14 저항성 유전자가 없고 Pfs에 대한 배경 저항성이 없는 시금치 식물과 교배시킴으로써 F2 집단이 개발되었다. 연관 맵핑을 수행하였고, 단일 뉴클레오티드 다형성 마커 (SNP)인 표 3에 제시된 SNP_01가 RPF14 유전자에 연결된 것으로 확인되었다.
<표 3>
RPF14 유전자에 연결된 SNP 마커
Figure pct00005
서열식별번호: 1은 뉴클레오티드 114에 아데닌을 포함하고, 서열식별번호: 2는 뉴클레오티드 114에 구아닌을 포함한다. 전에 언급된 바와 같이, 반복친은 감수성이다.
다른 시금치 배 형질을 SNP_01에서의 유전자형에 대해 스크리닝하였고, 또 다른 감수성 계통이 발견되었으며, 이는 SNP_01에 대한 감수성 뉴클레오티드를 포함하지만, SNP_01의 상류 (5')의 6개의 추가적인 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 'GTTATT')를 또한 포함한다는 점에서 다르다. 이러한 서열은 서열식별번호: 3으로서 포함되고, 뉴클레오티드 213개 대신 219개의 길이이다. 이러한 6개의 추가 뉴클레오티드로 인해, SNP_01이 서열식별번호: 3에서 뉴클레오티드 114에 위치하지 않고, 뉴클레오티드 120에 위치하며, 이는 쌍별 정렬에 나타난 바와 같이 서열식별번호: 3에서의 SNP_01의 동등한 위치이다 (도 1 참조; SNP_01은 볼드체임).
서열식별번호: 1 및 2를 SpinachBase 게놈 서열 (차이니즈 시금치 계통 SP75의 서열)에 대한 BLAST 분석에서 또한 사용하였다. 이러한 분석은 서열식별번호: 1 및 2가 3번 염색체 상에 위치하여, 뉴클레오티드 607896에서 시작하여 뉴클레오티드 607679에서 끝나고, 이때 SNP_01이 SP75에서 뉴클레오티드 607778 (이러한 뉴클레오티드에 G를 포함함)에 있다는 것을 나타냈다.
SpinachBase의 게놈 서열과 서열식별번호: 1의 쌍별 정렬에서, 2개의 서열은 90% 서열 동일성을 갖는다 (엠보스 프로그램 '니들', 디폴트 파라미터를 사용한 쌍별 정렬) (도 2 참조, SNP_01은 볼드체임). SpinachBase 내의 게놈 서열이 서열식별번호: 3 내의 감수성 시금치 계통에서 발견되는 6개의 추가 뉴클레오티드를 포함하지 않는다는 것이 또한 명백하다. 서열식별번호: 3과 SpinachBase 내의 게놈 서열의 쌍별 정렬은 93.2% 서열 동일성을 나타냈다. 이는 에스. 올레라세아 게놈에 가변성이 있다는 것을 지시한다.
도 1 및 2는 서열식별번호: 1과 다른 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열의 쌍 서열 정렬에 의해, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 (에스. 투르케스타니카로부터의 이입 단편 상에 존재함)이 서열식별번호: 1과 100% 동일하지 않은 서열에서 확인될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 서열 내에서의 뉴클레오티드 위치는 본원에서 서열식별번호: 1 내의 위치 114에 '동등한' 뉴클레오티드 위치로 지칭된다.
서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114 (SNP_01), 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 뉴클레오티드에서의 아데닌을 사용하여, RPF14가 위치하는 이입 단편을 포함하는 식물 또는 식물의 일부분을 선별할 수 있다.
5 - 다른 저항성 유전자에 대한 마커에 대한 테스트
WO2015054339는 적어도 Pfs 레이스 7, 10, 11, 12, 13, 및 14에 대한 저항성을 부여하는 정량적 형질 유전자좌 (QTL)를 포함하는 에스. 테트란드라로부터의 이입물을 기술하는 특허 출원이다. 이러한 출원은 WO2015054339에 기술된 에스. 테트란드라 공여자 내의 QTL에 플랭킹된 에스. 테트란드라 플랭킹 서열인 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2를 또한 개시하고, 즉, 이들은 적어도 Pfs 레이스 7, 10, 11, 12, 13, 및 14에 대한 저항성을 부여하는 상기 에스. 테트란드라 유전자에 플랭킹된다. 이하 "왼쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커"로 지칭되는 WO2015054339의 서열식별번호: 1은 본 출원에 서열식별번호: 4로 추가되었고, 이하 "오른쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커"로 지칭되는 WO2015054339의 서열식별번호: 2는 본 출원에 서열식별번호: 5로 추가되었다.
본 발명가들이 기탁한 식물 계통을 상기 왼쪽 및 오른쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커의 존재에 대해 테스트하였다. 특허에 기술된 2개의 플랭킹 서열 영역 각각에 대해, 2개의 프라이머 쌍을 디자인하여, NCIMB 42607로부터 성장된 시금치 식물의 DNA 내의 상응하는 영역을 증폭시켰다. 총 8개의 PCR 프라이머를 주문하였고, 영역 내에서 PCR 단편이 초래되는 것에 대하여 JCeasar를 사용하여 인-실리코로 점검하였다.
왼쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커에 대한 프라이머 쌍 조합을 사용하여, NCIMB 42607 종자로부터 성장된 시금치 식물의 DNA 상에서 PCR을 수행하였다. 생성된 PCR 생성물을 예상 단편 길이에 대해 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 단편은 예상된 크기를 가졌고, 이를 시퀀싱하였다. 물질의 시퀀싱된 단편을 시퀀처(Sequencher)에서 2개의 플랭킹 서열 영역 각각에 대한 콘티그로 정렬하였다. 이러한 콘티그를 기초로, NCIMB 42607 종자로부터 성장된 시금치 식물은 왼쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커를 포함하지 않는다. 대신, NCIMB 42607 종자 및 이로부터 성장된 식물은 본 출원에 서열식별번호: 6으로 추가된 또 다른 서열 (에스. 올레라세아 서열)이 있는 것으로 밝혀졌다. 2개의 서열 사이의 정렬이 도 3에서 제시된다. 왼쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 서열이 기탁된 종자 내에 존재하지 않는다는 것이 명확하다.
오른쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커에 대한 프라이머 쌍 조합을 사용하여, NCIMB 42607 종자로부터 성장된 시금치 식물의 DNA 상에서 제2 PCR을 수행하였다. 생성된 PCR 생성물을 예상 단편 길이에 대해 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 단편은 예상된 크기를 가졌고, 이를 시퀀싱하였다. 물질의 시퀀싱된 단편을 시퀀처에서 2개의 플랭킹 서열 영역 각각에 대한 콘티그로 정렬하였다. 이러한 콘티그를 기초로, NCIMB 42607 종자로부터 성장된 시금치 식물이 오른쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커를 갖지 않는다. 대신, NCIMB 42607 종자 및 이로부터 성장된 식물은 또 다시 본 출원에 서열식별번호: 7 (에스. 올레라세아)로 추가된 또 다른 서열이 있는 것으로 밝혀졌다. 2개의 서열 사이의 정렬이 도 4에서 제시된다. 오른쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 서열이 기탁된 종자 내에 존재하지 않는다는 것이 명확하다. 무엇을 어떻게 정렬하였는지 보여준다.
따라서, 왼쪽 또는 오른쪽 에스. 테트란드라 플랭킹 마커가 NCIMB 42607에 존재하지 않는다. NCIMB 42607은 이러한 염색체의 영역 내의 에스. 올레라세아 서열인 서열식별번호: 6 및 7을 포함한다. 명백하게, 본 발명에 따른 다른 재배 시금치 계통 또는 변종은 자신의 게놈 내에 서열식별번호: 6 및/또는 서열식별번호: 7, 또는 서열식별번호: 6 또는 7 중 어느 하나에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.
흥미롭게, 이러한 서열들을 사용하여 SpinachBase에서 BLAST 분석을 행할 때, 이들은 특허 출원에 언급된 바와 같이 6번 염색체 상에 있는 것이 아니라 3번 염색체 상에 위치하는 것으로 보인다.
Figure pct00006
따라서, 에스. 테트란드라 QTL은 3번 염색체의 0.7 Mb 내지 1.41 Mb 사이에 있는 것으로 보인다.
6 - RPF14 의 정밀 맵핑
NCIMB 42607 종자 (RPF14 유전자를 포함함)로부터 성장된 시금치 식물을 RPF14 저항성 유전자를 포함하지 않고 Pfs에 대한 배경 저항성을 포함하지 않는 시금치 식물과 교배시킴으로써 추가 분리 집단이 개발될 것이다. 또한, 추가 SNP가 RPF14가 발견되는 염색체 영역에 추가될 것이다. 추가 맵핑이 수행되어, RPF14 유전자에 연결된 더 많은 단일 뉴클레오티드 다형성 마커 (SNP) 마커가 생성될 것이다.
참고문헌
Figure pct00007
[수탁번호]
수탁 번호 수탁 일자 수탁 기관
NCIMB 42607 2016년 7월 12일 NCIMB
SEQUENCE LISTING <110> Nunhems B.V. <120> Spinach plants resistant to at least Peronospora farinosa race 8 and 10 to to 16 <130> 181984WO01 <150> EP18153715.0 <151> 2018-01-26 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 213 <212> DNA <213> Spinacia turkestanica <400> 1 gctcgtatha cttagggcth gagchygaay ctccatcacc aacaagggca ggcaacgatc 60 tcgaaagatt attcaaatyg taaaahgaag cataattcgc attattatta ttcaacattc 120 tcaatytatc ataattagac sggcgtatgc caccataccc gtgtytaaac ccatggatcg 180 accattgata accgggttta tgaatcattg aat 213 <210> 2 <211> 213 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 2 gctcgtatha cttagggcth gagchygaay ctccatcacc aacaagggca ggcaacgatc 60 tcgaaagatt attcaaatyg taaaahgaag cataattcgc attattatta ttcgacattc 120 tcaatytatc ataattagac sggcgtatgc caccataccc gtgtytaaac ccatggatcg 180 accattgata accgggttta tgaatcattg aat 213 <210> 3 <211> 219 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 3 gctcgtatha cttagggcth gagchygaay ctccatcacc aacaagggca ggcaacgatc 60 tcgaaagatt attcaaatyg taaaahgaag cataattcgc gttattatta ttattattcg 120 acattctcaa tytatcataa ttagacsggc gtatgccacc atacccgtgt ytaaacccat 180 ggatcgacca ttgataaccg ggtttatgaa tcattgaat 219 <210> 4 <211> 148 <212> DNA <213> Spinacia tetrandra <400> 4 gcaaatagat gtgaaataac tttttacata tgcaaatata ttggaaatag cgaattatat 60 atataatatg gtttacatag gtttcgacag agggcttact cgtatttatt tgaataatat 120 gtcatatttg acgagaataa gaatgact 148 <210> 5 <211> 148 <212> DNA <213> Spinacia tetrandra <400> 5 gctgctgcat catagggtga tagttccttc ctttttcctt tatcattggt agatcgtttg 60 gcaaaagcct gtggcaccaa tacaacaaaa ggttaagata aatttgtttg ctatgaccat 120 attctaatca aaagaacata gcaacata 148 <210> 6 <211> 299 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 6 ggaagaacat tagtactagc ttaattgaat attccataac tttttatttt tgcttaatta 60 gattgtggtt tgaagctatg caaatagatg tgaaataact ttttattttt gcttaattag 120 attgtggttt gaagctatgc aaatagatgt gaaatagcga atatatatta tataatatgg 180 tttacataga tttcgacaga ggggttactc gtatttgttt gaataatatt tcatatttga 240 tgaaaaatag ggattactta atcttaaaat agcatttatg ctttactcta agggtgtta 299 <210> 7 <211> 237 <212> DNA <213> Spinacia oleracea <400> 7 gcaacggcaa gctctcgaag ggcacgtagg gccttagatc tgcgaataag gtaagccctg 60 aaggtccact ggatcaaagc tgctgcatca tagggtgata gttccttcct ttttccttta 120 tcattggtag atcttttggc aaaagcctgt atggcaccaa tacaacaaaa ggttaagata 180 aatttgtttg ctatgaccat attctaatca aaagaacata gcaacatatt caagggg 237 <210> 8 <211> 218 <212> DNA <213> unknown <220> <223> Spinachbase sequence of Figure 2 <400> 8 gctcgtatta tttagggttt gagctgaatc tccatcacca ataagggcag gcaatgatct 60 cgaaagatta ttcaaattgt aaaatgaagc ataattcgcg ttattattat tattattcga 120 cattctcaat ttatcataat tagacgggcg tattccacca tacccgtgtc taaacccatg 180 gatcgaccat tgataaccgg gtttatgaat cattgaat 218

Claims (19)

  1. 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사(Peronospora farinosa) 레이스 8 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자를 포함하고, 상기 유전자가 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에 아데닌을 포함하는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하고 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114와 동등한 뉴클레오티드 위치에 아데닌을 포함하는 서열에 연결된 것인, 스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea) 종의 시금치 식물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일 유전자가, 유전자가 동형접합 형태인 경우에, 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 1, 2 및 6 내지 17에 대한 저항성을 부여하는 것인 식물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 저항성 유전자가 페로노스포라 파리노사 레이스 3, 4 및 5에 대한 저항성을 부여하지 않는 것인 식물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저항성 유전자가 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 시금치 종자 또는 이의 자손에서 발견되는 바와 같은 유전자인 식물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자가 스피나시아 투르케스타니카(Spinacia turkestanica) 종의 것인 식물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이입 단편이 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 시금치 종자에서 발견되는 바와 같은 단편, 또는 상기 저항성 유전자를 유지하고 서열식별번호: 1을 유지하는 상기 이입 단편의 하위-단편인 식물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저항성 유전자가 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자로부터 성장된 시금치 식물을 또 다른 시금치 식물과 교배시킴으로써 수득될 수 있는 것인 식물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시금치 식물이 잡종 식물이고, 상기 잡종 식물이 이형접합 형태 또는 동형접합 형태의 상기 저항성 유전자를 포함하거나, 또는 상기 시금치 식물이 동형접합 형태의 상기 저항성 유전자를 포함하는 순계 식물 또는 웅성 양친 계통 또는 자성 양친 계통인 식물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 시금치 식물이 사보이, 세미-사보이, 플랫- 또는 스무드 리프 또는 오리엔탈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 식물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 식물로 성장할 수 있는 종자.
  11. 제1항 내지 제9항에 따른 시금치 식물의 자손 식물이고, 여기서 상기 자손 식물이 저항성 유전자를 유지하고, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01을 유지하는 것인 자손 식물.
  12. 제11항에 있어서, 자손 식물이 자가수정, 교배, 이중 반수체 생산 또는 형질전환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 생산되는 것인 자손 식물.
  13. 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 및 10 내지 16에 대한 저항성을 포함하는 시금치 식물을 생성시키기 위한, 수탁 번호 NCIMB 42607 하에 기탁된 종자, 또는 이의 자손 또는 제1항 내지 제9항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 따른 식물의 용도.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 시금치 식물 또는 제11항 또는 제12항에 따른 자손 식물의 일부분이고, 여기서 일부분이 잎, 잎의 일부분, 줄기, 줄기의 일부분, 대, 대의 일부분, 출아물, 출아물의 일부분, 싹 또는 싹의 일부분, 절단물, 뿌리, 뿌리의 일부분, 뿌리 끝부분, 잎자루, 잎자루의 일부분, 자엽, 자엽의 일부분, 꽃, 꽃의 일부분, 꽃잎, 꽃잎의 일부분, 수술, 수술의 일부분, 꽃밥, 꽃밥의 일부분, 꽃가루, 암술머리, 암술머리의 일부분, 암술대, 암술대의 일부분, 씨방, 씨방의 일부분, 배주, 배주의 일부분, 종자, 종자의 일부분, 종자 외피, 배아, 배아의 일부분, 배축, 배낭, 열매, 열매의 일부분, 세포, 원형질체, 캘러스, 소포자, 분열조직, 형성층으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 식물의 일부분이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자를 유지하고, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01을 유지하는 것인 일부분.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 시금치 식물 또는 제11항 또는 제12항에 따른 자손 식물 또는 제14항의 식물의 일부분 중 어느 하나의 적어도 하나의 세포 또는 조직을 포함하는 세포 배양물 또는 조직 배양물이고, 여기서 상기 세포 배양물 또는 조직 배양물이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자를 유지하고, 추가로 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01을 유지하는 것인 세포 배양물 또는 조직 배양물.
  16. 제15항의 세포 배양물 또는 조직 배양물로부터 재생된 시금치 식물이고, 여기서 상기 식물이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 저항성 유전자를 유지하고, 추가로 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114에서의 아데닌 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 동등한 위치에서의 아데닌을 포함하는 SNP_01을 유지하는 것인 시금치 식물.
  17. 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에서의 아데닌, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열 내의 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114와 동등한 뉴클레오티드 위치에서의 아데닌의 존재를 결정하는 것
    을 포함하는, 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자를 포함하는 것인 시금치 식물을 확인 또는 선별하는 방법.
  18. 시금치의 야생 근연종인 공여자로부터의 이입 단편을 포함하고, 여기서 상기 이입 단편이 유전자가 동형접합 형태인 경우에 적어도 페로노스포라 파리노사 레이스 8 내지 16에 대한 저항성을 부여하는 단일 유전자를 포함하고, 상기 유전자가 뉴클레오티드 114 (SNP_01)에 아데닌을 포함하는 서열식별번호: 1, 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하고 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 114와 동등한 뉴클레오티드 위치에 아데닌을 포함하는 서열에 연결된 것인 재배 시금치 식물의 세포.
  19. 시금치 식물 또는 식물의 일부분을 확인하는 데 있어서 서열식별번호: 1의 SNP_01의 용도 또는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 포함하는 서열의 SNP_01의 용도.
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