CN111655025A - 对至少粉霜霉菌亚种8和10至16具有抗性的菠菜植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对至少粉霜霉菌亚种8和10至16具有新的抗性的栽培菠菜植物，所述植物的种子、细胞培养物和子代，具有抗性的植物的用途，以及产生和鉴定所述植物的方法。

Description

对至少粉霜霉菌亚种8和10至16具有抗性的菠菜植物

发明领域

本发明涉及具有对粉霜霉菌(Peronospora farinosa)亚种(race)的新抗性的栽培菠菜植物，所述植物的种子、细胞培养物和子代，具有所述抗性的植物的用途，以及产生所述植物的方法。

背景技术

菠菜(Spinacia Oleracea)是苋科(Amaranthaceae)，菠菜属(Spinacia)中的一种可食用植物。其原产于西亚和中亚。在世界的该地区，发现了菠菜的野生近缘种——新疆菠菜(Spinacia turkestanica)和粉防己菠菜(Spinacia tetrandra)。

菠菜已成为世界许多地区的重要蔬菜作物，其中中国是最大的菠菜生产国(2012年产量为19500000公吨(Mt))，其次是美国、日本和土耳其(FAOSTAT)。在全球范围内，亚洲种植约100万公顷菠菜，欧盟、美国和日本各种植约35,000公顷(见Correll et al.，2011，Eur J Plant Pathol 129：193-205)。菠菜需求增长的部分原因可能是由于消费者的健康意识和对菠菜有益特性的认识提高。菠菜叶富含β-胡萝卜素、叶黄素、叶酸、维生素C、钙、铁和抗氧化剂(美国农业部国家营养数据库(United States Department of AgricultureNational Nutrient Database))。近年来，对新鲜菠菜的需求显著增加。

由于过去几十年产量的增加，由卵菌纲(oomycete)菠菜粉霜霉菌(Peronosporafarinosa f.sp.spinaciae)(Pfs；同义词疏松霜霉菌(P.effusa))亚种引起的最具破坏性的菠菜病害之一——菠菜霜霉病(downy mildew)的发病率和严重度随之增加。在1990年，仅已知三个Pfs亚种，但在1990年至2017年期间，发现了13个新的亚种。Pfs新亚种的出现使这种病原体成为全球菠菜生产的主要威胁，因此有必要鉴定新的抗性来源。

在过去，Pfs亚种1(Pfs：01或Pfs1)最早在1824年报道，随后在两个伊朗种质(PI140467和PI140464)中鉴定了对亚种1的抗性，并将其整合到商业杂合品种，如Califlay(Smith and Zahara，California Agriculture，1956年7月)。1958年，Pfs变种2出现，几年后鉴定一个赋予对亚种1和2的抗性的单一显性基因(Smith et al.1961年和1962年)。1976年，亚种3出现，1990年，鉴定亚种4，并迅速发现了对这两种菌株的抗性。此后，新亚种的迅速出现，使得鉴定更多新的抗性基因并将其整合到商业品种，并开发标准化测试，如差异幼苗测试(differential seedling test)(见国际种子联合会-菠菜霜霉病指南，2015年12月和“Differential Sets-Peronospora farinosa f.sp.spinaciae”，Aug 2016；万维网worldseed dot org/isf/differential_hosts dot html)。其中还将一些品种用作差异化宿主，以确定Pfs分离株(isolate)的亚种，如下表1所示。

表1：菠菜差异株的病害反应，用于确定菠菜霜霉病原体菠菜粉霜霉菌分离株的亚种鉴定，截至2015年12月和2016年8月

图例：(-表示抗性反应(在差异幼苗测试中没有观察到子叶上孢子形成，HR抗性)；+表示易感(在差异幼苗测试中观察到子叶上孢子形成)；+/-表示观察到抗性植物和易感植物数量的变化性，(-)表示感染水平降低或中度抗性)

在2016年，鉴定了一种新的霜霉菌亚种(Plantum press release，2016-3-15)。分离株于2015年3月在美国加利福尼亚州萨利纳斯首次被鉴定，最初命名为UA201519B(还称为UA1519B)。在针对一组标准的差异品种的测试中，对该分离株的病害发展进行了评估，国际霜霉属(Peronospora)研究组(IWGP)确定该分离株新亚种。在确定许多地方出现了具有相同反应模式的分离株之后，IWGP即将其命名为Pfs：16。将其加入本申请中所示的标准差异表中，如表1所示。

在2018年，IWGP命名了另一个新亚种Pfs17(UA1014或US1602)。国际种子联合会(ISF)还发布了一组新的宿主差异株，以区分分离株Pfs1至Pfs 17。参见万维网worldseed.org/our-work/plant-health/differential-hosts/，在“Downy Mildew”链接下的名称为“Spinach-downy-mildew_April2018.pdf”的文档。

商用菠菜品种大多为通过杂交雄性和雌性近交系产生的杂种，尽管也存在一些开放授粉品种。父本系和母本系通常各携带不同的抗性基因。例如，杂合品种Andromeda(由Nunhems培育；见专利申请US8563807)对Pfs 1-12和Pfs 14具有抗性。在该品种中，对Pfs1、3、5、8、9、11、12和14的抗性由来自一个近交亲本系的抗性基因赋予，而对Pfs 1-10的抗性则由来自另一个近交亲本系的抗性基因赋予。两个亲本系均为抗性基因纯合型。抗性的最佳组合是一个难题，尤其是由于一些抗性基因不是显性的和/或定位到同一基因座，因此不可能将所有已知的抗性基因叠加在一个杂种中。因此，在菠菜育种领域不断需要额外的抗性基因。

WO2015054339记载了“一种菠菜植物，其基因组中包含来自粉防己菠菜的基因渗入基因座，赋予对菠菜粉霜霉菌的广谱抗性”，所述广谱抗性包括“对菠菜粉霜霉菌(Pfs)亚种7、10、11、12、13和14或对菠菜粉霜霉菌(Pfs)亚种1-14和UA4712的抗性”(分离株UA4712后来被IWGP命名为菠菜粉霜霉菌(Pfs)亚种15)，其中“所述基因渗入基因座被定义为在粉防己菠菜基因组中，其侧翼序列与SEQ ID NO：1或2具有至少95％同一性”，并且“来自粉防己菠菜的DM抗性介于在公布图谱6号染色体上0.0cM处的标记物E33/M62-231和10.3cM处的标记物E39/M47-203之间”(Khattak et al.，Euphytica 148：311-318，2006)。将WO2015054339中的位于赋予抗性基因座侧翼的SEQ ID NO：1和2分别作为SEQ ID NO：4和5加入到本申请中。

WO2013064436(EP2586294)记载了“一种新的抗性基因——命名为R6，其赋予菠菜植物对霜霉菌亚种Pfs 1、Pfs 2、Pfs 3、Pfs 4、Pfs 5、Pfs 6、Pfs 9、Pfs 11、Pfs 12、Pfs13和UA4410的抗性”(另见WO2013/064436第19页表1；类型菌株UA4410自2011年以来被IWGP命名为Pfs14)。没有提供标记物。没有记载R6赋予对Pfs亚种7、8和10号的抗性。

EP2912940(US2015240256)记载了对粉霜霉菌具有抗性的植物，所述抗性由“选自等位基因A、等位基因Vt和等位基因C的等位基因组合”赋予……“等位基因组合包括等位基因A和C，所述植物对至少菠菜粉霜霉菌亚种7、8、10、11、12、14和分离株UA4712具有抗性；等位基因组合包括等位基因A和Vt，所述植物对至少菠菜粉霜霉菌亚种7、8、10、11、12、13和14具有抗性；或等位基因组合包括等位基因C和Vt，所述植物对至少菠菜粉霜霉菌亚种7、8、10、11、12、13和分离株UA4712具有抗性”(强调)。分离株UA4712目前被称为Pfs 15。因此，EP2912940中公开的抗性涉及等位基因组合。

US9402363记载了“鉴定包含R15等位基因的菠菜植物的方法，其中所述等位基因赋予对至少菠菜粉霜霉菌亚种Pfs：1、Pfs：2、Pfs：3、Pfs：4、Pfs：5、Pfs：6、Pfs：9、Pfs：11、Pfs：12、Pfs：13、Pfs：14、Pfs：15和分离株UA1014的抗性，而不赋予对菠菜粉霜霉菌亚种Pfs：7的抗性，其中所述等位基因是在从种子生长的植物中发现的，该种子的代表性样本保藏于NCIMB，NCIMB登录号42466”，以及用于所述方法的20cM(厘摩)内的四个标记物序列。此外，“在纯合状态下，R15等位基因，如发现的…，还赋予了对菠菜粉霜霉菌亚种Pfs：8的抗性和至少对亚种Pfs：10的中度抗性”。分离株UA1014目前不是IWGP认可的编号的Pfs亚种。US9402363公开了“至少对Pfs：8、Pfs：10亚种的中度抗性，而不赋予对菠菜粉霜霉菌亚种Pfs：7的抗性”。对Pfs：8、Pfs：10的抗性被进一步描述为发挥以下功能“赋予抗性的R15等位基因以纯合或杂合形式存在，影响了本发明中菠菜粉霜霉菌亚种Pfs：8和Pfs：10的性状表达”。

US20170127641记载了“一种菠菜植物，包含对粉霜霉菌亚种1-9、11-15和分离株UA1014APLP的抗性。”分离株UA1014APLP目前不是IWGP认可的编号的Pfs亚种。US20170127641没有公开对Pfs亚种的抗性。US20170127641确实公开了对Pfs亚种3-5的抗性。没有公开一个或多个抗性基因的标记物。

US20170127642记载了“一种菠菜植物，包含对粉霜霉菌亚种1-9、11-15和分离株UA1014APLP的抗性。”分离株UA1014APLP目前不是IWGP认可的编号的Pfs亚种。US20170127642没有公开对Pfs亚种10的抗性。US20170127642确实公开了对Pfs亚种3-5的抗性。没有公开一个或多个抗性基因的标记物。

WO2017194073记载了“对至少官方认可的菠菜粉霜霉菌亚种Pfs：1、Pfs：2、Pfs：3、Pfs：4、Pfs：5、Pfs：6、Pfs：7、Pfs：8、Pfs：9、Pfs：10、Pfs：11、Pfs：12、Pfs：13、Pfs：14、Pfs：15和Pfs：16的非R基因介导的广谱抗性，其中所述抗性是由命名为p10的新的基因座引起的，其中由p10基因座引起的抗性至少是中度水平”，以及“与显性R基因介导的抗性相比，本发明的p10基因座仅在以纯合形式存在时才提供抗性”。

Correll et al.，2013记载了Coati和Meerkat品种，它们对Pfs 1-15和几个其他粉霜霉菌的分离株(包括UA1414、UA1012和UA1312)具有抗性。Coati和Meerkat是F1杂种。后来，Meerkat被证明对Pfs亚种16易感(Plantum press release，2016-3-15)。

品种Callisto F1是由Nunhems培育的菠菜品种，并且对Pfs亚种1-14和Pfs 16具有描述为HR或高抗性的抗性。其为杂种，并且Pfs抗性通过叠加各种显性基因获得。Rpf3(又称R3)——Correl et al.，2011及其他中描述的基因——赋予对Pfs 16的抗性。

品种Novico F1是由Nunhems培育的工业型菠菜，并且对Pfs亚种1-12和14-16具有描述为HR(高抗性)的抗性。其为杂种，并且Pfs抗性通过叠加各种显性基因获得。Rpf3——Correl et al.，2011及其他中描述的基因——赋予对Pfs 16的抗性。

品种Palco F1是由Nunhems培育的工业型菠菜，并且对Pfs亚种1-5、8、9、11、12、14和16具有描述为HR的抗性。其为杂种，并且Pfs抗性通过叠加各种显性基因获得。Rpf3赋予对Pfs 16的抗性。

品种Scorpius F1是由Nunhems培育的新鲜的市场菠菜，并且对Pfs亚种1-14和16具有描述为HR的抗性。其为杂种，并且Pfs抗性通过叠加各种显性基因获得。Rpf3赋予对Pfs16的抗性。

上文提及的品种Andromeda F1是由Nunhems培育的新的市场菠菜，并且对Pfs亚种1-12和14-16具有描述为HR的抗性。其为杂种，并且Pfs抗性通过叠加各种显性基因获得。Rpf3赋予对Pfs 16的抗性。

许多其他公司还销售含有大量抗性基因的菠菜品种。新引进的菠菜品种几乎完全是杂种。

WO2015036378公开了“一种新的显性抗性基因，命名为RPF13”。该基因提供了“对至少粉霜霉菌亚种7-14的抗性，……所述抗性由单一基因赋予。该基因……还任选地赋予对粉霜霉菌亚种1-6中的一种或多种或所有的抗性或至少对Pfs 1-2和Pfs 4-6的抗性……”。分离株UA4712目前被称为Pfs 15。RPF13不赋予对Pfs 16的抗性，如本申请的实施例中所示。

WO2015036469公开了“一种新的显性抗性基因，命名为RPF12”。该植物提供了“对至少粉霜霉菌亚种7-14的抗性，……所述抗性由单一基因赋予。……RPF12……还任选地赋予对粉霜霉菌亚种1-6中的一种或多种或所有的抗性或至少对Pfs 1-2和Pfs 4-6的抗性……”。RPF12不赋予对Pfs 16的抗性，如本申请的实施例中所示。此外，品种Pegasum含有RPF12，并被描述为对亚种Pfs 16易感，见Correll和Koike，Race diversity and thebiology of spinach downy mildew pathogen，CLGRB Annual Report，2016-4-1至2017-3-31中的表3。

EP2848114公开了“本发明提供了一种菠菜植物，包含对至少粉霜霉菌亚种7-14的抗性，其中所述抗性由单一基因赋予。……RPF11……还任选地赋予对粉霜霉菌亚种1-6中的一种或多种的抗性。因此，在一个方面，当RPF11基因在植物中为纯合或杂合形式时，其赋予对所有目前已知的致病Pfs亚种——亚种1-14——的抗性……”。RPF11不赋予对Pfs 16的抗性，如本申请的实施例中所示。此外，Virgo、Volans和Antalia品种含有RPF11，并被描述对Pfs 16易感，见Correll和Koike，Race diversity and the biology of spinachdowny mildew pathogen，CLGRB Annual Report，2016-4-1至2017-3-31的表3。

Xu，C.et al.(2017，Nat.Commun.8，15275doi：10.1038/ncomms15275“Draftgenome of spinach and transcriptome diversity of 120Spinacia accessions”(2017)公布了中国菠菜栽培种Sp75的基因组序列。该序列可在在线数据库“SpinachBase”中进行分析，该数据库可在万维网spinachbase.org上找到。在此，可例如通过Blast分析而查询菠菜的六条染色体。

如果育种者想要制备包含对IWGP认可的所有Pfs亚种(即Pfs亚种1至16)的抗性的菠菜品种，或对至少Pfs亚种8和10至16具有抗性的品种，育种者必须结合几个已知的抗性基因。已知没有赋予对所有已知的粉霜霉菌亚种或Pfs亚种8和10至16的抗性的单一基因，或尤其是赋予对至少Pfs亚种8和10至16的显性抗性的单一基因。此外，不可能组合所有的抗性基因(完全的叠加)，因为一些Pfs抗性基因为等位基因。这限制了抗性基因的可能的组合，因此允许有新组合的新基因倍受欢迎。

基于文献，如Correll和Koike(上文)以及Feng et al.(2014)，Plant Disease，第96卷，第1期，第145-152页，由不同的RPF抗性基因提供的对Pfs亚种的抗性可概括如下(-＝抗性，+＝易感)：

	Pfs1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17
																		RPF1	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+	-	+	-	+	-	-	+
RPF2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	+	-	+	+
																		RPF3	-	+	-	+	-	+	+	-	-	+	-	-	+	-	+	-	+
RPF4	-	-	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-	+	+
																		RPF5	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
RPF6	-	-	-	-	-	+	-	+	+	+	-	+	+	+	-	-	+
																		RPF7	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+	-	+	-	+	-	-	+
RPF8	-	-	-	-	-	-	-	+	-	+	-	+	-	+	-	-	+
																		RPF9	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	+	+
RPF11	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+
																		RPF12	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+

有必要提供新的抗性基因，尤其是对新的亚种如Pfs 16和Pfs 17，或甚至对所有较新的亚种Pfs 8至Pfs 17。

发明内容

本发明的目的是提供一种栽培菠菜植物，其包含来自菠菜野生近缘种的基因渗入片段，所述片段具有赋予至少对粉霜霉菌亚种8和10至16，优选至少亚种8和10至17的显性抗性的单一基因，即当所述抗性基因为纯合或杂合形式时。此外，所述基因赋予对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，至少当所述基因是纯合形式时。在另一个方面，所述基因赋予对Pfs分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性，还尤其是对新亚种Pfs 17的抗性。对新亚种Pfs 17的抗性也是显性的。在另一个方面，无论是杂合还是纯合形式，所述基因都不赋予对Pfs亚种3、4和5的抗性。

包含所述基因的基因渗入片段来自菠菜的野生近缘种。在一个优选的方面，菠菜的野生近缘种为新疆菠菜。

抗性基因命名为RPF14。以纯合形式(两个拷贝)时，它赋予对亚种Pfs 1、Pfs 2和Pfs 6至Pfs 17(即对17个已知的官方亚种中的14个)的抗性。重要的是，对于亚种Pfs 8和Pfs 10至Pfs 16抗性为显性的(即一个拷贝的RPF14基因或包含RPF14基因的基因渗入片段足以赋予对特定亚种的抗性)，以及对Pfs 17抗性为显性的。为了测试或确认显性，RPF14基因需要在易感菠菜植物中以杂合形式存在，然后可测试对不同Pfs亚种(如Pfs17)的抗性。如果在菠菜基因组中只存在基因渗入片段的一个拷贝时RPF14基因仍然赋予对某一特定亚种的抗性，则对该亚种的抗性为显性的。

在一个实施方案中，RPF14赋予对至少Pfs亚种8和10至16、优选对至少亚种8和10至17的显性抗性，并且至少在RPF14基因为纯合形式时，还赋予对Pfs亚种1、2、6、7和9，以及Pfs分离株UA0514和/或可能的其他Pfs分离株的抗性。因此，本发明的一个目的是提供单一基因，其赋予对至少8个、优选9个官方命名的病原体亚种(至少Pfs 8和Pfs 10至Pfs 16亚种、优选Pfs 8和Pfs 10至Pfs 17亚种)的显性抗性，并且至少在RPF14为纯合形式时(但也可能是杂合形式)，赋予对官方命名的Pfs 1至Pfs 17亚种中的至少14个病原体亚种(即至少Pfs 1、Pfs2、Pfs 6至Pfs 17)的抗性。

在本发明的一个方面，RPF14赋予对至少Pfs亚种8和10至16、优选亚种8和10至17的显性抗性，并至少当RPF14以纯合形式存在时，但也可能是杂合形式时，还赋予对Pfs亚种1、2、6、7和9的抗性。被赋予的对Pfs 1、2、6、7和/或9中的一种或多种的抗性是显性抗性(当存在RPF14基因的一个拷贝时可显示)还是隐性抗性(仅当存在RPF14基因的两个拷贝时可显示)，可通过将一个拷贝的RPF14基因转移到对Pfs 1、2、6、7和/或9中的一种或多种缺乏抗性的菠菜植物中，然后测试该植物对这些亚种的抗性来确定。在本发明的另一个方面，在RPF14以纯合形式存在时，该基因赋予对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性；以及在该基因以纯合形式存在时，赋予对Pfs分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性。

在一个方面，当RPF14为纯合形式时，该基因赋予对至少粉霜霉菌亚种8至16、优选对亚种8至17的抗性。在一个方面，当该基因(或包含该基因的基因渗入片段)为纯合形式时，该基因赋予对至少粉霜霉菌亚种1、2和6至17的抗性。在一个方面，RPF14基因与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或包含在与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列中同等位置处的腺嘌呤(当使用例如Emboss程序Needle成对比对时)。因此，在一个方面，菠菜植物或所述菠菜植物的部分，或种子或细胞或菠菜植物细胞的细胞培养物在其基因组中包含重组染色体，其含有来自供体植物的基因渗入片段，所述基因渗入片段包含与SNP_01连锁的RPF14基因，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤；或所述RPF14基因与这样的序列连锁，即该序列保留所述抗性供体SNP核苷酸，与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。由于菠菜是二倍体，如果包含SNP_01的基因渗入片段以纯合形式存在，则该植物在SNP_01处——即SEQ ID NO：1的第114位核苷酸——的基因型为AA。如果包含SNP_01的基因渗入片段以杂合形式存在，则该植物在SNP_01处——即SEQ ID NO：1的第114位核苷酸——的基因型为AC、AG或AT。

在一个方面，基因渗入片段包含SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的序列，其中在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处，或在使用例如Emboss程序Needle进行成对比对时在同等核苷酸处为腺嘌呤。

当在本文提及特定位置的SNP基因型时，例如在SEQ ID NO：1，“或与SEQ ID NO具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列”的第114位核苷酸处的SNP基因型，这意指SNP基因型存在于变体序列中相当于(对应于)所述变体序列(即与提及的SEQ ID NO具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列)中的相同核苷酸的核苷酸处(例如等同于SEQ ID NO：1的第114位核苷酸)。例如，变体序列可能短一个或几个核苷酸，但当将变体序列与提及的SEQID NO进行成对比对时，可看出变体序列的哪个核苷酸相当于(对应于)相同核苷酸。例如，在变体序列中，这可为该变体序列的第113或115或120位核苷酸，其相当于提及的序列的第114位核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种栽培菠菜植物或所述植物的一部分或其种子，包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段，所述片段包含新的抗性基因RPF14，从而使植物对至少Pfs亚种8号和10至16、优选对至少亚种8和10至17具有显性抗性。至少在RPF14基因以纯合形式存在时，栽培菠菜植物或所述植物的一部分或其种子还对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种以及Pfs分离株UA0514s具有抗性。基因渗入到栽培菠菜植物中的所述片段包含抗性供体核苷酸SNP_01，其包含在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A。

因此，在一个方面，提供了一种菠菜植物，其包含来自菠菜野生近缘种(尤其是新疆菠菜)供体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含一个基因，当该基因是纯合形式时，其赋予对至少粉霜霉菌亚种8至17的抗性，所述基因渗入片段包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)，因此所述基因渗入片段为纯合型的菠菜植物包含SNP_01的基因型‘AA’。

本发明的另一个目的是提供一种栽培菠菜植物或所述植物的一部分，或可生长成这种植物的种子，或细胞或菠菜细胞的细胞培养物，其中所述部分或所述细胞可再生成包含新的抗性基因RPF14的植物，其中所述栽培植物或再生植物对至少Pfs亚种8和10至16、优选亚种8和10-17具有显性抗性，并且优选包含抗性供体核苷酸SNP_01，其包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(当使用例如Emboss程序Needle进行成对比对时)的序列的同等位置处的A。至少在RPF14基因(或包含该基因的基因渗入片段)为纯合形式时，栽培菠菜植物、其植物部分或所述种子还具有对Pfs亚种1、2、6至7和9的抗性，或在另一个选择中，对Pfs分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性。

在另一个目的中，本发明提供了一种生成栽培菠菜植物的方法，当RPF14基因为纯合形式时，该植物包括对至少Pfs亚种8和10至16、优选8和10至17的抗性，以及任选地还对Pfs亚种1-2和6至7和9的抗性，以及对Pfs分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性，其中该植物包含抗性供体核苷酸SNP_01，其包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(当使用例如Emboss程序Needle进行成对比对时)的序列的同等位置处的A。

因此，一个方面提供了一种栽培菠菜植物，其包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含单一基因，该单一基因以杂合和纯合形式时赋予对至少粉霜霉菌亚种8和10至16，优选对8和10至17的抗性，并且所述基因连锁到包含第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)的SEQ ID NO：1，或连锁到与SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性并包含在相当于SEQ ID NO：1的第114位核苷酸的核苷酸位置处的腺嘌呤的序列。

还提供了一种用于鉴别或选择菠菜植物、植物部分或细胞的方法，所述菠菜植物、植物部分或细胞包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包括单一基因，该单一基因以杂合和纯合形式时赋予对至少粉霜霉菌亚种8和10至16，优选亚种8和10至17的抗性，所述方法包括：

确定SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)的存在，或在与SEQ IDNO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列中相当于SEQ ID NO：1的第114位核苷酸的核苷酸位置处的腺嘌呤的存在。

该方法还可包括测试由RPF14基因赋予的对本文提及的一种或多种Pfs亚种的抗性表型。

可通过本领域已知的各种方法(如SNP基因分型方法、测序等)来确定在第114位核苷酸处或变体序列的同等核苷酸处是否存在腺嘌呤。

此外，本发明还提供包含新的抗性基因RPF14的栽培菠菜植物、其植物部分或可生长成这种植物的种子，以及细胞或细胞培养物，其中所述基因是存在于或可获得自或可源自以登录号NCIMB 42607保藏的栽培菠菜种子或源自所述种子的子代的基因。

因此，在一个方面，提供了包含来自菠菜野生近缘种(特别是新疆菠菜)供体的基因渗入片段的菠菜植物，其中所述基因渗入片段包含一个基因，当所述基因为杂合形式时，其赋予对至少粉霜霉菌亚种8和10至16、优选对亚种8和10至17的抗性，当所述基因为纯合形式时，其赋予对亚种1、2和6至17的抗性，并且所述基因渗入片段包含SEQ ID NO：1的第114核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)，其中所述基因是从种子生长的植物中存在的基因，所述种子的代表性样本已保藏在登录号NCIMB42607下。

本发明提供了一种菠菜种的菠菜植物，其具有对粉霜霉菌亚种8和10至16、优选对亚种8和10至17的抗性，其中所述抗性由包含单一基因的基因渗入片段赋予，所述基因渗入片段的SNP_01包含在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，其中所述基因是从种子生长的植物中存在的基因，所述种子的代表性样本已保藏在登录号NCIMB 42607下。

还提供了所述菠菜植物的子代植物，其中所述子代植物保留有包含抗性基因且SNP_01包含在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤的基因渗入片段，当该基因为杂合形式时，其赋予对粉霜霉菌亚种8和10至16、优选对亚种8和10至17的抗性。

此外，本发明还提供了包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段的栽培菠菜植物、其植物部分或可生长成这种植物的种子，以及细胞或细胞培养物，所述片段包含新的抗性基因RPF14或包含保留有RPF14的所述基因渗入片段的子片段，其中所述基因渗入片段是存在于或可获得自或可源自在登录号NCIMB 42607下保藏的栽培菠菜种子中的片段。在一个方面，所述基因渗入片段或子片段包含抗性供体核苷酸SNP_01，其包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(当使用例如Emboss程序Needle进行成对比对时)的序列的同等位置处的腺嘌呤。

本发明还提供了产生或鉴定栽培菠菜植物或其种子、植物部分或细胞或细胞培养物的方法，所述植物或其种子、植物部分或细胞或细胞培养物包含对至少Pfs亚种8和10至16、优选亚种8和10至17的抗性，以及至少在抗性基因为纯合形式时，对Pfs亚种1、2、6、7和9的抗性，以及对Pfs分离株UA0514的抗性。本发明还提供了鉴定、选择或检测RPF14基因或包含RPF14基因的基因渗入片段的方法，所述方法任选地使用SNP_01的抗性供体核苷酸，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(当使用例如Emboss程序Needle进行成对比对时)的序列的同等位置处的A。

在本发明的一个方面，抗性基因RPF14连锁到SNP_01的抗性供体核苷酸，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在一个方面，抗性基因RPF14位于重组染色体上的基因渗入片段或该片段的一部分上。在一个实施方案中，基因渗入片段位于菠菜基因组的3号染色体上，其中3号染色体为在数据库SpinachBase中找到的且在Xu et al.(2017，上文)中描述的染色体。SNP_01位于数据库中3号染色体的核苷酸607778处。由于这是不包含包含RPF14的基因渗入片段的栽培菠菜品种的序列，SNP_01在核苷酸607778处含有鸟嘌呤。在一个方面，RPF14基因位于3号染色体上核苷酸607778(0.6Mb)处的SNP_01和3号染色体的核苷酸1219930(1.2Mb)之间。因此，其中发现RPF14基因的3号染色体区相对较小(0.6Mb区)。测序或精细定位可进一步缩小该区域，并且对该区域发现的基因进行Crispr/Cas基因编辑可用来显示该区域中存在的从野生供体基因渗入的基因中导致产生抗性表型的基因。

值得注意的是，本文提及的‘单一基因’是指发现抗性分离具有单一基因或基因座的分离比率(见实施例)。这不排除在基因渗入片段上可存在几个紧密连锁的分离为‘单一基因’或基因座的基因。

因此，在本发明的一个方面，栽培菠菜植物或可生长成这种植物的种子或植物部分或栽培菠菜细胞/细胞培养物包含来自菠菜野生近缘种的基因渗入片段，其中所述片段包含RPF14，并包含野生供体SNP核苷酸SNP_01。包含RPF14的DNA片段是从菠菜野生近缘种(抗性基因的供体)基因渗入的，在一个优选的方面，菠菜野生近缘种为新疆菠菜。所述基因已被基因渗入到栽培菠菜(轮回亲本)。因此，本发明提供栽培菠菜植物或可生长成这种植物的种子、其植物部分或细胞培养物，包含来自所述菠菜野生近缘种的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含RPF14基因和抗性供体核苷酸SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A。

在本发明的一个方面，本发明的植物的基因渗入片段是杂合的，并包含一条染色体，该染色体具有SEQ ID NO：1的第114位处的核苷酸A，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的核苷酸A。在本发明的另一个方面，本发明的植物的基因渗入片段为纯合的，并包含两条染色体，这两条染色体具有在SEQ ID NO：1的第114位处的核苷酸A，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的核苷酸A。优选这两条染色体具有相同的基因渗入片段，即所述基因渗入片段的核苷酸序列以及片段的大小和位置是相同的。

另一个目的是提供一种或多种DNA标记物，其可用于选择包含RPF14抗性基因的植物或植物部分或细胞。本文提供的一种标记物为抗性供体核苷酸SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A。与RPF14基因和/或基因渗入片段连锁的其他DNA标记物可由技术人员开发，例如通过测序包含基因渗入片段(例如存在于NCIMB42607中)的3号染色体区，以鉴定供体的新疆菠菜片段。例如，新疆菠菜片段和菠菜之间的任何多态性都可作为标记物来选择或鉴定包含RPF14的基因渗入片段。

通过对保藏种子的基因组进行测序，技术人员可鉴定单一、特定的新疆菠菜供体植物/种质的基因渗入片段(具有特定的核苷酸序列，该序列具有多态性且不同于其在3号染色体上取代的菠菜序列，也不同于其他新疆菠菜植物/种质)。此外，基因渗入片段可用来区分本发明的植物和任何其他菠菜植物，即使所述菠菜植物具有相同的抗性表型。例如，本文使用的单一、特定的供体植物——包含RPF14并具有保藏种子NCIMB42607中的核苷酸序列，是不同于用于生成NCIMB 42608(包含RPF15)、NCIMB 42159(包含RPF 12)、NCIMB 42158(包含RPF 11)的供体植物的供体植物。因此，不仅抗性基因不同，而且每个基因渗入片段的大小、染色体区域和核苷酸序列也是独有的。

此外，还提供了产生或鉴定包含所述抗性基因的植物或植物部分或细胞的方法。在某些方面，提供了选择、鉴定和/或检测抗性基因(命名为RPF14)或与该基因连锁的DNA标记物(如SNP_01或SEQ ID NO：1)的方法，所述方法包括：例如，将一个或多个核酸探针与怀疑含有RPF14的植物的核酸杂交(例如与SEQ ID NO：1杂交或与和SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处或同等位置处的腺嘌呤的序列杂交)，或使用一个或多个核酸引物扩增怀疑含有RPF14的植物的核酸。例如，引物可用来检测SNP_01和测定SNP_01的SNP基因型。

将RPF14从菠菜的野生近缘种、优选新疆菠菜(供体或抗性基因供体)基因渗入到栽培菠菜(也称为轮回亲本或受体)中。在一个方面，提供了包含来自菠菜野生近缘种的基因渗入片段的栽培菠菜植物或植物部分，其中所述基因渗入片段包含RPF14基因，并且任选地其中RPF14基因与抗性供体核苷酸SNP_01连锁，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A。

还提供了所述基因和/或物理连锁到所述基因的分子标记物(尤其是单核苷酸多态性或SNP，更尤其是抗性供体核苷酸SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列中同等位置处的A)用于鉴定包含RPF14的植物或植物部分或种子或细胞或细胞培养物的用途，以及使用所述标记物来鉴定或产生包含RPF14的植物或植物部分或种子或细胞或细胞培养物的方法。

在一个方面，栽培菠菜包含重组染色体，尤其是重组3号染色体(如Xu et al.，2017所提及，见上文)，所述染色体包含基因渗入片段，所述基因渗入片段又包含RPF14，并且任选地在一个方面，基因渗入片段包含SNP_01的抗性供体核苷酸(即SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A)。在另一个方面，所述植物的其余染色体为栽培菠菜染色体。在一个实施方案中，重组染色体为3号染色体(如Xu et al.，2017所提及，见上文)。

在一个方面，基因渗入片段(包含RPF14)存在于3号染色体的上部(如存在于SpinachBase)，其中所述上部为3号染色体的0Mb至2.0Mb。在一个方面，RPF14位于3号染色体的起始于0.4Mb、终止于1.5Mb的区域。在一个方面，基因渗入片段的大小等于或小于2Mb，并包含RPF14基因。在一个方面，基因渗入片段与在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中存在的片段具有相同的核苷酸序列和大小，并包含RPF14基因(其赋予本文描述的抗性表型)。在一个方面，基因渗入片段与在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中存在的片段具有相同的核苷酸序列，并包含RPF14基因(其赋予本文描述的抗性表型)，但其大小小于在保藏的种子中发现的片段。因此，例如，完整大小的片段的一部分可通过例如在RPF14基因任一侧上的重组而除去。在一个方面，基因渗入片段包含RPF14和SEQ ID NO：1。

在一个方面，RPF14基因和/或基因渗入片段和/或重组染色体为存在于登录号NCIMB 42607下保藏的种子，或从所述种子生长成的植物，或在基因组中保留有RPF14基因的其子代中的基因和/或基因渗入片段和/或重组染色体，所述子代为例如保留有RPF14基因的子代，该基因任选地与抗性供体核苷酸SNP_01连锁，其中所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A。在一个方面，子代保留有供体的SNP_01核苷酸，尽管技术人员还可选择保留有供体的RPF14基因但缺乏SNP_01，从而包含较短的基因渗入片段的植物。因此，在一个方面，SNP_01的SNP核苷酸还可为轮回亲本的核苷酸，同时RPF14基因仍然存在。技术人员可对保藏的种子中存在的和/或子代中存在的基因渗入片段进行测序，以确定植物的抗性表型是否由本发明的RPF14基因赋予。基因渗入片段(及由重组产生的其任何子片段)为源自特定供体的特定基因组序列，因此是独有的。

定义

本文所引用的所有专利和非专利文件均通过引用整体纳入本文。

不定冠词“一(a或an)”不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个要素。因此，不定冠词“一”通常意指“至少一”。

“植物品种”为同一植物分类单元中已知最低等级的一组植物，这些植物(无论是否满足植物育种者权利认可的条件)可基于源自某一基因型或基因型组合的特征的表达进行定义，可通过表达这些特征中的至少一个而与任何其他植物组区分开，并且可被视为实体，因为其可在没有无任何变化的情况下繁殖。因此，术语“植物品种”不可用来表示一组植物，即使所述一组植物为同一种类，即使它们都以存在一个或两个基因座或基因为特征(或由于这些特定基因座或基因而产生的表型特征)，但在其他基因座或基因方面，它们之间可存在巨大差异。

在本文中，“菠菜”或“栽培菠菜”是指人类为食物而培育的具有良好农艺特性的菠菜种的植物(或从种子生长成的植物)和所述植物的部分。这包括任何栽培菠菜，如育种系(例如回交系、近交系)、栽培种和品种(开放授粉或杂种)。这包括任何类型的菠菜，如皱叶、扁平叶或光滑叶菠菜或半皱叶型。野生菠菜(即非栽培菠菜)或菠菜的野生近缘种(如粉防己菠菜和新疆菠菜)不包括在该定义中。

“菠菜的野生近缘种”包含菠菜科的未栽培的植物，特别是粉防己菠菜和新疆菠菜。这些物种还称为RPF14基因和任选地与RPF14基因连锁的DNA标记物的供体植物，所述DNA标记物为例如抗性供体核苷酸SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列中同等位置处的A；即，包含RPF14基因的片段及任选地SNP_01获得自或可获得自所述供体植物。“新疆菠菜”是菠菜的野生近缘种，记载在Acta Inst.Bot.Acad.Sc.URSS，Ser.I.Fasc.2，123(1936)及其他文献中。在本发明的一个方面，RPF14基因的供体植物是新疆菠菜植物；在一个方面，基因渗入片段是基因渗入到NCIMB 42607的新疆菠菜供体种质的片段(包含SNP_01的抗性供体核苷酸)，或所述基因渗入片段的子片段(例如通过减数分裂重组而生成的较小片段)，该子片段赋予RPF14抗性表型且优选地包含SNP_01抗性供体核苷酸。

如本文所用，术语“植物”包括种子(可从种子生长成植物)、完整植物或任何部分，如植物器官(例如采收的或未采收的叶等)、植物细胞、植物原生质体、可由其再生出完整植物的植物细胞培养物或组织培养物、繁殖或非繁殖的植物细胞、不在组织培养物中的植物细胞(但例如在植物或植物部分体内)、分离的植物细胞、植物愈伤组织、原生质体、小孢子、植物细胞团、植物移植体、幼苗、在植物中完整的植物细胞、植物克隆体或微体繁殖体、或植物的一部分(例如采收的组织或器官)(如植物插条、营养繁殖体、克隆繁殖的植物、子叶、下胚轴、叶、经加工的叶、茎、秆、梢、芽、根、根尖、叶柄、花、花瓣、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花粉粒、胚珠、胚芽、胚囊、果实、分生组织、形成层、种子(自体授精或异体受精后在植物上产生))、作为母体组织的种子的一部分、移植物、接穗、根茎、其中任何一种的一部分等，或其优选与获得其的植物具有相同遗传组成(或非常相似的遗传组成)的衍生物。此外，还包括任何发育阶段，如幼苗、生根前或生根后的插条、成熟和/或未成熟的植物或成熟和/或未成熟的叶。当提及“植物的种子”时，其是指由可其生长出植物的种子或在自体授精或异体受精后在植物上产生的种子。

“组织培养物”或“细胞培养物”是指包含相同或不同类型的分离细胞或组织成植物组织的所述细胞的集合的体外组合物。菠菜的组织培养物和细胞培养物以及由其再生的菠菜植物是众所周知且广泛发表的(见例如Nguyen et al.，2013，Plant BiotechnologyReports，第7卷，第1期，第99页)。

“采收的植物材料”是指已收集以供进一步储存和/或进一步使用的植物部分(例如从完整植物中分离出的叶)。本文使用的“采收的叶”是指菠菜叶，即没有根系的植物，例如基本上所有(采收的)叶。采收的叶可被处理。“采收的种子”是指从株系或品种中采收的种子，例如自体授精或异体受精后产生并收集的种子。

本文使用的“子代”或“后代”是指获得自(可获得自)本发明的植物的子代(offspring)或第一代和/或所有其他后代，其包含(保留有)纯合或杂合形式的RPF14抗性基因，和/或包含本文描述的RPF14抗性表型。子代可通过细胞培养物或组织培养物或植物的一部分的再生，或植物的自交，或通过产生植物的种子来获得。在其他实施方案中，子代还可包含由至少一种菠菜植物与同一或另一个品种或(育种)系的另一菠菜植物杂交，和/或回交，和/或将基因座插入到植物中和/或突变而获得的菠菜植物。子代为例如第一代子代，即子代直接源自、获得自或可获得自或可源自母体植物，通过例如传统育种方法(自交和/或杂交)或再生。然而，术语“子代”一般包括其他代如第二代、第三代、第四代、第五代、第六代、第七代或更多代，即通过例如传统育种方法、再生或遗传转化技术源自、获得自、可获得自或可源自前一代的植物代。例如，第二代子代可通过上述任何方法从第一代子代中产生。双单倍体植物也是子代。

“植物株系”为例如可用于开发一个或多个品种的育种系。“近交系”或“近交亲本”是通过将植物自交几代而开发的植物株系，可用作“F1杂种”(或通过将雄性亲本系与雌性亲本系杂交而成的单交杂种)的亲本。“雄性育种系”或“雄性亲本”或“雄性亲本系”为雄性亲本，即花粉供体。“雌性育种系”或“雌性亲本”或“雌性亲本系”为雌性亲本，即胚珠供体。在菠菜育种中，雌性亲本通常在雄花之前至少3周产生雌花。这阻止或大大减少了在F1杂种种子生产中自交的雌性亲本系的存在。

“优良菠菜植物”为具有产生所需农艺性状的基因型的植物、通常为杂种，所述农艺性状使种植者收获商业上所需的产品。“优良亲本系”为近交亲本，具有在其杂种子代中产生所需农艺性状的基因型。此外，“优良母本”为优良的种子生产者。

“F1、F2、F3等”是指两个亲本植物或亲本系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或株系杂交产生的种子生长成的植物称为F1代。F1植物自交产生F2代等。

“杂种”是指通过一个植物株系或品种与另一个植物株系杂交而采收的种子，以及由所述种子生长成的植物或植物部分。

“杂交”是指两个亲本植物的交配。同样，“异花授粉”是指来自不同植物的两个配子结合受精。

“自交”是指植物自花授粉，即同一植物的配子结合。

在本文中，术语“传统育种技术”包括育种者已知的杂交、回交、自交、选择、染色体加倍、双单倍体生产、胚胎抢救、桥种(bridge species)使用、原生质体融合、标记物辅助选择、突变育种等(即除遗传修饰/转化/转基因方法外的方法)，通过这些方法例如可获得、鉴定、选择和/或转移RPF14抗性基因。

“回交”是指一种育种方法，通过该方法可将(单一)性状(如RPF14抗性基因赋予的Pfs抗性)从一个遗传背景(还称为“供体”；通常但不一定是劣等遗传背景)转移到另一个遗传背景(还称为“轮回亲本”或“受体”；通常但不一定是优良遗传背景)。将杂交的子代(例如通过杂交供体(例如菠菜的野生近缘种)和受体(例如栽培菠菜株系)而获得的F1植物；或自交F1而获得的F2植物或F3植物等)“回交”到具有优良遗传背景的亲本(或受体)，例如栽培亲本。重复回交后，供体遗传背景的性状(例如RPF14基因)将被整合到轮回遗传背景中。在本文中，术语“基因转化”或“转化植物”或“单一基因座转化”是指通过回交而开发的植物，其中除了从供体亲本转移的一个或多个基因(例如RPF14抗性基因)外，还基本上恢复了轮回亲本的所有所需形态和/或生理特征。

“再生”是指从体外细胞培养物或组织培养物或营养繁殖发育出植物。

在本文中，“营养繁殖”、“营养生殖”、“克隆繁殖”可互换使用，意指取植物部分并使该植物部分形成至少根的方法，其中植物部分例如定义为或源自(例如通过扦插)叶、叶的一部分、茎、茎的一部分、秆、秆的一部分、梢、梢的一部分、芽或芽的一部分、插条、根、根的一部分、根尖、叶柄、叶柄的一部分、子叶、子叶的一部分、花、花的一部分、花瓣、花瓣的一部分、雄蕊、雄蕊的一部分、花药、花药的一部分、花粉、柱头、柱头的一部分、花柱、花柱的一部分、子房、子房的一部分、胚珠、胚珠的一部分、种子、种子的一部分、种皮、胚、胚的一部分、胚轴、胚囊、果实、果实的一部分、细胞、原生质体、愈伤组织、小孢子、分生组织、形成层。当完整植物是通过营养繁殖再生时，其还称为“营养繁殖体”或“营养繁殖的植物”。

“单一基因座转化(的)植物”是指通过包含回交或由回交组成的植物育种技术开发的植物，其中除已通过回交技术和/或遗传转化转移到植物中的单一基因座(例如包含来自供体的RPF14基因的基因座)的特征外，还基本上恢复了菠菜植物的所有所需形态和/或生理特征。

“转基因”或“嵌合基因”是指包含DNA序列的遗传基因座，该DNA序列通过转化引入菠菜植物的基因组中。包含稳定地整合到其基因组中的转基因的植物称为“转基因植物”。

“Pfs”或“粉霜霉菌”或“疏松霜霉菌”或“霜霉菌”是指卵菌纲菠菜粉霜霉菌的亚种。该定义包含至少官方认可的亚种和分离株。Pfs1-Pfs17是指官方认可的亚种，其可在菠菜差异化宿主上进行区分，所述菠菜差异化宿主可从Naktuinbouw，P.O.Box 40，2370AARoelofarendsveen，The Netherlands获得或由ISF(国际种子联合会(International SeedFederation))提供的参考。官方认可的致病亚种是广泛存在的。“差异化宿主”或“差异株”是指用于区分Pfs亚种1-17的菠菜的差异化宿主，其可从a.o.Naktuinbouw，P.O.Box 40，2370 AA Roelofarendsveen，The Netherlands获得或由ISF(国际种子联合会)提供的参考。菠菜粉霜霉菌亚种16在美国加利福尼亚州萨利纳斯(2015-3)首次发现，后来发现是广泛存在的。其最初命名为UA201519B，并且其“基于一组标准的差异品种的病害发展而被表征”。“亚种Pfs：16能够感染差异株Viroflay、Resistoflay、Clermont、Lazio、Pigeon和Meerkat，但不能感染Califlay、Campania、Boeing(Avenger)、Lion、Whale和Caladonia。”还存在可成为官方认可的亚种的许多其他分离株。菠菜粉霜霉菌的一种重要分离株为UA0514。

“Pfs抗性植物”或“霜霉菌抗性植物”或具有“Pfs抗性”或“Pfs抗性表型”的植物是指对Pfs的一个或多个致病亚种(和致病分离株)具有抗性——如例如在可控环境条件下进行定性抗性试验测定的——的菠菜植物。在这种抗性试验中，使某基因型的多株植物(例如至少10株植物的至少2次重复)接种所述亚种或分离珠的孢子囊悬浮液，并在适当的条件下培育。在适当的培育期后(例如接种后7、8、9、10、11天或更长时间)对植物进行症状评估。易感对照应在症状评估时显示孢子形成。在子叶上(和/或在真叶上)显示孢子形成的植物被认为是“易感的”，而在子叶上(和/或在真叶上)没有显示出任何孢子形成的植物被认为是“抗性的”。超过85％的接种植物(优选超过90％或95％)被归类为“抗性”植物的植物基因型被认为是对所述亚种或分离株有抗性的。在测试中，易感对照植物(如栽培种Viroflay)中超过85％的接种植物(优选超过90％或95％的植物)应显示出孢子形成。适当的测试记载在本文实施例或Irish et al.2007(Plant Disease Vol 91No.11，1392-1394页，材料和方法)或Correll et al.2010，“Guidelines for Spinach Downy Mildew：Peronsporaferinosa f.sp.spinaciae(Pfs)”，参见ISF(国际种子联合会)的网站。

在本文中，“RPF14”是指来自菠菜野生近缘种的单一基因，该基因赋予对至少Pfs亚种8和10至16(优选8和10至17)的抗性(如上文所定义的)(当该基因为纯合或杂合形式时)，并且至少在该基因为纯合形式(但也可能在该基因为杂合形式时)，还赋予对Pfs亚种1、2、6、7和9和分离株UA0514和/或Pfs的其他致病分离株的抗性。在本发明的一个方面，由RPF14赋予的抗性是对至少Pfs亚种8至16(在一个方面，对至少亚种8至17)的抗性，并且至少在该基因为纯合形式时赋予。在本发明的一个方面，由RPF14赋予的抗性是对Pfs亚种1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17的抗性，以及至少在该基因为纯合形式时，也可能在该基因为杂合形式时，还赋予对其他致病分离株(如UA0514)的抗性。在本发明的另一个方面，当该基因为纯合形式时，赋予对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性以及对分离株UA0514和/或其他致病分离株的抗性。在本文中，抗性表型还称为“由RPF14基因赋予的Pfs抗性表型”。在本发明的另一个方面，RPF14位于来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段上，或位于基因渗入片段的一部分上。在本发明的另一个方面，RPF14从菠菜的野生近缘种基因渗入，在一个方面，菠菜的野生近缘种为新疆菠菜。在本发明的另一个方面，RPF14位于第一DNA标记物和第二DNA标记物之间。在另一个方面，RPF14与SNP_01抗性供体核苷酸(其为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤)物理连锁。

术语“基因座”(多个基因座)意指例如基因(如RPF14基因)或遗传标记物存在于染色体上的一个或多个具体位置或位点。在本发明的在菠菜中，包含RPF14基因的抗性基因座从菠菜的野生近缘种基因渗入，例如从新疆菠菜的抗性种质(即供体植物)基因渗入到栽培菠菜中。RPF14基因所位于的基因座与SNP_01的抗性供体核苷酸(其为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤)物理连锁并遗传连锁。

术语“等位基因”意指特定基因座处基因的一种或多种替代形式中的任一种，所有这些等位基因均与特定基因座处的一种性状或特征相关。在生物体的二倍体细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或单个基因座(多个基因座)处。一个等位基因存在于一对同源染色体中的每条染色体上。二倍体植物物种可在特定基因座上包含大量不同的等位基因。所述等位基因可为所述基因的相同等位基因(纯合的)或两个不同的等位基因(杂合的)。

术语“基因”意指包含在细胞中转录为信使RNA分子(mRNA)的区域(转录区)和可操作地连接的调控区(例如启动子)的(基因组)DNA序列。因此，基因的不同等位基因是基因的不同替代形式，其可为例如差异在于在基因组DNA序列(例如启动子序列、外显子序列、内含子序列等)的一个或多个核苷酸、mRNA和/或所编码的蛋白的氨基酸序列的形式。

“等位性试验”指可用于测试在两种植物中观察到的两种表型由相同的基因或由不同的基因决定的遗传试验。例如，将待测植物彼此杂交，F1自交，并测定F2子代之间表型的分离。分离比率表明基因是否为等位的。参见例如EP1816908B1，其中等位性试验用于显示HMBN等位基因与dw-1和dw-2等位基因不是等位的，并且位于不同的基因座。

“基因渗入片段”或“基因渗入区段”或“基因渗入区域”是指已通过杂交或传统育种技术(例如回交)引入到相同或近缘物种(related species)的另一植物中的染色体片段(或染色体部分或区域)，即基因渗入片段是用动词“基因渗入”表示的育种方法(例如回交)的结果。在菠菜中，菠菜的野生近缘种(如新疆菠菜)可用于将野生基因组的片段基因渗入到栽培菠菜的基因组中。因此，这类菠菜植物具有“菠菜的基因组”，但在基因组中包含了菠菜的野生近缘种的片段，即供体植物的基因渗入片段。应理解，术语“基因渗入片段”从不包括整条染色体，而仅包括染色体的一部分。所述基因渗入片段可以是大的，例如甚至是染色体的一半，但优选地较小，例如约15Mb或更小，例如约10Mb或更小，约9Mb或更小，约8Mb或更小，约7Mb或更小，约6Mb或更小，约5Mb或更小，约4Mb或更小，约3Mb或更小，约2Mb或更小，约1Mb(等于1,000,000个碱基对)或更小，或约0.7Mb、0.6Mb、0.5Mb(等于500,000个碱基对)或更小，例如约200,000bp(等于200千碱基对)或更小，约100,000bp(100kb)或更小，约50,000bp(50kb)或更小，约25,000bp(25kb)或更小。技术人员可将保留有赋予所需性状的基因的片段从供体植物基因渗入到受体植物中。对包含基因渗入片段的植物的整个基因组进行测序，将鉴定出所述基因渗入片段源自特定供体物种，并使得鉴定出特定供体，原因是该序列是特定供体独有的。

“包含RPF14抗性基因的基因渗入片段”或“RPF14基因渗入片段”是指源自供体且包含RPF14基因的染色体的一部分。在本发明的一个方面，基因渗入片段还包含一个或多个在供体和栽培菠菜植物之间具有多态性的标记物，所述标记物允许鉴定基因渗入片段，例如SNP_01。因此，在一个方面，RPF14基因与SNP_01的抗性供体核苷酸(其为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A)连锁。

“SNP_01供体核苷酸”是指在SNP位置——即在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处——发现的核苷酸腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

可通过使用全局或局部比对算法进行的两个核苷酸序列的比对来确定“序列同一性”。然后，当通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)对序列进行最佳比对时，序列共有至少某一最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义的)时，所述序列可称作“基本相同”或“基本相似”。这些程序使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在全长上比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位生成(gap creation)罚分＝10，空位延伸(gap extension)罚分＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对均适用)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL。例如可使用计算机程序(例如可在万维网上http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/获得的EMBOSS)来确定用于序列同一性百分比的序列比对和评分。或者，可通过检索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定序列相似性或同一性，但是应检索命中(hit)并进行成对比对以比较序列同一性。如果序列同一性百分比为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大(如对于核酸，通过Emboss“Needle”使用评分矩阵DNAFULL，使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5)测定的)，则两个核酸序列具有“基本序列同一性”。

在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“物理距离”为实际物理距离，其用碱基对(bp)、千碱基对(kb)或者兆碱基对(Mb)表示。

通过交换频率或重组频率(RF)测量在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“遗传距离”，并且用厘摩(cM)表示。1cM相当于约1％的重组频率。如果没有发现重组体，则RF为零并且所述基因座在物理上非常紧密地在一起或它们是相同的。两个基因座的相距越远，RF越高。

“分子标记物”为一段与某一基因组或染色体位置相关的DNA或单核苷酸多态性(SNP)，其存在于接近目的基因的染色体上，优选接近RPF14。分子标记物可用于鉴定特定的DNA序列，或基因组或染色体上的某一位置，或鉴定基因渗入片段。本文中，当提到一个或多个分子标记物通过分子标记物试验“可检测”时，这当然意指植物或植物部分在其基因组中包含一个或多个标记物，否则该标记物是不可检测到的。在一个方面，该标记物是单核苷酸多态性(SNP)，但也可同样使用其他分子标记物，如RFLP、AFLP、RAPD、INDEL、DNA测序等。在一个方面，SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01的抗性供体核苷酸)，或与SEQID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤，与RPF14基因和包含RPF14基因的基因渗入片段连锁，其中所述抗性供体核苷酸可用于选择包含基因渗入片段(包含RPF14基因)的植物、植物组织或植物部分，从而选择和/或产生抗性植物或植物部分(如上文所定义的)。技术人员通过例如测序或精细定位可开发其他在基因渗入片段和栽培菠菜之间为多态性的SNP。

“侧翼标记物”是位于染色体上RPF14基因任一侧的分子标记物。精细定位或测序可用来鉴定侧翼标记物，或除本文提供的SNP_01之外的至少第二标记物。

可开发与RPF14连锁和/或位于包含RPF14基因的基因渗入片段上的其他分子标记物，例如所述分子标记物位于SNP_01和RPF14之间，或位于RPF14基因座侧翼，或者与所述基因座物理连锁。这可通过例如精细定位基因或染色体或染色体区的测序来实现。然后，这些标记物可用于鉴定和/或选择包含RPF14基因的基因渗入片段，在该基因为杂合或纯合形式时，其赋予对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少亚种8和10至17)的Pfs抗性(如上所定义的)。例如，可进行精细定位，以找到与基因渗入片段上的RPF14基因甚至更紧密连锁的标记物。精细定位包括：制备重组植物种群(源自如在登录号NCIMB 42607下保藏的种子与易感植物(例如易感株系或品种)杂交)，其包括RPF14基因所定位的染色体的不同重组事件；和分析这些重组植物(包括例如不同大小的基因渗入片段的子片段)的由RPF14基因赋予的抗性表型和DNA标记物。因此，可更精确地限定RPF14基因的位置，并可鉴定与该基因更紧密连锁的标记物。同样地，可生成这样的植物，其包含与在NCIMB登录号42607下保藏的种子中发现的片段相比更小的基因渗入片段(即子片段)。或者，可进行测序，以鉴定与RPF14基因紧密连锁或甚至在该基因内的标记物。

术语“标记物测定法”或“基因分型测定法”是指可用于确定标记物基因型(例如SNP基因型)的测定法。例如，SNP标记物可使用KASP测定法(见万维网kpbioscience.co.uk)或技术人员已知的其他测定法来检测。

“标记物辅助选择”或“MAS”或“标记物辅助育种”或“MAB”是一种利用分子标记物的存在来选择存在特定基因座或区域(例如基因渗入片段)的植物(例如子代)的方法，其中所述分子标记物遗传连锁或物理连锁到特定基因座或特定染色体区域(例如基因渗入片段)。例如，SNP_01的抗性供体核苷酸(其为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的A)或RPF14基因附近的任何标记物可用于MAS中以选择包含RPF14基因的菠菜植物或植物部分。

在一个实施方案中，当提到这样的核酸序列(例如DNA或基因组DNA)时，即所述核酸序列与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少80％，例如，至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核酸序列同一性的序列同一性，所述核苷酸序列被认为是与给定的核苷酸序列基本上相同的，并且可使用严格杂交条件进行鉴定。在另一个实施方案中，与给定的核苷酸序列相比，所述核酸序列包含一个或多个替换、插入或缺失的核苷酸，但是仍然可使用严格杂交条件进行鉴定。

“严格杂交条件”可用于鉴定核甘酸序列，所述核甘酸序列与给定的核苷酸序列基本相同。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境下是不同的。通常，所选择的严格条件为在确定的离子强度和pH下，低于特定序列的热熔解温度(Tm)约5℃。所述Tm为50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常选择其中在pH 7下盐浓度为约0.02摩尔且温度为至少60℃的严格条件。降低盐浓度和/或增加温度均会提高严格性。RNA-DNA杂交(使用例如100nt探针的RNA印迹法)的严格条件为，例如包括在63℃下于0.2X SSC中至少一次洗涤(持续20min)的条件，或等同条件。DNA-DNA杂交(使用例如100nt探针的DNA印迹法)的严格条件为，例如包括在至少50℃、通常约55℃的温度下于0.2XSSC中至少一次(通常2次)的洗涤(持续20min)的条件，或等同条件。也可参见Sambrook etal.(1989)和Sambrook and Russell(2001)。

序列简述

SEQ ID NO：1描述了新疆菠菜序列，该序列包含SNP_01在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤。SEQ ID NO：1存在于在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中。

SEQ ID NO：2描述了菠菜(轮回亲本)的SNP_01的序列，其包含SEQ ID NO：2的第114位核苷酸处的鸟嘌呤(G)。

SEQ ID NO：3描述了菠菜的易感株系，所述易感株系包含第120位核苷酸处的SNP_01(包含第120位核苷酸处的鸟嘌呤(G))，如从SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：1的成对比对可看出的，所述第120位核苷酸与SEQ ID NO：1的第114位核苷酸为同等核苷酸。SEQ ID NO：3包含在SNP_01上游插入的6个核苷酸，从而SNP位于第120位，而不是第114位。

SEQ ID NO：4描述了来自粉防己菠菜的一个侧翼序列，位于WO2015054339中描述的霜霉菌QTL(对应于WO2015054339中的SEQ ID NO：1)的侧翼。

SEQ ID NO：5描述了来自粉防己菠菜的另一个侧翼序列，位于WO2015054339中描述的霜霉菌QTL(对应于WO2015054339中的SEQ ID NO：2)的侧翼。

SEQ ID NO：6描述了对应于SEQ ID NO：4的区域的菠菜序列，其存在于本发明的种子中，所述种子的代表性的样本已保藏在NCIMB42607下。

SEQ ID NO：7描述了对应于SEQ ID NO：5的区域的菠菜序列，其存在于本发明的种子中，所述种子的代表性的样品已保藏在NCIMB42607下。

SEQ ID NO：8描述了图2的SpinachBase序列。

具体实施方式

本发明的植物和方法

在一个实施方案中，本发明提供了一种栽培菠菜植物，其对至少粉霜霉菌亚种8和10至16、优选对至少8和10至17具有抗性，其中所述抗性由单一显性基因赋予。

所述单一基因被命名为RPF14，即粉霜霉菌抗性基因14。因此，本发明提供了RPF14，其赋予对粉霜霉菌亚种8和10至16、优选8和10至17的显性抗性。在另一个实施方案中，至少当RPF14基因为纯合形式时，RPF14还赋予对粉霜霉菌亚种1、2、6、7和9的抗性。在本发明的另一个方面，RPF14赋予对粉霜霉菌的分离株UA0514和/或潜在地其他致病分离株的抗性。这些其他分离株潜在地包含该领域开发的未来的分离株。所述基因不赋予对亚种3、4和5的抗性。RPF14基因在菠菜的野生近缘种中被鉴定，并通过回交被引入菠菜，优选栽培菠菜。所述RPF14基因为单一基因。所述基因显性遗传对至少Pfs亚种8和10至16、优选8和10至17的抗性；也就是说，当包含纯合形式的RPF14的植物与易感植物(如Viroflay品种)杂交时，F1子代将全部对至少Pfs亚种8和10至16，优选对亚种8和10至17表现出抗性，而在F2子代中，所述抗性将以3(抗性)：1(易感)的比例分离。RPF14基因以纯合形式存在于登录号NCIMB 42607下保藏的种子中，即包含RPF14的基因渗入片段以纯合形式存在。所述RPF14基因与抗性供体核苷酸SNP_01连锁，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。因此，保藏种子中存在的基因渗入片段包含SEQ ID NO：1，即包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，并且所述腺嘌呤(和SEQ ID N：1)以纯合形式存在于保藏种子中(保藏种子的SNP_01基因型为‘AA’)。

在本发明的一个方面，在菠菜种的栽培菠菜植物的基因组中，当来自新疆菠菜的RPF14基因以纯合或杂合形式存在时，该基因赋予对至少Pfs亚种8和10至16、优选对亚种8和10至17的抗性。

在本发明的另一个方面，在菠菜种的栽培菠菜植物的基因组中，至少当来自新疆菠菜的RPF14基因为纯合形式时，该基因赋予对至少Pfs亚种8至17，或对至少亚种6至17，或对至少亚种1、2和6至17的抗性，以及当该基因为杂合形式时，对这些亚种中的几个的抗性。

在本发明的另一个方面，在栽培菠菜植物的基因组中，至少当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合形式时，RPF14赋予对至少亚种8和10-16，优选8和10至17的抗性，以及还有对选自亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，以及当该基因(或包含该基因的基因渗入片段)为杂合形式时，对这些亚种中的几个的抗性。

在本发明的其他方面，在栽培菠菜植物的基因组中，当RPF14为纯合或杂合形式时，赋予对至少亚种8和10-16，优选对至少8和10至17的抗性，并且当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合或杂合形式时，还赋予对Pfs亚种1的抗性，和/或当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合或杂合形式时，还赋予对Pfs亚种2的抗性，和/或当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合或杂合形式时，还赋予对Pfs亚种6的抗性，和/或当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合或杂合形式时，还赋予对Pfs亚种7的抗性，和/或当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合或杂合形式时，对Pfs亚种9的抗性。在本发明的另一个方面，在栽培菠菜植物的基因组中，当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)为纯合或杂合形式时，RPF14赋予对分离株UA0514和/或另一种致病Pfs分离株的抗性。

在本发明的另一个方面，RPF14基因渗入赋予栽培菠菜植物对至少Pfs亚种8和10-16、优选8和10至17的抗性，其中所述RPF14基因(或包含该基因的基因渗入片段)与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁(包含SNP_01的抗性供体核苷酸)，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。在至少基因渗入片段以纯合形式或杂合形式存在时，赋予对亚种8和10至16，或8和10至17的抗性，因为对这些亚种的抗性是显性的。对于对Pfs 1、2、6、7、9和UA0514的抗性，目前尚不清楚仅当RPF14基因为纯合形式时才出现抗性，还是当RPF14基因为杂合形式时出现抗性(对于其中一个或多个亚种)，这取决于对亚种的抗性是显性的还是隐性的。对亚种的抗性是显性的还是隐性的，可在抗性试验中在例如RPF14杂合型和/或RPF14分离的植物中进行测试。

在本发明的另一个方面，RPF14基因渗入片段赋予栽培菠菜对至少Pfs亚种7至16、7至17或8至17的抗性，其中所述RPF14基因(或包含该基因的基因渗入片段)与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁(包含SNP_01的抗性供体核苷酸)，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。至少当基因渗入片段为纯合形式时，任选地还当基因渗入片段为杂合形式时，赋予对这些亚种的抗性，这取决于对亚种的抗性是显性的还是隐性的。对亚种的抗性是显性的还是隐性的，可在抗性试验中在例如RPF14杂合型和/或RPF14分离的植物中进行测试。

在本发明的另一个方面，RPF14基因渗入赋予栽培菠菜对至少Pfs亚种6至16、6至17的抗性，其中所述RPF14基因(或包含该基因的基因渗入片段)与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁(包含SNP_01的抗性供体核苷酸)，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。至少当基因渗入片段为纯合形式时，任选地当基因渗入片段为杂合形式时，赋予对这些亚种的抗性，这取决于对亚种的抗性是显性的还是隐性的。对亚种的抗性是显性的还是隐性的，可在抗性试验中在例如RPF14杂合型和/或RPF14分离的植物中进行测试。

发现对Pfs亚种8和10-16和17的抗性以显性的方式赋予。RPF14赋予对亚种1、2、6、7、9和/或UA0514的抗性是显性的还是隐性的还有待确定。如前文所述，技术人员可容易地确定这一点。众所周知，当RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段)以纯合形式存在时，栽培菠菜植物对这些亚种具有抗性。在保藏的种子中，基因渗入片段以纯合形式存在。因此，从所述种子生长成的植物可与缺乏RPF14基因的植物杂交，产生F1植物，并且可测试F1和/或F2和/或F3种群对每个Pfs亚种的抗性，以确定所赋予的抗性是当RPF14为杂合形式时观察到(显性)，还是仅当RPF14为纯合形式时才观察到(隐性)。

包含纯合形式的RPF14基因(即包含RPF14基因的基因渗入片段)的栽培菠菜株系的种子的代表性样本已根据布达佩斯条约于2016年7月12日由Nunhems B.V.保藏于NCIMBLtd.，登录号为42607。因此，在本发明的一个实施方案中，RPF14抗性基因是在登录号NCIMB42607下保藏的种子中，或来自登录号NCIMB 42607下保藏的种子生长成的植物或其部分，或源自所述种子或所述植物或其部分的细胞培养物中发现的基因。显然，NCIMB 42607的子代也包括在内，这些子代在其核基因组中包含RPF14基因。

本文中，当提及“包含RPF14基因”的栽培菠菜植物或植物部分时，应理解为意指菠菜植物或植物部分包含基因渗入片段，该片段包含位于染色体上RPF14基因座的来自野生新疆菠菜供体的RPF14基因。在一个方面，野生新疆菠菜供体是与保藏的种子相同的供体，即新疆菠菜的RPF14基因序列和包含RPF14基因的片段的序列与保藏的种子具有相同的核苷酸序列。这可通过例如全基因组测序来确定。或者，野生新疆菠菜供体可为不同的种质，包含RPF14基因(赋予例如相同的Pfs抗性)，但其核苷酸序列与保藏种子的RPF14基因或包含保藏种子的RPF14基因的基因渗入片段具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在NCIMB 42607下保藏的种子的代表性样本的栽培菠菜株系——包含携带纯合形式的RPF14的新疆菠菜基因渗入片段，对Pfs亚种1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和UA0514具有抗性。

RPF14基因位于菠菜野生近缘种的基因渗入片段上。在本发明的一个方面，所述基因渗入片段来自新疆菠菜，并且除包含RPF14基因外，还包含与RPF14基因连锁的分子标记物，且所述分子标记物可用于选择包含RPF14的片段。发现在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01的抗性供体核苷酸)与基因渗入片段上的RPF14基因连锁。发现缺乏基因渗入片段的易感株系含有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的鸟嘌呤(如SEQ ID NO：2所示)或SEQ ID NO：3的第120位核苷酸处(该核苷酸为SEQ ID NO：1或2的第114位核苷酸的同等核苷酸，从配对比对可看出(使用Emboss程序Needle))的鸟嘌呤。因此，易感菠菜植物株系的序列可在SNP标记物区表现出变异。因此，在一个方面，RPF14基因与SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤连锁或与和SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤连锁。在本发明的一个方面，抗性基因RPF14获得自或可获得自新疆菠菜种质，该种质具有与RPF14赋予的Pfs抗性表型(例如与保藏种子)相同的Pfs抗性表型，并且包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01的抗性供体核苷酸)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在本发明的另一个方面，包含RPF14的基因渗入片段为存在于(并可获得自；或获得自；或可源自；或源自)在登录号NCIMB 42607下保藏的菠菜种子中的基因渗入片段或其子片段(保留有RPF14)，其中所述基因渗入片段(或子片段)包含赋予对至少Pfs亚种8和10至16的抗性的RPF14基因。在一个方面，基因渗入片段还包含SEQ ID NO：1。

保藏种子中存在的基因渗入片段来自特定的供体种质，因此具有独有的核苷酸序列。整个片段可通过将从保藏种子生长的植物与另一菠菜植物杂交并选择包含基因渗入片段的后代而容易地转移到其他菠菜株系或品种中。选择可通过各种方法进行，通过Pfs抗性表型和/或选择包含SEQ ID NO：1的子代和/或测序、SNP基因分型(选择包含SNP_01的腺嘌呤的子代等)。

所述片段还可通过一个或多个分子标记物(例如SNP标记物、AFLP标记物、RFLP标记物等)、尤其是在栽培菠菜和野生供体基因渗入片段之间具有多态性的分子标记物来鉴定。通常，定位群用于生成标记物。例如，可产生基因渗入片段的特定标记物，这些标记物与RPF14基因的距离在6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM以内，和/或与RPF14基因的距离在1Mb、0.9Mb、0.8Mb、0.7Mb、0.6Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb以内或更小。在一个特别优选的实施方案中，通过包括使NCIMB 42607的种子生长成植物的步骤的方法获得包含RPF14基因的基因渗入片段。

在另一个实施方案中，提供栽培菠菜植物，其包含在NCIMB 42607种子中存在的基因渗入片段的子片段上的RPF14基因。这种植物可通过自交，或将NCIMB 42607种子生长的植物与另一菠菜植物杂交并选择具有较短基因渗入片段的后代(即其中在基因渗入片段内的同源染色体之间发生重组事件，从而部分片段重组)而产生。例如，可产生具有与NCIMB42607种子中存在的原始全长基因渗入片段不同的子片段的重组近交系。估计来自新疆菠菜供体的原始基因渗入片段在大小上等于或小于3.0Mb，特别是在大小上等于或小于2.0Mb。因此，包含RPF14的子片段可小于3.0Mb，小于2.0Mb，例如小于1.0Mb、0.7Mb、0.6Mb、0.5Mb、0.4Mb、0.3Mb、0.2Mb、0.1Mb或更小，并且可仍然包含RPF14基因。任选地，子片段还保留有SEQ ID NO：1。

如前文所述，在RPF14定位群中，来自新疆菠菜供体的SNP_01的SNP核苷酸是SEQID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，而不是轮回亲本(缺乏基因渗入片段的菠菜)的SNP核苷酸——鸟嘌呤，如SEQ ID NO：2的第114位或SEQ ID NO：3的第120位(SEQ ID NO：3的第120位是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的第114位的同等位置)所示。在易感株系中发现SEQID NO：2和SEQ ID NO：3(另见实施例的图1)。

因此，包含RPF14的基因渗入片段纯合型的二倍体菠菜植物具有在每个同源染色体的SNP_01位置处的腺嘌呤(即‘AA’基因型)。基因渗入片段杂合型的菠菜植物具有在一条染色体的SNP_01位置处的腺嘌呤和在另一条染色体的同等位置处的鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶——取决于轮回亲本背景(即‘AG’或‘AC’或‘AT’基因型)。

本发明包括来自新疆菠菜供体的基因渗入片段，如在保藏的种子中存在的基因渗入片段(包含RPF14且任选地包含SEQ ID NO：1；和SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤)和来自其他新疆菠菜供体的基因渗入片段，其在菠菜基因组3号染色体上同一染色体基因座上包含RPF14的，但其中所述基因渗入片段的核苷酸序列与保藏种子中存在的基因渗入片段的序列不是100％相同(例如与保藏种子中存在的基因渗入片段仅具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％的序列同一性)。在一个方面，所述基因渗入片段可包含SNP_01，其中SNP_01具有与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列中的腺嘌呤。因此，SEQ ID NO：1的标记物序列在这样不同的新疆菠菜供体中也可以不是100％相同的。本发明还包括来自其他新疆菠菜供体的这种基因渗入片段的子片段，所述子片段包含RPF14，并任选地包含与SEQ IDNO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列中第114位核苷酸处的腺嘌呤。

因此，本发明还包括包含RPF14基因的上述基因渗入片段的子片段，其中所述子片段包含RPF14基因，该基因赋予至少对Pfs亚种8和10至16、优选Pfs 8和10至17的抗性，并且所述子片段为在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中存在的基因渗入片段的一部分，或为与保藏种子中存在的基因渗入片段具有基本序列同一性的不同新疆菠菜供体的基因渗入片段的一部分。本发明包括包含RPF14基因并包含SNP_01的抗性供体核苷酸的所述子片段，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ IDNO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。因此，在一个方面，基因渗入子片段获得自(和可获得自；或可源自；或源自)在登录号NCIMB 42607下保藏的栽培菠菜种子中发现的片段，并且该子片段保留有RPF14基因(和该基因赋予的Pfs抗性表型，以及任选地SEQ ID NO：1)；而在另一个方面，基因渗入片段获得自另一个在3号染色体上同一基因座上包含RPF14基因的新疆菠菜供体。包含这样一个较短的基因渗入片段的菠菜植物可通过将本发明的植物与另一菠菜植物杂交并选择保留有RPF14基因赋予的抗性表型、但包含较短的基因渗入片段的重组子代来产生。技术人员可例如将从保藏种子生长的植物与另一栽培菠菜植物(例如对Pfs亚种8和10至17的一种或多种易感的植物)杂交，然后使F1子代自交产生F2种群，并鉴定在基因渗入片段中已发生的重组体(交换事件)。

如前文所述，WO2015054339记载了6号染色体上的QTL。该基因座是从粉防己菠菜基因渗入的，并赋予广谱的Pfs抗性，特别是“对菠菜粉霜霉菌(Pfs)亚种7、10、11、12、13和14，或对菠菜粉霜霉菌(Pfs)亚种1-14和UA4712的抗性”。(UA4712为Pfs亚种15)。6号染色体实际上对应于SpinachBase的3号染色体。位于QTL侧翼的两个粉防己菠菜序列——本文中提供为SEQ ID NO：4和5——位于1.4Mb(SEQ ID NO：4)和0.7Mb(SEQ ID NO：5)处。另一方面，来自新疆菠菜的即时SNP_01标记物(instant SNP_01marker)位于3号染色体的0.6Mb处。

发明人还测试了在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中是否存在位于粉防己菠菜的QTL侧翼的序列。左翼和右翼序列(即SEQ ID NO：4和5)均不存在于保藏种子中，如实施例中进一步描述的。相反，在保藏种子中相应的染色体区域处存在菠菜DNA(提供为SEQ IDNO：6和7)。

因此，在一个方面，本发明的包含含有RPF14的基因渗入片段的栽培菠菜植物不包含WO2015054339中描述的广谱抗性基因座。当然，由于该基因座位于3号染色体的不同区域，即使RPF14和QTL均为纯合形式，该基因座可与RPF14结合而不造成不必要的负担。

如存在于NCIMB 42607下保藏的种子中的本发明的包含RPF14基因的基因渗入片段不包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5与WO2015054339中描述的来自粉防己菠菜的赋予抗性的基因渗入片段连锁。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5不存在于本发明的基因渗入片段中，也不存在于NCIMB 42607下保藏的本发明种子中。在NCIMB42607下保藏的种子(其包含RPF14基因)，在SEQ ID NO：4的同等区域包含SEQ ID NO：6。在NCIMB 42607下保藏的种子(其包含RPF14基因)，在SEQ ID NO：5的同等区域包含SEQ IDNO：7。

RPF14基因是有用的，因为其为赋予对几个致病粉霜霉菌亚种——即对至少Pfs亚种8和10至16、优选对至少亚种8和10至17——的显性抗性的单一基因。RPF14可用于产生抗性菠菜品种。在现有技术中，通常将抗性基因叠加(与其他互补抗性基因组合)，以提供对大量粉霜霉菌亚种的抗性。为了在杂种品种中叠加抗性基因，所述基因应赋予显性抗性。这对于赋予二倍体菠菜对粉霜霉菌的抗性尤其重要，因为一些抗性基因是等位基因，限制了可能组合的数量。因此，本文描述的产品(例如植物、植物部分、子代植物等)提供了对现有技术的重大改进。

在一个方面，本发明提供了菠菜F1杂种植物和植物部分(以及可从其生长成F1杂种的种子)，其中一个亲本为包含纯合形式的本发明的RPF14基因的近交系。另一个亲本可为易感的，或可为包含粉霜霉菌抗性基因的近交亲本系，所述抗性基因选自：RPF1、RPF2、RPF3、RPF4、RPF5、RPF6、RPF7、RPF8、RPF9、RPF11、RPF12、RPF15、R6基因(WO2013/064436)、p10基因(WO2017/194073)、R15基因(WO2017/084724)，或US20170127641或US20170127642中描述的基因。

还提供了一种生产杂种菠菜种子的方法，包括将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交，并采收由此产生的杂种菠菜种子，其中第一亲本菠菜植物包含RPF14基因，该基因赋予对至少Pfs亚种8和10至16、优选对8和10至17的显性抗性，并且需要与另一种霜霉菌抗性基因叠加，以对亚种3、4和/或5具有抗性；和/或对亚种1、2、6、7和/或9具有抗性。因此，在一个方面，另一个亲本为包含粉霜霉菌抗性基因的近交亲本系，所述抗性基因选自：RPF1、RPF2、RPF3、RPF4、RPF5、RPF6、RPF7、RPF8、RPF9、RPF11、RPF12、R6基因(WO2013/064436)、p10基因(WO2017/194073)、R15基因(WO2017/084724)，或US20170127641或US20170127642中描述的基因。还包括通过这种方法生产的F1杂种菠菜种子，以及由所述种子生长的杂种菠菜植物或植物部分。

为了提供对亚种3、4和/或5的额外抗性，以下基因最适合：RPF1、RPF2、RPF3、RPF4、RPF6、RPF7、RPF8、RPF9、RPF11、RPF12、R6、R15，以及US20170127641或US20170127642中描述的基因。

为了提供对亚种1、2、6、7和9的额外抗性，以下基因最适合：RPF1、RPF2、RPF8、RPF9、RPF11和RPF12以及US20170127641或US20170127642中描述的基因。因此，在一个优选的方面，F1杂种植物(或可生长成植物的种子)包含来自一个亲本的RPF14基因和来自另一个亲本的选自RPF1、RPF2、RPF8、RPF9、RPF11、RPF12和US20170127641或US20170127642中描述的基因的基因。

来自一个亲本的RPF14基因与来自另一个亲本的以下基因的结合提供了对Pfs 1至Pfs 17具有抗性的菠菜植物：RPF1、RPF2、RPF8、RPF9、RPF12、US20170127641或US20170127642中描述的基因。在本发明的一个方面，包含RPF14抗性基因的菠菜植物可获得自(或获得自，或可源自，或源自)：将在登录号NCIMB 42607下保藏的种子生长的菠菜植物与另一菠菜植物杂交，例如与缺乏Pfs抗性基因的菠菜植物(易感植物)杂交，或与包含一个或多个不同的Pfs抗性基因的菠菜植物杂交。合适的易感植物的实例为品种Viroflay。

本发明的菠菜植物可为例如包含纯合形式的RPF14的近交系，或包含纯合或杂合形式的RPF14基因的F1杂种。

在一个实施方案中，本发明的RPF14抗性基因可与其他的粉霜霉菌抗性基因或抗性基因座(例如RPF1-RPF9、RPF11或RPF12、R6、R15或WO2015054339和EP2912940中公开的抗性等)或与其他性状结合，所述抗性为例如针对以下的抗性：细菌(如菠菜丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.spinacea)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora))，真菌(例如Albugo occidentalis；菠菜束状刺盘孢(Colletotrichum dematiumf.sp.spinaciae)；菠菜匍柄霉(Stemphylium botryosum f.sp.spinacia))，病毒(例如引起卷曲顶病(Curly top disease)或斑点病(Speckles)或菠菜枯萎病(Spinach blight)或菠菜花叶病(Spinach Mosaic)的病毒)或线虫类(例如三叶草囊线虫(车轴草异皮线虫(Heterodera trifolii))、病变线虫(短体线虫属种(Pratylenchus spp.))、根结线虫(根结线虫属种(Meloidogyne spp.))或甜菜囊线虫(甜菜囊线虫(Heterodera schachtii))。结合可例如通过传统育种技术(例如通过回交)来完成，以将一个或多个性状引入本发明的植物中，或将本发明植物的RPF14基因引入包含这样一个或多个其他性状的另一种菠菜植物中，或通过其他技术(包括基因编辑或转化)来完成。在一个方面，本发明的植物用作RPF14基因的供体，而在另一个方面，本发明的植物用作一个或多个其他性状的受体。技术人员可通过将RPF14基因与其他合适的抗性基因结合，获得对所有目前已知的Pfs亚种(即Pfs 1至16，或1至17)具有抗性的杂种植物。例如，RPF14可与RPF12或RPF1、或RPF2、或RPF8或RPF9或US20170127641或US20170127642中描述的基因结合，以获得对所有目前已知的Pfs亚种的抗性。

RPF14抗性基因，或其所位于的基因渗入片段，或包含RPF14的片段的子片段，可通过技术人员已知的各种方法从本发明的植物转移到另一种菠菜植物。因此，RPF14抗性基因的供体可为例如从保藏的种子生长出的植物，或其子代植物。

因此，RPF14抗性基因的供体可为NCIMB 42607，或是从所述保藏物生长的植物的子代，所述植物的子代，或从所述植物的细胞培养物生长的植物。转移的RPF14基因可赋予受体植物对至少Pfs亚种8和10至16、优选亚种8和10至17的抗性，和对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，以及对Pfs分离株UA0514的抗性。

RPF14抗性基因，或其所位于的基因渗入片段，或包含该基因的其子片段，可用于制备杂种植物(例如F1杂种)，或近交植物或纯合植物，任选地双单倍体植物。在另一个方面，近交或纯合植物为雄性亲本系，优选雄性优良亲本。在另一个方面，近交或纯合植物为雌性亲本系，优选雌性优良亲本。可将雄性亲本系与雌性亲本系杂交，得到包含纯合形式的RPF14(或包含RPF14的基因渗入片段，且任选地包含SEQ ID NO：1)的F1杂种种子。

在一个实施方案中，亲本系用作RPF14抗性基因的供体。所述供体植物可与另一种菠菜植物杂交，并可获得子代，包括F1、F2、F3、或进一步自交子代、回交子代(例如BC1、BC2、BC1S1、BC2S1、BC1S2等)等。可在子代中鉴定和选择与本发明初始植物具有相同的Pfs抗性表型的植物。同样，也可在子代中检测到基因渗入片段，例如通过检测指示基因渗入片段的标记物(例如SNP_01)或测序等。

在一个方面，近交系为菠菜种的栽培植物，包含至少对粉霜霉菌亚种8和10至16(优选至少亚种8和10至17)的抗性，其中所述抗性由从新疆菠菜基因渗入的单一基因(RPF14)赋予，所述基因与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，优选至少97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

RPF14抗性基因，或其所位于的基因渗入片段，或其子片段，还可在各种类型的菠菜中转移，如：皱叶、半皱叶、扁平叶或光滑叶或东方菠菜。优选地，所述皱叶、半皱叶、扁平叶或光滑叶或东方栽培菠菜植物为杂种植物。

在一个实施方案中，包括栽培菠菜植物，其包含对至少Pfs亚种8和10至16、优选对至少亚种8和10至17的抗性，其中所述抗性由从菠菜野生近缘种(优选新疆菠菜)基因渗入的单一显性基因RPF14赋予，该基因与SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，优选至少97％、98％或99％的序列同一性的序列连锁。在一个方面，这些序列中任一个的第114位的核苷酸(或成对比对中的同等核苷酸)为腺嘌呤。RPF14基因可在菠菜野生近缘种的不同种质中，尤其是在新疆菠菜种的种质中被鉴定，并被可基因渗入到栽培菠菜。为此，技术人员可例如筛选存在SNP_01的抗性供体核苷酸的种质，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，优选至少97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤，和/或测试Pfs抗性表型和任选地遗传性(作为单个基因)，以确定该种质是否包含RPF14。还可任选地进行测序、精细定位、等位基因试验等来确定种质中的基因是否确实是RPF14基因。

在一个特定的方面，栽培植物对粉霜霉菌的抗性由新疆菠菜的基因渗入片段赋予。因此，栽培菠菜植物包含源自新疆菠菜的RPF14基因，并任选地与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％，优选至少97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

抗性基因RPF14的存在可通过对至少Pfs亚种8和10至16(优选至少8号和10至17)，还可任选地对Pfs亚种1、2、6、7和9和/或分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性试验来确定。在另一个实施方案中，对Pfs亚种的抗性，或对Pfs亚种的选择可用于指示基因从供体转移到受体植物。因此，如果例如杂交中的受体亲本缺乏对特定Pfs亚种的抗性，则选择对该亚种具有抗性的子代植物表明RPF14基因的转移。

在栽培菠菜植物(即菠菜株系或品种)中存在抗性基因的测试包括例如在可控环境条件下的定性抗病试验。技术人员熟悉应用不同的方案进行所述试验。简而言之，待测植物基因型的多株植物的幼苗(例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多株植物)接种待测Pfs亚种的接种物，并在有利于病原体的条件下培育幼苗。在培育几天后，对植物进行感染症状评估，尤其是子叶和/或叶(例如第一真叶)上的孢子形成，并将每株植物归类为“抗性”(没有孢子形成迹象)或“易感”(显示孢子形成)。如果某一基因型的所有植物中有一定比例被归类为“抗性”，例如超过85％、90％、95％、98％、99％(甚至100％)，则该菠菜植物基因型对所测试的亚种具有抗性。显然，在使用相同处理和环境条件的试验中还应包括一株或多株对照植物(例如易感株系或品种、抗性株系或品种)，以确保试验如按预期进行。

这种对RPF14存在的测试可在所述基因为纯合或杂合的植物上，使用任何Pfs分离株或亚种进行。当基因以杂合形式存在时，如果根据测试将植物归类为抗性，则抗性是显性的。简单的测试可包括将包含抗性基因的植物与对至少一种Pfs亚种易感的植物(即没有背景抗性)杂交，并测试F1子代对该Pfs亚种的抗性。如果F1子代对该Pfs亚种具有抗性，则可得出抗性是显性的结论。该测试得出的结论是，RPF14赋予对Pfs亚种8和10至16，优选17的显性抗性。用于显性单基因遗传的另一个合适的测试是将包含抗性基因的植物与对所有Pfs亚种易感的植物杂交，使该杂交的子代自交，产生F2代，并观察对Pfs亚种的抗性分离。如果抗性与易感植物的分离比例为3∶1，抗性是显性单基因的。如果根据测试将植物归类为抗性，仅在基因以纯合形式存在时，抗性为隐性遗传。

还可直接确定在菠菜植物或植物部分(例如细胞)中存在RPF14抗性基因(或包含该基因的基因渗入片段)。技术人员了解筛选、选择或鉴定包含本发明的RPF14的栽培菠菜植物(例如子代植物)或菠菜植物的部分，或细胞或细胞培养物的方法，可通过检测与RPF14基因或基因座连锁的一个或多个分子标记物(例如SNP_01)来实现。因此，在一个方面，包含RPF14基因的基因渗入片段可通过SNP_01的抗性供体核苷酸和/或任何其他与RPF14和/或包含RPF14基因的新疆菠菜基因渗入片段连锁的分子标记物的存在而检测，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。因此，技术人员可将包含基因渗入片段的基因组、尤其是基因组的3号染色体与缺乏基因渗入片段而包含菠菜基因组序列的基因组、尤其是基因组的3号染色体区分开来。

RPF14基因位于3号染色体的起始处、在染色体的0Mb至2.0Mb的区域、尤其是在3号染色体的起始于0.4Mb至1.5Mb结束的区域(如可见于在SpinachBase基因组)。因此，如果对该区域测序，并包含新疆菠菜序列以及任选地与该基因连锁的SNP_01标记物，并且植物包含由RPF14基因赋予的抗性表型，则该植物或植物部分(例如细胞)包含本发明的RPF14基因。

在另一个方面，本发明提供了一种栽培菠菜种子，其包含作为基因渗入片段或基因渗入片段的子片段的一部分RPF14，如在登录号NCIMB42607下的保藏物中存在的。本发明还提供了多个包含RPF14的栽培菠菜种子，优选在容器中。

本发明还提供了一种栽培菠菜植物，其包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段，所述基因渗入片段赋予对粉霜霉菌亚种8和10至16、优选8和10至17的显性抗性，以及对Pfs亚种1、2、6、7和9和分离菌UA0514的抗性(潜在地仅当所述片段为纯合形式时)。在本发明的一个方面，所述片段从新疆菠菜基因渗入。在本发明的另一个方面，基因渗入片段为在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中存在的基因渗入片段，或该片段的短片段。因此，本发明还包括一种包含上述基因渗入片段的子片段的栽培菠菜植物，其中所述子片段赋予对Pfs亚种8和10至16、优选对亚种8和10至17的显性抗性，以及对Pfs亚种1、2、6、7和9和分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性(潜在地仅在所述片段为纯合形式时)。本发明还包括一种包含所述子片段的栽培菠菜植物，其中所述子片段是在登录号NCIMB 42607下保藏的种子中存在的基因渗入片段的一部分。较短的子片段保留有RPF14基因。

本发明的栽培菠菜植物可为杂种植物，尤其是F1杂种或近交植物(例如可用作F1杂种种子生产的亲本的近交系)，或纯合植物，任选地双单倍体植物。

可将RPF14基因转移到任何菠菜株系或品种中。

换句话说，通过基因渗入，可将RPF14基因从其代表性样本保藏在NCIMB 42607下的种子生长的植物，或者任何源自其并保留有RPF14基因的菠菜植物引入到任何其他菠菜植物中。因此，保藏的种子，以及非直接从保藏物获得而是间接获得(例如通过以后发布的商业品种)且包含本发明的RPF14基因的菠菜植物，是本发明的RPF14抗性基因的来源。

可鉴定RPF14基因的其他来源，例如在菠菜野生近缘种中(尤其是其他具有相同Pfs抗性表型和/或包含与本文提供的RPF14连锁的标记物(SNP_01)的新疆菠菜种质)，并且例如等位性测验可用于确定赋予相同的Pfs抗性表型的另一个基因是相同的基因还是不同的基因。同样，测序可用于证实RPF14基因的存在。确定另一个基因是否为相同基因的替代方法包括开发至少一种与本发明的RPF14基因连锁的分子标记物，并分析所述标记物是否存在于包含另一个基因的植物中。合适的标记物的实例是SNP_01的抗性供体核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在一个方面，提供了产生包含RPF14基因的栽培菠菜植物的方法，包括以下步骤：

a)将本文所述的包含RPF14基因的菠菜植物与另一菠菜植物杂交以产生子代植物；

b)任选地将步骤a的子代植物自交一次或多次，以产生另一代自交子代并任选地产生种子；

在一个实施方案中，步骤a)的另一菠菜植物对Pfs亚种8和10至16或17中的至少一种是易感的。在另一个实施方案中，步骤a)的另一菠菜植物是近交植物或纯合植物或雄性亲本系或雌性亲本系，或优选优良雄性亲本系或优良雌性亲本系。

在另一个方面，提供了包括步骤a)和任选地b)的方法，然后进行以下步骤：

c)通过以下方法鉴定包含RPF14抗性基因的步骤a或b的子代植物：确定子代植物是否包含对至少Pfs亚种8和10至16(优选至少对8和10至17)的抗性，和/或是否包含SEQ IDNO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤；和/或哪一个包含含有RPF14基因的来自新疆菠菜的基因渗入片段。

d)任选地将步骤c中已鉴定的子代植物与另一菠菜植物杂交，以产生子代植物或子代种子。

在另一个实施方案中，提供了产生菠菜植物的方法，所述菠菜植物包含RPF14基因(赋予对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，还任选地对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种和/或对分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性)，所述方法包括以下步骤：

a)将包含可获得自(或存在于)NCIMB 42607下保藏的种子的基因渗入片段(该基因渗入片段包含SEQ ID NO：1)的菠菜植物与另一菠菜植物杂交；

b)任选地将步骤a的子代植物自交一次或多次，以产生下一代自交子代，并任选地收集在该植物上产生的种子；

在一个实施方案中，步骤a)的另一菠菜植物对Pfs亚种8和10至16或17中的至少一种是易感的。在另一个实施方案中，步骤a)的另一菠菜植物是近交植物或纯合植物或雄性亲本系或雌性亲本系，或优选优良雄性亲本系或优良雌性亲本系。

在另一个方面，提供了包括步骤a)和任选地b)的方法，然后进行以下步骤：

c)通过确定子代植物是否包含对至少Pfs亚种8和10至16的抗性和/或包含SEQ IDNO：1，来鉴定包含RPF14抗性基因的步骤a或b的子代植物；

d)任选地将步骤c的已鉴定的子代植物与另一菠菜植物杂交，以产生子代植物或种子。

关于这两种方法，本文包括以下：在一个方面，步骤a)的植物包含在登录号NCIMB42607下保藏的种子中发现的RPF14基因。菠菜植物可为从保藏种子生长的植物，或使用或使用过保藏种子制备的并且保留有Pfs抗性表型(以及赋予Pfs抗性表型的RPF14基因)，并且任选地保留有SEQ ID NO：1的任何菠菜植物。这包括使用保藏种子制备的商业菠菜品种。因此，a)的菠菜植物包含根据本发明的RPF14基因，例如发现于(或可获得自；获得自；可源自；源自)NCIMB 42607的RPF14基因。

步骤c中的选择(或鉴定)可基于表型(即使用Pfs抗性测定法)和/或基于分子方法(例如检测与RPF14基因或基因座连锁的分子标记物，例如检测SNP_01的抗性供体核苷酸，其包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤)或其他方法(如测序)进行。

在上述方法中，步骤(a)的菠菜植物优选包含纯合形式的RPF14基因(即包含RPF14基因的基因渗入片段或其子片段)。在步骤a)中，在一个方面，包含抗性的菠菜植物与另一菠菜植物杂交，所述另一菠菜植物对至少一种Pfs亚种(a)的植物对该Pfs亚种具有抗性)是易感的。如果b)中的第二亲本为对至少一种Pfs亚种(a)的植物对该Pfs亚种具有抗性)是易感的菠菜植物，则步骤(d)和/或(f)中的选择可基于选择当前对该亚种具有抗性的植物。

在上述方法中，还可选择和/或鉴定保留有RPF14基因赋予的Pfs抗性表型，但其基因渗入片段比保藏的种子中存在的基因渗入片段小的植物。这可为有利的，因为耦合到基因渗入片段的新疆菠菜的不利性状可由此去除。因此，优选通过重组来减小基因渗入片段的大小，并选择包含较小基因渗入片段但保留有赋予抗性的基因的植物。因此，在一个方面，本文包括含有全部大小的基因渗入片段的菠菜，所述基因渗入片段起源自(或源自；或可源自；或获得自；或可获得自)在登录号NCIMB42607下保藏的种子，只要在菠菜植物中保留有赋予Pfs抗性的部分(即RPF14基因)。如前文所述，这种存在可通过表型和/或使用本领域已知的分子方法进行测试/选择。

还提供了一种生成菠菜植物的方法，所述菠菜植物包含对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的显性抗性，所述方法包括以下步骤：

a)将菠菜种的第一菠菜植物与第二菠菜植物杂交，所述第二菠菜植物对Pfs亚种8和10至16或17中的一种或多种是易感的，其中所述第一菠菜植物包含对Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，所述抗性由从新疆菠菜基因渗入的单一基因赋予，所述基因与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01的抗性供体核苷酸具有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤；

b)将从所述杂交子代生长的植物自交一次或多次，以产生下一代自交子代，和/或将从所述杂交子代生长的或从下一代自交子代生长的植物与对Pfs亚种8、10至16或17中的一种或多种易感的菠菜植物回交；和

c)在步骤b)的子代植物中鉴定包含步骤a)的第一亲本植物的单一基因的菠菜植物。

在一个方面，SNP_01(与RPF14基因连锁)的基因型用于在步骤c)中鉴定植物。SNP_01的核苷酸是腺嘌呤，即供体核苷酸。因此，在一个方面，植物包含含有供体SNP_01核苷酸的基因渗入片段。

由上述方法产生的植物也是本发明的实施方案。

此外，还提供了筛选、鉴定或检测菠菜植物或植物部分中存在本文所述的RPF14基因的方法，包括：

a)使用分子标记物测定法筛选栽培菠菜植物或植物部分或所述植物或植物部分的DNA，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：

i)SNP_01的抗性供体核苷酸，其具有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤；

ii)与RPF14基因或包含RPF14基因的基因渗入片段连锁的另一种标记物；和任选地

b)鉴定或选择包含SNP_01的抗性供体SNP核苷酸的植物或植物部分，所述抗性供体SNP核苷酸为SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤；和/或鉴定或选择包含与RPF14基因或包含RPF14基因的基因渗入片段连锁的另一种标记物的植物或植物部分。

在另一个方面，提供了检测栽培菠菜植物是否包含含有如本文所述的RPF14基因的基因渗入片段的方法，所述方法包括：

a)使用分子标记物测定法筛选植物或植物部分(或从所述植物或植物部分获得的DNA)，所述分子标记物测定法检测选自以下的至少一种SNP标记物：

i)SNP_01的抗性供体核苷酸，其含有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％，优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤；和/或

ii)与RPF14基因或包含RPF14基因的基因渗入片段连锁的另一种标记物。

此外，源自、获得自、可获得自或可源自上述任何一种方法或从上述任何一种方法鉴定或检测到的栽培菠菜植物或植物部分是本发明的实施方案，所述植物包含对由RPF14赋予的对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，或所述植物部分包含RPF14基因(或包含该基因的基因渗入片段，以及任选地与该基因连锁的标记物)。

本发明的植物可用于产生子代，所述子代具有或保留有本发明的Pfs抗性基因，该基因可获得自(存在于；可源自；获得自或源自)在NCIMB42607下保藏的种子。为产生子代，本发明的菠菜可自交，和/或可与另一菠菜植物杂交一次或多次，并收集种子。子代植物中RPF14基因的存在可通过Pfs抗性表型和/或分子方法如与RPF14基因或基因座连锁的分子标记物(例如SNP标记物)来测定(即可以鉴定/选择包含RPF14基因的子代植物)。

本发明还考虑RPF14基因(以及包含该基因的基因渗入片段)赋予对至少Pfs亚种8和10至16(优选地对至少8和10至17)的抗性，还任选对亚种1、2、6、7、9和分离株UA0514的抗性的用途。

在一个实施方案中，提供了菠菜植物或所述植物的子代(例如通过自交获得)，或可再生的细胞或细胞培养物，或可营养繁殖的植物部分，用于产生栽培菠菜植物的用途，所述栽培菠菜植物包含对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，还任选地对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，和/或任选地对分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性，其中所述植物的代表性种子已保藏在登录号NCIMB 42607下。

在另一个实施方案中，本发明考虑包含由可获得自登录号NCIMB42607下保藏的种子或其子代(例如通过自交获得)的基因渗入片段所赋予的对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性的菠菜植物用于产生栽培菠菜植物的用途，所述栽培菠菜植物包含至少对Pfs 8号和10至16号小种(优选对至少8号和10至17号小种)的抗性，还任选对Pfs1、2、6、7和9号小种中的一种或多种的抗性，和/或任选地对分离菌UA0514和/或其他Pfs分离菌的抗性的。

种子

本发明提供一种种子，本发明的任何植物都可从其生长。此外，本发明还提供了多粒这样的种子。由于RPF14抗性基因的存在，本发明的种子可通过表型(基于具有RPF14抗性表型的植物)和/或使用分子方法与其他种子区分开来。

在一个方面，将多粒种子包装到容器(例如袋、箱、罐等)中。容器可为任何尺寸的。种子可在包装前制粒(形成丸或球)和/或用各种化合物(包括种子涂层)处理。

在本发明的一个实施方案中，菠菜种子被引发。引发(priming)为一种在种子上进行的基于水的方法，以提高种子从土壤中萌芽和出苗的均一性，从而增强蔬菜可站立性(stand establishment)。引发减少了第一个幼苗和最后一个幼苗出苗之间的时间跨度。引发菠菜种子的方法是本领域众所周知的(见例如Chen et al.2010，Seed Sci.&Technol.38：45-57)。在另一个实施方案中，将菠菜种子用作物保护进行处理，或膜涂覆，或制粒。膜涂覆和作物保护处理通常结合在一起，见例如US20170127670。

植物部分和营养繁殖

在另一个方面，本文提供了获得自(可获得自)本发明植物的植物部分，以及包含所述植物部分的容器或包装。

在一个优选实施方案中，所述植物部分为本发明的菠菜植物的叶或多片叶，或叶的一部分，优选采收的叶。所述叶可为是松散的、成束的、新鲜的(例如在容器中，例如在袋子中)、冷冻的、漂过的(blanched)或煮过的。所述叶可为新鲜的或经加工的，并且它们可为食品或饲料产品的一部分。可在其发育的任何阶段采收叶，优选阶段是幼叶和成熟叶。

本发明植物的其他植物部分包括叶、叶的一部分、茎、茎的一部分、秆、秆的一部分、梢、梢的一部分、芽或芽的一部分、插条、根、根的一部分、根尖、叶柄、叶柄的一部分、子叶、子叶的一部分、花、花的一部分、花瓣、花瓣的一部分、雄蕊、雄蕊的一部分、花药、花药的一部分、花粉、柱头、柱头的一部分、花柱、花柱的一部分、子房、子房的一部分、胚珠、胚珠的一部分、种子、种子的一部分、种皮、胚、胚的一部分、胚轴、胚囊、果实、果实的一部分、细胞、原生质体、愈伤组织、小孢子、分生组织、形成层等。本发明包括各个发育阶段的上述植物部分。

种子包括例如自花授粉后在本发明植物上产生的种子或异花授粉后产生的种子，例如用另一菠菜植物的花粉授粉给本发明的植物或用本发明植物的花粉授粉给另一菠菜植物。

在一个方面，植物部分或种子可通过供体SNP核苷酸——SNP_01的抗性供体核苷酸的存在来鉴定，所述SNP_01的抗性供体核苷酸具有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在另一个方面，植物部分是植物细胞。在又一个方面，植物部分是不可再生的细胞或可再生的细胞。在另一个方面，植物细胞是体细胞。在一个方面，细胞是从其天然位置分离出来的。

不可再生的细胞为不能通过体外培养再生成整个植物的细胞。不可再生的细胞可在本发明的植物或植物部分(例如叶)中。不可再生的细胞可为种子中或所述种子的种皮中的细胞。成熟的植物器官(包括成熟的叶、成熟的茎或成熟的根)包括至少一个不可再生的细胞。将要成熟的(maturing)植物器官(如幼叶菠菜叶)也包括至少一个不可再生的细胞。

此外，还提供了本发明的菠菜植物的体外细胞培养物或组织培养物，其中所述细胞培养物或组织培养物源自上述植物部分，例如但不限于叶、叶的一部分、茎、茎的一部分、秆、秆的一部分、梢、梢的一部分、芽或芽的一部分、插条、根、根的一部分、根尖、叶柄、叶柄的一部分、子叶、子叶的一部分、花、花的一部分、花瓣、花瓣的一部分、雄蕊、雄蕊的一部分、花药、花药的一部分、花粉、柱头、柱头的一部分、花柱、花柱的一部分、子房、子房的一部分、胚珠、胚珠的一部分、种子、种子的一部分、种皮、胚、胚的一部分、胚轴、胚囊、果实、果实的一部分、细胞、原生质体、愈伤组织、小孢子、分生组织、形成层、体细胞、不可再生的细胞或可再生的细胞。

因此，在一个方面，提供了细胞培养物或组织培养物，其包含源自菠菜种的菠菜植物的部分的细胞或组织，所述菠菜植物包括对Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，其中所述抗性由从新疆菠菜渐渗的单一基因赋予，该基因与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01的抗性供体核苷酸包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在一个方面，所述细胞或组织可通过存在SNP_01的供体基因型来鉴定，所述SNP_01的供体基因型包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

还提供了一种从任何上述植物部分再生，或从上述细胞培养物或组织培养物再生的菠菜植物，所述再生植物具有Pfs抗性表型(由RPF14基因赋予)，即保留本发明的RPF14基因(或包含RPF14基因的基因渗入片段)。这种植物还可以称为本发明的植物的营养繁殖体。

还提供了采收的本发明植物的叶和包括本发明一种或多种植物的多片叶的包装。因此，这些叶包含本发明的RPF14基因，所述基因通过例如连锁的分子标记物或表型(用于最初使用的整个植物和/或再生植物)可检测到。在任何发育阶段都可采收叶。采收叶的优选发育阶段是成熟阶段和幼叶阶段。

本发明还提供了包括本文所述的植物部分或由本文所述的植物部分组成的食品或饲料产品。所述食品或饲料产品可为新鲜的或经加工的，例如罐装的、蒸的、煮的、炸的、漂过的和/或冷冻的等。实例为包括本发明植物的叶或叶的一部分的沙拉或沙拉混合物，或包装的冷冻菠菜。

保留有RPF14基因赋予的Pfs抗性表型的本发明的菠菜植物或其子代(所述基因任选地与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01的抗性供体核苷酸包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤)，和/或保留有包含RPF14基因和任选地所述SNP_01(或SEQ ID NO：1)的基因渗入片段或子片段(如NCIMB42607中存在的)的本发明的菠菜植物或其子代，以及上述植物的一部分，可适当包装运输和/或新鲜出售。所述部分包括从幼苗或植物中可获得的任何细胞、组织和器官，例如但不限于：叶、插条、花粉、叶的一部分等。

采收的叶可为未成熟的(如幼叶或幼菠菜)或成熟的。单个或多个植物或其部分可单独或与其他植物或材料一起装在容器(例如袋、箱、罐等)中。部分可储存和/或进一步加工。因此，还包括食品或饲料产品，其包含从本发明的植物中可获得的这种部分、这种叶或其部分，其子代和上述植物的部分中的一种或多种。例如，本文还提供了包括本发明植物的植物部分(新鲜和/或经加工的)的容器，如罐、盒、板条箱、袋、箱、气调包装、薄膜(例如可生物降解薄膜)等。

植物和子代

在另一个实施方案中，提供了本发明的菠菜植物及其部分，以及本发明的菠菜植物的子代，例如从种子生长的，通过有性繁殖或营养繁殖产生的，从上述植物部分再生的，或从细胞培养物或组织培养物再生的，其中所述繁殖的(种子繁殖的或再生的或营养繁殖的)植物包括对至少Pfs亚种8和10至16，优选至少对8和10至17的抗性(还任选地对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，和/或任选地对分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性(由任选地与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁的RPF14基因赋予，所述SNP_01的抗性供体核苷酸包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在一个方面，本发明的菠菜植物的子代植物为保留有与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁的RPF14抗性基因的子代植物，所述SNP_01的抗性供体核苷酸具有SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。

在另一个方面，子代植物为菠菜种的菠菜植物，其包括对Pfs亚种8和10至16(优选至少对8和10至17)的抗性，其中所述抗性由从新疆菠菜基因渗入的单一基因RPF14赋予，在一个方面，该基因与SNP_01的抗性供体核苷酸连锁，所述SNP_01的抗性供体核苷酸为SEQID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(A)或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的同等位置处的腺嘌呤。优选地，通过上述SNP_01供体核苷酸和/或另一种与RPF14或基因渗入片段连锁的标记物来鉴定RPF14的存在。

如前文所述，植物、子代或营养繁殖体是否包括RPF14基因赋予的Pfs抗性表型，可以使用以下方法进行表型测试：例如，使用如上文所述或在实施例中描述的Pfs抗病试验法；和/或使用分子技术，如分子标记物分析、DNA测序(例如全基因组测序以鉴定基因渗入)、染色体涂染等。

此外，本发明提供了包含或保留有Pfs抗性表型(由RPF14基因赋予)的子代，例如通过例如自交一次或多次，和/或将本发明的植物用另一种不同品种或育种系的菠菜植物或用本发明的菠菜植物异花授粉一次或多次而获得的子代。特别是，本发明提供了保留有NCIMB 42607中(发现的)RPF14基因(赋予Pfs抗性表型)的子代。在一个方面，本发明提供了包含RPF14抗性的子代植物，例如通过一种或多种选自以下的方法从包含RPF14抗性的菠菜植物产生的子代植物：自交、杂交、突变、双单倍体生产或转化。突变可为自发突变或人为诱导突变或体细胞克隆突变。在一个实施方案中，本发明的植物或种子还可发生突变(通过例如辐照、化学诱变、热处理、TILLING等)，和/或可选择突变的种子或植物(例如自然变体、体细胞克隆变体等)以改变植物的一个或多个特征。同样，本发明的植物可被转化和再生，从而将一个或多个嵌合基因引入到植物中。转化可使用标准方法进行，如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化或基因枪转化(biolistics)，然后选择转化的细胞并再生成植物。通过用赋予所需性状的转基因转化本发明的植物或其子代，可将所需性状(例如赋予害虫抗性或疾病抗性、除草剂耐受性、杀真菌剂耐受性或杀虫剂耐受性等的基因)引入植物或其子代，其中转化后的植物保留有RPF14基因和其赋予的Pfs抗性表型，并具有所需的性状。

在一个方面，本文包括本发明植物的单倍体植物和/或双单倍体植物，所述单倍体植物和/或双单倍体植物包括由RPF14基因或由包含RPF14基因的基因渗入片段赋予的对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，还任选地对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，和/或任选地对分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性。单倍体和双单倍体(DH)植物可例如通过花药或小孢子培养和再生成整个植物而生产。对于DH的生产，染色体加倍可用已知的方法诱导，如秋水仙碱处理等。因此，在一个方面，提供了一种包括所述的Pfs抗性表型的菠菜植物，其中该植物是双单倍体植物。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种生产菠菜种子的方法，包括将本发明的植物自交或与不同的菠菜植物杂交，并采收所得种子。在另一个实施方案中，本发明涉及根据该方法生产的种子和/或通过种植所述种子而生产的菠菜植物。因此，在生产菠菜种子时，本发明的植物可用作雄性和/或雌性亲本，因此由于RPF14基因的存在，从所述种子生长的植物包含对至少Pfs亚种8和10至16(优选对至少8和10至17)的抗性，还任选地对Pfs亚种1、2、6、7和9中的一种或多种的抗性，和/或任选地对分离株UA0514和/或其他Pfs分离株的抗性。

因此，在一个方面，提供了本发明的菠菜植物的子代，其中所述子代植物通过自交、杂交、突变、双单倍体生产或转化而产生，并且其中所述子代保留有本文所述的RPF14抗性基因(及其赋予的表型)，例如通过将在登录号NCIMB 42607下保藏的种子生长的菠菜植物与另一菠菜植物杂交可获得的。换句话说，在一个方面，存在于/发现于/源自(或可源自)NCIMB 42607中保藏的种子的抗性基因或基因座(或包含该基因或基因座的基因渗入片段)保留在子代植物中。

分子标记物还可用于帮助鉴定包含RPF14抗性基因或基因座的植物(或由此获得的植物部分或核酸)。例如，可开发一种或多种分子标记物，它们在遗传上物理上与RPF14抗性基因或基因座紧密连锁。这可通过将抗性菠菜植物(包含RPF14)与易感的菠菜植物杂交并从该杂交形成分离群(例如F2或回交群)而实现。然后，分离群可进行Pfs抗性表型分析，并使用例如分子标记物如SNP(单核苷酸多态性)、AFLP(扩增片段长度多态性；参见例如EP534858)或其他进行基因分型，通过软件分析，可鉴定在分离群中与Pfs抗性性状共分离的分子标记物，并可鉴定它们的顺序和与RPF14抗性基因或基因座的遗传距离(厘摩距离，cM)。通过对SpinachBase的BLAST分析，可确定3号染色体上的物理位置。如果鉴定出侧翼标记物(RPF14基因的任何一侧)，则可鉴定标记物之间RPF14定位的3号染色体的物理区域。

然后，与RPF14抗性基因座紧密连锁的分子标记物，例如5cM或更短距离处的标记物，可用于检测和/或选择包含或保留有包含RPF14抗性基因或基因座的基因渗入片段的植物(例如本发明的植物或本发明的植物的子代)或植物部分。在育种计划中，即在标记物辅助选择(MAS)中，所述紧密连锁的分子标记物可取代表型选择(或除表型选择之外还使用)。优选地，在MAS中使用连锁标记物。一个可用作标记物的序列为包含所述SNP_01的序列。更优选地，在MAS中使用侧翼标记物，即在RPF14基因或基因座的任一侧的一个标记物。

使用本文公开的SEQ ID NO：1和保藏的种子，技术人员还可使用本领域已知的方法来鉴定RPF14基因本身的序列。例如，对3号染色体区域进行测序，并将该序列与例如SpinachBase中的序列进行比较，可用于鉴定基因渗入片段上的开放阅读框，以鉴定RPF14基因本身。例如通过CRISPR-Cas9对RPF14基因的修饰，可用于证明该基因的功能。因此，技术人员还可产生包含RPF14基因诱导突变的植物(例如在启动子、蛋白质编码序列、其他调控序列中)。本文包括包含RPF14基因诱导突变的植物。

在一个方面，提供了筛选和任选地选择菠菜种子、植物或植物部分或来自所述种子、植物或植物部分的DNA中存在的一种或多种与RPF14基因连锁的标记物的方法。

在其他方面，使用一种或多种核酸探针、核酸引物或其组合可检测到RPF14基因。

因此，在一个方面，RPF14基因可通过一种或多种核酸探针检测到，使用严格的杂交条件将所述核酸探针杂交到由包含RPF14基因的植物或植物部分获得的基因组DNA。

例如，核酸探针可为DNA分子，所述DNA分子包含SEQ ID NO：1(或包含与SEQ IDNO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的第114位同等位置处的腺嘌呤)或其互补序列。在另一个方面，RPF14基因可通过一种或多种核酸引物检测到，该引物扩增了与RPF14基因连锁的基因组DNA。例如，所述引物可扩增包含上述SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性并在第114位的同等位置处有腺嘌呤的序列的核酸分子。合适的引物例如在SNP标记物上游70至100bp，和下游70至100bp，可选择来设计正向和反向引物，其扩增标记物。引物可用于例如SNP基因分型，例如在KASP-试验中用于检测SNP_01的SNP基因型。

能够鉴定植物或植物部分中目标性状(即RPF14基因或基因座)相对存在或不存在的任何其他类型的分子标记物和/或其他试验也可用于育种目的。

保藏信息

代表性数量的菠菜NCIMB 42607由Nunhems B.V.根据布达佩斯条约于2016年7月12日保藏在NCIMB有限公司，其地址为英国，阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克莱伯斯通区，弗格森大厦(Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，United Kingdom)(NCIMB)。在本申请未决期间，由美国专利局局长确定的有资格的人员可请求而获得所述保藏物。遵从37C.F.R.§1.808(b)，在专利授权时，保藏者针对保藏材料的公众可获得性而提出的所有限制均永久性地取消。所述保藏物将保存30年，或在最近一次请求之后5年的时间，或保存到专利的有效期，以较长时间为准，在此期间如果所述保藏物不能存活，都要将其替换。申请人不放弃任何本专利申请或植物品种保护法(PlantVariety Protection Act)(7USC 2321et seq.)所授予的任何权利。

本发明所描述的产品和方法的各种修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的，而不偏离本发明的范围和精神。虽然本发明已与具体的优选实施方案相关联，但应理解，所要求保护的本发明不应过度地限于所述具体的实施方案。事实上，对植物育种、化学、生物学、植物病理学或相关领域的技术人员来说是显而易见的对实施本发明的所述模式的各种修改意欲在以下权利要求的范围内。

本发明将在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅用于说明目的，并无意以任何方式限制本发明。

实施例

1-选择野生供体，并将野生供体的RPF14基因杂交到栽培菠菜

用菠菜粉霜霉菌亚种1至16和分离株UA0514对几种野生种质进行抗感染测试。发现新疆菠菜种质对至少Pfs亚种8和10至16具有抗性，并选择该种质。

选择的植物(抗性供体)与对Pfs没有任何已知的背景抗性的栽培菠菜植物杂交。测试子代植物对至少Pfs亚种8和10至16的Pfs抗性(如选择的植物(供体)所显示的抗性)，并选择抗性子代植物，并将其与所述栽培菠菜植物回交并自交几代，以产生包含纯合形式的基因渗入片段的株系。因此，来自新疆菠菜供体的抗性基因渗入到栽培菠菜植物中。由此获得的植物株系种子以NCIMB 42607保藏在NCIMB。

2-包含RPF14基因的栽培菠菜的Pfs抗性表型

借助于差异组(可获得自a.o.Naktuinbouw，The Netherlands)对粉霜霉菌感染的抗性进行测试。

在含有BVB基质(Euroveen，Grubbenvorst)的托盘中，将从NCIMB42607种子(包含RPF14基因)生长的菠菜植物与差异组和其他基因型的菠菜植物(用作校核物(check))一起种植，并用Agra-vermiculite(Pull，Rhenen)覆盖。每次测试至少10株来自一个基因型的植物，每株都进行一或两次重复测试。将托盘放置在光周期为12小时的12℃/15℃(日/夜)的气候室中。播种后14天，通过喷洒菠菜粉霜霉菌的致病亚种的孢子囊悬浮剂(2.5x10⁵/ml)接种植物。以这种方式检测致病亚种。接种植物用透明塑料材料在100％相对湿度下覆盖24h，在此期间后，将顶部的塑料去除，使相对湿度降低到80％。

在10天后，根据病原体在子叶和真叶上孢子形成的症状，将这些植物评估为“抗性”或“易感”，如Irish et al.(2007；Plant Dis.91：1392-1396)所描述的。认为显示孢子形成迹象的植物株系是‘易感的’。认为其中至少85％的株系个体没有表现出孢子形成的植物株系是‘抗性的’。对抗性植物重新接种，以评估最初认为是抗性的植物是否逃脱了感染，或者它们是否真正具有抗性。在第二次接种后10天，对这些植物再次进行评分。认为＜15％的植物归类为“易感的”的任何基因型(即超过85％的植物不表现出孢子形成)是抗性基因型。

发现新的抗性基因RPF14——以纯合形式存在于NCIMB 42607中——赋予对Pfs1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16和分离株UA0514的抗性。表2示出从NCIMB 42607种子(包含纯合RPF14)生长的菠菜植物对Pfs亚种1-16和分离株UA0514的抗性。

发现RPF11、RPF12或RPF13纯合型株系对Pfs亚种16不具有抗性。

表1中的易感和抗性差异品种用作校核物，其表现如根据表1中给出的标准所预期的(数据未显示)。

表2：RPF14的抗病性

图例：(-表示抗性；+表示易感；)

3-RPF14抗性性状向其他菠菜植物的基因渗入

在另一个实验中，从NCIMB 42607种子生长的菠菜植物(作为父本)与对待测亚种易感的不同的菠菜植物杂交。如实施例2所述，对F1群的植物进行对Pfs亚种8和10至16的Pfs抗性测试。观察到杂合F1植物保留有对Pfs亚种8和10至16的抗性，从而得出的结论是对这些亚种的抗性是显性的。在F2群中，对这些亚种的抗性以3(抗性)：1(易感)的比例分离。

4-开发与RPF14连锁的标记物并比对

通过将NCIMB 42607的菠菜植物(包含RPF14基因)与不具有RPF14抗性基因且不具有对Pfs的背景抗性的菠菜植物杂交，产生F2群。进行连锁定位，并鉴定出与RPF14基因连锁的单核苷酸多态性标记物(SNP)SNP_01，如表3所示。

表3：与RPF14基因连锁的SNP标记物

SEQ ID NO：1包含第114位核苷酸处的腺嘌呤，SEQ ID NO：2包含第114位核苷酸处的鸟嘌呤。如前文所述，轮回亲本是易感的。

筛选其他菠菜种质中SNP_01处的基因型，发现另一种易感株系，其包含SNP_01的易感核苷酸，但其不同之处在于其还包含SNP_01上游(5’)的六个额外的核苷酸(核苷酸‘GTTATT’)。包括的该序列为SEQ ID NO：3，并且其长度为219个核苷酸而不是213个核苷酸。由于这六个额外的核苷酸，SNP_01不位于SEQ ID NO：3中的第114位核苷酸处，而是位于第120位核苷酸处——其为SEQ ID NO：3中SNP_01的同等位置，从成对比对中可以看出(见图1：SNP_01粗体)。

SEQ ID NO：1和2还用于对(中国菠菜株系SP75的)SpinachBase基因组序列的BLAST分析。该分析表明，SEQ ID NO：1和2位于3号染色体上，从第607896位核苷酸开始至第607679位核苷酸结束，其中SNP_01在SP75中的第607778位核苷酸(该核苷酸处包含G)处。

在SpinachBase基因组序列与SEQ ID NO：1的成对比对中，这两个序列具有90％的序列同一性(使用Emboss程序‘Needle’成对比对，默认参数)(参见图2，SNP_01粗体)。同样明显的是，SpinachBase中的基因组序列确实包含在SEQ ID NO：3的易感菠菜株系中发现的六个额外的核苷酸。SEQ ID NO：3与SpinachBase中的基因组序列的成对比对显示出93.2％的序列同一性。这表明菠菜基因组存在变异。

图1和图2示出，SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(存在于新疆菠菜的基因渗入片段上)可在与SEQ ID NO：1不完全相同的序列、例如与SEQ ID NO：1包含至少90％的序列同一性的序列(通过SEQ ID NO：1与其他序列成对序列比对)中鉴定。在本文中，所述序列的核苷酸位置称为‘同等’于SEQ ID NO：1的第114位的核苷酸位置。

在SEQ ID NO：1中的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)，或在与SEQ ID NO：1包含至少90％序列同一性的序列中的同等核苷酸处的腺嘌呤，可用于选择包含RPF14所位于的基因渗入片段的植物和植物部分。

5-其他抗性基因标记物的测试

WO2015054339是一项专利申请，其记载了来自包含赋予对至少Pfs亚种7、10、11、12、13和14的抗性的数量性状基因座(QTL)的粉防己菠菜的基因渗入。该申请还公开了粉防己菠菜侧翼序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，其位于WO2015054339中记载的粉防己菠菜供体中的QTL侧翼，即它们位于赋予对至少Pfs亚种7、10、11、12、13和14的抗性的所述粉防己菠菜基因的侧翼。WO2015054339的SEQ ID NO：1，以下称为“粉防己菠菜左侧翼标记物”，作为SEQ ID NO：4加入到本申请中；WO2015054339的SEQ ID NO：2，以下称为“粉防己菠菜右侧翼标记物”，作为SEQ ID NO：5加入到本申请中。

测试由本发明人保藏的植物株系是否存在所述粉防己菠菜左侧翼标记物和粉防己菠菜右侧翼标记物。针对专利中描述的两个侧翼序列区域中的每一个，设计了两个引物对，扩增了由NCIMB 42607生长的菠菜植物的DNA中的相应区域。使用JCeasar，通过计算机模拟(in silicio)共排序并检查8个PCR引物，以产生在该区域内的PCR片段。

使用用于粉防己菠菜左侧翼标记物的引物对组合，对NCIMB 42607种子生长的菠菜植物的DNA进行PCR。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上验证了预期的片段长度。这些片段具有预期的大小，并进行了测序。在Sequencher中，材料的测序片段被比对成两个侧翼序列区域中的每个区域的重叠群(contig)。基于这些重叠群，从NCIMB 42607种子生长的菠菜植物不包含粉防己菠菜左侧翼标记物。相反，发现NCIMB 42607种子和从其生长的植物具有另一个序列(菠菜序列)，该序列作为SEQ ID NO：6加入到本申请中。两个序列之间的比对如图3所示。明显地，在保藏的种子中不存在粉防己菠菜左侧翼序列。

使用用于粉防己菠菜右侧翼标记物的引物对组合，对从NCIMB42607种子生长的菠菜植物的DNA进行了第二次PCR。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上验证了预期的片段长度。片段具有预期的大小，并进行了测序。在Sequencher中，材料的测序片段被比对成两个侧翼序列区域中的每个区域的重叠群。基于这些重叠群，从NCIMB 42607种子生长的菠菜植物不包含粉防己菠菜右侧翼标记物。相反，再次发现NCIMB 42607种子和从它生长的植物具有另一个序列，该序列作为SEQ ID NO：7(菠菜)加入到本申请中。两个序列之间的比对如图4所示。明显地，在保藏的种子中不存在粉防己菠菜右侧翼序列。请示出所比对的及如何比对。

因此，NCIMB 42607中既不存在粉防己菠菜左侧翼标记物也不存在粉防己菠菜右侧翼标记物。NCIMB 42607在染色体区域中包含菠菜序列SEQ ID NO：6和7。显然，本发明的其他栽培菠菜株系或品种可在其基因组中包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7，或与SEQID NO：6或7具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。

有趣的是，当使用这些序列在SpinachBase进行BLAST分析时，所述序列似乎位于3号染色体上，而不是本专利申请中提及的6号染色体上。

因此，粉防己菠菜QTL似乎位于3号染色体的0.7Mb和1.41Mb之间。

6-RPF14的精细定位

将通过将从NCIMB 42607种子(包含RPF14基因)生长的菠菜植物与不包含RPF14抗性基因且不包括对Pfs的背景抗性的菠菜植物杂交来产生进一步的分离群。此外，还将其他SNP加到发现RPF14的染色体区域。进行进一步的定位，产生更多的与RPF14基因连锁的单核苷酸多态性标记物(SNP)。

参考文献

Correll et al.2011，Eur J Plant Pathol 129：193-205

Correll et al.2010，"Guidelines for Spinach Downy Mildew：Peronsporaferinosa f.sp.spinaciae(Pfs)"found on the website of the ISF

Smith，P.G.and M.B.Zahara.1956.New spinach immune tomildew.Calif.Agr.10：15.

Smith，P.G.，R.E.Webb，and C.H.Luhn.1962.Immunity to race 2of spinachdowny mildew.Phytopathology 52：597-599.

Smith，P.G.，R.E.Webb，A.M.Millett，and C.H.Luhn.1961.Downy mildew onspinach.Calif.Agr.15：5.

Brandenberger et al.(1992)HORTSCIENCE 27(20)：1118-1119.

Plantum press release，Denomination of Pfs：16，a new race of downymildew in spinach March 15 2016

International Seed Federation Guidelines for Spinach Downy MildewPeronospora farinosa f.sp.spinaciae(Pfs)Jim Correll，Lindsey du Toit，StevenKoike，and Kees van Ettekoven，dec 2015；http://www.worldseed.org/isf/differential_hosts.html

Xu，C.et al.(2017，Nat.Commun.8，15275doi：10.1038/ncomms15275)“Draftgenome of spinach and transcriptome diversity of 120 Spinacia accessions”(2017)

序列表

<110> 纽海姆有限公司

<120> 对至少粉霜霉菌亚种8和10至16具有抗性的菠菜植物

<130> 181984WO01

<150> EP18153715.0

<151> 2018-01-26

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 213

<212> DNA

<213> 新疆菠菜（Spinacia turkestanica）

<400> 1

gctcgtatha cttagggcth gagchygaay ctccatcacc aacaagggca ggcaacgatc 60

tcgaaagatt attcaaatyg taaaahgaag cataattcgc attattatta ttcaacattc 120

tcaatytatc ataattagac sggcgtatgc caccataccc gtgtytaaac ccatggatcg 180

accattgata accgggttta tgaatcattg aat 213

<210> 2

<211> 213

<212> DNA

<213> 菠菜（Spinacia oleracea）

<400> 2

gctcgtatha cttagggcth gagchygaay ctccatcacc aacaagggca ggcaacgatc 60

tcgaaagatt attcaaatyg taaaahgaag cataattcgc attattatta ttcgacattc 120

tcaatytatc ataattagac sggcgtatgc caccataccc gtgtytaaac ccatggatcg 180

accattgata accgggttta tgaatcattg aat 213

<210> 3

<211> 219

<212> DNA

<213> 菠菜（Spinacia oleracea）

<400> 3

gctcgtatha cttagggcth gagchygaay ctccatcacc aacaagggca ggcaacgatc 60

tcgaaagatt attcaaatyg taaaahgaag cataattcgc gttattatta ttattattcg 120

acattctcaa tytatcataa ttagacsggc gtatgccacc atacccgtgt ytaaacccat 180

ggatcgacca ttgataaccg ggtttatgaa tcattgaat 219

<210> 4

<211> 148

<212> DNA

<213> 粉防己菠菜（Spinacia tetrandra）

<400> 4

gcaaatagat gtgaaataac tttttacata tgcaaatata ttggaaatag cgaattatat 60

atataatatg gtttacatag gtttcgacag agggcttact cgtatttatt tgaataatat 120

gtcatatttg acgagaataa gaatgact 148

<210> 5

<211> 148

<212> DNA

<213> 粉防己菠菜（Spinacia tetrandra）

<400> 5

gctgctgcat catagggtga tagttccttc ctttttcctt tatcattggt agatcgtttg 60

gcaaaagcct gtggcaccaa tacaacaaaa ggttaagata aatttgtttg ctatgaccat 120

attctaatca aaagaacata gcaacata 148

<210> 6

<211> 299

<212> DNA

<213> 菠菜（Spinacia oleracea）

<400> 6

ggaagaacat tagtactagc ttaattgaat attccataac tttttatttt tgcttaatta 60

gattgtggtt tgaagctatg caaatagatg tgaaataact ttttattttt gcttaattag 120

attgtggttt gaagctatgc aaatagatgt gaaatagcga atatatatta tataatatgg 180

tttacataga tttcgacaga ggggttactc gtatttgttt gaataatatt tcatatttga 240

tgaaaaatag ggattactta atcttaaaat agcatttatg ctttactcta agggtgtta 299

<210> 7

<211> 237

<212> DNA

<213> 菠菜（Spinacia oleracea）

<400> 7

gcaacggcaa gctctcgaag ggcacgtagg gccttagatc tgcgaataag gtaagccctg 60

aaggtccact ggatcaaagc tgctgcatca tagggtgata gttccttcct ttttccttta 120

tcattggtag atcttttggc aaaagcctgt atggcaccaa tacaacaaaa ggttaagata 180

aatttgtttg ctatgaccat attctaatca aaagaacata gcaacatatt caagggg 237

<210> 8

<211> 218

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 图2的Spinachbase序列

<400> 8

gctcgtatta tttagggttt gagctgaatc tccatcacca ataagggcag gcaatgatct 60

cgaaagatta ttcaaattgt aaaatgaagc ataattcgcg ttattattat tattattcga 120

cattctcaat ttatcataat tagacgggcg tattccacca tacccgtgtc taaacccatg 180

gatcgaccat tgataaccgg gtttatgaat cattgaat 218

PCT/RO/134表

Claims (19)

1.一种菠菜种的菠菜植物，其包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段，其中所述基因渗入片段包含单一基因，当所述基因为纯合形式时，其赋予至少对粉霜霉菌亚种8至16的抗性，并且所述基因与包含第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)的SEQ ID NO：1连锁，或与和SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性并包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸的同等核苷酸位置处的腺嘌呤的序列连锁。

2.根据权利要求1所述的植物，其中当所述单一基因为纯合形式时，该基因赋予对至少粉霜霉菌亚种1、2和6至17的抗性。

3.根据权利要求1或2所述的植物，其中所述抗性基因不赋予对粉霜霉菌亚种3、4和5的抗性。

4.根据前述权利要求中任一项所述的植物，其中所述抗性基因为已在登录号NCIMB42607下保藏的菠菜种子或其子代中发现的基因。

5.根据前述权利要求中任一项所述的植物，其中所述供体是新疆菠菜种。

6.根据权利要求5所述的植物，其中所述基因渗入片段为已在登录号NCIMB 42607下保藏的菠菜种子中发现的片段，或保留有所述抗性基因且保留有SEQ ID NO：1的所述基因渗入片段的子片段。

7.根据前述权利要求中任一项所述的植物，其中所述抗性基因可通过将在登录号NCIMB 42607下保藏的种子生长的菠菜植物与另一菠菜植物杂交而获得。

8.根据前述权利要求中任一项所述的植物，其中所述菠菜植物为杂种植物，并且所述杂种植物包含杂合形式或纯合形式的所述抗性基因，或其中所述菠菜植物为包含纯合形式的所述抗性基因的近交植物或雄性亲本系或雌性亲本系。

9.根据前述权利要求中任一项所述的植物，其中所述菠菜植物选自：皱叶、半皱叶、扁平叶或光滑叶或东方菠菜。

10.种子，可从其生长成根据前述权利要求中任一项所述的植物。

11.根据权利要求1至9所述的菠菜植物的子代植物，其中所述子代植物保留有抗性基因并保留有SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQID NO：1具有至少90％序列同一性的序列中的同等位置处的腺嘌呤。

12.根据权利要求11所述的子代植物，其中所述子代植物由选自以下的一种或多种方法产生：自交、杂交、双单倍体生产或转化。

13.在登录号NCIMB 42607下保藏的种子或其子代或根据权利要求1-9或11-12所述的植物用于产生包含对至少粉霜霉菌亚种8和10至16的抗性的菠菜植物的用途。

14.根据权利要求1至9中任一项所述的菠菜植物的部分或根据权利要求11至12中任一项所述的子代植物的部分，其中所述部分选自：叶、叶的一部分、茎、茎的一部分、秆、秆的一部分、梢、梢的一部分、芽或芽的一部分、插条、根、根的一部分、根尖、叶柄、叶柄的一部分、子叶、子叶的一部分、花、花的一部分、花瓣、花瓣的一部分、雄蕊、雄蕊的一部分、花药、花药的一部分、花粉、柱头、柱头的一部分、花柱、花柱的一部分、子房、子房的一部分、胚珠、胚珠的一部分、种子、种子的一部分、种皮、胚、胚的一部分、胚轴、胚囊、果实、果实的一部分、细胞、原生质体、愈伤组织、小孢子、分生组织、形成层，其中所述植物部分保留有所述抗性基因，当所述基因为纯合形式时，赋予对至少粉霜霉菌亚种8至16的抗性，并保留有SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的序列中的同等位置处的腺嘌呤。

15.一种细胞培养物或组织培养物，其包含根据权利要求1-9中任一项所述的菠菜植物或根据权利要求11-12中任一项所述的子代植物或来自权利要求14中的任一个植物部分的至少一个细胞或组织，其中所述细胞培养物或组织培养物保留有所述抗性基因，当所述基因为纯合形式时，赋予对至少粉霜霉菌亚种8至16的抗性，并且还保留有SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的序列中的同等位置处的腺嘌呤。

16.从权利要求15所述的细胞培养物或组织培养物中再生的菠菜植物，其中所述植物保留有所述抗性基因，当所述基因为纯合形式时，赋予对至少粉霜霉菌亚种8至16的抗性，并且还保留有SNP_01，所述SNP_01包含SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤，或与SEQID NO：1具有至少90％序列同一性的序列中的同等位置处的腺嘌呤。

17.一种鉴定或选择包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段的菠菜植物的方法，其中所述基因渗入片段包含单一基因，当所述基因为纯合形式时，赋予对至少粉霜霉菌亚种8至16的抗性，所述方法包括：

确定存在SEQ ID NO：1的第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)，或与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的序列中与SEQ ID NO：1的第114位核苷酸同等的核苷酸位置处的腺嘌呤。

18.一种包含来自菠菜野生近缘种供体的基因渗入片段的栽培菠菜植物的细胞，其中所述基因渗入片段包含单一基因，当所述基因为纯合形式时，其赋予对至少粉霜霉菌亚种8至16的抗性，并且所述基因与包含第114位核苷酸处的腺嘌呤(SNP_01)的SEQ ID NO：1连锁，或与和SEQ ID NO：1具有至少90％的序列同一性并包含与SEQ ID NO：1的第114位核苷酸同等的核苷酸位置处的腺嘌呤的序列连锁。

19.SEQ ID NO：1的SNP_01或与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的序列的SNP_01用于鉴定菠菜植物或植物部分的用途。

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