KR20190037609A

KR20190037609A - 엽록체 유전체와 45ＳｎｒＤＮＡ 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190037609A
Application number: KR1020170127143A
Authority: KR
Inventors: 김태호; 윤웅한; 김창국; 이근표; 천경성; 배선화; 이예지
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2019-04-08
Also published as: KR102026758B1

Abstract

본 발명은 들깨 종(Perilla species)의 엽록체 게놈(genome) 및 45S nrDNA(45S nuclear ribosomal DNA) 염기서열 정보를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커, 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 들깨 종의 엽록체 게놈 및 45S nrDNA 염기서열 정보를 기반으로 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별 방법, 및 들깨 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 들깨 종의 엽록체 유전체와 45S nrDNA 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 상용되고 있는 들깨 품종의 기원 및 품종의 순도 검정에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

엽록체 유전체와 45ＳｎｒＤＮＡ 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커 및 이의 용도{Molecular marker for identifying Perilla cultivars and Perilla wild species based on the information of chloroplast genomes and 45S nrDNAs sequence and uses thereof}

본 발명은 들깨 종(Perilla species)의 엽록체 게놈(genome) 및 45S nrDNA(45S nuclear ribosomal DNA) 염기서열 정보를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커, 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는 들깨 종의 엽록체 게놈 및 45S nrDNA 염기서열 정보를 기반으로 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별 방법, 및 들깨 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.

들깨(Perilla)는 한국, 중국, 일본 등이 포함된 동아시아에서 널리 재배되는 꿀풀과(Lamiaceae) 식물이며, 박하향을 내는 계통(mint family)에 속한다. 들깨는 우울증, 불안, 종양, 기침, 박테리아 및 곰팡이 감염, 알레르기, 중독 및 장 질환과 같은 다양한 조건을 치료하는 전통 식물 약제(herbal medicine)로 사용하고 있다(J. Sci . Food Agric ., 80:1063-1072, 2000; J. Argic . Food Chem ., 45:304-309, 1997). 가공하지 않은 잎은 조미료와 향미료(flavoring agents)로 사용되며, 종자는 오메가-3 지방산과 알파-리놀렌산(alpha-linolenic acid, ALA)이 풍부한 오일(oil)을 함유하고 있다. 재배종(cultivated species)인 Perilla frutescens Britt.는 2n=4×=40의 염색체 수를 갖는 이질4배체(allotetraploid) 식물이다. 반면에 야생종(wild species) P. citriodora, P. hirtella 및 P. setoyensis 3종은 2n=2×=20 염색체 수를 갖는다(J. Phytogeogr . Taxon., 44:43-52, 1996; Nat. Med ., 48:185-190, 1994). 재배종 및 야생종은 모용(trichomes)의 특성에 따라 구별될 수 있다. 재배종의 모용은 희소하게 분포하고 직선이며 긴 특성을 지니는 반면, 야생종의 모용은 밀도가 높고 비뚤어지며 짧은 특성을 지닌다.

시아노박테리아(cyanobacteria)에서 내부공생(endosymbiosis)을 통해 유래된 엽록체 게놈(chloroplast(cp) genome)은 진화 및 계통 발생 연구, DNA 바코드(DNA barcoding) 및 집단 수준의 유전적 다양성 분석에 널리 사용된다(Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A ., 104:19369-19374, 2007; PLoS One., 6:e19254, 2011; Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A ., 92:7759-7763, 1995). 엽록체 게놈은 진화론적으로 보존된 광합성 과정과의 연관성 때문에 식물 종 내에서 고도로 보존되어 있다. 따라서, 종 내(intra-species) 다형성(polymorphisms)은 드물지만, 종간(inter-species) 다형성은 유전자 내 또는 유전자 간 영역에서 공통적으로 존재한다. 45S 핵 리보솜 DNA(45S nuclear ribosomal DNA, 45S nrDNA)의 번역 영역(coding regions)은 고도로 보존되어 있으며, 종 내에서는 염기서열 치환이나 돌연변이율(mutation rate)이낮아, 동일 종의 구성원 간의 계통 발생 관계를 밝히기 위해 사용하는데 한계가 있다(Genes Genet. Syst., 79:105-118, 2004; J. Med . Coll . PLA ., 13:123-128, 1998; Biochemistry., 15:505-508, 1976). 대조적으로, 내부 전사 공간(internal transcribed spacer, ITS) 영역은 삽입, 결실 및 점 돌연변이로 인해 종 간 변이가 상대적으로 높다. 그러므로, 거의 예외 없이, ITS 서열 분석은 동일한 종 내 구성원들 사이에서도 계통발생 관계를 재구성하는데 적합하다. 따라서 엽록체 게놈과 45S nrDNA 서열은 유전적 관계를 명확히 하고, 종 내 및 종 간 표본 사이의 유전적 다양성을 조사하는데 중요한 유전 형질(genetic material)이다. 공공 염기서열 DB인 NCBI 데이터베이스는 다양한 생물체로부터 유래 된 완전 엽록체(complete chloroplast) 게놈 및 45S nrDNA 서열의 일차 정보원(primary resource)이나, 이 데이터베이스 내의 많은 염기서열(sequence)은 한 종에서 나온 하나의 대표적인 서열이므로, 한 종 내의 여러 개체(multiple accession)로부터 얻은 완전 엽록체 또는 nrDNA 서열을 사용하여 비교 분석을 수행하는 것은 어렵다. 이 때문에, 완전 엽록체, 45S nrDNA 또는 둘 다를 사용하여서 양파(Allium cepa), 사과(Malus domestica), 인삼(Panax ginseng)과 같은 식물의 종 내 수준에서만 약간의 유전적 다양성 연구가 수행된 실정이다(Mol . Cells., 21:411-417, 2006; Mol . Biol . Evol ., 30:1751-1760, 2013; PLoS One., 10:e0117159, 2015). 들깨 속(Perilla genus)의 다양성 연구에서, 들깨 종간을 구별하기 위해 RFLP(restriction fragment length polymorphism)와 SCAR(sequence characterized amplified region) 마커(marker)가 사용되었다(J. of Life Science., 20:119-123, 2010; Kor . J. Breed. Sci ., 43:197-204, 2011). 그러므로, 들깨의 유전 연구에 대한 잠재적 활용성이나 의약품 및 식품으로서의 원천임에도 불구하고, 들깨 속의 종 내 서열 변이에 대한 지식은 제한적이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 엽록체 유전체와 45S nrDNA 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 판별 분자 마커를 개발하기 위하여, 차세대염기서열분석법(NGS; Next Generation Sequencing)을 활용하여 3종의 들깨 야생종과 6종의 들깨 재배종의 엽록체 게놈과 45S nrDNA 염기서열을 완성하고, 상기 완성된 들깨 엽록체 게놈과 45S nrDNA 염기서열에 대한 비교 분석을 실시하였으며, 이를 토대로 한 염기서열을 활용하여 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

J. Sci. Food Agric., 80:1063-1072, 2000 J. Argic. Food Chem., 45:304-309, 1997 J. Phytogeogr. Taxon., 44:43-52, 1996 Nat. Med., 48:185-190, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104:19369-19374, 2007 PLoS One., 6:e19254, 2011 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:7759-7763, 1995 Genes Genet. Syst., 79:105-118, 2004 J. Med. Coll. PLA., 13:123-128, 1998 Biochemistry., 15:505-508, 1976 Mol. Cells., 21:411-417, 2006 Mol. Biol. Evol., 30:1751-1760, 2013 PLoS One., 10:e0117159, 2015 J. of Life Science., 20:119-123, 2010 Kor. J. Breed. Sci., 43:197-204, 2011

본 발명의 목적은 들깨 종의 엽록체 게놈 및 45S nrDNA 염기서열 정보를 기반으로 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별 방법, 및 들깨 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;

서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;

서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;

서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및

서열번호 25의 염기서열 내에서 149번째 내지 176번째 염기에 위치한 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 30-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 들깨 배수체간 품종 판별용 키트를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 들깨 배수체간 품종 판별 방법을 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 또는 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 들깨 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;을 증폭시킬 수 있는, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 들깨 배수체간 품종 판별용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별 방법, 및 상기 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 들깨 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 2배체 들깨 야생종 품종 판별 방법, 및 상기 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에 따른, 들깨 종의 엽록체 유전체와 45S nrDNA 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트를 이용하여 상용되고 있는 들깨 품종의 기원 및 품종의 순도 검정에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 들깨 품종 판별 마커 개발에 사용한 3종의 2배체 야생종(wild species) 들깨 및 6종의 4배체 들깨 재배종(cultivars)을 나타낸 사진이다. 여기에서, (A) 내지 (C)는 야생종 들깨로, (A)는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), (B)는 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis), (C)는 페릴라 히르텔라(P. hirtella)이다. (D) 내지 (I)는 재배종 들깨로, (D)는 차조기(Chajogi, CH), (E)는 앞푸른차조기(Apureunchajogi, AC), (F)는 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi, PJC), (G)는 주름차조기(Jureumchajogi, JC), (H)는 들깨(Deulkkae, DK), (I)는 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)이다.
도 2는 본 발명의 들깨 품종 9종의 엽록체 게놈 지도이다. 여기에서, 원 안쪽에 표시된 유전자들은 시계 방향(clockwise)으로 전사되는 유전자를 나타낸 것이고, 원 바깥쪽에 표시된 유전자들은 반시계 방향(counter-clockwise)으로 전사되는 유전자를 나타낸 것이다. 다른 기능적 그룹에 속하는 유전자는 서로 다른 색으로 구분하였으며, 진한 회색 링(ring)은 GC 함량을, 연한 회색 링은 AT 함량을 의미한다.
도 3은 본 발명의 들깨 종의 완전(complete) 45S nrDNA 서열 단위 조립을 나타낸 도이다. 구체적으로, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 완성된 45S nrDNA 단위(unit)는 18S rRNA(18S ribosomal RNA), ITS 1(internal transcribed spacer 1), 5.8S rRNA(5.8S ribosomal RNA), ITS 2(internal transcribed spacer 2), 26S rRNA(26S ribosomal RNA) 및 유전자 간 스페이서 영역(intergenic spacer region)으로 구성되어 있다. 여기에서, 파란색 음영은 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 45S nrDNA 서열에 대한 비가공(raw) 판독(read)의 매핑 깊이(mapping depth)를 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4c는 mVISTA 프로그램을 사용하여 9종의 들깨 종의 엽록체 게놈을 비교하여 나타낸 도이다. 여기에서, 9종의 들깨 종의 순서는 위에서 아래로 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 차조기(Chajogi, CH), 앞푸른차조기(Apureunchajogi, AC), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi, PJC), 주름차조기(Jureumchajogi, JC), 들깨(Deulkkae, DK), 푸른차조기(Pureunchajogi, PC), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 순이며, 푸른색은 보존된 유전자를, 청록색은 tRNA 및 rRNA를, 적색은 유전자 간 영역(intergenic region)을, 흰색은 변이 영역(variation region)을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라, 주석 처리된 다양한 유전자에 대한 SNP 수와 비동의 SNP(non-synonymous SNPs, nsSNPs) 대비 동의 SNP(synonymous SNPs, sySNPs)의 빈도(frequency)를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 9종의 들깨 종의 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 및 InDel 다형성 부위(polymorphic sites)를 이용한, 2배체 및 4배체 배수체간 들깨 종을 판별한 PCR 전기영동 분석 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따라 (A)는 엽록체 ndhF 유전자 내 SNP에 대해 제한효소 SacⅡ를 포함하는 CAPS-1 프라이머 세트를 이용하여 9종의 들깨 종을 판별한 결과, (B)는 엽록체 ycf1 유전자 내 SNP에 대해 제한효소 VspI을 포함하는 CAPS-2 프라이머 세트를 이용하여 9종의 들깨 종을 판별한 결과, (C)는 엽록체 ycf2 유전자 내 SNP에 대해 제한효소 AluI을 포함하는 CAPS-3 프라이머 세트를 이용하여 9종의 들깨 종을 판별한 결과, (D)는 45S nrDNA ITS 1 염기서열 내 SNP에 대해 제한효소 BsmAI을 포함하는 CAPS-4 프라이머 세트를 이용하여 9종의 들깨 종을 판별한 결과, (E)는 엽록체 trnKUUU - maK 유전자 사이의 InDel 영역에 대해 InDel-1 프라이머 세트를 이용하여 9종의 들깨 종을 판별한 결과를 나타낸 도이다. 여기에서, M은 100-bp 마커를, CH는 차조기(Chajogi)를, AC는 앞푸른차조기(Apureunchajogi)를, PJC는 푸른주름차조기(PureunJureumchajogi)를, JC는 주름차조기(Jureumchajogi)를, DK는 들깨(Deulkkae)를, PC는 푸른차조기(Pureunchajogi)를 나타낸 것이고, N은 음성 대조군(negative control)으로 주형(gDNA) 대신 증류수로 PCR하여 그 산물을 로딩(loading)한 것이며, 화살표는 300 bp를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 9종의 들깨 종과 꿀풀과(Lamiaceae family)의 대표 종들의 엽록체 게놈의 계통 분석을 나타낸 도이다. 여기에서, 올리브(Olea europaea) 엽록체 게놈은 대조그룹(outgroup)으로 사용하였다. 괄호는 GenBank accession number를 기재한 것이고, 내부 노드(internal node)에 있는 숫자는 부트스트랩 값(bootstrap value)을 나타낸 것이다. 한편, Salvia mitiorrhiza, Lavandula angustifolia, Stenogyne kanehoana, Haplostachts haplostachya, Scutellaria insignis, 및 Premna microphylla 6종은 꿀풀과의 참고용 식물로 사용하였다.
도 8a 내지 도 8e는 본 발명의 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 및 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 서열정보를 나타낸 도이다.

본 발명은 들깨 종(Perilla species)의 엽록체 게놈(genome) 및 45S nrDNA(45S nuclear ribosomal DNA) 염기서열 정보를 기반으로 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 들깨 배수체간 품종 판별 방법, 및 들깨 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 25의 염기서열 내에서 149번째 내지 176번째 염기에 위치한 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 30-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미하며, 상기 서열번호 13 내지 24는 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 폴리뉴클레오타이드이다.

상기 서열번호 13 내지 24는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열로, 상기 "다형성 서열(polymorphic sequence)"이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른, 상기 SNP 다형성 염기 정보는 도 8a 내지 도 8d에 나타내었다.

본 발명에서 3종의 들깨 야생종 및 6종의 들깨 재배종의 배수체간 SNP 정보는 상기 9종의 들깨 종의 완전서열 정보를 이용한 비교이기 때문에 다형성 위치 정보는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)(GenBank No. KT220690 및 KT220699)의 위치 정보에 준하여 표 5 및 표 8에 표시하였다.

본 발명의 일실시예에 따른, 상기 SNP 위치 염기는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 엽록체 서열을 기준으로 서열번호 13, 14 및 15의 경우 110,180번째 위치(ndhF 유전자 영역), 서열번호 16, 17 및 18의 경우 123,676번째(ycf1 유전자 영역), 서열번호 19 및 20의 경우 146,157번째(ycf2 유전자 영역) 위치이다. 또한, 서열번호 21, 22, 23 및 24에 표시된 상기 SNP 위치 염기는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 45S nrDNA 서열을 기준으로 1,915번째(ITS1 영역) 위치이다.

구체적으로, 110,180번째 SNP 부위의 염기가 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)는 G인 반면, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 및 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)는 T이다.

123,676번째 SNP 부위의 염기가 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 히르텔라(P. hirtella)는 A인 반면, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 및 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis), 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)는 G이다.

146,157번째 SNP 부위의 염기가 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)는 G인 반면, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella), 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)는 A이다.

1,915번째 SNP 부위의 염기가 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)는 T인 반면, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella), 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)는 G이다.

본 발명에서 용어 "InDel(insertion/deletion) 다형성"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열 중에 일부가 중간에 삽입(insertion)되거나 결실(deletion)된 것을 의미하며, 상기 서열번호 25는 삽입(insertion) 또는 결실(deletion) 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 폴리뉴클레오타이드이다.

상기 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 서열번호 25는 폴리뉴클레오타이드 서열 중에 일부가 중간에 더해지거나 없어져 품종 또는 종간에 길이 차이가 생긴 경우를 포함하는 서열이다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른, 상기 InDel 다형성 염기 정보는 도 8e에 나타내었다.

상기 InDel(insertion/deletion) 다형성을 보이는 InDel 마커 부위는 표준유전체인 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)(GenBank No. KT220690)와 실험에 사용된 나머지 8종의 들깨 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작할 수 있다. 이에 따라, 그 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드 크기가 큰 경우(tandem repeat 염기서열이 2 카피(copy)인 경우)와 작은 경우(tandem repeat 염기서열이 1 카피(copy)인 경우)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른, 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 상기 InDel 마커 부위의 서열 내에 적색으로 표시된 부분에서 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)는 엽록체 유전체의 trnKUUU 유전자와 matK 유전자 사이에 위치하는 27bp 크기의 직렬 반복(tandem repeats) 서열, TTCAGAATAGAAATAGGGGAGATCCCA가 2개(2 copy) 존재하는 반면, 상기 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)을 제외한 나머지 7종의 들깨 품종은 상기 직렬 반복 서열이 1개(copy)만 존재, 즉, 서열번호 25의 염기서열 내의 149번째 내지 176번째 염기에 위치한 TTCAGAATAGAAATAGGGGAGATCCCA가 결실되어 있다(표 7 및 도 8e).

본 발명에서 용어 "배수체(polyploidy)"란 2쌍 이상의 유전체가 있는 개체를 의미하며, 체세포는 통상 이배체(2n로 나타냄)이지만 유전체가 중복하여 3배체(3n), 4배체(4n) 등으로 되는 경우가 있다. 유전체의 중복은 자연에서도 일어나지만, 콜히친 등의 약품 처리 또는 온도 처리 등의 물리적 자극에 의해서도 고빈도로 일어나는 것으로 알려져 있다. 동일유전체를 중복하여 포함하는 개체를 동질배수체, 다른 유전체를 포함하는 경우를 이질배수체라고 한다.

본 발명에 따른 2배체 들깨 품종은 2배의 들깨 염색체수를 갖는 들깨 야생종(2n)으로, 이에 제한되지는 않으나, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 4배체 들깨 품종은 4배의 들깨 염색체수를 갖는 들깨 재배종(4n)으로, 이에 제한되지는 않으나, 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 들깨 배수체간 판별, 즉, 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종을 판별할 수 있다. PCR 조건, 정방향 및 역방향 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

상기 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트는 상기 3종의 2배체 들깨 야생종 품종 및 6종의 4배체 들깨 재배종 품종 중, 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 150 bp 및 109 bp일 수 있다. 또한, 상기 2종의 들깨 야생종 품종을 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 259 bp일 수 있다(도 6의 A).

또한, 상기 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트는 페릴라 히르텔라(P. hirtella)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 128 bp 및 99 bp일 수 있다. 상기 페릴라 히르텔라(P. hirtella)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 227 bp일 수 있다(도 6의 B).

상기 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트는 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 159 bp 및 120 bp일 수 있다. 상기 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 279 bp일 수 있다(도 6의 C).

상기 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 176 bp, 65 bp 및 56 bp일 수 있다. 상기 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 231 bp 및 66 bp일 수 있다(도 6의 D).

상기 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트는 엽록체 유전체의 trnKUUU 유전자와 matK 유전자 사이에 위치하는 27bp 크기의 InDel(insertion/deletion) 부위에 특이적이며, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)의 증폭산물의 크기는 313 bp일 수 있고, 상기 2종의 들깨 야생종 품종을 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 340 bp일 수 있다(도 6의 E).

전술한 바와 같이, 상기 프라이머 세트는 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)와 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC) 중, 한 개 또는 두 개의 품종, 즉, 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella); 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis); 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis); 또는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 특이적으로 검출할 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트에 따라 상기 9종의 들깨 품종의 증폭산물 크기가 차이를 나타내어, 여러 개의 조합을 통해 2배체 들깨 야생종 및 4배체 들깨 재배종의 배수체간 들깨 품종 판별 용도로 활용할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트는 들깨 배수체간 품종 판별을 위한 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커 증폭용 프라이머 세트일 수 있다.

상기 "CAPS 마커"는 개체 간의 유전적 차이를 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하고 결과물을 분석하는 CAPS 방법에 이용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 CAPS 방법은 개체 간의 다른 제한효소 부위를 포함하는 영역에서 PCR 증폭을 실시하고, 상기 PCR 증폭의 산물을 제한효소로 절단한다. 절단된 산물을 아가로즈 또는 아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 절단된 산물의 밴드 패턴을 분석한다.

본 발명의 일실시예에서, CAPS 마커는 각각 ndhF 유전자 영역, ycf1 유전자 영역, ycf2 유전자 영역, 및 ITS1 영역에 존재하는 2배체 들깨 야생종 품종 및 4배체 들깨 재배종 품종, 총 9종의 들깨 품종 간의 특이적인 SNP 중 각각의 제한효소(SacⅡ, VspⅠ, AluⅠ 및 BsmAⅠ) 자리에 위치한 SNP를 선정하여 후보 CAPS 마커로 개발할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 들깨 배수체간 품종 판별용 키트는 상기 프라이머 세트, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 포함하는 것일 수 있다.

상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별 방법에 있어서, 상기 들깨 시료는 이에 제한되지는 않으나, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 2배체 들깨 야생종 품종과, 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)로 이루어진 4배체 들깨 재배종 품종일 수 있다.

본 발명의 상기 방법을 이용하는 경우, 2배체 들깨 야생종과 4배체 들깨 재배종 간의 품종 판별, 즉 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별이 가능하며, 2배체 들깨 야생종 간의 판별, 즉 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 간의 품종 판별도 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서, 들깨 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 분리된 들깨 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 들깨 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl₂, KCl 등을 포함한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시　³²P 또는　³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법에 있어서, 2배체 들깨 야생종과 4배체 들깨 재배종 간의 품종 판별, 즉 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별을 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 서열번호 25의 염기서열 내에서 149번째 내지 176번째 염기에 위치한 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 30-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 또는 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열은 전술한 바와 같다.

상기 다형성 폴리뉴클레오타이드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 폴리뉴클레오타이드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오타이드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및

서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;을 증폭시킬 수 있는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미하며, 상기 서열번호 13, 14, 15, 21, 22, 23 또는 24는 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 폴리뉴클레오타이드이다.

상기 서열번호 13, 14, 15, 21, 22, 23 또는 24는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열로, 상기 "다형성 서열(polymorphic sequence)"이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른, 상기 SNP 다형성 염기 정보는 도 8a 및 도 8d에 나타내었다.

본 발명의 일실시예에 따른, 상기 SNP 위치 염기는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 엽록체 서열을 기준으로 서열번호 13, 14 및 15의 경우 110,180번째 위치(ndhF 유전자 영역) 위치이다. 또한, 서열번호 21, 22, 23 및 24에 표시된 상기 SNP 위치 염기는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 45S nrDNA 서열을 기준으로 1,915번째(ITS1 영역) 위치이다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

또한, 상기 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 176 bp, 65 bp 및 56 bp일 수 있다. 상기 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 231 bp 및 66 bp일 수 있다(도 6의 D).

상기 프라이머 세트는 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)와 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC) 중, 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella); 또는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 특이적으로 검출할 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트에 따라 상기 9종의 들깨 품종의 증폭산물 크기가 차이를 나타내어, 상기 최소 2개의 프라이머 세트 조합을 통해 2배체 들깨 야생종 및 4배체 들깨 재배종의 배수체간 들깨 품종 판별 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 키트를 제공한다.

상기 들깨 배수체간 품종 판별용 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별 방법을 제공한다.

상기 b) 단계의 상기 프라이머 세트는 상기 3종의 2배체 들깨 야생종 품종 및 6종의 4배체 들깨 재배종 품종 중, 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)에 대해 증폭산물 크기 150 bp 및 109 bp로 특이적으로 검출할 수 있고, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)에 대해 증폭산물 크기 176 bp, 65 bp 및 56 bp로 특이적으로 검출할 수 있다(도 6의 A 및 도 6의 D). 따라서, 상기 최소 2개의 프라이머 세트 조합을 통해 2배체 들깨 야생종 및 4배체 들깨 재배종의 배수체간 들깨 품종을 판별할 수 있다.

상기 a) 단계의 DNA 분리 방법 및 c) 단계의 PCR 증폭산물을 검출하는 방법은 전술한 바와 같다.

서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;

서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및

서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 용어 "단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)"이란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미하며, 상기 서열번호 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24는 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 다형성 폴리뉴클레오타이드이다.

상기 서열번호 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열로, 상기 "다형성 서열(polymorphic sequence)"이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른, 상기 SNP 다형성 염기 정보는 도 8b 내지 도 8d에 나타내었다.

본 발명의 일실시예에 따른, 상기 SNP 위치 염기는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 엽록체 서열을 기준으로 서열번호 16, 17 및 18의 경우 123,676번째(ycf1 유전자 영역), 서열번호 19 및 20의 경우 146,157번째(ycf2 유전자 영역) 위치이다. 또한, 서열번호 21, 22, 23 및 24에 표시된 상기 SNP 위치 염기는 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 45S nrDNA 서열을 기준으로 1,915번째(ITS1 영역) 위치이다.

구체적으로, 123,676번째 SNP 부위의 염기가 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 히르텔라(P. hirtella)는 A인 반면, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 및 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis), 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)는 G이다.

146,157번째 SNP 부위의 염기가 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)는 G인 반면, 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella), 4배체 들깨 재배종 품종인 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)는 A이다.

본 발명에 따른 2배체 들깨 품종은 2배의 들깨 염색체수를 갖는 들깨 야생종(2n)으로, 이에 제한되지는 않으나, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

상기 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트는 상기 2배체 들깨 야생종 품종 중, 페릴라 히르텔라(P. hirtella)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 128 bp 및 99 bp일 수 있다. 상기 페릴라 히르텔라(P. hirtella)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 227 bp일 수 있다(도 6의 B).

또한, 상기 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트는 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 159 bp 및 120 bp일 수 있다. 상기 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 279 bp일 수 있다(도 6의 C).

상기 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 특이적으로 검출하는 것일 수 있으며, 증폭산물의 크기는 176 bp, 65 bp 및 56 bp일 수 있다. 상기 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)를 제외한 나머지 들깨 품종의 증폭산물 크기는 231 bp 및 66 bp일 수 있다(도 6의 D).

상기 프라이머 세트는 2배체 들깨 야생종 품종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)를 각각 특이적으로 검출할 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트에 따라 상기 3종의 들깨 야생종의 증폭산물 크기가 차이를 나타내어, 상기 3개의 프라이머 세트 조합을 통해 2배체 들깨 야생종 품종 판별 용도로 활용할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 키트를 제공한다.

상기 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별 방법을 제공한다.

본 발명의 2배체 들깨 야생종 품종 판별 방법에 있어서, 상기 들깨 시료는 이에 제한되지는 않으나, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 2배체 들깨 야생종 품종일 수 있다.

상기 b) 단계의 상기 프라이머 세트는 상기 3종의 2배체 들깨 야생종 품종 중, 페릴라 히르텔라(P. hirtella)에 대해 증폭산물 크기 128 bp 및 99 bp로 특이적으로 검출할 수 있고, 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)에 대해 증폭산물 크기 159 bp 및 120 bp로 특이적으로 검출할 수 있으며, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)에 대해 증폭산물 크기 176 bp, 65 bp 및 56 bp로 특이적으로 검출할 수 있다(도 6의 B 내지 도 6의 D). 따라서, 상기 3개의 프라이머 세트 조합을 통해 2배체 들깨 야생종 품종을 판별할 수 있다.

서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

실시예 1-1: 들깨( Perilla ) 식물 재료 준비

들깨 품종 판별 마커를 개발하기 위해, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 들깨(Deulkkae, DK), 차조기(Chajogi, CH), 앞푸른차조기(Apureunchajogi, AC), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi, PJC), 주름차조기(Jureumchajogi, JC) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC) 6종의 4배체 들깨 재배종(cultivars)과, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 3종의 2배체 야생종(wild species) 들깨를 게놈 DNA(genomic DNA) 준비 및 염기서열분석(sequencing)에 사용하였다(표 1 및 도 1). 다형성 변이 확인을 위해, 상기 9종의 들깨 품종 각각의 개별 식물 4~8개 개체를 PCR 분석에 사용하였다. 이때, 어린 들깨 잎 재료는 농촌진흥청(Rural Development Administration, RDA) 국립식량과학원(National Institute of Crop Science) 포장으로부터 확보하여 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

실시예 1-2: 들깨( Perilla ) DNA 준비 및 추출

들깨 품종 판별 마커를 개발하기 위해 다형성 변이를 확인하고자 한, 상기 실시예 1-1의 9종의 들깨 품종의 어린 들깨 잎 재료는 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부 온실에서 상기 9종의 각각의 들깨 종자를 120공(120-hole) 모판에 심어 재배하여 확보하였다.

상기 9종의 들깨 품종의 각각의 DNA는 변형된 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법(Nucleic Acids Res., 8:4321-4326 (1980))을 사용하여 파종 후 20일 된 들깨 묘에서 분리하였다.

구체적으로, 액체 질소를 사용하여 싱싱한 잎 조직 200㎎을 동결시키고, 분쇄기로 분말화한 후, 2㎖ 볼륨(volume)의 원심분리용 튜브(microcentrifuge tubes)에 추출 완충액(extraction buffer; Intron Biotechnology, Inc, 2% CTAB, 100mM Tris-HCl (pH 8.0), 20mM EDTA, 1.4M NaCl, 1% 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)) 800㎕와 혼합하여 넣고 65℃ 온도 조건의 워터 배스(water bath)에서 1시간 동안 방치시켰다. 이후, 클로로포름/옥탄올(chloroform/octanol; 24:1 (vol/vol)) 800㎕를 첨가하고, 2분 동안 반전(inversion)시켜 에멀젼(emulsion)을 형성시켰다. 에멀젼 형태의 샘플 시료는 4℃의 온도 조건에서 4,200 rpm으로 10분 동안 원심분리시켰다. 원심분리 후, 450㎕의 상등액(upper aqueous solution)을 새로운 1.5㎖ 볼륨(volume)의 원심분리 튜브에 옮기고 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 2분 동안 천천히 반전(inversion)시키면서 혼합하였다. 10초 동안 원심분리로 gDNA(genomic DNA)를 침전시키고 액체(liquid)는 부드럽게 쏟아버렸다. 침전된 gDNA를 1㎖의 70% 에탄올로 2회 세척하고, 실온(room temperature)에서 밤새(overnight) 건조 시켰다. 상기 건조 시킨 gDNA는 1×TE 완충액(buffer) 600㎕에 녹인 후 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

실시예 1-3: 엽록체 게놈과 45S nrDNA의 신규 조립( de novo assembly)

차세대염기서열분석(NGS; Next Generation Sequencing) 장비인 Illumina Nextseq 장비를 사용하여, 상기 실시예 1-2에서 확보한 총 9종의 들깨 게놈 DNA(gDNA, genomic DNA) 시료에 대해 전체 게놈 서열(whole genome sequence) 길이의 약 5배 범위(5× coverage)를 획득하였다. 본 발명에서는 약 650 Mb로 추정된 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 게놈을 사용하여 각 들깨 품종의 gDNA 샘플 시료의 서열 범위(sequence coverage)를 계산하였다. 낮은 품질(low quality)의 염기(프레드 점수(phred score) ≤ 30)를 제거한 고품질(high quality) 염기(base)와 자동적으로(autonomously) 중복염기서열 크기를 제어하는 200-600 염기쌍(bp)의 매개 변수(parameter)를 반영한 CLC Genome Assembler(ver. 4.6 beta, CLC Ins., Aarhus, Denmark)를 사용하여 엽록체 게놈과 45S nrDNA 서열을 조립하였다. CLC 신규 조립(de novo assembly)으로부터 엽록체 컨티그(contigs)를 선택하였으며, NCBI 기관 게놈 자원 DB(NCBI organelle genome resource database; ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plastid/)에 대응하여 BLASTN 분석을 하였다. 중첩된 말단 서열(terminal sequences)을 결정한 다음 이들을 결합하여 완전한(complete) 엽록체 서열을 만들었다. 완전 엽록체 조립체(complete chloroplaste assembly)는 E-value가 1e-6인 BlastZ를 사용하여 이전에 보고된 엽록체 게놈으로 검증하였고(Genome Res., 13:103-107 (2003)), 결합 부위(merged gap)는 PCR 증폭 후 생거 염기서열 분석기(Sanger sequencing)로 확인하였다.

PCR은 20ng의 gDNA 주형(template), 0.2 μM의 각 프라이머(정방향 5'-CATTTGCATAAGATCATAAG-3'(서열번호 1), 역방향 5'-TTAGAAAGGTGGGCTTTTAT-3'(서열번호 2)), 각 dNTP 0.2 mM, 10× Taq 중합효소 완충액(Taq polymerase buffer) 및 0.4 U의 Taq 중합효소(Vivagen, Seongnam, Korea)를 사용하여 총 25㎕ 볼륨(volume)으로 수행하였다. PCR 증폭(amplification)은 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 95℃에서 40초, 40℃에서 40초, 72℃에서 40초 동안 35회 반복한 다음, 72℃에서 10분간 최종 신장(elongation)하였다.

상기 기재한 동일한 조립(assembly) 방법으로 45S nrDNA 서열(sequence)을 단일 컨티그(single contig)로 조립하였다. 직렬 반복(tandem repeats, TR)으로 인한 조립 오류(assembly errors)를 수동으로 수정하고, 45S nrDNA 서열 전체를 PCR 증폭으로 확인하였다. 서열이 애매하여 수동으로 분석할 수 없는 경우에는, 엽록체 게놈과 45S nrDNA 서열을 ABI 생거 염기서열 분석기(ABI Sanger sequencing)로 검증하였다.

실시예 1-4: 유전자 주석(gene annotation)

엽록체 게놈의 유전자 주석(gene annotation)은 DOGMA 프로그램 (http://dogma.ccbb.utexas.edu)을 사용하여 수행하였으며(Bioinformatics., 22:3252-3255 (2004)), 이때, 유사성 매개 변수(similarity parameter)로 단백질 해독(protein-coding)은 60%, RNA 유전자는 80%를 적용하였다. 엽록체 유전자의 정확한 좌표(coordinates)는 수동으로(manually) 확인하고, NCBI 색소체 DB (NCBI plastid database; ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plastid/)에 대한 BLASTN 검색을 사용하여 수정하였다. 45S nrDNA 유전자(18S rDNA, 5.8S rDNA 및 26S rDNA)는 RNAmmer(http://www.cbs.dtu.dk/servives/RNAmmer/)를 사용하여 예측하였으며(Nucleic Acids Res., 35:3100-3108 (2007)), 유전자간(intergenic) 염기서열들을 ITS1(internal transcribed spacer 1; 18S rDNA와 5.8S rDNA 사이) 및 ITS2(internal transcribed spacer 2; 5.8S rDNA와 16S rDNA 사이)로 주석을 달았다. 인삼(Panax ginseng cv. Chunpoong, GenBank Acc. KM036295) 45S nrDNA을 참고(reference)로 이용하여 들깨 45S nrDNA의 완전 구조(complete structure)를 확인하였다. 원형 엽록체 게놈지도(circular cp genome maps) 작성은 OGDRAW(http://ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/)를 이용하였다(Curr . Genet., 52:267-274 (2007)).

실시예 1-5: 들깨 종( Perilla species)간의 염기서열과 변이서열 비교 분석

9종의 들깨 종의 엽록체 게놈 간 서열 변이(sequence variations)를 확인하기 위하여, 비교 서열 분석(Comparative sequence analysis)을 수행하였다. 먼저, MAFFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server) 프로그램으로 다중 염기서열 정렬(multiple sequence alignment)을 실시하였으며(Nucleic Acids Res., 32:273-279 (2003)), LAGAN 정렬 프로그램(LAGAN alignment program; http://genomelbl.gov/mvista/submit.shtml)으로는 mVISTA를 수행하였다(Nucleic Acids Res., 32:273-279 (2004)). 이후, 정렬된 다중 서열(multiple sequences)은 BioEdit 프로그램을 사용하여 수동으로 확인하였다(Nucleic acids symposium series., p. 95-98 (1999)). 엽록체 게놈의 직렬 반복(tandem repeats, TR)은 Tandem Repeat Finder software v2.0(https://tandem.bu.edu/trf/trf.html)을 사용하였다(Nucleic Acids Res., 27:573-580 (1999)). 이때, 사용한 정렬 매개 변수(alignment parameters)로는 일치(matches) 항목 2, 불일치(mismatches) 7 및 InDels의 경우 7이었다. 최종 직렬 반복(TR)은 최소 점수(minimum score) 30, 최대 기간 크기(maximum period size) 500 bp 및 서열 유사성(sequence similarity) 100%의 기준(criteria)으로 선택하였다.

9종의 들깨 식물들 간의 다형성(polymorphisms)을 확인하기 위하여, 엽록체 게놈과 45S nrDNA 염기서열 사이에서 발견되는 다형성 위치들(polymorphic sites)에 기초하여 특정 프라이머를 설계하였다. SNP 및 InDel 위치 프라이머(표 9)는 Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)을 사용하여 설계하였다(Nucleic Acids Res., 40:e115 (2012); Bioinformatics., 23:1289-1291 (2007)). SNP 및 InDel 영역에 대한 PCR 증폭은 20ng의 gDNA 주형(template), 1× Ex-Taq 완충액(Ex-Taq buffer), 200 μM의 dNTP, 0.5 U의 Ex-Taq(TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 및 0.4 μM의 각 프라이머를 포함한 총 20㎕ 볼륨(volume)의 반응 혼합물(reaction mixtures)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 94℃에서 3분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성(denaturation), 60℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extention)을 32회 반복한 다음, 72℃에서 5분간 최종 신장(elongation)하였다. 10㎕의 각각의 PCR 증폭 산물은 0.5×TAE 완충액을 사용하여 2.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동(electrophoresis)으로 확인하였다. 이어서, 5㎕의 각각의 증폭된 생성물은 제한효소(restriction enzymes)로 절단하였다.

9종의 들깨 종의 엽록체 게놈의 계통학적 분석(phylogenomic analyses)을 위해, 대조 그룹(outgroup)으로 올리브(Olea europaea) 엽록체 게놈의 존재하에 CSA 도구(tool)를 사용하여 게놈에 대한 최적의 회전(best rotation)을 결정하였다(BMC Bioinformatics., 10:230 (2009)). 그런 다음 재정렬(reorder) 및 자동 옵션(auto options)이 반영된 MAFFT를 사용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다(Mol Biol Evol ., 30:772-780 (2013)). 계통수(phylogenomic tree)는 올리브(O. europaea)를 대조 그룹으로 한 PHYLIP 패키지(package)의 Dnaml 프로그램에서 구현된 최대 유사성 방법(maximum likelihood method)을 사용하여 수행되었다(Felsenstein, J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 3.6. (Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle, 2005). 부트스트랩 분석(Bootstrap analysis; 1000 부트스트랩 반복(bootstrap replicates))은 R 환경(R environment)에서 Phangorn을 사용하여 수행하였다(Bioinformatics., 27:592-593 (2011)).

실시예 2: 들깨 종( Perilla species)의 완전 엽록체 게놈 및 45S nrDNA 서열 완성

상기 실시예 1-1의 표 1에 나타낸 바와 같이, 들깨(Deulkkae, DK), 차조기(Chajogi, CH), 앞푸른차조기(Apureunchajogi, AC), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi, PJC), 주름차조기(Jureumchajogi, JC) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC) 6종의 4배체 들깨 재배종(cultivars)과, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 3종의 2배체 야생종(wild species) 들깨를 대상으로 낮은 범위(low-coverage)로 전체 게놈 서열(whole genome sequencing)을 조사하였다.

염기서열 분석(sequencing)을 통해 118,243×10⁶ bp(1,165 × 10⁶ 판독(read)에 해당)을 얻었는데, 2배체(diploid) 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 게놈의 ~ 5배 범위(~5× coverage)와 동일한 것이다(Mitochondrial DNA Part A., 28(1):131-132(2017)). 프레드(phred) 값이 Q20 이상(>Q20)인 고품질 서열을 사용하여 각 들깨 종에 대한 엽록체 게놈과 45S nrDNA 서열을 조립하였다. 전체 해독(read) 중 약 5%가 엽록체 게놈 조립에 정렬되었으며, 이에 따라 추정된 엽록체 적용 범위는 평균 2,790 배(2,790×)였다(표 2).

9종의 들깨 종의 완전 엽록체 게놈 크기 범위는 차조기(Chajogi, CH)의 152,588 bp(base pair, 염기쌍)에서 페릴라 히르텔라(P. hirtella)의 152,656 bp까지였다(도 2 및 표 3).

들깨 종의 엽록체 게놈은 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)의 경우 25,675 염기쌍(bp)을 제외하고는, 각각 25,676 bp의 역전된 반복 영역(IRa와 IRb)을 포함하고 있는 것으로 확인되었다(표 3). 두 개의 IR 영역(inverted repeat region)은 엽록체 게놈을 LSC(large single copy) 영역과 SSC(small single copy) 영역으로 나누었다. LSC 영역은 83,699 bp에서 83,757 bp 길이였고, SSC 영역은 17,537 bp에서 17,547 bp 길이였다(표 3). 유전자의 콘텐츠(content)와 순서(order)는 9종의 들깨 종의 엽록체 게놈 간에 동일하며, 각각은 80개의 단백질 코딩 유전자(protein-coding genes), 30개의 전이 RNA(transfer RNA, tRNA) 유전자, 4개의 리보솜 RNA(ribosomal RNA, rRNA) 유전자를 포함하여 총 114개의 유전자가 존재한다. 인트론(introns)을 포함하는 총 18개의 유전자의 주석(annotation) 처리를 수행하였으며, 그 중 9개는 단백질 코딩 유전자이고, 6개는 하나의 인트론을 포함하는 tRNA 유전자이며, 그 중 3개(rps12, clpP 및 ycf3)는 2개의 인트론을 포함하고 있었다(표 4).

단삼(Salvia miltiorrhiza), 불가레오레가노(Origanum vulgare L.), 인삼(Panax ginseng)의 엽록체 게놈에서도 유사한 유전자 콘텐츠(content)가 관찰되었다(PLoS One., 8:e57607, 2013; Gene., 528:162-169, 2013; PLoS One., 10:e0117159, 2015; DNA Res., 11:247-261, 2004). 각각의 45S nrDNA 염기서열은 낮은 범위의 전체 게놈 서열을 사용한 신규 조립(de novo assembly using low-coverage whole genome sequences, dnaLCW)으로 단일 컨티그(single contig)로 조립되었다. 18S rRNA, ITS 1, 5.8S rRNA, ITS 2, 26S rRNA 및 IGS를 포함하는 45S nrDNA 염기서열의 길이는 6,235 bp와 8,303 bp 사이의 단일 단위(single units)로 구성되어 매우 균질함을 확인하였다(도 3 및 표 2).

실시예 3: 들깨 종( Perilla species)의 엽록체 게놈 염기서열 간의 상동성 (homology)

종간(inter-species) 및 종내(intra-species) 수준에서 들깨 종의 유전적 다양성을 평가하기 위해, 엽록체 게놈 염기서열에서 염기 치환(nucleotide substitutions)을 분석하였다. 9종의 들깨 종의 전체적인 엽록체 게놈 염기서열 동일성(identity)은 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 주석(annotation)을 참고로 사용하여, mVISTA로 나타내었다(Nucleic Acids Res., 32:273-279 (2004)).

결과적으로, 앞푸른차조기(Apureunchajogi, AC), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi, PJC), 주름차조기(Jureumchajogi, JC)는 서열과 길이가 동일하였고, 나머지 6종, 들깨(Deulkkae, DK), 차조기(Chajogi, CH), 푸른차조기(Pureunchajogi, PC), 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)의 엽록체 게놈은 99.7% 이상의 유사성을 보였다. 상기 9종의 들깨 종 중에서 야생종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)가 가장 높은 수준의 변이를 보였다(도 4a 내지 도 4c).

실시예 4: 들깨 종 내 엽록체 게놈 및 45S nrDNA 염기서열의 서열 변이 분석

9종의 들깨 종의 유전적 다양성에 대한 통찰력을 얻기 위해, 엽록체 게놈과 45S nrDNA 서열을 분석하였다. 유전자 간 영역(intergenic regions)의 154개의 SNP(single nucleotide polymorphism)와 코딩 서열(coding sequences) 중 79개의 SNP를 포함하여 9종의 들깨 종의 엽록체 게놈 내에서 233개의 SNP를 확인하였다(표 5). 상대적으로 큰 서열 길이 차이가 LSC 영역(large single copy region)에서 확인되었고, 검출된 SNP의 대부분(~ 73.4%)은 LSC 영역에 위치했다. 코딩(coding) 서열들 간의 변이를 확인하기 위해, 개별적으로 주석 처리된 유전자 서열들 각각을 비교하였다(표 5).

9종의 들깨 종(Perilla species)에 대한 DNA 다형성(polymorphism) 목록

SNP

position

region

gene

P. citriodo ra

Chajogi

Apureuncha jogi

PureunJure umchajogi

Jueumchajo gi

Dulkkae

Pureunchaj ogi

P. setoyens is

P. hirtella

130

LSC

intergenic

C

A

266

LSC

intergenic

G

A

G

277

LSC

intergenic

C

T

C

281

LSC

intergenic

A

T

A

334

LSC

intergenic

C

T

C

335

LSC

intergenic

T

C

T

C

337

LSC

intergenic

C

T

C

341

LSC

intergenic

T

A

T

343

LSC

intergenic

C

A

C

344

LSC

intergenic

T

G

T

346

LSC

intergenic

T

A

T

350

LSC

intergenic

A

G

A

352

LSC

intergenic

G

A

G

353

LSC

intergenic

A

G

A

354

LSC

intergenic

G

A

1634

LSC

intergenic

A

C

1652

LSC

intergenic

G

C

1694

LSC

intergenic

G

T

G

1953

LSC

intergenic

A

T

A

NS

2094

LSC

matK

T

C

NS

2130

LSC

matK

A

G

NS

3342

LSC

matK

G

A

4520

LSC

intergenic

T

G

NS

4943

LSC

rps16

C

G

C

SY

5007

LSC

rps16

C

T

6049

LSC

intergenic

G

A

G

6096

LSC

intergenic

C

A

6210

LSC

intergenic

G

-

T

6337

LSC

intergenic

G

A

G

6355

LSC

intergenic

A

G

A

6387

LSC

intergenic

C

T

6622

LSC

intergenic

T

A

T

6707

LSC

intergenic

G

T

G

6708

LSC

intergenic

A

C

A

6756

LSC

intergenic

G

A

6820

LSC

intergenic

T

G

7088

LSC

intergenic

G

A

G

7155

LSC

intergenic

T

G

T

7721

LSC

intergenic

C

T

C

8581

LSC

intergenic

C

T

8606

LSC

intergenic

A

G

9172

LSC

intergenic

A

T

A

9385

LSC

intergenic

A

C

10150

LSC

intergenic

A

C

A

SY

11256

LSC

atpA

G

T

SY

12077

LSC

atpF

C

T

SY

12143

LSC

atpF

T

C

12603

LSC

intergenic

A

C

12698

LSC

intergenic

G

A

G

12751

LSC

intergenic

C

T

13100

LSC

intergenic

C

G

13145

LSC

intergenic

T

C

13151

LSC

intergenic

T

A

T

13152

LSC

intergenic

A

T

13154

LSC

intergenic

T

C

13155

LSC

intergenic

C

T

13865

LSC

intergenic

T

C

T

14457

LSC

intergenic

C

T

C

SY

17023

LSC

rpoC2

T

C

T

SY

17371

LSC

rpoC2

G

A

G

NS

17565

LSC

rpoC2

T

A

T

NS

17958

LSC

rpoC2

G

A

SY

19234

LSC

rpoC2

G

A

20808

LSC

intergenic

G

A

20850

LSC

intergenic

T

C

T

20877

LSC

intergenic

G

A

SY

22313

LSC

rpoC1

G

A

G

SY

25008

LSC

rpoB

G

A

G

SY

25668

LSC

rpoB

T

C

T

SY

26310

LSC

rpoB

C

T

C

SY

26463

LSC

rpoB

T

C

27711

LSC

intergenic

A

T

A

28602

LSC

intergenic

T

G

T

28944

LSC

intergenic

G

T

G

29131

LSC

intergenic

A

G

A

29251

LSC

intergenic

C

A

29365

LSC

intergenic

T

C

30844

LSC

intergenic

G

A

G

31251

LSC

intergenic

T

A

SY

34321

LSC

psbC

G

T

34972

LSC

intergenic

A

C

A

35521

LSC

intergenic

G

A

36214

LSC

intergenic

A

C

A

36899

LSC

intergenic

A

G

SY

37408

LSC

psaB

T

C

42516

LSC

intergenic

C

T

C

43299

LSC

intergenic

C

A

44363

LSC

intergenic

T

G

T

44502

LSC

intergenic

T

C

45042

LSC

intergenic

A

C

A

45130

LSC

intergenic

G

C

G

SY

45642

LSC

rps4

G

A

G

46013

LSC

intergenic

A

T

A

46051

LSC

intergenic

G

T

46870

LSC

intergenic

G

T

46927

LSC

intergenic

T

G

T

47400

LSC

intergenic

T

G

47879

LSC

intergenic

G

A

48092

LSC

intergenic

G

A

50491

LSC

intergenic

A

G

50628

LSC

intergenic

G

A

50952

LSC

intergenic

G

C

52097

LSC

intergenic

A

G

52323

LSC

intergenic

T

G

T

SY

52682

LSC

atpE

C

A

54534

LSC

intergenic

C

A

54856

LSC

intergenic

A

G

SY

55843

LSC

rbcL

T

C

SY

57295

LSC

accD

G

A

G

NS

58337

LSC

accD

T

A

T

59065

LSC

intergenic

A

C

59393

LSC

intergenic

T

G

T

59428

LSC

intergenic

A

T

A

59768

LSC

intergenic

C

A

60604

LSC

intergenic

C

T

C

60620

LSC

intergenic

A

G

60925

LSC

intergenic

T

G

61027

LSC

intergenic

G

T

62027

LSC

intergenic

A

G

A

SY

62314

LSC

petA

A

G

63819

LSC

intergenic

C

-

A

64417

LSC

intergenic

T

C

65036

LSC

intergenic

T

A

65549

LSC

intergenic

C

T

65609

LSC

intergenic

A

G

65809

LSC

intergenic

T

C

66233

LSC

intergenic

C

T

C

66436

LSC

intergenic

T

G

66765

LSC

intergenic

T

A

T

67812

LSC

intergenic

T

G

T

68836

LSC

intergenic

A

G

68911

LSC

intergenic

G

A

68932

LSC

intergenic

T

A

T

68997

LSC

intergenic

T

C

69191

LSC

intergenic

T

C

T

NS

70863

LSC

clpP

C

T

C

71260

LSC

intergenic

G

A

G

71413

LSC

intergenic

C

T

C

71898

LSC

intergenic

C

A

71910

LSC

intergenic

G

T

71980

LSC

intergenic

G

A

G

72001

LSC

intergenic

A

T

72126

LSC

intergenic

C

T

C

SY

72623

LSC

psbB

T

C

T

73775

LSC

intergenic

G

A

G

75234

LSC

intergenic

A

G

NS

75774

LSC

petB

A

G

76575

LSC

intergenic

C

A

SY

77083

LSC

petD

A

G

SY

77338

LSC

petD

C

T

77584

LSC

intergenic

A

T

SY

77773

LSC

rpoA

A

G

NS

77863

LSC

rpoA

A

C

A

NS

78559

LSC

rpoA

C

G

79198

LSC

intergenic

G

A

79676

LSC

intergenic

C

T

C

NS

79982

LSC

rps8

C

A

C

NS

79996

LSC

rps8

G

C

G

80287

LSC

intergenic

A

T

A

80339

LSC

intergenic

A

T

81377

LSC

intergenic

T

C

81453

LSC

intergenic

T

A

82201

LSC

intergenic

T

C

SY

82372

LSC

rps3

A

G

A

SY

82735

LSC

rps3

A

G

A

NS

82916

LSC

rps3

C

T

SY

83022

LSC

rpl22

A

G

SY

83124

LSC

rpl22

C

T

NS

83135

LSC

rpl22

G

T

G

NS

83142

LSC

rpl22

G

T

G

NS

83719

LSC

rps19

A

T

A

SY

87317

IRA

ycf2

C

A

C

NS

88843

IRA

ycf2

T

C

T

SY

89453

IRA

ycf2

G

A

NS

90151

IRA

ycf2

T

C

T

SY

96591

IRA

rps7

C

A

98083

IRA

intergenic

C

T

98214

IRA

intergenic

A

C

A

98892

IRA

intergenic

G

T

101455

IRA

intergenic

G

C

NS

109217

IRA

ycf1

G

A

SY

109547

SSC

ndhF

G

T

NS

109888

SSC

ndhF

G

A

G

NS

109895

SSC

ndhF

C

T

C

NS

110020

SSC

ndhF

T

C

T

NS

110021

SSC

ndhF

T

C

T

NS

110068

SSC

ndhF

T

G

NS

110180

SSC

ndhF

T

G

NS

110195

SSC

ndhF

G

A

NS

110721

SSC

ndhF

C

T

C

111586

SSC

intergenic

G

T

111788

SSC

intergenic

G

T

111896

SSC

intergenic

A

T

A

111897

SSC

intergenic

G

A

G

111898

SSC

intergenic

A

G

A

112324

SSC

intergenic

G

C

112537

SSC

intergenic

G

T

G

NS

113262

SSC

ccsA

A

T

114002

SSC

intergenic

C

A

C

114010

SSC

intergenic

A

C

A

SY

115724

SSC

ndhD

G

A

G

115796

SSC

intergenic

T

G

T

115853

SSC

intergenic

G

A

116260

SSC

intergenic

G

T

116679

SSC

intergenic

A

G

116730

SSC

intergenic

G

C

G

SY

117029

SSC

ndhG

T

G

SY

117128

SSC

ndhG

G

A

G

117675

SSC

intergenic

G

A

G

119862

SSC

intergenic

C

T

SY

120052

SSC

ndhA

G

A

SY

120268

SSC

ndhA

C

T

C

SY

120836

SSC

ndhH

C

T

122046

SSC

intergenic

T

G

122181

SSC

intergenic

A

G

A

NS

122632

SSC

ycf1

A

C

SY

122919

SSC

ycf1

G

A

G

NS

123615

SSC

ycf1

C

A

C

NS

123676

SSC

ycf1

G

A

NS

125843

SSC

ycf1

C

T

C

NS

126527

SSC

ycf1

T

C

SY

126639

SSC

ycf1

T

C

NS

127091

SSC

ycf1

C

T

134853

IRB

intergenic

C

G

SY

135862

IRB

rrn16

T

G

T

137416

IRB

intergenic

C

A

138094

IRB

intergenic

T

G

T

138225

IRB

intergenic

G

A

SY

139717

IRB

rps7

G

T

NS

146157

IRB

ycf2

A

G

A

SY

146855

IRB

ycf2

C

T

NS

147465

IRB

ycf2

A

G

A

152589

IRB

intergenic

T

A

T

9종의 들깨 종의 서열을 비교 분석한 결과, 하기 도 5에 나타낸 바와 같이, 33개의 유전자가 81개의 SNP를 가지고 있었으며, 구체적으로, 27개의 유전자에 44개의 동의 SNP(synonymous SNP, sySNP)가 포함되어 있었으며, 15개의 유전자에 아미노산 잔기를 변형시키는 37개의 비동의 SNP(non-synonymous SNPs, nsSNPs)가 포함되어 있었다. 모든 tRNA와 rRNA 유전자는 보존되어 있었으며 SNP는 발견되지 않았다. 4가지 유전자(즉, rpoC2, ycf1, ycf2 및 ndhF) 각각에서 5개 이상의 SNP가 검출되었다. 예를 들어, 검사된 모든 코딩 서열의 SNP 수가 가장 많은 ndhF에는 8개의 비동의 SNP(non-synonymous SNPs, nsSNPs)와 1개의 동의 SNP(synonymous SNP, sySNP)가 포함되었다(도 5). 쌍방향 비교 분석(interactive comparative analysis) 결과, 27개의 유전자에서 42개의 sySNP와 15개의 유전자에서 37개의 nsSNP가 밝혀졌다. 대부분의 nsSNP는 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)(28 nsSNPs)와 페릴라 히르텔라(P. hirtella)(18 nsSNPs)에서 발견되었다. 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)에서 2개의 nsSNP(rpl22와 rps8에서 각각 1개)가 검출되었지만, 다른 6종의 들깨 재배종은 nsSNP가 존재하지 않았다(표 6).

전체 SNP 수의 약 53.2%에 해당하는 124개의 종-특이적 SNP(species-specific SNPs, ssSNPs)가 엽록체 게놈에서 확인되었다. 대부분의 ssSNP는 들깨 야생종인 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)(각각 83개 및 36개)에도 존재했다. ssSNP 중 76개가 유전자 간 영역(intergenic regions)에서 확인되었고 48개는 코딩 영역(coding regions)에서 확인되었다(표 5). 6종의 재배종 들깨 중 차조기(Chajogi, CH)(87,317 위치에서 C가 A로)와 들깨(Deulkkae, DK)(114,010 위치에서 A가 C로)에서는 단 하나의 ssSNP가 확인되었다 (표 5).

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 5가지 직렬 반복(tandem repeats, TR)이 9종의 들깨 종의 엽록체 게놈 염기서열 비교에서 관찰되었다. 이 중 5가지 가변적인(variable) TR은 길이가 1-27 염기쌍(bp)인 간단한(simple) InDel에서 파생되었다. 이들 중, 하나의 가변적인(variable) TR은 petB 유전자의 인트론(intron)에서 발견되었고, 다른 것들은 유전자 간 영역(intergenic regions)에서 발견되었다. 페릴라 히르텔라(P. hirtella)에는 두 개의 종 특이적(species-specific) 가변적인 TR이 존재하기 때문에 다른 들깨 종과 쉽게 구별되었다. petB 유전자 인트론에 위치하고 있는 하나의 TR은 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 종에서 6-bp TR(AAAGAA)를 3개(copy) 가지고 있고, 다른 들깨 종들에서는 2개만 가지고 있음을 확인하였다. 한편, 다른 TR은 petA와 psbJ 유전자 사이의 유전자 간 영역에서 발견되었으며, 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 종에 7-bp TR(ATTATAT)이 2개 있고, 다른 종들에는 단 하나만 있는 것으로 확인되었다. 또한, trnKUUU와 matK 유전자 사이의 유전자 간 영역에서 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)와 페릴라 히르텔라(P. hirtella)는 2개의 27-bp TR을 가지고 있고, 다른 종들은 단 하나의 TR을 가지고 있었다(표 7).

45S nrDNA 비교 분석에서는, 상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 18개의 변이(16개의 SNP, 2개의 InDel)을 발견했는데, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)가 14개의 변이(13개의 SNP, 1개의 InDel)를 가져 가장 변이가 많았고, 페릴라 히르텔라(P. hirtellal)가 11개의 SNP를 나타내 페릴라 시트리오도라 다음으로 변이가 많았다. 엽록체 게놈 변이 결과(표 5)와 대조적으로, 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)는 45S nrDNA 분석에서 가장 적은 변이(1개의 SNP와 2개 InDel)를 가지고 있었다. 45S nrDNA 서열 비교 분석을 통해 18S rRNA에서 2개의 SNP, 26S rRNA에서 5개의 SNP, ITS 1에서 3개의 SNP 및 2개의 InDel, 그리고 ITS 2에서 6개 SNP가 밝혀졌다. 이 비교에서 한 개의 종 특이적 InDel이 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)의 ITS 1 영역 2,006 위치에서 확인되었다. 또한, 6개의 ssSNP(species-specific SNP)가 9종의 들깨 종의 45S nrDNA 간에서 확인되었다. 구체적으로, ITS 1 영역의 1,915 위치에서 G 에서 T로, ITS 1 영역의 1,974 위치와 ITS 2 영역의 2,409 위치에서 C에서 A로, ITS 2 영역의 2,263 위치와 2,408 위치에서 C에서 T로, 그리고 26S rRNA의 5,642 위치에서 T에서 C로 치환된 것으로 확인되었다.

페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella) 3종의 2배체 야생종(wild species)과, 들깨(Deulkkae, DK), 차조기(Chajogi, CH), 앞푸른차조기(Apureunchajogi, AC), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi, PJC), 주름차조기(Jureumchajogi, JC) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC) 6종의 4배체 들깨 재배종(cultivars)에서 엽록체 게놈과 45S nrDNA 염기서열에서 확인된 다형성(polymorphism)을 확인하기 위해, 상기 9종의 들깨(Perilla) 식물에서 개별적으로 추출한 gDNA(genomic DNA)와 여러 다형성 부위를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다(도 6). 제한 효소 부위를 SNP 유전자형(genotype)의 명확한 검증에 이용 가능할 경우, SNP 위치에 대해 4개의 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 설계하였다(표 9). ndhF, ycf1 및 ycf2(각각 110,180 위치, 123,676 위치 및 146,157 위치)의 각 SNP는 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및/또는 페릴라 히르텔라(P. hirtella)에 대해 특이적(unique) 이었으며(도 6의 A, 도 6의 B 및 도 6의 C), ITS 1 영역의 SNP(1,915 위치) 하나는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)에 특이적(unique)이었다(도 6의 D). 이러한 SNP는 하기 표 9의 CAPS 마커를 사용하여 검출할 수 있다. 직렬 반복(tendem repeats, TR)을 검증하기 위해, 상기 표 7의 5개의 TR 중 가장 긴 27 bp(base pair)의 간단한(simple) InDel에서 파생된 trnKUUU와 matK 사이의 영역을 PCR 분석으로 확인하였다(도 6의 E).

9종의 들깨종(Perilla species) 간의 다형성 검출용 프라이머

	프라이머명	프라이머 서열(5'-3')	서열번호	증폭산물 크기 (bp)	위치	제한효소
SNP based	CAPS-1	F: CATTCTCATGACTTCGGTATGTT	3	259/150/109	ndhF	SacⅡ
		R: ATTTTCGCAATAATAGCTTGGA	4
	CAPS-2	F: AGTTTTGTGAATTGGTTTCTGG	5	227/128/99	ycf1	VspⅠ
		R: TGATCTAGGGCAGGTTGATATT	6
	CAPS-3	F: GATTGATGGGATTTGGTATGAG	7	279/159/120	ycf2	AluⅠ
		R: CAGAGTTCGAAAAGGTCAAATC	8
	CAPS-4	F: GAAGGATCATTGTCGAAACCT	9	176/65/56 (P. citriodora) 231/66(others)	ITS1	BsmAⅠ
		R: CATTTCGCTACGTTCTTCATC	10
TR based	InDel-1	F: CGTGCTTGCATTTTTCATTG	11	340/313	trnKU UU ~ matK
		R: AAAAGCTTCTTCCGCTTTGC	12

* F: 정방향 프라이머, R: 역방향 프라이머

실시예 5: 엽록체 게놈 기반 계통분류 분석

전체 엽록체 게놈 배열(alignment)을 이용한 계통분류 분석(Phylogenomic analysis)으로 꿀풀과(Lamiaceae)에 속하는 들깨 종(Perilla species)의 위치를 확인하였다(도 7). 9종의 들깨 종 게놈은 모두 꿀풀아과(Nepetoideae) 서브패밀리(subfamily)에서 다른 외부그룹(outgroup) 종인 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 단삼(Salvia miltiorrhiza) 및 참깨(Sesamum indicum L.)와는 뚜렷하게 구별되는 하나의 클러스터(cluster)를 형성하였다. 3종의 야생종(wild species) 들깨 중에서 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis)와 페릴라 히르텔라(P. hirtella)가 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 보다 서로 더 밀접한 관계가 있음을 확인하였다. 또한, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)는 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi) 6종의 들깨 재배종(cultivars)과 더 밀접한 관계가 있음을 확인하였다. 이는 예상대로, 모든 들깨 재배종은 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)와 클러스터(cluster)를 형성하고 있으며, 이는 들깨 재배종과 페릴라 시트리오도라(P. citriodora) 사이에 밀접한 관계를 보여준다.

한편, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)의 엽록체 게놈 서열을 참깨과(Pedaliaceae)인 참깨(Sesamum indicum)와 꿀풀과(Lamiaceae)인 단삼(S. miltiorrhiza)의 엽록체 게놈 서열과 비교하여, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)와 참깨(Sesamum indicum) 사이의 유사성이 89.6%이고, 페릴라 시트리오도라(P. citriodora)와 단삼(S. miltiorrhiza) 사이의 유사성이 93.9%임을 확인하였다(표 10).

<110> Republic of Korea <120> Molecular marker for identifying Perilla cultivars and Perilla wild species based on the information of chloroplast genomes and 45S nrDNAs sequence and uses thereof <130> P17R12C0729 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> merged gap_forward primer <400> 1 catttgcata agatcataag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> merged gap_reverse primer <400> 2 ttagaaaggt gggcttttat 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-1_F primer <400> 3 cattctcatg acttcggtat gtt 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-1_R primer <400> 4 attttcgcaa taatagcttg ga 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-2_F primer <400> 5 agttttgtga attggtttct gg 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-2_R primer <400> 6 tgatctaggg caggttgata tt 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-3_F primer <400> 7 gattgatggg atttggtatg ag 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-3_R primer <400> 8 cagagttcga aaaggtcaaa tc 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-4_F primer <400> 9 gaaggatcat tgtcgaaacc t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPS-4_R primer <400> 10 catttcgcta cgttcttcat c 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InDel-1_F primer <400> 11 cgtgcttgca tttttcattg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> InDel-1_R primer <400> 12 aaaagcttct tccgctttgc 20 <210> 13 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. setoyensis_CAPS-1 <400> 13 cattctcatg acttcggtat gtttttttcg aaaaaaaaga agaactttcc ttattattca 60 ttcttaataa actaaaattc ttgttaattc tttttgaaca ccccttaccc catagagata 120 tggaatagaa agaagcattt tgattgccgc ggtaattttg aaaacgaacg tttaaatgac 180 cttcaaaagt aagtaaatag atgcgaaaca tataaaatgc ggttaatcct gcggtggtcc 240 aagctattat tgcgaaaat 259 <210> 14 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. hirtella_CAPS-1 <400> 14 cattctcatg acttcggtat gtttttttcg aaaaaaaaga agaactttcc ttattattca 60 ttcttaataa actaaaattc ttgttaattc tttttgaaca ccccttaccc catagagata 120 tggaatagaa agaagcattt tgattgccgc ggtaattttg aaaacaaacg tttaaatgac 180 cttcaaaagt aagtaaatag atgcgaaaca tataaaatgc ggttaatcct gcggtggtcc 240 aagctattat tgcgaaaat 259 <210> 15 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> other species_CAPS-1 <400> 15 cattctcatg acttcggtat gtttttttcg aaaaaaaata agaactttcc ttattattca 60 ttcttaataa actaaaattc ttgttaattc tttttgaaca ccccttaccc catagagata 120 tggaatagaa agaagcattt tgattgccgc tgtaattttg aaaacgaacg tttaaatgac 180 cttcaaaagt aagtaaatag atgcgaaaca tataaaatgc ggttaatcct gcggtggtcc 240 aagctattat tgcgaaaat 259 <210> 16 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. hirtella_CAPS-2 <400> 16 agttttgtga attggtttct ggaatcataa gataaaaaat ctctttttta gaaattattt 60 gagagttgtt agtacgaatt tgaacatttt gattcctatt aatatcaatt atgatccagg 120 cctcaatatc gactttttgt ctaagataaa aattgaaaat tttccaatca aaatattttc 180 tatcagccgg tttttcgata tatggaatat caacctgccc tagatca 227 <210> 17 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. setoyensis_CAPS-2 <400> 17 agttttgtga attggtttct ggaatcataa gataaaaaat atctttttta gaaattattt 60 gagagttgtt agtacgaatt tgaacatttt gattcctatt agtatcaatt atgatccagg 120 cctcaatatc gactttttgt ctaagataaa aattgaaaat tttccaatca aaatattttc 180 tatcagccgg tttttcgata tatggaatat caacctgccc tagatca 227 <210> 18 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> other species_CAPS-2 <400> 18 agttttgtga attggtttct ggaatcataa gataaaaaat atctttttta gaaattattt 60 gagagttgtt agtacgaatt tgaacatttt gattcctatt agtatcaatt atgatccagg 120 cctcaatatc gactttttgt ctaagataaa aattgaaaat tttccaatca aaatattttc 180 tatcagccgg tttttcgata tatggaatat caacctgccc tagatca 227 <210> 19 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. setoyensis_CAPS-3 <400> 19 gattgatggg atttggtatg agatcgatga tatcgatgag attgatactc aaatatttct 60 tcttagaacg tagtgatttg accccataag cgggaccaag catgttgccg ccagaagccc 120 gtatttcttc tagagaatct cctaattgtt ccagagcagc tagaaagaga ttctttaacc 180 agaaagaatt cggtacagat gtaggatacc tatccagaag ttttcgtaac tcaatcatag 240 atgatggaat catcaaagat ttgacctttt cgaactctg 279 <210> 20 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> other species_CAPS-3 <400> 20 gattgatggg atttggtatg agatcgatga tatcgatgag attgatactc aaatatttct 60 tcttagaacg tagtgatttg accccataag cgggaccaag catgttgccg ccagaagccc 120 gtatttcttc tagagaatct cctaattgtt ccagagcaac tagaaagaga ttctttaacc 180 agaaagaatt cggtacagat gtaggatacc tatccagaag ttttcgtaac tcaatcatag 240 atgatggaat catcaaagat ttgacctttt cgaactctg 279 <210> 21 <211> 295 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. citriodora_CAPS-4 <400> 21 gaaggatcat tgtcgaaacc tgcaaagcag accgcgaaca cgtgtttaac atcatcggac 60 acggcgtggg agactcccgt cgtgcaccgc tcccgccgga gtgcgccctc gggcgtctca 120 ccgtgcgggc taacgaaccc cggcgcggca agcgccaagg aaaacaaaat ttagcgaccg 180 ccctccgcat cccgttcgcg gggtgtgcgg ggggaatgga cgtctatcga atgtcataac 240 gactctcggc aacggatatc tcggctctcg catcgatgaa gaacgtagcg aaatg 295 <210> 22 <211> 294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. setoyensis_CAPS-4 <400> 22 gaaggatcat tgtcgaaacc tgcaaagcag accgcgaaca cgtgtttaac atcatcggac 60 acggcgtggg agactcccgt cgtgcaccgc tcccgccgga gtgcgccctc gggcgtcgca 120 ccgtgcgggc taacgaaccc cggcgcggca agcgccaagg aaaacaaaat ttagcgcccg 180 ccttccgcat cccgttcgcg gggtgtgcgg gggaatggac gtctatcgaa tgtcataacg 240 actctcggca acggatatct cggctctcgc atcgatgaag aacgtagcga aatg 294 <210> 23 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P. hirtella_CAPS-4 <400> 23 gaaggatcat tgtcgaaacc tgcaaagcag accgcgaaca cgtgtttaac atcatcggac 60 acggcgtggg gagactcccg tcgtgcaccg ctcccgccgg agtgcgccct cgggcgtcgc 120 accgtgcggg ctaacgaacc ccggcgcggc aagcgccaag gaaaacaaaa tttagcgccc 180 gccctccgca tcccgttcgc ggggtgtgcg gggggaatgg acgtctatcg aatgtcataa 240 cgactctcgg caacggatat ctcggctctc gcatcgatga agaacgtagc gaaatg 296 <210> 24 <211> 296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> other species_CAPS-4 <400> 24 gaaggatcat tgtcgaaacc tgcaaagcag accgcgaaca cgtgtttaac atcatcggac 60 acggcgtggg gagactcccg tcgtgcaccg ctcccgccgg agtgcgccct cgggcgtcgc 120 accgtgcggg ctaacgaacc ccggcgcggc aagcgccaag gaaaacaaaa tttagcgccc 180 gccttccgca tcccgttcgc ggggtgtgcg gggggaatgg acgtctatcg aatgtcataa 240 cgactctcgg caacggatat ctcggctctc gcatcgatga agaacgtagc gaaatg 296 <210> 25 <211> 340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27bp InDel <400> 25 cgtgcttgca tttttcattg cacacggctt tccctatgta tacaccattt cctttcttag 60 aaaaactttc aaaagtggaa tactcagttg atttaaccct taattacata ctacatcaac 120 atttcagaat agaaataggg gagatcccat tcagaataga aataggggag atcccatttt 180 gatcttttat ctcttcatcc attttattta ggaaaaattt ctattttcaa gatcccataa 240 tcataatttt gatttatgat ttgccggatc attgatagaa atcatatcca aataccaaat 300 ccgacttcta tatacttccc gcaaagcgga agaagctttt 340

Claims

서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 25의 염기서열 내에서 149번째 내지 176번째 염기에 위치한 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 30-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 들깨(Perilla)는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 2배체 들깨 야생종 품종과, 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)로 이루어진 4배체 들깨 재배종 품종인 것인, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제3항에 있어서, 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트는 엽록체 유전체의 trnKUUU 유전자와 matK 유전자 사이에 위치하는 27bp 크기의 InDel(insertion/deletion) 부위에 특이적인 것인, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 들깨 배수체간 품종 판별용 키트.
a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별 방법.
제1항에 기재된 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP) 또는 InDel(insertion/deletion) 다형성을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이.
서열번호 13, 14 또는 15의 염기서열 내에서 151번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;을 증폭시킬 수 있는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제8항에 있어서, 상기 들깨(Perilla)는 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 2배체 들깨 야생종 품종과, 들깨(Deulkkae), 차조기(Chajogi), 앞푸른차조기(Apureunchajogi), 푸른주름차조기(Pureunjureumchajogi), 주름차조기(Jureumchajogi) 및 푸른차조기(Pureunchajogi, PC)로 이루어진 4배체 들깨 재배종 품종인 것인, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제8항에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 들깨 배수체간 품종 판별용 프라이머 세트.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 들깨 배수체간 품종 판별용 키트.
a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별 방법.
제8항에 기재된 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 들깨(Perilla) 배수체간 품종 판별용 마이크로어레이.
서열번호 16, 17 또는 18의 염기서열 내에서 102번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 19 또는 20의 염기서열 내에서 159번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 21 또는 22의 염기서열 내에서 118번째 염기, 또는 서열번호 23 또는 24의 염기서열 내에서 119번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 프라이머 세트.
제14항에 있어서, 상기 2배체 들깨 야생종 품종은 페릴라 시트리오도라(P. citriodora), 페릴라 세토엔시스(P. setoyensis) 및 페릴라 히르텔라(P. hirtella)로 이루어진 것인, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 프라이머 세트.
제14항에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 프라이머 세트.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 키트.
a) 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 증폭된 PCR 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별 방법.
제14항에 기재된 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 10-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 2배체 들깨 야생종 품종 판별용 마이크로어레이.