KR20220087095A - 토마토 풋마름병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 풋마름병 저항성 판별 방법 - Google Patents

토마토 풋마름병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 풋마름병 저항성 판별 방법 Download PDF

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이정윤
최유수
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이주희
노형준
한범수
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Abstract

본 발명은 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별 SNP 분자표지 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 토마토 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 토마토 품종을 판별할 수 있는 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 판별 키트 및 판별 방법에 관한 것으로, 상기 SNP 분자표지는 토마토 풋마름병 저항성 개체를 객관적으로 평가할 수 있는 수단을 되어 토마토 풋마름병에 대한 저항성을 갖는 토마토를 구별할 수 있으며, 토마토 풋마름병 저항성 품종 개발 및 판별에 활용될 수 있다.

Description

토마토 풋마름병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 풋마름병 저항성 판별 방법{Primer set for selecting bacterial wilt resistant tomato and selection method using the same primer set}
본 발명은 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별 SNP 분자표지 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 토마토 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 토마토 품종을 판별할 수 있는 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 판별 키트 및 판별 방법에 관한 것이다.
풋마름병(bacterial wilt)은 식물의 뿌리를 통해 침입한 세균이 체내에서 증식하고 도관을 막아 식물을 고사시키는 것으로, 토마토 생산량을 91%까지 감소시킨다. 병원균인 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum)은 200종 이상의 기주를 갖는 토양 세균으로, 다양한 race, biovar, phylotype, clade로 분류되는 등 환경과 기주 적응성이 높고 방제가 매우 어렵다. 이러한 치명적인 질병을 통제하기 위해 화학 및 생물학적 방제와 같은 다양한 전략이 사용되었지만 랄스토니아 솔라나시아룸을 줄이는데 효과적이지 못했다. 따라서 질병을 방제하는 가장 좋은 전략은 랄스토니아 솔라나시아룸에 대한 저항성이 강한 저항성 품종을 개발하는 것이다.
DNA 유전정보를 읽어내는 자동화 기술인 NGS(Next-Generation Sequencing)의 발달과 분석 비용의 하락으로 인해, 다양한 연구 분야에서 NGS가 보편적으로 활용되고 있다. NGS와 같은 식물 게놈 분석기술의 발달로 인해 목표형질에 연관된 유전적 변이 탐색이 가능해졌으며, 이를 육종 프로그램에서 분자 표지선발(marker-assisted selection)에 활용하기 위한 연구가 진행되고 있다. 리시퀀싱(resequencing) 방식은 기존에 공개된 표준 유전체 데이터를 참조하여, 시퀀싱을 수행하는 개체의 서열 단편들을 맞추어 나가며 분석하는 방식을 말한다. 이와 같이 개체의 염기서열 정보를 공개된 표준 유전체와 비교하여 단일염기다형성(SNP), 및 상기 SNP를 기반으로 한 특정 형질에 대한 분자마커의 개발이 가능하며, 유전자형 분석(genotyping)이 가능케 되었다.
랄스토니아 솔라나시아룸에 대한 저항성을 가지는 토마토 품종의 연구가 시작되고, 토마토 풋마름병에 대해 가장 안정한 저항성을 가지는'Hawaii7996'(Solanum lycopersicum)이 개발되며 풋마름병에 대한 유전적 특성이 활발하게 연구되었다. 이후, 맵핑 결과를 통해 SSR 마커를 개발하면서, Bwr-6 및 Bwr-12로 명명된, 각각 6번 및 12번 염색체에 위치하며 풋마름병 저항성과 밀접한 관계가 있는 두 개의 주요 양적 형질 유전자좌(quantitative trait loci, QTL)가 보고되었다. 그러나, 토마토의 풋마름병 저항성에 대한 QTL 맵핑 연구가 있었지만 분자 마커의 접근 가능성의 한계로 인해 저항성 잡종에 대한 토마토 육종에 실제로 사용된 분자 마커는 거의 없었다.
따라서 효과적인 육종 프로그램을 위한 저항성과 밀접한 관련이 있는 새로운 분자 마커의 개발이 필요한 실정이다.
한국 등록특허 제10-1883117호
본 발명은 토마토 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 토마토를 판별할 수 있는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 토마토 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 토마토를 판별할 수 있는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속된 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 저항성 품종 개발을 위한 분자육종의 조기선발 표지를 선발하기 위하여 적은 비용으로 다수의 저항성 연관 분자표지(molecular marker)를 탐색하기 위한 GBS(genotype by sequencing) 방법으로 토마토 풋마름병 저항성 연관 SNP(single nucleotide polymorphism) 분자표지를 다수 선발하였으며, 육종에 범용적 활용할 수 있도록 저항성 QTL에 위치한 SNP들을 이용하여 이를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 사용된 '뉴클레오티드'는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)를 의미하며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명에서 사용된 '저항성'은 외부의 스트레스에 대해 견디는 성질을 의미하며, 구체적으로 질병 등의 감염에 내성을 가지거나, 해충 등의 피해를 견디는 성질을 의미한다.
본 발명에서 사용된 '개체'는 토마토 풋마름병 저항성을 확인하고자 하는 대상인 토마토를 의미하며, 상기 토마토로부터 얻어진 검체를 이용하여 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 토마토 풋마름병 저항성이 있는 토마토를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 'SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커'는 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명에서는 SNP 마커가 아미노산 서열의 변이 또는 토마토 풋마름병 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.
여기서, '다형성(polymorphism)'은 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다. '대립유전자'는 상동염색체의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 토마토 풋마름병 저항성 SNP 마커를 발굴하기 위해, 토마토 풋마름병 저항성 유전자원 5종 및 이병성 유전자원 10종을 이용한 GBS 및 GWAS 분석을 수행하여 토마토 풋마름병의 저항성을 판별할 수 있는 3개의 SNP 마커를 확인하였다.
상기 SNP 마커는 토마토 풋마름병 저항성을 판별할 수 있는 유전자 마커로서 토마토 12번 염색체의 염기서열에 존재하는 SNP 위치에 근거한 것이다 (하기 표 1 참조). 예를 들면, 서열번호 1의 301번째 염기에 해당하는 SNP는 C 또는 T로 염기 다형성을 나타내며, 이때 C 유전자형을 갖는 개체는 토마토 풋마름병 이병성 품종이고 T 유전자형을 갖는 개체는 토마토 풋마름병 저항성 품종으로 판단할 수 있다.
위치 유전자 서열번호 SNP 위치 이병성(S)
/저항성(R)
2916793 Intergenic 1 ACGGTAGGGGCAGGGAATTTCCGGTGGAGCAGTGAAATGCGTAGTGAGCGGAGAGTTTTTCAAGTTTAACTCACCAAAACTTCCAACTATGTTTTCATATCTAAATACAATTTCAACTTCAACTTCCAAGTACCATTTGGTTAACTTAACGTCTGATTTTTTCTCCAAATATCAACCAATTCATGCACAAATGCCTACTAAGTATGGTTGAAGCAATGGAGTTGCAGCCTAAGGTTTGCAACTTCATGCGACATTCATTAGGTGCAGGGTTCAATACCTACTGATAGCCATTGGCTGCAA[C/T]TCAATACTGAATCTCTATGGTGCAAGGTTCAATTCCTACATATGGCTCTCCCTTAATCCAGAAACAGTATAAAACACCGTGTTTACTTTGCAGCTTCATGACAAATCCAAGGAACCACCTTTATTCTGCTTGATAGAAGCTAAGGTGCAACATTAACATTTGTTGTGGACCTAAGCTTACAAAGGATGCAAAGCCCTTACCAGAAATGGATGATGCATTCAGCTCCGCTGTAGCCATTTCTTTCTTTTCAAGGAAAGATCTTGGACTGATAGCCACGGAGGGTTTTCTCTAAAACTGACT C/T
3198615 Solyc12g010050.1 2 TTGGCCTTAACTAGCAACTAATGTTCCAACTTTGAGTATGCATGTCTAGACACCTCAATTCATTTCGACTGGGTCAGTTGAACAGTCCAACTTGCAAAATATGATCATCGAGACACCTCCAAAATTTATGTGTAACTTCAATGTTGGGTGTCCAAAGAAACTGTGAGGATGAGCTAGAGTGTTTGATCACCAATTGACATCAAGTTGAGATGTGTGTACTCTCAAAGTTGGGGTGCTTACTTGCCAGCTGAGGCCAAGTTCGAGTTTCTGTTTATGTATTTTTGAAATCCTTTGGCTGCA[C/T]AGTATATGAATTGGCTATAGCAAGACCTTATTATCTTCTACTTCCAGTACTGTTGGCTATAGGAAATGTCAGACTGAATTTGAAAGCTGCAGAAAACTTTAAATAATTTTGAGAGTATATACTGACGATTAAAATCCTTGTTAAGCTATATATATATATATAGTACGACCTATACAATTTTGAGCTTGTAGTTTCTTATATTGTTTCTCCTTTTAACCAGATCCATCTTATGCTAATTTCCACGATGAAGAATGGGGAGTTCCAGTCCATGACGACAAGTAAGTTGCCAGATTCTTGTCC C/T
3238637 Solyc12g010110.1 3 TCTCCTTAGATCACTTTCTGTTATCTTTATGTTCGCTCTATCAAGAAGCATAACAGTTCACAATTATGCACGGATGGAAGGTTCTTTTTTCAGACATGGATGTTGCTGCTTCTGTAGTCCCTGTTGATTTGTCTTGTTTTGATAAGAAGGATGGTATACCGGAGGAAGCATTTGCTAAAGTTCAGGAAATTATTAACAGCACCGATTGGCTAAATCAAAAGGGTGATGCTGCTAGCAAAACGCTCGAACAAATAACTGAATCAAATTTGATCCCAGAAAAATTGGGATCTCCACCTGACA[C/T]AATAGCCACTACCAAGCTCATTGATCAAGCTACTTTGGAGAACCCTCAAGAGAGGCAAGAACTTGCAGCATTAGTGAATAATACTAAGGGCTTGGCACAGTCTACTTTGGAGCAGCAGGTTGGGTCATCCTCTGAAGCATACCGTAGTAACAAACAAGAAGCTATGTTTCAGCTTGTTGAAACAAAAGGTAAGATGAAAATGTCATACTTGCAATAATTAATCTCGCTTTCATAACCTTCCCCTATTGGCACTAGTGTAAAATCTAGTGCTGAATTTCAGATTGTTGGAAAAAAAAAGGC C/T
본 발명에서는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별을 위한 조성물로서 상기 SNP 마커를 포함하는 5 내지 200개, 바람직하게는 10 내지 50, 더욱 바람직하게는 15 내지 30의 연속된 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 SNP 마커 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기를 포함하는 10 내지 30의 연속된 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.
상기 토마토 풋마름병 저항성 개체는 토마토 풋마름병의 원인균 Ralstonia solanacearum에 대해 저항성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 토마토 풋마름병 저항성 개체는 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) WR-1 균주에 대해 저항성을 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트, 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 14 및 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 '프라이머(primer)'는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존한다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명에서 사용된 '프라이머 세트'는 복제하려는 핵산 가닥에 대한 정방향(foreword) 프라이머 및 역방향(reverse) 프라이머를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트를 사용하여 토마토 풋마름병 원인균인 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) WR-1 균주에 대해 저항성을 갖는 개체를 판별할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 분석 키트 또는 DNA 칩 키트인 것일 수 있다.
상기 HRM 분석 키트는 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 토마토 풋마름병 저항성 토마토를 판단할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 HRM 분석 키트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기의 변이에 따른 이중가닥의 해리 정도의 차이를 감지하여 유전자형을 판단하는 것일 수 있다.
상기 HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트(post) PCR 분석 방법으로, 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 이중가닥 DNA(dsDNA)에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리할 수 있다. 본 발명에서는 토마토 풋마름병 저항성 토마토 품종을 선별하기 위해서 HRM 분석을 사용하였다.
이러한 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, ddH2O, 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 DNA 칩 키트는 토마토 풋마름병 저항성 토마토 판별용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 토마토 풋마름병 저항성 토마토를 판별할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 DNA 칩 키트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 301번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속된 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 토마토 풋마름병 저항성 판별용 키트일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 a) 시료로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계; b) 상기 추출된 유전체 DNA를 주형으로 하여 상기 프라이머 세트로 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭된 산물을 분석하는 단계를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별 방법을 제공한다.
상기 a) 단계는 토마토에서 유전체 DNA를 추출하는 과정이다.
상기 유전체 DNA 추출 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 일례로 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있다.
상기 b) 단계는 토마토 풋마름병 저항성 개체를 판별할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 토마토의 유전체 DNA를 증폭하는 과정이다.
상기 프라이머 세트는 하나의 세트 이상이 사용될 수 있으며, 다수의 프라이머를 동시에 사용하여 보다 정확하게 토마토 품종을 판별할 수 있다. 예를 들면, 프라이머 세트는 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트, 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 14 및 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전체 DNA 증폭 방법은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 수행될 수 있다. PCR은 당업계에서 PCR 반응에 필요한 것으로 공지된 성분들을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하거나 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 토마토에서 추출된 유전체 DNA와 상기 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함할 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
증폭된 표적 서열 (증폭 산물)은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 예를 들면, 표지 물질은 당업계에 공지된 표지 물질로, 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 표지 물질로 방사성 물질을 이용할 경우에는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성 동위원소가 증폭 산물에 혼입되어 방사성으로 표지될 수 있다. 한편, 증폭 산물은 은염색 키트 (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.
증폭 산물은 제한효소를 이용하여 절단하는 과정을 더 수행될 수 있다. 예를 들면, 증폭 산물은 각 프라이머에 따른 제한효소를 이용하여 활성 온도 내에서 처리하여 절단할 수 있다. 이때, 제한효소는 당업계에 공지된 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 c) 단계는 증폭된 산물에서 SNP 마커 부위의 염기를 확인하는 과정이다.
상기 증폭된 산물의 분석은 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하기 위해 시퀀싱(sequensing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼 (Applied Biosystems), 질량 분석법 (예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템 (BioRad), CEQ 및 SNPstream 시스템 (Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술 (예를 들면, Affymetrix GeneChip) 및 BeadArray Technologies (예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 증폭된 산물을 분석하는 단계는 HRM 분석을 통해 다형성 부위의 염기를 결정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 증폭된 산물을 HRM 분석하여 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리 정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정함으로써 토마토 풋마름병에 대한 저항성 또는 이병성 품종을 구분할 수 있다.
본 발명에 따른 신규 SNP 분자표지는 토마토 풋마름병 저항성 개체를 객관적으로 평가할 수 있는 수단을 되어 토마토 풋마름병에 대한 저항성을 갖는 토마토를 구별할 수 있으며, 토마토 풋마름병 저항성 품종 개발 및 판별에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 토마토 풋마름병 진행 정도에 따른 토마토 풋마름병의 발병지수를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 총 48개의 토마토 풋마름병 저항성 및 이병성 자원을 GWAS 분석하여 염색체별 다형성 SNP 위치를 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트 Bwr12-HRM1, Bwr12-HRM2 또는 Bwr12-HRM3를 이용하여 토마토 자원 302개체의 유전자형을 분석한 용융곡선 그래프이다. R은 저항성 동형접합체, S는 이병성 동형접합체, H는 이형접합체 유전형을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 토마토 풋마름병 저항성 확인
토마토 풋마름병 저항성을 확인하기 위하여, 토마토 풋마름병 저항성 유전자원 4종, 저항성 시판품종 1종 및 이병성 유전자원 10종을 대상으로 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) WR-1 (Biovar3) 균주를 접종하였다.
먼저, WR-1 균주를 TTC(triphenyl tetrazolium chloride) 고체배지에 streaking하여 28℃에서 24 ~ 48시간 동안 배양하였다. TTC 고체배지에서 배양된 균주의 단일 콜로니(single colony)를 NB(nutrient broth) 액체배지 8 mL에 옮겨 진탕배양기 (28℃, 150 rpm)에서 24시간 동안 배양 후 500 mL의 NB 액체배지로 옮겨 24시간씩 진탕배양기에서 배양하였다. 균주 배양액을 최종 농도가 1Х108 CFU/㎖이 되도록 증류수로 희석하여 준비하였다.
각 토마토 자원의 씨를 파종하여 4주간 재배하였다. 각 자원당 유묘 10개에 각 분(pot)당 준비된 균주 배양액 10 mL로 접종한 후 60%의 습도, 28℃의 기온에서 2주간 1주 간격으로 풋마름병 증상을 관찰하였다.
하기 표 2 및 도 1를 참조하여, 발병지수(disease index, DI)는 풋마름병 증상 정도에 따라 WR-1 균주에 의한 토마토 풋마름병의 진행 정도를 5단계로 분류하였고, 각 자원별 10개체의 발병지수를 평균 내었다. 풋마름병 발병률 (%)은 [(병징을 보이는 유묘 수)/(평가에 사용된 전체 유묘수)] X 100으로 계산하다.
발병지수 증상
0 풋마름병 증상 없음(병징이 보이지 않는 것)
1 전체 잎의 1~25% 시들음 증상(일엽이상 전체의 1/2이하 잎이 시듦)
2 전체 잎의 26~50% 시들음 증상(전체의 1/2정도 시드는 것)
3 전체 잎의 51~75% 시들음 증상(거의 전체의 잎이 시드는 것)
4 전체 잎의 76%~ 식물체 전체 시들음(완전히 시들어 말라 죽는 것)
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 다양한 기후대에서 서식하는 풋마름병원균에 대하여 안정적으로 저항성을 보인다고 알려진 Hawaii7996를 포함한 저항성 자원 4종 및 시판품종 1종은 WR-1 균주에 의한 토마토 풋마름병에 대해 강한 저항성을 나타내며, 이병성 자원 10종은 WR-1 균주에 의한 토마토 풋마름병 발병에 취약한 것으로 확인되었다. 이러한 토마토 자원 또는 품종은 기존에 알려진 각 품종의 저항성 정보와 일치하였다.
구분 자원번호/
품종		 학명 자원명칭
(Accession name)		 D. I.
(중증도)		 발병률
(%)
저항성
자원		 IT032935 Solanum lycopersicum var.
lycopersicum 		CL80-0-2-0 0.3 29
IT032964 Solanum lycopersicum var.
lycopersicum 		CL185-0-1-0 0.1 11
IT032965 Solanum lycopersicum var.
lycopersicum 		CL203-0-5-0 1.0 25
Hawaii7996 Solanum lycopersicum var.
lycopersicum 		K124978 1.8 44
저항성
시판품종		 Support Solanum lycopersicum var.
lycopersicum 		0.0 0
이병성
자원		 IT173787 Solanum peruvianum L00892 4.0 100
IT173818 Solanum pimpinellifolium L01687 4.0 100
IT173821 Solanum peruvianum L01720 4.0 100
IT173823 Solanum habrochaites L01723 4.0 100
IT173827 Solanum peruvianum L01750 4.0 100
IT173829 Solanum peruvianum L01752 4.0 100
IT173844 Solanum pimpinellifolium L02109 4.0 100
IT173849 Solanum pimpinellifolium L02114 4.0 100
IT173852 Solanum pimpinellifolium L02117 4.0 100
IT173853 Solanum pimpinellifolium L02118 4.0 100
실시예 2. 토마토 풋마름병 저항성 SNP 마커 탐색
토마토 자원 간의 SNP 마커를 탐색하기 위하여, 토마토 풋마름병 저항성 자원 4종 및 이병성 자원 10종을 이용하여 GBS 및 GWAS(Genome-wide association study) 분석을 수행하였다.
각 자원간 개체 반복을 두어 총 96개체 (저항성 자원 48개체 및 이병성 자원 48개체)를 사용하였다.
먼저, DNeasy Plant mini kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 총 96개체의 모종에서 게놈 DNA를 추출했다. NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 DNA 농도를 정량하고 라이브러리 구성을 위해 50 ng/μL로 표준화하였다. 제한효소 ApeK1를 이용하여 GBS 라이브러리를 구성하였고, 정량화된 라이브러리는 HiSeq 2000 시스템 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA)에서 시퀀싱(sequencing)되었다. 시퀀싱 결과 데이터는 바코드를 기반으로 디멀티플렉싱 되었고, SolxaQA v1.13 패키지 (Cox et al., 2010)를 사용하여 저품질, 어댑터 및 바코드 시퀀스가 제외되도록 트리밍 되었다. 전처리 과정을 거친 cleaned reads는 BWA (v0.6.1-r104) (Li and Durbin, 2009) 프로그램을 사용하여 reference genome v2.50 (The Tomato Genome, 2012)에 맵핑(mapping)하였다. Clean reads를 표준유전체에 맵핑하여 생성된 BAM format의 파일을 SAMtools (v0.1.16) (Li et al., 2009) 프로그램을 사용하여 raw SNP (In/Del)를 검출하고 공통염기배열(consensus sequence)을 추출하였다. 분석대상 간의 SNP 비교 분석을 수행하기 위해 SEEDERS in-house script (Kim et al., 2014)를 이용하여 샘플간 통합 SNP 매트릭스(matrix)를 작성하였다. SNP 매트릭스를 사용하여 분석을 수행하기에 앞서 최소 대립 유전자 빈도(minor allele frequency) > 5%, 누락된 데이터(missing data) < 30% 의 기준 하에서 SNP 필터링 과정을 수행하였다. 필터 과정을 거쳐 선발된 대표 SNP좌를 R package SNP Relate (Zheng et al., 2012)를 이용하여 계통수(phylogenetic tree), 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA)을 수행, 유연관계 분석을 수행하였다. 또한, 대표 SNP좌와 형질 정보 (저항성, 이병성)를 TASSEL5 (version 5.2.30) (Bradbury et al., 2007) 프로그램을 이용하여 연관분석 (Genome-wide association study)을 수행하였고, 저항성/이병성 그룹 내 샘플의 SNP좌의 염기서열을 비교하여 공통 SNP를 선발하고, 저항성과 이병성 그룹 간의 공통 SNP를 비교하여 다형성(polymorphic) SNP좌를 선발하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 12번 염색체에서 저항성 개체와 이병성 개체 간의 확연한 차이가 나타났다.
이에, 토마토 표준유전체 Heinz 1706 전체서열과 비교하여 12번 염색체에 대한 유전자원 간의 다형성 SNP를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 12번 염색체에서 총 7개의 후보 SNP를 발견하였으며, 1개는 유전자 사이(intergenic), 2개는 인트론(intron), 나머지 4개는 CDS(coding sequence) 내에 위치하였다. SNP 변화로 인해 아미노산이 바뀌는 유전자로는 2개가 확인되었으며, 특히 유전자 Solyc12g010110.1 내 SNP의 변화는 아미노산이 트레오닌(threonine, T)에서 이소루신(isoleucine, I)으로 바뀌면서 저항성 기작에도 변화가 나타날 것으로 예상하였다.
번호 위치 이병성
(S)		 저항성
(R)		 Genic/
Intergenic		 Gene feature Gene descriptions 아미노산
S R
1 2817063 A G,R Solyc12g009560.1 CDS F-box/LRR-repeat protein K R
2 2916793 C T Intergenic -
3 2919236 C T, Y Solyc12g009640.1 CDS HAT family dimerisation domain containing protein expressed T T
4 3134873 G T Solyc12g009990.1 Intron Signal recognition particle protein
5 3198615 C T Solyc12g010050.1 Intron DNA-3-methyladenine glycosylase I
6 3238637 C T,Y Solyc12g010110.1 CDS Formin 2B T I
7 3471641 A G, R Solyc12g010450.1 CDS Protein phosphatase 2C S G
실시예 3. 토마토 풋마름병 저항성 SNP 마커 개발 및 검증
3-1. 토마토 풋마름병 저항성 SNP 마커 후보군 분석
토마토 풋마름병 저항성 SNP 마커를 개발하기 위하여, 후보 SNP의 표현형과 유전형을 분석하였다.
먼저, 각 SNP 마커를 인식하여 증폭할 수 있는 7종의 프라이머 세트를 설계하여 준비하였다 (하기 표 5 참조). SNP 마커를 증폭하기 위해, PCR반응과 HRM 반응 실험을 하였다. HRM 반응액은 유전체 DNA (50 ng·μL-1) 2.0 μL, 10x EasyTaq® buffer (Transgen Biotech, China) 2.0 μL, dNTP mixture (Transgen Biotech, China) 1.0 μL, 0.1units Taq DNA polymerase (Transgen Biotech, China) 0.1 μL, SYTO®9 green fluorescent nucleic acid stain (Life technologiese™, USA) 0.5 μL, 정방향/역방향 프라이머 10 pmole·μL-1, 그리고 멸균된 3차 증류수로 총 20 μL 를 혼합하였다. PCR 반응은 Biometra Tadvanced (Biometra, Germany)를 사용하였고, 95℃에서 10분간 초기 변성(denaturation)을 수행한 후, 95℃에서 10초간 변성denaturation), 60℃에서 15초간 결합(annealing), 72℃에서 15초간 신장(extension) 과정을 40회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로 72℃에서 20초간 전체 신장(full extension) 반응을 시켰으며, PCR 산물을 LightCycler® Real-Time PCR (Roche, Swizerland)를 이용하여 용융 곡선(melting curve)를 작성하는데 이용하였다.
HRM 분석은 65℃에서 95℃까지 0.02℃씩 온도를 올리면서 각 온도에서 SYTO*9의 형광 값을 측정하여 melting curve 값을 LightCycler® v.1.1 프로그램을 이용하여 SNP 마커를 가진 토마토 자원의 유전형을 확인하여 표현형과 일치하는지 확인하였다.
번호 프라이머 명칭 유전자 프라이머 서열 (5'→3') 서열
번호		 융해온도
(℃)		 생성물
길이 (bp)
1 Bwr12-HRM4 Solyc12g009560.1 F: GGCTTACAGTGTTGAGTAGCG 4 59.01 143
R: CCCTTCCACACACCTGGTAA 5 59.23
2 Bwr12-HRM1 Intergenic F: AGGTGCAGGGTTCAATACCT 6 58.63 137
R: AGCTGCAAAGTAAACACGGT 7 58.32
3 Bwr12-HRM5 Solyc12g009640.1 F: TGCTCGAACTTTAAGCAGCA 8 58.12 146
R: GCACTTGAAGCTGCTGTTTG 9 58.52
4 Bwr12-HRM6 Solyc12g009990.1 F: TGGGGTTGGAAAGTCTACCA 10 58.18 117
R: CAACCTGCAGCAGAACATGT 11 59.04
5 Bwr12-HRM2 Solyc12g010050.1 F: ACTCTCAAAGTTGGGGTGCT 12 59.15 142
R: AGCCAACAGTACTGGAAGTAGA 13 58.49
6 Bwr12-HRM3 Solyc12g010110.1 F: AAAAGGGTGATGCTGCTAGC 14 58.53 133
R: TGAGGGTTCTCCAAAGTAGCT 15 58.38
7 Bwr12-HRM7 Solyc12g010450.1 F: GTAGTCTCCTCCGGGCAAAA 16 59.39 136
R: GGTCCATTGAGTGCTGAACC 17 58.83
그 결과, 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 12번 염색체 내 SNP 위치가 2916793, 3198615, 3238637인 경우는 생물검정결과 표현형과 유전형이 일치하였으며, 나머지 4개의 후보 SNP는 분석 초기에 불일치 자원수가 많거나 HRM(High Resolution Melting) 분석 시 저항성과 이병성 밴드 구분이 어려워 토마토 풋마름병 저항성 판별 마커로 적용할 수 없었다. 결과적으로, 프라이머 세트 Bwr12-HRM1, Bwr12-HRM2 및 Bwr12-HRM3에 의해 증폭된 3개의 SNP 마커가 토마토 풋마름병 품종의 유전자형을 분석하는데 적합한 것을 확인하였다.
번호 위치 검정개체 수 불일치z 자원수 비고
1 2817063 16 4
2 2916793 214 0
3 2919236 102 5 밴드구분 어려움
4 3134873 102 1 밴드구분 어려움
5 3198615 212 0
6 3238637 183 0
7 3471641 107 4 밴드구분 어려움
Z: 생물검정 표현형과 유전형 결과 일치 여부
3-2. 토마토 풋마름병 저항성 SNP 마커의 검증
3개의 SNP 마커를 검증하기 위하여, 토마토 풋마름병 저항성 유전자원 66개체 및 이병성 유전자원 232개체를 이용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 HRM 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 토마토 자원의 유전자형은 프라이머 세트 Bwr12-HRM1, Bwr12-HRM2 또는 Bwr12-HRM3를 사용한 HRM 분석에서 표준화된 용융 곡선에 기초하여 이병성 그룹(S)과 저항성 그룹(R)으로 명확하게 나뉘었다.
이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 SNP 마커는 토마토 풋마름병에 저항성을 갖는 토마토 품종을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for selecting bacterial wilt resistant tomato and selection method using the same primer set <130> RDA-P200030 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intergenic in Chromosome 12 <400> 1 acggtagggg cagggaattt ccggtggagc agtgaaatgc gtagtgagcg gagagttttt 60 caagtttaac tcaccaaaac ttccaactat gttttcatat ctaaatacaa tttcaacttc 120 aacttccaag taccatttgg ttaacttaac gtctgatttt ttctccaaat atcaaccaat 180 tcatgcacaa atgcctacta agtatggttg aagcaatgga gttgcagcct aaggtttgca 240 acttcatgcg acattcatta ggtgcagggt tcaataccta ctgatagcca ttggctgcaa 300 ctcaatactg aatctctatg gtgcaaggtt caattcctac atatggctct cccttaatcc 360 agaaacagta taaaacaccg tgtttacttt gcagcttcat gacaaatcca aggaaccacc 420 tttattctgc ttgatagaag ctaaggtgca acattaacat ttgttgtgga cctaagctta 480 caaaggatgc aaagccctta ccagaaatgg atgatgcatt cagctccgct gtagccattt 540 ctttcttttc aaggaaagat cttggactga tagccacgga gggttttctc taaaactgac 600 t 601 <210> 2 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc12g010050.1 in Chromosome 12 <400> 2 ttggccttaa ctagcaacta atgttccaac tttgagtatg catgtctaga cacctcaatt 60 catttcgact gggtcagttg aacagtccaa cttgcaaaat atgatcatcg agacacctcc 120 aaaatttatg tgtaacttca atgttgggtg tccaaagaaa ctgtgaggat gagctagagt 180 gtttgatcac caattgacat caagttgaga tgtgtgtact ctcaaagttg gggtgcttac 240 ttgccagctg aggccaagtt cgagtttctg tttatgtatt tttgaaatcc tttggctgca 300 cagtatatga attggctata gcaagacctt attatcttct acttccagta ctgttggcta 360 taggaaatgt cagactgaat ttgaaagctg cagaaaactt taaataattt tgagagtata 420 tactgacgat taaaatcctt gttaagctat atatatatat atagtacgac ctatacaatt 480 ttgagcttgt agtttcttat attgtttctc cttttaacca gatccatctt atgctaattt 540 ccacgatgaa gaatggggag ttccagtcca tgacgacaag taagttgcca gattcttgtc 600 c 601 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solyc12g010110.1 in Chromosome 12 <400> 3 tctccttaga tcactttctg ttatctttat gttcgctcta tcaagaagca taacagttca 60 caattatgca cggatggaag gttctttttt cagacatgga tgttgctgct tctgtagtcc 120 ctgttgattt gtcttgtttt gataagaagg atggtatacc ggaggaagca tttgctaaag 180 ttcaggaaat tattaacagc accgattggc taaatcaaaa gggtgatgct gctagcaaaa 240 cgctcgaaca aataactgaa tcaaatttga tcccagaaaa attgggatct ccacctgaca 300 caatagccac taccaagctc attgatcaag ctactttgga gaaccctcaa gagaggcaag 360 aacttgcagc attagtgaat aatactaagg gcttggcaca gtctactttg gagcagcagg 420 ttgggtcatc ctctgaagca taccgtagta acaaacaaga agctatgttt cagcttgttg 480 aaacaaaagg taagatgaaa atgtcatact tgcaataatt aatctcgctt tcataacctt 540 cccctattgg cactagtgta aaatctagtg ctgaatttca gattgttgga aaaaaaaagg 600 c 601 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM4 forward primer <400> 4 ggcttacagt gttgagtagc g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM4 reverse primer <400> 5 cccttccaca cacctggtaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM1 forward primer <400> 6 aggtgcaggg ttcaatacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM1 reverse primer <400> 7 agctgcaaag taaacacggt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM5 forward primer <400> 8 tgctcgaact ttaagcagca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM5 reverse primer <400> 9 gcacttgaag ctgctgtttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM6 forward primer <400> 10 tggggttgga aagtctacca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM6 reverse primer <400> 11 caacctgcag cagaacatgt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM2 forward primer <400> 12 actctcaaag ttggggtgct 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM2 reverse primer <400> 13 agccaacagt actggaagta ga 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM3 forward primer <400> 14 aaaagggtga tgctgctagc 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM3 reverse primer <400> 15 tgagggttct ccaaagtagc t 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM7 forward primer <400> 16 gtagtctcct ccgggcaaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bwr12-HRM7 reverse primer <400> 17 ggtccattga gtgctgaacc 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 중 301번째 염기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속된 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 SNP 마커 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 토마토 풋마름병 저항성 개체는 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) WR-1 균주에 대해 저항성을 가지는 것인, 조성물.
  3. 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트, 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트 및 서열번호 14 및 15의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 프라이머 세트.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 토마토 풋마름병 저항성 개체는 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum) WR-1 균주에 대해 저항성을 갖는 것인, 프라이머 세트.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction) 또는 다중 PCR(multiplex PCR)에 사용하기 위한 것인, 프라이머 세트.
  6. 청구항 3의 프라이머 세트를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별용 키트.
  7. a) 시료로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하는 단계;
    b) 상기 추출된 유전체 DNA를 주형으로 하여 청구항 3의 프라이머 세트로 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 증폭된 산물을 분석하는 단계
    를 포함하는 토마토 풋마름병 저항성 개체 판별 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 c) 단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 다형성 부위의 염기를 결정하는 것인, 방법.
KR1020200177464A 2020-12-17 2020-12-17 토마토 풋마름병 저항성 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 풋마름병 저항성 판별 방법 KR20220087095A (ko)

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