KR102024212B1 - ＤＮＡ 마커를 포함하는 벼 키다리병 저항성 유전자 qBK1WD를 가진 벼 품종 선별용 조성물 및 이를 이용한 저항성 벼 품종 선별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키다리병 (bakanae disease) 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키다리병 저항성 선별용 키트, 및 (a) 벼 시료의 DNA로부터 제1항의 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커의 다형성 부위인 서열번호 31의 241번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공되는 벼 키다리병 저항성 품종 선별용 조성물은 키다리병 저항성 유전자의 위치와 아주 밀접하게 연관된 마커를 이용하여 효율적으로 키다리병 저항성 및 감수성 개체를 구분할 수 있으므로, MAS (marker-assisted selection)을 통한 키다리병 저항성을 개선하는 벼 육종에 유용할 수 있다.

Description

ＤＮＡ 마커를 포함하는 벼 키다리병 저항성 유전자 qBK1WD를 가진 벼 품종 선별용 조성물 및 이를 이용한 저항성 벼 품종 선별 방법 {Composition for selecting variety resistant to rice bakanae disease containing qBK1WD gene comprising DNA marker and method for selecting variety resistant to rice bakanae disease using DNA marker}

본 발명은 키다리병 (bakanae disease) 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키다리병 저항성 선별용 키트, 및 (a) 벼 시료의 DNA로부터 제1항의 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커의 다형성 부위인 서열번호 31의 241번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법에 관한 것이다.

육종이란 생물의 유전질(遺質)을 개선하거나 변경함으로써 인류의 생활에 이용가치가 더 높은 작물의 신종(新種) 또는 새로운 품종을 육성하는 기술이다. 새로운 품종은 그 형질(특성)이 조금이라도 기존의 것과는 다르고, 그것이 작물로서 농업생산에 유익한 우수성, 균등성 및 영속성을 지녀야만 한다. 한편, 냉해병해 또는 충해 등에 대한 저항성을 향상시킨 신품종을 육성 보급하면 재배의 안전성을 증대할 수 있다. 특히, 내병성(耐病性), 내충성(耐性) 품종의 보급으로 농약을 절약할 수 있는 등 농업경영의 합리화를 꾀할 수 있다.

벼 키다리병(Bakanae disease)은 Gibberella fujikuroi 또는 Fusarium moniliforme 등에 의해 발생하는 대표적인 종자전염성 질병으로, 육묘시부터 본답시까지 발생하는 병해이다. 묘가 비정상적으로 신장하는 병징때문에 키다리병이라 명명된다. 일본에서 1898년 처음 보고되었으며, 우리나라에서는 1960년대 일부 농가에 심하게 발생하여 문제가 되었고, 최근 들어 벼 종자 내부의 심한 감염과 약제에 대한 저항성균의 출현 등에 의하여 그 발병이 급격히 증가하여 보급종 종자에까지 발병하고 있는 추세이다. 또한 벼 키다리병에 대하여 저항성이 높은 벼 품종이 개발되어있지 않아, 방제를 위한 농약살포에 막대한 농약과 노동력이 소모되고 있고, 이에 따라 생산비 절감과 친환경 농산물의 생산에 큰 걸림돌이 되고 있는 실정이다.

이러한 감염을 예방하기 위한 벼 종자소독법으로는 ⅰ)적당한 온도의 온수탕을 만들어 파종종자를 일정시간동안 침지시킴으로써 병원균 포자나 유해 미생물을 살균, 예방하는 방법인 온탕침법(溫湯浸法)이나, ⅱ)헥사코나졸(hexaconazole), 테부코나졸(tebuconazole)과 같은 새로운 종자소독제들이 개발 보급되고 있으나, ⅰ)온탕침법은 대량의 종자를 균일한 온도로 처리하기가 어렵다는 한계점이 있고, ⅱ)종자소독제와 같은 화학적 처리는 약제 저항성 균의 출현이 우려되는 문제점이 있다. 따라서 벼 키다리병의 근본적인 해결을 위해서는 벼 키다리병 병원균에 대한 저항성 품종의 재배가 필요하다.

종래의 벼 키다리병 저항성 평가를 위한 검정방법으로는, ⅰ)병원균의 포자 배양액에 벼 종자를 침지한 후 육묘상에 파종하여 균계에 따른 도장과 고사 증상을 품종별로 비교하는 방법, ⅱ)토양-귀리 배지에서 배양한 병원균을 살균 토양과 혼합한 상토에 종자를 파종하여 육묘상에서 키다리병 발병을 조사하는 방법, ⅲ)시험관 배양을 통한 실내검정법, ⅳ)포자 배양액에 벼 종자를 침지한 후 포장에서 검정하는 방법 등이 있다. 그러나 이들은 방법에 따라 정밀도가 떨어지거나, 넓은 면적을 필요로 하며, 검정하는 데 장기간의 시간이 소요되는 등의 한계점이 존재한다.

새로운 품종을 개발하여 생산하기 위해서는 일반적으로 8-12년 이상의 장기간이 소요되며, 계통 전개 및 선발을 위한 넓은 재배면적이 필요하다. 우리나라에서 재배되고 있는 벼 품종들은 대부분 벼 키다리병에 약하여 저항성 품종에 대한 개발요구가 매우 높다. 따라서, 벼 유전자원 및 교배집단 대상 저항성 자원 및 계통의 선발 등에 소요되는 시간과 비용 절감을 위해 정밀하면서도 객관성이 있는 검정결과를 얻을 수 있는 가장 효율적인 검정방법인 분자표지방법이 매우 필요한 실정이다.

분자 표지방법은 분자 육종시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 널리 이용되고 있다. 분자표지를 이용한 벼 육종은 환경변이에 영향을 받지 않고 어린 시기에 형질을 탐색할 수 있기 때문에 대량의 자원을 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있다. 가장 먼저, 염색체 내 제한효소 인식부위의 변이의 의해 발생하는 염기서열 길이 차이를 이용한 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms) 방법이 개발되었으나 이 방법은 방사선 동위원소를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 이후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용한 핵산지문법(fingerprinting)으로서, RAPD(randomly amplified polymorphic DNA) 방법 등이 개발되었다. PCR 방법은 10~20여 개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 올리고뉴클레오타이드(이하 프라이머)을 생물체의 DNA 또는 RNA와 결합(annealing)시킨 후, 내열성 DNA 중합 효소(Tag DNA Polymerase)를 첨가하여 합성반응이 반복적으로 이루어지게 하는 방법이다. 이것은 다른 방법에 비해 소량의 DNA(1-50ng)만을 요구하며, 간편하고 빠르게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 갖고 있다. PCR 방법으로 분석하는 상기 방법 중 RAPD 방법은 비특이적 PCR 산물이 증폭되므로 재현성이 떨어지는 단점이 있고, AFLP(Amplified Fragment Length polymorphism) 방법은 높은 DNA 다형성(polymorphism)검출로 각광을 받고 있지만 재현성이 떨어지는 밴드의 출현과 분석이 복잡하며, SSR (single sequence repeat)방법은 DNA 반복 배열인 초위성체(microsatellite) 영역의 염기배열 정보를 근거로 PCR 프라이머를 제작하여 개체 내의 초위성체를 분석하는 방법으로 상기 단순염기서열의 반복수는 품종간 또는 개체 간에 다르게 나타나기 때문에 이 부분을 PCR 반응으로 증폭하였을 때 다형화 현상이 나타나게 되며 이를 동물과 식물의 유전 연구 및 분자마커 개발에 활발히 이용하고 있다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 벼 키다리병 저항성인 원씨대수로부터 저항성 유전자인 qBK1 ^WD 를 탐색하였으며, 이 벼에 존재하는 수많은 분자표지 중 qBK1 ^WD 를 가진 저항성 품종을 선발할 수 있는 마커를 발굴하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 31의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 241번째 염기가 A또는 G이고, 상기 241번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 제1항의 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커를 검출 또는 중폭할 수 있는 제제를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 벼 시료의 DNA로부터 제1항의 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커의 다형성 부위인 서열번호 31의 241번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 31의 염기서열로 구성되는, 키다리병 저항성 형질을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 서열번호 31의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 241번째 염기가 A또는 G이고, 상기 241번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

상기 마커는 qBK1 ^WD 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호 31로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 31의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 241번째 염기가 A또는 G이고, 상기 241번째 염기를 포함하는 5 내지 100개, 구체적으로 5 내지 70개, 보다 구체적으로 5 내지 60개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커일 수 있다. 또한, 상기 마커는 241번째 염기가 A인 경우 키다리병 저항성 벼 품종인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

본 발명에서의 용어, "키다리병 (Bakanae disease)"은 Gibberella fujikuroi 또는 Fusarium moniliforme 등에 의해 발생하는 대표적인 종자전염성 질병으로, 육묘시부터 본답시까지 발생하는 병해이다. 묘가 비정상적으로 신장하는 병징때문에 키다리병이라 명명된다. 일본에서 1898년 처음 보고되었으며, 우리나라에서는 1960년대 일부 농가에 심하게 발생하여 문제가 되었고, 최근 들어 벼 종자 내부의 심한 감염과 약제에 대한 저항성균의 출현 등에 의하여 그 발병이 급격히 증가하여 보급종 종자에까지 발병하고 있는 추세이다. 또한 벼 키다리병에 대하여 저항성이 높은 벼 품종이 개발되어있지 않아 피해를 막기 어려운 상황이다.

본 발명의 용어, "저항성"은 외부의 스트레스에 대해 견디는 성질을 의미하며, 구체적으로 질병 등의 감염에 내성을 가지거나, 해충 등의 피해를 견디는 성질을 의미한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 벼 키다리병 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "개체"란, 벼 키다리병 저항성을 확인하고자 하는 대상인 벼를 의미하며, 상기 벼로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 키다리병 저항성이 있는 벼를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커를 검출 또는 중폭할 수 있는 제제를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 키다리병 저항성 벼를 선별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 27 또는 29 및 28 또는 30으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 테트라 마커 방법에 의한 테트라 프라이머를 사용하는 것일 수 있다.

상기 테트라 마커는 네 개의 프라이머를 사용하여 SNP의 염기 변이에 따라 PCR의 결과물이 달라지는 특성을 이용하여 PCR 및 전기영동만으로 대상의 SNP 염기를 간단하게 분석할 수 있는 분자 마커의 한 종류이다 (Ye et al. 2001).

본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 27 또는 29 및 28 또는 30의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 전기영동 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 전기영동 키트는 전해질 중에 존재하는 하전(荷電) 입자에 직류전압을 걸면 정의 하전 입자는 음극으로, 부의 하전 입자는 양극으로 향하여 이동하는 특성을 통해 크기가 다른 성분들이 분리되어 분석하는 성분을 파악할 수 있으며, 특히 DNA의 경우, 음전하를 띄기 때문에 양극으로 이동하면서 그 크기에 따라 이동하는 속도가 다르기 때문에 본 발명에서 사용되는 테트라 프라이머에 의해 형성된 PCR 결과물의 폴리뉴클레오티드 크기 차이에 따라 이동하는 속도에 변화가 생기는 점을 이용하여 키다리병 저항성 벼를 선별할 수 있다.

본 발명의 DNA 칩 키트는 키다리병 저항성 벼 선별용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 키다리병 저항성 벼를 선별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 키다리병 저항성 벼 선별용 DNA 칩 키트는 서열번호 31의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 241번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 키트일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 벼 시료의 DNA로부터 제1항의 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 SNP 마커의 다형성 부위인 서열번호 31의 241번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법을 제공한다.

상기 선별 방법은 상기 241번째 염기가 A인 경우, 키다리병 저항성 벼인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 (a)단계는 서열번호 27 또는 29 및 28 또는 30으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것일 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 전기영동, 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 서열번호 31의 염기서열로 구성되는, 키다리병 저항성 형질을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 키다리병 저항성 형질을 갖는 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 키다리병 저항성을 가진다고 판단할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 또한 키다리병 저항성 형질을 가진다고 판단할 수 있다. 게다가 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 키다리병 저항성 형질과 관련된 QTL인 qBK1 ^WD 에 존재하여 상기 폴리뉴클레오티드와 키다리병 저항성 형질과의 관계는 더욱 밀접한 것으로 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 갖는 벼는 키다리병 저항성 형질을 나타낼 수 있음을 시사하며, 이러한 염기서열은 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다.

상기 폴리뉴클레오티드는 241번째 염기가 A인 경우, 키다리병 저항성 형질을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA로서 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 또한 목적하는 단편의 발현 조절을 위한 프로모터를 벡터에 함께 포함시킬 수 있다. 본 발명의 벡터는 키다리병 저항성 형질을 갖는 폴리뉴클레오티드를 가지고 있어, 상기 벡터가 벼에 주입되었을 경우, 키다리병에 대한 저항성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 키다리병 저항성을 갖는 형질전환 벼를 제공한다.

상기 "형질전환(transformation)"은 외부로부터 주어진 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 말한다.

상기 형질전환 벼는 인위적으로 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 도입하여 형질을 전환시킨 벼일 수 있고, 형질의 전환을 통해 키다리병에 대해 감수성이었던 형질이 저항성으로 전환된 벼일 수 있다.

따라서, 상기 형질전환 벼는 키다리병에 저항성을 갖는 형질전환 벼일 수 있다.

본 발명에서 제공되는 벼 키다리병 저항성 품종 선별용 조성물은 키다리병 저항성 유전자의 위치와 아주 밀접하게 연관된 마커를 이용하여 효율적으로 키다리병 저항성 및 감수성 개체를 구분할 수 있으므로, MAS (marker-assisted selection)을 통한 키다리병 저항성을 개선하는 벼 육종에 유용할 수 있다.

도 1은 키다리병 저항성 벼 유전자원인 ‘원씨대수’의 키다리병 저항성 정도이다.
도 2은 키다리병 저항성 벼 유전자 qBK1 ^WD 의 위치이다
도 3은 qBK1 ^WD 분자마커의 저항성 분자마커 중 WD-T59 선발과정이다
도 4는 BK1 ^WD 분자마커 WD-T59의 qBK1 ^WD 저항성 다형성 분자마커의 검증결과 이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 키다리병 병원균의 준비

본 발명에서 사용한 벼 키다리병의 병원균은 후사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme)에 해당하며, 국립농업과학원에서 분양받은 후사리움 모닐리포르메 균계의 CF283을 사용하였다. 벼 키다리병 저항성 품종을 검정하기 위하여 후사리움 모닐리포르메의 포자를 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 3주간 배양하였고 배양된 포자를 물에 현탁함으로써 포자현탁액을 제조하였다. 본 발명의 병원균의 포자현탁액의 농도는 물에 현탁된 포자를 현미경을 이용하여 11×10⁶ spore/mL로 조절하였다.

실험예 1. 벼 품종에 대한 키다리병 저항성 생물검정

키다리병 저항성 생물검정은 벼 키다리병 저항성 품종의 대량 검정방법 (출원번호 제10-2013-0056065)에 준하였다. 키다리병 저항성 생물검정을 위하여, 티슈 임베딩 카세트(tissue embedding cassette)를 사용하여, 서로 다른 종자들을 각각 제1용기 또는 제2용기의 서로 다른 구획 내에 치상시킨 후, 벼 키다리병 병원균 포자 현탁액이 수용되어 있는 욕조(bath)에 동시에 침지하여 접종하였다. 동일한 환경에서 벼 키다리병 병원균을 접종시킨 후, 접종된 종자들을 육묘용 상자에 구별하여 파종하고, 이로부터 품종별 총 발아 식물체 중 정상식물체(건전주)의 비율을 확인하여 객관적이고도 신속하게 저항성을 평가하였다.

포자현탁액 접종 전 균일한 접종을 위해 접종 전 종자에 존재하는 병균을 제거하기 위해 종자소독을 실시하였다. 티슈 임베딩 카세트에 담긴 종자를 Fusarium moniliforme의 희석된 포자현탁액에 침지하여 26℃에서 3일간 접종하였다. 이 때, 병원균의 균일한 접종을 위하여 하루 4회 이상 포자현탁액을 흔들어 주었다. 전단계에서 접종된 종자들을 육묘용 상자에 구별하여 파종하고 약 1개월 후 병징이 충분히 나타날 때까지 생육시킨 후 건전주와 비건전주를 평가하여 전체 품종 또는 계통별 총 생육 식물체 중 건전주의 비율을 조사하였다. 벼 품종별 키다리병 발병에 따른 건전주 및 비건전주에 대한 구분에 있어서, ⅰ)건전주는 병이 전혀 진전되지 않은 건강한 상태의 식물체와, 발병이 되어 약간의 도장이 관찰되나 이후 회복될 정도로 심각하지 않은 식물체를 말하며, ⅱ)비건전주는 심각하게 도장한 식물체, 신엽과 하위엽의 사이각도가 45°이상 벌어진 식물체, 위축된 식물체, 균에 의해 발아 직후 고사된 식물체, 위축 또는 도장 후 고사된 식물체를 말한다. 나아가 접종된 품종의 건전주 비율은, 품종별 총 발아 식물체 중 건전주의 비율로 산출하였다.

이에 도 1에 나타낸 바와 같이, 키다리병 균주 cf283를 접종하고 원씨대수와 주남 품종의 건전주 비율을 확인한 결과, 원씨대수가 1×10⁶ spore/mL의 농도에서 주남 벼 보다 유의적으로 높은 건전주 비율을 나타내었다.

실험예 2. 키다리병 저항성 유전 인자 발굴을 위한 연관성 분석

키다리병 저항성 유전자원인 ‘원씨대수’에 키다리병 감수성인 주남벼를 교배하여 육성한 F₄ 세대 200개체을 이용하여 생물검정, 유전분석 및 분자마커와 연관분석을 수행하였다.

상기 과정에서 이용된 원씨대수/주남 F₄ 세대 200개체, 원씨대수 및 주남벼에서 추출한 게놈 DNA의 PCR 증폭의 반응 방법 및 조건은 하기와 같이 실시하였다.

25ng의 상기 주형 DNA, 각 프라이머 10 pmol, 10X e-Taq 반응 버퍼(25 mM MgCl₂ 혼합), 10mM dNTP Mix, 0.02 U의 Solg? e-Taq DNA 중합효소(SolGent Co. Ltd., South Korea) 및 물을 첨가한 최종 부피 25 ㎕의 반응액을 PCR 분석에 사용하였다. PCR 증폭은 Veriti 96-Well Thermal Cycler(Applied Biosystems, Life Technologies, Grand Island, NY, USA)를 사용하였다. PCR 조건은 InDel(Insertion-deletion) primer의 마커의 경우 초기 변성은 94℃에서 2분간, 다음 변성은 94℃에서 20초, 어닐링(annealing)은 프리이머에 따라 55∼60℃에서 30초, 그리고 DNA합성은 72℃에서 40초간 총 35회를 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 7분간 합성하였다. Tetra primer의 경우에는 초기 변성 94℃에서 2분간, 다음 변성은 94℃에서 30초, 어닐링(annealing)은 프리이머에 따라 60∼65℃에서 40초, 그리고 DNA합성은 72℃에서 60초간 총 35회를 수행한 후, 마지막으로 72℃에서 7분간 합성하였다. 증폭된 PCR 산물은 EtBr이 첨가된 3% 아가로스 겔(agarose gel)을 이용하여 200V에서 1시간 동안 전기영동하였고, UV를 이용하여 다형성을 확인하였다.

실험예 3. 키다리병 저항성 양적형질 유전자좌(QTL) 분석

원씨대수와 주남벼의 전체 염기서열을 GBS (genotyping by sequencing) 방법으로 분석하여 얻은 후 벼의 12개의 염색체에서 총 135개의 다형성 Indel마커를 탐지하였다. 원씨대수/주남 F₄ 세대 200개체를 대상으로 PCR을 수행한 후 대립유전자 형을 조사하고 생물검정 결과와 종합하여 QTL 분석을 수행하였다. QTL 분석은 IciMapping v4.0.6.0 program (Meng et al. 2015)을 이용한 복합 인터벌 매핑(composite interval mapping) 방법을 이용하였으며 LOD 값 7.2이상인 SSR 마커를 탐색 목표로 지정하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, QTL 분석 결과 원씨대수의 1번 염색체 중 InDel마커인 chr01_10336087에서 chr01_26628298 범위의 영역 에서 LOD 값이 8.29로 매우 높고 표현형 설명력이 20.2%인 주동 QTL이 탐색되어 이를 qBK1 ^WD (bakanae disease resistance 1 from Wonseadaesoo)으로 명명하였다.

QTL	염색체 번호	왼쪽 primer	오른쪽 primer	PVE (%)1)	LOD
qBK1 WD	1	chr01_10336087	chr01_26628298	20.2	8.29

¹⁾ 해당 SSR 마카의 키다리병저항성 (정상식물체 비율) 설명력

실험예 4. 키다리병 저항성 유전자 qBK1 ^WD 의 1번 염색체상 위치 정밀화

상기 실험예 2를 통해 발견한, qBK1 ^WD 유전자을 이용하여 신규의 키다리병 저항성 분자마커를 규명하고자, 먼저 상기 qBK1 ^WD 의 더욱 정밀한 위치를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실험예 2를 통해 발견한 qBK1 ^WD 유전자의 범위인 1번염색체 chr01_10336087에서 chr01_26628298 범위의 영역에서 실험예 2에서 확인한 원씨대수와 주남벼의 염기서열을 바탕으로 두 품종에서 다형을 보이는 7종의 InDel 마커와 Tetra 마커를 추가로 설계하여 확보하였다. 또한 원씨대수/주남 F₅ 세대로부터 1번염색체 chr01_10336087에서 chr01_26628298 범위에서 원씨대수로부터 유래한 유전자의 존재범위가 서로 다른 7계통을 선발하여 확보한 7종의 InDel 마커와 Tetra 마커에 대한 유전자형과 키다리병 접종에 따른 저항성 여부를 확인하여 정밀 유전자 지도를 작성하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, qBK1 ^WD 는 chr01_13542347(13.54 Mbp)와 chr01_15132528 (15.13 Mbp) 사이의 영역에 위치함을 확인하였고, 그 길이는 약 1.59Mbp임을 확인하였다. 상기 영역에 존재하는 다형성 마커를 검출하기 위한 InDel 프라이머의 서열은 하기 표 2(서열번호1에서 서열번호14) 에 SNP 프라이머의 서열은 표3(서열번호15에서 서열번호30)에 나열하였다.

프라이머 ID	Forward primer (5'-3')	Reverse primer (5'-3')
Chr01_10336087	TCTGGTTGGCCCAAATGAC (서열번호 1)	CACCTTCTTAGGAGGGCGAT (서열번호 2)
Chr01_12338697	TGAAAACTTTCAACCCAGATTT (서열번호 3)	TTCGCACACCTCTTTACAAATG (서열번호 4)
Chr01_15781262	CGTGGCTGCTCTTTTGATGT (서열번호 5)	GCGAAACACCTCCATGGTTA (서열번호 6)
Chr01_16707939	AGCACATGCATCTTCCTAAACC (서열번호 7)	GCACAGCAAGGGCATAAACA (서열번호 8)
Chr01_18535452	CATTCGACCATCGGTTTTGA (서열번호 9)	TGTGGTCTTTTCTTTGCCCA (서열번호 10)
Chr01_20125412	TCTTTTAAAGTACTCCCTCC (서열번호 11)	TTTTAGTCTCACCAAGTTTG (서열번호 12)
Chr01_26628298	AAAAATTTCCCTAATTACTCGTCA (서열번호 13)	AAACATGACACGCTATAGAAAACA (서열번호 14)

프라이머 ID	Outer/Inner	Forward primer (5'-3')	Reverse primer (5'-3')
Chr01_13542347	Outer	TCACCGAAGACAACGAGTGGTGACCACA (서열번호 15)	CCCATTGCCAAGTGGAGGTAAAGCTCGA (서열번호 16)
	Inner	GTCTGATCCTCGTAGGGGATGATGCATGG (서열번호 17)	ATGGCTCTCATCGTGGTTGGGCTGGT (서열번호 18)
Chr01_14710701	Outer	AGTTAAGTCCAAGCTGGAGTGCCGCGAT (서열번호 19)	CAACTCATTTTCGCCCCAGCCCTTGTAG (서열번호 20)
	Inner	CTTTCGGCACACCCACATCCTTCACAAT (서열번호 21)	GCTCTTGTCGCCGTACCTTGTGGGTAATG (서열번호 22)
Chr01_15132528	Outer	TCCCTCCATCCAAAATTATAAGGCCTAT (서열번호 23)	GGCAATGTAAGATGTAGAATGTGGCAGT (서열번호 24)
	Inner	CAAGTTTGATTTTCCTTAAAAAGAGGAAGC (서열번호 25)	AAAACTCCCTCCGTCCCAAATTATATGA (서열번호 26)
WD-T59	Outer	CAGATAAGCTAGCAGTATAC (서열번호 27)	TACCGACCATTCCAACTGTC (서열번호 28)
	Inner	GATACTACTAAACTAAACTTG (서열번호 29)	AGAGCTCTCTCATTCCTCTT (서열번호 30)

실험예 5. qBK1 ^WD 저항성 다형성 분자마커 규명

상기 실험예 4을 통해 발견한 11개의 마커 중에서, qBK1 ^WD 유전자에 의해 키다리병 저항성을 나타내는 벼 품종을 판별할 수 있는 다형성 마커를 선발하고자 하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, 11개의 마커 중에서도 WD-T59 증폭 산물을 이용하는 경우에 신광 등 기존에 알려진 qBK1 보유 품종, 그리고 qBK1 ^WD 를 보유한 원씨대수를 구분할 수 있음을 확인하였다. 원씨대수의 WD-T59 증폭 산물은 약 344 bp 및 260bp인 반면 일품, 주남 등 감수성 품종 및 신광, NIL, 밀양299호 등 qBK1 보유 품종은 344 bp 및 280bp의 크기를 나타내어 뚜렷하게 구분되었으나, 나머지 10개의 마커 (Chr01_10336087, Chr01_12338697, Chr01_15781262, Chr01_16707939, Chr01_18535452, Chr01_20125412, Chr01_26628298, Chr01_13542347, Chr01_14710701 및 Chr01_15132528)의 증폭 산물로는 원씨대수와 주남은 구분가능하였으나 감수성 품종 또는 신광 등 qBK1 보유 저항성 품종을 구분할 수 없음을 확인하였다.

상기 결과를 통해, WD-T59는 원씨대수 유래의 qBK1 ^WD 를 포함하고 있는 벼 품종과 신광 유래의 BK1을 포함하고 있는 벼 품종을 용이하게 구분할 수 있으므로, qBK1 ^WD 유전자를 포함하는 키다리병 저항성 품종의 판별용 분자마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실험예 6. qBK1 ^WD 저항성 다형성 분자마커의 검증

상기 실험예 5를 통해 발견한 WD-T59 마커가 qBK1 ^WD 유전자를 포함하는 키다리병 저항성 품종의 판별에 사용될 수 있는지 검증하였다.

구체적으로, WD-T59 마커의 탐지 대상으로서 실시예 3에서 확보한 원씨대수/주남 F₅ 세대로부터 1번염색체 chr01_10336087에서 chr01_26628298 범위에서 원씨대수로부터 유래한 유전자의 존재범위가 서로 다른 7계통을 대상으로 탐지하였다. 이때, 주남과 원씨대수를 각각 키다비병에 대한 감수성과 저항성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, WD-T59 마커의 증폭 산물이 약 344 bp 및 260bp로 원씨대수와 동일한 유전자형을 보이는 4계통은 키다리병 저항성 생물검정 결과, 원씨대수와 동일한 건강한 표현형을 나타냄을 확인하였다. 반면, WD-T59 마커의 증폭 산물이 344 bp 및 280bp로 주남와 동일한 유전자형을 보이는 3계통은 키다리병 저항성 생물검정 결과, 주남벼와 같이 병에 약한 표현형을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통해, WD-T59는 qBK1 ^WD 유전자를 포함하는 키다리병 저항성 품종의 판별용 분자마커로 사용될 수 있으며, 이에 따라 키다리병 저항성 유전자, 특히 qBK1 ^WD 유전자를 이용한 키다리병 저항성 중간모본의 육성 및 품종개발에 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Composition for selecting variety resistant to rice bakanae disease containing qBK1WD gene comprising DNA marker and method for selecting variety resistant to rice bakanae disease using DNA marker <130> KPA180396-KR <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_10336087 forward primer <400> 1 tctggttggc ccaaatgac 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_10336087 reverse primer <400> 2 caccttctta ggagggcgat 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_12338697 forward primer <400> 3 tgaaaacttt caacccagat tt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_12338697 reverse primer <400> 4 ttcgcacacc tctttacaaa tg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_15781262 forward primer <400> 5 cgtggctgct cttttgatgt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_15781262 reverse primer <400> 6 gcgaaacacc tccatggtta 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_16707939 forward primer <400> 7 agcacatgca tcttcctaaa cc 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_16707939 reverse primer <400> 8 gcacagcaag ggcataaaca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_18535452 forward primer <400> 9 cattcgacca tcggttttga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_18535452 reverse primer <400> 10 tgtggtcttt tctttgccca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_20125412 forward primer <400> 11 tcttttaaag tactccctcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_20125412 reverse primer <400> 12 ttttagtctc accaagtttg 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_26628298 forward primer <400> 13 aaaaatttcc ctaattactc gtca 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_26628298 reverse primer <400> 14 aaacatgaca cgctatagaa aaca 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_13542347 Outer forward primer <400> 15 tcaccgaaga caacgagtgg tgaccaca 28 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_13542347 Outer reverse primer <400> 16 cccattgcca agtggaggta aagctcga 28 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_13542347 Inner forward primer <400> 17 gtctgatcct cgtaggggat gatgcatgg 29 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_13542347 Inner reverse primer <400> 18 atggctctca tcgtggttgg gctggt 26 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_14710701 Outer forward primer <400> 19 agttaagtcc aagctggagt gccgcgat 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_14710701 Outer reverse primer <400> 20 caactcattt tcgccccagc ccttgtag 28 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_14710701 Inner forward primer <400> 21 ctttcggcac acccacatcc ttcacaat 28 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_14710701 Inner reverse primer <400> 22 gctcttgtcg ccgtaccttg tgggtaatg 29 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_15132528 Outer forward primer <400> 23 tccctccatc caaaattata aggcctat 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_15132528 Outer reverse primer <400> 24 ggcaatgtaa gatgtagaat gtggcagt 28 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_15132528 Inner forward primer <400> 25 caagtttgat tttccttaaa aagaggaagc 30 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chr01_15132528 Inner reverse primer <400> 26 aaaactccct ccgtcccaaa ttatatga 28 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD-T59 Outer forward primer <400> 27 cagataagct agcagtatac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD-T59 Outer reverse primer <400> 28 taccgaccat tccaactgtc 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD-T59 Inner forward primer <400> 29 gatactacta aactaaactt g 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD-T59 Inner reverse primer <400> 30 agagctctct cattcctctt 20 <210> 31 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD-T59 PCR product <400> 31 cagataagct agcagtatac tcagtataac atgaacataa tgtaaagtag gtactcatat 60 actcggaaag tatttcaata ccataaatgt atttagaaga gtattcaaat aaaagtacaa 120 agcttacaaa agagaagaga aaagctacta gagccatacc cgaactcttc cgaagacttc 180 cggactcctg attcctattc taattctatt ccaccagcta gatactacta aactaaactt 240 aagaggaatg agagagctct 260

Claims (10)

1. 서열번호 27, 28, 29 및 30의 프라이머 세트를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항의 조성물을 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별용 키트.
   
7. (a) 벼 시료의 DNA로부터 서열번호 27, 28, 29 및 30으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 통해 증폭 또는 검출된 수득물을 얻는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 수득물을 통해 키다리병 저항성 벼 품종에 해당여부를 결정하는 단계를 포함하는, 키다리병 저항성 벼 품종 선별 방법.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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