KR102081964B1 - 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 snp 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 벼 키다리병 저항성 판별용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별 방법에 관한 것이다.

Description

벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커{SNP marker for selecting rice cultivars resistant to bakanae disease of rice and use thereof}

본 발명은 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 벼 키다리병 저항성 판별용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별 방법에 관한 것이다.

벼 키다리병은 곰팡이 병원균인 푸사리움균(Fusarium fujikuroi)에 의해 발생하는 대표적인 종자전염성 병으로, 육묘시부터 본답시까지 발생하는 병해이다. 묘가 비정상적으로 신장하는 병징때문에 Bakanae disease라 명명된다. 일본에서 1898년 처음 보고되었으며, 우리나라에서는 1960년대 일부 농가에 심하게 발생하여 문제가 되었고, 최근 들어 벼 종자 내부의 심한 감염과 약제에 대한 저항성 균의 출현 등에 의하여 그 발병이 급격히 증가하여 보급종 종자에까지 발병하고 있는 추세이다. 또한 벼 키다리병에 대하여 저항성이 높은 벼 품종이 개발되어있지 않아, 방제를 위한 농약살포에 막대한 농약과 노동력이 소모되고 있고, 이에 따라 생산비 절감과 친환경 농산물의 생산에 큰 걸림돌이 되고 있다.

이러한 벼 종자소독을 위하여, i) 적당한 온도의 온수탕을 만들어 파종종자를 일정시간동안 침지시킴으로써 병원균 포자나 유해 미생물을 살균·예방하는 방법인 온탕침법(溫湯浸法)을 수행하거나, ⅱ) 헥사코나졸(hexaconazole), 테부코나졸(tebuconazole)과 같은 새로운 종자소독제들이 개발 보급되어 이용되고 있으나, 상기 온탕침법은 대량의 종자를 균일한 온도로 처리하기가 어렵다는 한계점이 있고, 상기 종자소독제의 사용과 같은 화학적 처리는 약제 저항성 균의 출현이 우려되는 문제점이 있다. 따라서 벼 키다리병의 근본적인 해결을 위해서는 벼 키다리병 병원균에 대한 저항성 품종을 발굴하는 것이 필요하다.

종래의 벼 키다리병 저항성 평가를 위한 검정방법으로는, i) 병원균의 포자 배양액에 벼 종자를 침지한 후 육묘상에 파종하여 균계에 따른 도장과 고사 증상을 품종별로 비교하는 방법, ⅱ) 토양-귀리 배지에서 배양한 병원균을 살균 토양과 혼합한 상토에 종자를 파종하여 육묘상에서 키다리병 발병을 조사하는 방법, ⅲ) 시험관 배양을 통한 실내검정법, ⅳ) 포자 배양액에 벼 종자를 침지한 후 포장에서 검정하는 방법 등이 있다. 그러나 이들은 방법에 따라 정밀도가 떨어지거나, 넓은 면적을 필요로 하며, 검정하는 데 장기간의 시간이 소요되는 등의 한계점이 존재한다.

새로운 품종을 개발하여 생산하기 위해서는 일반적으로 8~12년 이상의 장기간이 소요되며, 계통 전개 및 선발을 위한 넓은 재배면적이 필요하다. 우리나라에서 재배되고 있는 벼 품종들은 대부분 벼 키다리병에 약하여 저항성 품종에 대한 개발 요구가 매우 높다. 따라서, 벼 유전자원 및 교배집단 대상 저항성 자원 및 계통의 선발 등에 소요되는 시간과 비용 절감을 위해 정밀하면서도 객관성이 있는 검정결과를 얻을 수 있는 가장 효율적인 검정방법인 분자표지방법이 매우 필요한 실정이다. 분자 표지방법은 분자 육종시스템에서 유용 형질 탐색, 생물의 종 판별, 품종 분류동정 및 집단 개체군의 유연관계 분석 등의 목적으로 널리 이용되고 있다. 분자 표지를 이용한 벼 육종은 환경변이에 영향을 받지 않고 어린 시기에 형질을 탐색할 수 있기 때문에 대량의 자원을 정확하고 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있다(한국등록특허 제10-1509076호).

최근 차세대 염기서열 분석기술(Next Generation Sequencing)이 발달하면서 대용량의 염기서열 분석 비용이 감소하고, 속도가 가속화되었다. 또한, 벼 유전체 해독이 완료됨으로써 표준유전체(reference sequence)를 기반으로 전장 유전체 재염기서열 분석(whole genome re-sequencing)을 수행하여 SNP, 삽입(insertion) 그리고 결실(deletion) 등 다양한 마커들을 대량으로 단기간 안에 개발할 수 있게 되었다. 중국에서는 재래종 벼에 대한 재염기서열 분석을 통해 대량의 SNP를 탐색하여 고밀도의 분자 유전지도를 작성하였다(Nature Genet., 42:961-967, 2010).

작물 육종에 있어서 농업적으로 중요한 형질들은 독립적인 단일 유전자가 아니라 전체 염색체 상에 존재하는 수많은 유전자들에 의해서 조절되는 양적형질이다. 양적 형질은 일반적으로 많은 수의 유전자에 의하여 영향을 받을 뿐만 아니라 여러 가지 환경요인에 의해서도 상당히 영향을 받는다. 따라서 양적 형질에 있어서는 이에 영향하는 개별적인 유전자 작용이나 특성과 같은 것을 구명하는 것이 질적 형질(qualitative trait)보다 극히 곤란하다. 때문에, 양적 형질의 유전을 연구하는데 통계적 방법이 강력한 수단으로 사용되고 있으며 양적 형질에 영향하는 유전적 요인을 여러 환경 요인으로부터 분리하여 효과적으로 추정하고자 하는 연구가 여러 학자들에 의해 수행되어 왔다. 품종 개량을 위한 분자 유전학적 기법의 이용은 DNA 수준에서의 개체의 유전적 소질에 대한 연구를 가능토록 할 수 있을 것이며, 개량 대상형질에 관련된 유전자, 즉 주유전자(major gene) 혹은 양적 형질 유전자좌위(QTL: Quantitative Trait Loci)에 대한 직접적인 선발 혹은 양적 형질 유전자좌위(QTL)에 연관되어 있는 유전적 표지(genetic marker)에 대한 선발을 통해 유전적 소질을 실현시킬 수 있는 도구를 제공할 수 있다. 표현형 정보에만 의존하는 것이 아니라 분자 유전학적인 정보의 추가적인 이용을 통해 유전적 개량을 보다 가속화할 수 있을 것이다. 따라서 오늘날은 이러한 양적형질 유전자좌를 연구하기 위해서 고밀도 분자 유전지도 작성을 통해 유전자를 찾고, 그 기능을 밝히는 등의 접근이 많이 이루어지고 있다. 현재까지 고밀도 분자 유전지도를 작성하기 위해 RFLP(restriction fragment-length polymorphism), RAPD (randomly amplified polymorphism) 및 AFLP (amplified fragment length polymorphism) 등 다양한 DNA 마커가 개발되었다(Genetics, 148:479-494, 1998).

기존의 DNA 마커들은 식별방법이 간편하지 못하고, 고비용과 많은 소요시간이 걸린다. 게다가 출현빈도가 낮다는 한계를 가지고 있다. 최근에 개발된 SNP(single nucleotide polymorphism)는 품종 또는 개체간에 훨씬 높은 다형성을 보여주며, 골고루 분포하기 때문에 이용가치가 높아 표지인자로 많은 연구가 이루어지고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 키다리병 저항성 벼 품종을 구별하는데 효율적으로 이용될 수 있는 DNA 마커를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 키다리병 저항성과 관련된 새로운 SNP 마커를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1509076호

Nature Genet., 42:961-967, 2010 Genetics, 148:479-494, 1998

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 846번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 846번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 벼 시료의 DNA로부터 제1항의 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 846번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 846번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 846번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 제공한다.

본 발명에서는 남평벼 유전체 시퀀싱과 QTL 분석 및 후보 유전자 형질전환 실험을 통해 벼 키다리병 저항성 QTL이 위치한 1번 염색체에 위치한 남평벼의 Os01g0601625 유전자가 벼 키다리병 저항성임을 밝히고, 이 유전자 내의 SNP들을 이용하여 벼 키다리병 저항성 특이적인 마커를 제작하였으며, HRM(High Resolution Melting) 분석을 실시하여 시판되고 있는 품종 중에서 저항성 품종과 감수성 품종을 명확하게 구별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 마커는 Os01g0601625 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 846번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 846번째 염기를 포함하는 5 내지 200개, 구체적으로 5 내지 150개, 보다 구체적으로 5 내지 100개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커일 수 있다. 또한, 상기 마커는 846번째 염기가 G인 경우, 벼 키다리병 저항성 벼인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 마커는 서열번호 1의 847번째 염기가 A 또는 G, 861번째 염기가 A 또는 C, 875번째 염기가 A 또는 G, 876번째 염기가 T 또는 G, 879번째 염기가 A 또는 T, 882번째 염기가 G 또는 A, 및 890번째 염기가 G 또는 A 중 하나 이상의 SNP를 추가로 포함할 수 있고, 이러한 염기서열을 포함하는 5 내지 200개, 구체적으로 5 내지 150개, 보다 구체적으로 5 내지 100개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커일 수 있다.

본 발명의 용어, "저항성"은 외부의 스트레스에 대해 견디는 성질을 의미하며, 구체적으로 질병 등의 감염에 내성을 가지거나, 해충 등의 피해를 견디는 성질을 의미한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 벼 키다리병 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "개체"란, 벼 키다리병 저항성을 확인하고자 하는 대상인 벼를 의미하며, 상기 벼로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 벼 키다리병 저항성이 있는 벼를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 벼 키다리병 저항성 SNP 마커를 발굴하기 위해, 시판되고 있는 벼 키다리병 저항성 및 감수성 품종에 해당하는 남평벼 및 니폰바레 벼를 대상으로 전체 유전체 시퀀싱을 통해 벼 유전체의 SNP를 탐색한 후, 벼 키다리병 저항성과 연관된 QTL 주변의 SNP로 범위를 좁혀 탐색을 진행한 결과, 1번 염색체에서 다수의 SNP를 발견하였고, 이 구간에서 토마토 잎곰팡이병 저항성 유전자인 Cf-2와 상동성이 있는 유전자인 Os01g0601625가 키다리병 저항성을 부여하는 유전자로 추정되었다. 상기 후보 유전자에 포함된 다수 SNP를 벼 키다리병 저항성 품종 및 감수성 품종에서 확인한 결과, 본 발명의 SNP 마커가 벼 키다리병의 저항성 또는 감수성의 판별을 정확하게 할 수 있었다. 또한, 범위를 넓혀 21가지 품종에 대해 HRM 분석을 통해서 SNP 마커를 확인한 결과, 저항성 품종과 감수성 품종이 확연히 구별되는 것을 확인하였다. 따라서, 상기의 실험을 통해 본 발명의 SNP마커의 신뢰성 및 정확성을 확인할 수 있었고, 상기 SNP 마커의 유전자형을 증폭하고 HRM 분석을 수행하여, SNP 마커의 유전자형을 판독하면, 벼 키다리병 저항성 벼를 판별할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 벼 키다리병 저항성 벼를 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 2 및 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 HRM 분석 키트는 벼 키다리병 저항성 벼 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 벼 키다리병 저항성 벼를 판단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 벼 키다리병 저항성 벼 판단용 HRM 분석 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 846번째 염기의 변이에 따른 이중가닥의 해리 정도의 차이를 감지하여 유전자형을 판단하는 키트일 수 있다. 상기 "고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 분석" 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법으로, 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 이중가닥 DNA(dsDNA)에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리할 수 있다. 본 발명에서는 벼 키다리병 저항성 벼를 선별하기 위해서 HRM 분석을 사용하였다.

상기 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 DNA 칩 키트는 벼 키다리병 저항성 벼 판단용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 벼 키다리병 저항성 벼를 판별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 벼 키다리병 저항성 벼 판단용 DNA 칩 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 846번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 벼 키다리병 저항성 판별용 키트일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 벼 시료의 DNA로부터 제1항의 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 846번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별 방법을 제공한다.

상기 판별 방법은 상기 846번째 염기가 G인 경우, 벼 키다리병 저항성 벼인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가아제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것일 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

"HRM 분석" 기술은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.

구체적으로, 상기 (b)단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는, 벼 키다리병 저항성 형질을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명자들은 벼 키다리병 저항성을 갖는 벼를 판별하기 위해 전체 유전체 시퀀싱을 통해 SNP를 탐색하였고 탐색 과정에서 벼 키다리병 저항성과 관계가 있는 QTL 주변의 유전자를 발견하였다. 또한, 해당 유전자의 ORF 서열에서 SNP를 발견했으며, 해당 SNP가 벼 키다리병 저항성을 정확하게 판별 가능한 SNP 마커임을 입증하였다.

한편, 벼 키다리병 저항성 형질을 갖는 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 벼 키다리병 저항성을 가진다고 판단할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 또한 벼 키다리병 저항성 형질을 가진다고 판단할 수 있다. 게다가 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 벼 키다리병 저항성 형질과 관련된 SNP가 추가로 존재하여 상기 폴리뉴클레오티드와 벼 키다리병 저항성 형질과의 관계는 더욱 밀접한 것으로 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 갖는 벼는 벼 키다리병 저항성 형질을 나타낼 수 있음을 시사하며, 이러한 염기서열은 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 846번째 염기가 G일 경우 벼 키다리병 저항성 형질을 나타낼 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 847번째 염기가 A, 861번째 염기가 A, 875번째 염기가 A, 876번째 염기가 T, 879번째 염기가 A, 882번째 염기가 G 및 890번째 염기가 G 중 하나 이상인 경우, 벼 키다리병 저항성 형질을 나타내는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA로서 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 또한 목적하는 단편의 발현 조절을 위한 프로모터를 벡터에 함께 포함시킬 수 있다. 본 발명의 벡터는 벼 키다리병 저항성 형질을 갖는 폴리뉴클레오티드를 가지고 있어, 상기 벡터가 벼에 주입되었을 경우, 벼 키다리병에 대한 저항성을 가지는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 벼 키다리병 저항성을 갖는 형질전환 벼를 제공한다.

상기 "형질전환(transformation)"은 외부로부터 주어진 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 말한다.

상기 형질전환 벼는 인위적으로 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 도입하여 형질을 전환시킨 벼일 수 있고, 형질의 전환을 통해 벼 키다리병에 대해 감수성이었던 형질이 저항성으로 전환된 벼일 수 있다.

따라서, 상기 형질전환 벼는 벼 키다리병에 저항성을 갖는 형질전환 벼일 수 있다.

본 발명의 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 HRM(high resolution melting) 분석 방법은 벼 키다리병 저항성 벼를 판별할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 육안으로 구별되지 않는 벼 키다리병 저항성 벼를 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 벼 키다리병에 대한 저항성을 갖는 벼 품종을 구별할 수 있으며, 벼 품종개량 및 개량된 품종에 대한 벼 키다리병 저항성을 평가할 수 있을 것이다.

도 1은 남평벼의 키다리병 저항성 QTL 부위 및 Os01g0601625 유전자 위치를 도시한 것이다.
도 2는 남평벼의 Os01g0601625 유전자 코딩 단백질의 도메인 구조를 도시한 것이다: SP: signal peptide, LRR: leucine-rich repeat, TM: transmembrane
도 3은 남평벼의 Os01g0601625 유전자가 삽입된 형질전환 벡터를 도시한 것이다: LB: left border, HYG(R): hygromycin resistance gene, CAMV35S: cauliflower mosaic virus(CaMV) 35S promotor, RB: right border
도 4는 남평벼의 Os01g0601625 유전자가 형질전환된 벼 계통의 병반응을 검정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 남평벼의 Os01g0601625 유전자 형질전환 계통의 벼 키다리병 균주를 접종한 후 4주차 고사율을 나타낸 것이다.
도 6은 Ff-1.1HRM 마커로 21종의 벼 품종을 분석한 결과를 나타낸 것이다: 녹색선 : 저항성 품종(남평벼), 적색선: 감수성품종들

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 남평벼의 키다리병 저항성 QTL 부위 및 키다리병 저항성 후보유전자 확인

선행연구를 통해 남평벼의 키다리병 저항성 양적형질유전자좌(QTL)인 qFfR1이 벼 1번염색체 87.9-91.7 cM 구간에 위치하고 있음을 구명하였다(Ji et al. (2018) Mapping of a major quantitative trait locus for bakanae disease resistance in rice by genome resequencing. Molecular Genetics and Genomics 293:579-586). 이 구간에서 토마토 잎곰팡이병 저항성 유전자인 Cf -2와 상동성이 있는 유전자인 Os01g0601625가 키다리병 저항성을 부여하는 것으로 추정되었다(도 1).

실시예 2. 남평벼의 Os01g0601625 유전자 분리 및 염기서열 확인

Os01g0601625 부위의 니폰바레 벼 표준유전체 염기서열을 참조하여 남평벼의 Os01g0601625 유전자 부위를 long PCR로 증폭하였다. 이 때, ORF의 5' upstream promoter 부위 약 2kb, 3' downstream terminator 부위 약 1kb가 포함되도록 프라이머를 아래 표와 같이 제작하였다.

서열번호	구분	염기서열
4	forward primer	GCAGGCATGCAAGCTTTGTCGATCACCACCACCGTCCCGAA
5	reverse primer	GGCCAGTGCCAAGCTTTCATCTGCAGGGCCGGCGTTCTTTC

※ 적색부분은 In-fusion cloning을 위한 tail sequencelong PCR 과정은 다음과 같다. PCR 반응을 위해 총량 25㎕중에 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara Bio Inc., Japan) 1.0㎕, 5X PrimeSTAR GXL Buffer 5.0㎕, dNTP Mixture(2.5 mM each) 2.0㎕, 10pmol 정방향 프라이머 1.0㎕, 10pmol 역방향 프라이머 1.0㎕, 증류수 13.0㎕, 50ng/㎕ gDNA 2.0㎕로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 94℃ 3분 처리 후에, 98℃ 10초, 68℃ 8분을 30번 반복 수행하는 것이었다.

long PCR로 증폭한 남평벼의 Os01g0601625 유전자 부위를 In-fusion(Clontech, USA) cloning 방법으로 pCAMBIA1300 벡터에 삽입하였으며, 유전자가 삽입된 벡터 플라스미드를 E. Coli DH5α 균주에 transformation 한 후 균주를 배양하여 플라스미드 DNA를 추출하고 삽입부위를 시퀀싱하였다.

시퀀싱 결과 삽입부위는 프로모터 부위 2,207 bp, ORF 3,174 bp, 터미네이터 1,046 bp를 포함하여 총 6,247 bp 이었다. 상기 염기서열 중 ORF 부위 염기서열은 서열번호 1과 같으며, 상기 서열번호 1의 Os01g060125 유전자가 코딩하는 단백질은 N 말단에 시그널 펩타이드가 있고 그 뒤로 LRR 도메인과 transmembrane 도메인을 가지고 있다(도 2).

실시예 3. 남평벼의 Os01g0601625 유전자 형질전환

위와 같이 남평벼 Os01g0601625 유전자를 pCAMBIA1300 벡터에 삽입시켜 작성한 벡터를 형질전환벡터로 사용하였으며 벡터모식도는 다음과 같다(도 3). 위의 형질전환 벡터를 아그로박테리움 LBA4404 균주에 도입한 후, 키다리병 감수성 품종인 동진벼를 형질전환하였다.

동진벼와 남평벼 및 남평벼의 Os01g0601625 유전자 형질전환체 T1 계통들을 대상으로 키다리병 반응을 검정하였다.

기내유묘검정법을 사용하여 검정한 결과, 접종 후 4주 후에 접종한 동진벼는 거의 대부분 고사한 반면, 남평벼는 대부분 생존하였으며, 형질전환체 T1 계통들 역시 대부분 생존하였다(도 4). 그리고, 형질전환 계통들의 고사율은 원품종인 동진벼에 비해 현저히 낮았다(도 5).

위의 결과에 따라, 남평벼의 Os01g0601625 유전자가 키다리병 저항성을 증진시키는 유전자임이 밝혀졌다.

실시예 4. 벼 키다리병 저항성 유전자 선발 마커 개발

남평벼의 Os01g0601625 유전자와 니폰바레벼 표준유전체상의 Os01g0601625 유전자 염기서열을 비교한 결과, SNP가 53개, InDel 3개 존재하였다(표 2).

남평벼의 Os01g0601625 유전자와 벼 표준유전체(Nipponbare) Os01g0601625 유전자 염기서열 비교 결과 SNP에서 HRM 마커를 개발하였다. 개발된 HRM 마커를 Ff-1.1HRM으로 명명하였으며 프라이머 염기서열은 다음 표 3와 같고 프라이머 위치는 표 2에 나타내었다.

HRM 실험 과정은 다음과 같다. PCR 반응을 위해 총량 20㎕중에 10㎕ real time PCR mix (Biocubesytem, Suwon, Korea), 0.5㎕ 10pmol 정방향 프라이머, 0.5㎕ 10pmol 역방향 프라이머, 7㎕ 증류수, 2㎕ gDNA로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 95℃ 3분 처리 후에, 95℃ 10초, 60℃ 15초를 35번 반복 수행하는 것이었다. PCR과 HRM 분석은 CFX Connect TM Real-Time PCR Detection System(BIO-RAD, Hercules, USA)로 수행하였다. HRM 형광 정도 측정을 위해 65℃에서 95℃로 온도가 0.3℃씩 증가하면서 형광 물질의 해리속도를 측정하였다.

마커명	forward primer	reverse primer
Ff-1.1HRM	GGTTTTGGGATCTCACTAGCCT(서열번호 2)	AGACATGTTACCCAATCTATCAGGG(서열번호 3)

Ff-1.1HRM 마커로 다음 표 4에 있는 벼 품종들의 유전자형을 분석한 결과 저항성인 남평벼가 다른 감수성품종들과 뚜렷하게 구분되었다(도 6).

번호	품종	비고
1	남평	저항성
2	운광	감수성
3	화성	감수성
4	다마금	감수성
5	중생은방주	감수성
6	진흥	감수성
7	일미	감수성
8	기호	감수성
9	호품	감수성
10	오대	감수성
11	동진	감수성
12	금오	감수성
13	칠보	감수성
14	동안	감수성
15	설향찰	감수성
16	안미	감수성
17	소비	감수성
18	영안	감수성
19	낙동	감수성
20	주남	감수성
21	주지도	감수성

<110> Republic of Korea <120> SNP marker for selecting rice cultivars resistant to bakanae disease of rice and use thereof <130> P18R12C0897 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3174 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgtctaaac tggcgctcct cctccgagga gctgcaatga tcttgtggct actcatctcg 60 cagacaccat ctacctgttg tgttcatgcg agatgcgtca ccggcgagcg tgatgcactg 120 ctctccttca aggcaagcct tctggaccct tctggcaggc tgtcgtcatg gcagggtgac 180 gactgctgcc agtggaaggg agtccggtgc agcaacagaa ctggcaatat cgttgcgctt 240 aacctccgca acactaataa tttctggtac gatttctatg atgctgatgg gttgaaccta 300 ttgagaggcg gtgacttgag cctattggga ggtgaattga gctcctcttt gattgcttta 360 catcatctga ggcatctcga tctgagttgc aatttcttca acggaacgag catacctgtt 420 ttcatgggct ctttcaagaa cttgagatat ctcaacctct cctgggcagg tttcggtggg 480 aaaatacctt cgcaaattgg taatatttcc agcttacaat accttgatgt tagctcgaat 540 tatttcttcc atgaacagaa cacgtttttc atgtcttcaa ctgatctttc ttggttgcca 600 cgtctcacct ttttgaggca tgttgacatg actgacgttg acctcagttc cgtgagggat 660 tgggttcaca tggtgaacat gcttcctgct cttcaagttc ttcgtttgtc cgagtgtggc 720 cttaaccata ctgtatctaa actatcccat tcaaacctca caaatcttga ggtccttgat 780 ctatcagaca atgaacaaat ctacacgcca ctccaacaca actggttttg ggatctcact 840 agcctgaagg agctttatct atcagaatat gcatatttag cgcctgcagg acctatccct 900 gatagattgg gtaacatgtc tgctctacgt gttttagatc taagttccag ttctattgtt 960 ggtttgtttc cgaagagctt agagaatatg tgcaatttac aagtattgcg aatgaatggc 1020 aacaatattg atgcagacat aagggaattc atgcaacggt tgccaatgtg ctcgtggaat 1080 tctttggaag agttgagttt agactacaca aatatgagcg gaacattccc aacaacgttg 1140 attcgcaaaa tgagtaatct cagtgttctt ctattgtctg aaaacaagtt ggttggcgag 1200 ctacctgctg gtgtcggagc gctgggtaat ttgaaaatat tggctcttag ctacaataac 1260 ttcagtggtc cagtaccgct tgggcttgga gctgtaaatt tgaaaatttt gtatcttaac 1320 aacaacaagt tcaacggttt tgtgcctctt ggaattggag cagtaagtca tttgaaagag 1380 ttgtactaca ataatttcag cggccctgca ccatcgtggg ttggagcatt aggtaattta 1440 caaattttgg atctttccca caatagcttc agtggacctg taccaccagg gattggatca 1500 ctcagtaatt tgacaacatt ggatcttagc tataacaggt tccaaggcgt aatctctaag 1560 gatcatgttg aacatttatc tcgtctgaag tatctggatt tgtcatacaa cttcttgaaa 1620 atagatatac atacaaattc ttctccgcca ttcaaactaa gaaacgcatc tttccggtca 1680 tgtcagctgg ggccgcgctt tccattgtgg cttagatggc agactgacat tgatgctctt 1740 gttcttgaaa atacaaaatt ggatgatgtt attccggatt ggttctgggt gacattttcc 1800 cgagcttcat tcttgcaagc atcaggaaat aagttgcatg gctcattacc gccaagtcta 1860 gaacacatct cagttggtcg catatatctc ggttccaact tgttgacagg tcaagttcct 1920 caactcccta taagtatgac ttgcttgaat ttgtcttcaa actttttgtc agggccattg 1980 ccatctctca aagctccact gctggaggag ctgttgcttg ccaataataa tattacaggc 2040 agcatcccac catccatgtg ccaattgact ggtttgaacc gtttggacct gtcaggaaac 2100 aaaataacag gagatcttga acaaatgcaa tgctggaaac agtcagatat gcccaataca 2160 aactctgcag ataaatttgg ttctagtatg ctcagtcttg ccttgaacca caatgaactt 2220 tcaggtatat ttcctcaatt tcttcaaaat gcctcacaat tattgttcct ggatctttca 2280 cacaacaggt tttttggaag tttgccaaag tggttaccag aaagaatgcc aaacttgcaa 2340 atcttgaggt tgcggtcaaa tattttccat ggccatattc ccaagaacat tatttacctt 2400 ggtaaacttc attttctgga catagcacac aacaacatat caggatccat accagactcc 2460 ttagcaaact tcaaagcaat gactgttata gctcagaata gtgaggacta tatttttgaa 2520 gagagcatac cagtaatcac gaaagatcaa cagcgtgact acacctttga aatctacaat 2580 caggtggtta atcttgattt ttcatgtaac aagttaacag cgcatattcc agaagaaata 2640 catttactta ttggacttac caatttaaat ttatcaagta atcagttcag tggaacaatc 2700 catgatcaaa ttggtgattt gaagcagttg gaatcccttg acttgtccta caatgaatta 2760 tctggtgaaa tccccccaag tttgtcagct ctaacttctc taagccactt gaacctatca 2820 tacaacaatt tatcaggcac aataccatca ggatcacagc tacaagcact cgatgaccag 2880 atttatatat atgttggaaa tcctggtctt tgtgggcctc ctctcttgaa gaactgttca 2940 actaatggta cacaacaaag tttctatgaa gatagaagcc atatgggatc tctctacctc 3000 gggatgagca taggatttgt gattggtcta tggactgtgt tttgcaccat gatgatgaag 3060 agaacctgga tgatggctta ctttcggatc attgacaatt tatatgataa ggcctatgta 3120 caagtggcta taagctggag tcgcttgatg cggaaaaacc aagatgcagc atga 3174 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ff-1.1HRM forward primer <400> 2 ggttttggga tctcactagc ct 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ff-1.1HRM reverse primer <400> 3 agacatgtta cccaatctat caggg 25 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 4 gcaggcatgc aagctttgtc gatcaccacc accgtcccga a 41 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 ggccagtgcc aagctttcat ctgcagggcc ggcgttcttt c 41

Claims (11)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 846번째 염기가 G 또는 C, 847번째 염기가 A 또는 G, 861번째 염기가 A 또는 C, 875번째 염기가 A 또는 G, 876번째 염기가 T 또는 G, 879번째 염기가 A 또는 T, 882번째 염기가 G 또는 A, 및 890번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 846번째 염기, 847번째 염기, 861번째 염기, 875번째 염기, 876번째 염기, 879번째 염기, 882번째 염기, 및 890번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 846번째 염기가 G인 경우 벼 키다리병 저항성 벼인 것으로 판별하는 것인, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.
3. 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물로서,
   상기 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 846번째 염기가 G 또는 C, 847번째 염기가 A 또는 G, 861번째 염기가 A 또는 C, 875번째 염기가 A 또는 G, 876번째 염기가 T 또는 G, 879번째 염기가 A 또는 T, 882번째 염기가 G 또는 A, 및 890번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 846번째 염기, 847번째 염기, 861번째 염기, 875번째 염기, 876번째 염기, 879번째 염기, 882번째 염기, 및 890번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브인 것인, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것인, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 조성물.
6. 제3항의 조성물을 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 키트.
7. 제6항에 있어서,
   상기 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 키트.
8. (a) 벼 시료의 DNA로부터 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계로서, 상기 벼 키다리병 저항성 벼 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 846번째 염기가 G 또는 C, 847번째 염기가 A 또는 G, 861번째 염기가 A 또는 C, 875번째 염기가 A 또는 G, 876번째 염기가 T 또는 G, 879번째 염기가 A 또는 T, 882번째 염기가 G 또는 A, 및 890번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 846번째 염기, 847번째 염기, 861번째 염기, 875번째 염기, 876번째 염기, 879번째 염기, 882번째 염기, 및 890번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 벼 키다리병 저항성 벼 판별 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 846번째 염기가 G인 경우, 벼 키다리병 저항성 벼인 것으로 판별하는 것인, 판별 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것인, 판별 방법.
11. 제8항에 있어서,
    상기 (b)단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것인, 벼 키다리병 저항성 벼 판별 방법.
    

Images