KR20180055075A - 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커는 새로이 탐색된 고추 풋마름병 저항성 QTL(양적형질유전자좌)에 연관된 마커로 우량 고추 품종 육성을 위한 분자 재료로 유용하게 활용될 것이다.

Description

고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도{Single nucleotide polymorphism marker for selecting bacterial wilt-resistant or sensitive pepper cultivar and uses thereof}
본 발명은 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
고추의 풋마름병(bacterial wilt)은 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 세균에 의해 감염되는 가지과 식물의 대표적 병해로서 국내 고추생산에 상당한 피해를 주고 있으나 아직 병원균-기주 상호반응에 관한 분자적 기작 및 저항성 연관 유용마커의 개발이 이루지지 않아 저항성 품종 육종이 어려운 실정이다.
특히 고추 풋마름병은 다른 고추 관련 주요병(탄저병, 역병, 흰가루병 등)들과 마찬가지로 양적형질의 특성을 가지고 있기 때문에 단일유전자 및 소수 주동 유전자들에 의한 병저항성 연구와는 달리 저항성 관련 유전자를 정확히 탐색하기 위해서는 고밀도 유전지도를 기반으로 한 양적형질유전자좌(QTL, quantitative trait loci) 분석이 수행되어야 한다.
고추 풋마름병 저항성에 관한 연구는 현재까지 매우 미흡한 실정이다. 최근까지 보고된 고추 풋마름병 저항성 관련 QTL은 Mimura 등(2009, J. Japan. Soc. Hort. Sci. 78(3):307-313)에 의해서 보고된 고추 염색체 1번에 존재하는 Bw1이 유일하다.
최근 들어 차세대시퀀싱(NGS, next generation sequencing) 기술을 이용한 GBS(genotyping-by-sequencing) 방법은 대량마커분석 시스템을 사용함으로써 분석에 투입되는 시간과 비용을 절감할 수 있고, 또한 초고밀도 유전자 지도 제작 및 근접분자지표 개발을 가능하게 하였다.
본 발명자들은 Mimura 그룹에서 사용된 고추 풋마름병 저항성 유전자원인 'LS2341'과는 다른 저항성 유전자원인 'YCM334'를 이용하여 고추 풋마름병 저항성 관련 QTL를 탐색하였으며, 결과적으로 고추 염색체의 7번과 8번에서 새로운 QTL를 탐색하였다.
한편, 한국등록특허 제1092988호에는 '감자 풋마름병 레이스 특이 진단용 프라이머'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0894620호에는 '풋마름병원균 특이 디엔에이 단편 검출을 위한 합성올리고뉴클레오티드 및 이들을 이용한 풋마름병 병원균에 감염된 식물체의 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고추 풋마름병 저항성 계통인 'YCM334'와 감수성 계통인 '태안'을 모부본으로 하여 169계통의 F8 RIL 집단을 제작하였고, 상기 유전집단을 이용하여 고밀도 유전자지도를 작성하고 총 5개의 고추 풋마름병 저항성 관련 QTL(양적형질유전자좌)을 탐색하였다. 그 후 탐색된 후보 QTL 중 각각 7번과 8번 염색체에 위치하는 두 개의 QTL에 연관된 SNP 마커를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종 판별용 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종 판별용 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 SNP의 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하여 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 SNP 마커 조성물은 고추 풋마름병 저항성을 판별할 수 있는 신규의 분자마커로, 특히 본 연구를 통해 새로이 탐색된 고추 풋마름병 저항성 QTL(양적형질유전자좌)에 연관된 본 발명의 SNP 마커는 향후 우량 고추 품종 육성을 위한 분자 재료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 풋마름병에 대한 병 반응 정도에 따른 고추의 분류를 보여주는 사진이다. 숫자가 높을 수록 병에 대한 감수성이 높은 것을 의미한다.
도 2는 총 169개의 RIL 집단의 풋마름병에 대한 병 반응 정도의 분포를 보여주는 결과이다. YCM334, 저항성 계통; Taean(태안), 감수성 계통.
도 3은 총 169개의 RIL 집단을 이용한 GBS 기반의 고추 유전자지도이다.
도 4는 CIM(composite interval mapping) 방법을 통해 고추 염색체에서 탐색된 고추 풋마름병 저항성 관련 신규 QTL을 보여주는 그림이다. 녹색점들은 각 마커들의 LOD 값을 반영하고 있으며, 붉은색 별모양은 QTL 위치를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2는 각각의 SNP 부위의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열이다. 다형성 서열(polymorphic sequence)이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째로, 다형성 염기 정보는 표 3의 SNP 염기서열 정보에 [/]로 표시하였다.
본 발명에 따른 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 SNP를 구성하는 각 단일 SNP의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 8개 이상의 연속 염기이며, 더욱 바람직하게는 15개 이상의 연속 염기이며, 더더욱 바람직하게는 20개 이상의 연속 염기이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 각 서열이다.
본 발명의 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 참조서열인 Pepper.v.1.55(http://peppergenome.snu.ac.kr, Pepper.v.1.55.total.chr 파일)의 7번 염색체의 823,317번째 염기서열부터 823,425번째 염기서열까지에 대응되는 염기서열로, 서열번호 1의 SNP 염기의 위치는 Pepper.v.1.55 7번 염색체의 823,371번째 염기 위치에 대응된다. 또한, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 참조서열인 Pepper.v.1.55의 8번 염색체의 137,903,346번째 염기서열부터 137,903,444번째 염기서열까지에 대응되는 염기서열로, 서열번호 2의 SNP 염기의 위치는 Pepper.v.1.55 8번 염색체의 137,903,390번째 염기 위치에 대응된다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 55번째 염기에 위치한 SNP 또는 서열번호 2의 염기서열 중 55번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종 판별용 프라이머를 제공한다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종 판별용 프로브를 제공한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1 또는 서열번호 2의 55번째 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다.
일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 SNP의 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 진단용 마이크로어레이를 제공한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 판별하기 위한 키트는 상기 프로브 또는 상기 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하여 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 결정된 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형이 T인 경우 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종으로 판별할 수 있으며, C 또는 A인 경우 고추 풋마름병에 대해 감수성을 갖는 고추 품종으로 판별할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 조직 또는 세포로부터 DNA를 직접적으로 정제하거나 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 특정한 영역을 특이적으로 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA란 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성되는 cDNA도 포함한다. 피검체로부터 핵산을 얻는 단계는 예를 들면, PCR 증폭법, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
분리된 DNA의 염기서열의 결정은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으며, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법은 바람직하게는, 상기 고추 시료로부터 분리한 핵산 시료를 본 발명에 따른 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드, 또는 이와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화시킨 후 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 유전집단
QTL(quantitative trait loci) 분석을 위한 고밀도 유전자지도 제작을 위해 169 계통 F8 RILs (recombinant inbred line)이 사용되었으며, 이 유전집단은 풋마름병 저항성인 'YCM334'와 감수성인 '태안'을 모부본으로 하여 만들어졌다. 'YCM334'와 '태안' 식물체는 농촌진흥청 국립원예특작과학원(National Institute of Horticultural and Herbal Science)으로부터 분양받았다.
2. GBS 분석 및 맵핑(mapping)용 유전자형 매트릭스(genotype matrix) 작성
GBS(genotyping-by-sequencing)용 라이브러리 제작은 제한효소 ApeKI을 이용한 단일 효소 시스템을 사용하였고, 시퀀싱은 HiSeq4000 플랫폼을 이용하였다.
ApeKI 제한효소의 인식부위를 참조 게놈 서열(reference genome sequence)에서 서열 기반으로 찾고 제한효소로 잘라질 200-2,000bp 사이의 서열 조각들만 모아서 BWA 프로그램(http://bio-bwa.sourceforge.net)을 통해 색인 작성(indexing)한 뒤, GBS 라이브러리에서 시퀀싱되어 나온 계통별 paired-end reads를 맵핑하였다. 맵핑된 계통별 bam 파일을 SAMtools 프로그램(http://samtools.sourceforge.net)의 mpileup 기능을 통해 하나의 파일에 통합한 뒤, custom python script를 통해 read cover depth가 100이 넘는 게노믹 위치(genomic positions) 중 부모의 유전자형이 3반복 모두 일률적으로 나온 위치를 먼저 고르고, 이종률(hetero rate) 0.2 이하, MAF(minor allele frequency) 0.1 이상을 골라서 최종 SNP(single nucleotide polymorphism) 매트릭스를 작성하였다.
3. 고밀도 유전자지도 작성
작성된 유전자형 매트릭스(genotype matrix)를 바탕으로 JoinMap4.1 프로그램(https://www.kyazma.nl/index.php/JoinMap/Evaluate/)을 이용하여 유전자지도를 작성하였다. 연관지도(linkage map)은 Kosambi function을 사용하였으며, LOD(logarithm of odds) 값 > 7.0 그리고 최대 유전적 거리(maximum genetic distance)는 45cM으로 결정하였다.
4. 고추 풋마름병 저항성 검정
고추 풋마름병원균의 접종 및 고추 식물체의 병 저항성 평가는 국립원예특작과학원에서 수행되었다. 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 균주는 WR-1을 사용하였고 NA(Nutrient agar) 배지에서 배양하였다. 균주의 접종 농도는 107~108cfu/㎖로 조정하였으며 관주 접종을 통해 169 계통 F8 RILs 식물체로 접종하였다.
고추 식물체의 병 저항성 평가는 균주 접종 후 5~10일 후부터 발병이 시작되면 아래의 기준을 통해 저항성을 판별하였다.
<발병정도>
1. 병징이 거의 보이지 않고 건전함
2. 줄기에 병징은 보이지 않고 낙엽이 시작됨
3. 줄기가 갈변되거나 지상부가 시들고 낙엽이 됨
4. 줄기가 심하게 갈변하거나 지상부가 거의 시들며 낙엽이 많이 진행됨
5. 식물체가 마르고 고사함
5. QTL 분석
각각의 RIL 계통에서 관찰된 고추 풋마름병 저항성 관련 표현형 데이터, 유전집단의 유전자형 데이터(genotype data) 및 고밀도 유전자지도 정보를 바탕으로 풋마름병 저항성 관련 QTL을 탐색하였으며, 이를 위해 MapQTL6(https://www.kyazma.nl/index.php/mc.MapQTL) 프로그램의 composite interval mapping 옵션을 이용하였다. 또한 탐색된 후보 QTL 중 유의한 QTL을 선발하기 위해서 1,000번의 순열검정법(permutation test)을 통해 5%의 유의수준에서 LOD 한계점을 결정하였다.
실시예 1. F8 RILs의 병 저항성 분석
총 169개의 F8 RIL 집단에 대하여 풋마름병 저항성에 대한 조사를 실시하였다. 그 결과, 9개의 RIL 계통은 풋마름병 저항성인 'YCM334'와 유사하게 병징이 거의 확인하지 않았고(숫자 1), 63개의 RIL 계통은 줄기에 병징은 보이지 않고 낙엽이 시작되었으며(숫자 2), 47개의 RIL 계통은 줄기가 갈변되거나 지상부가 시들고 낙엽이 진행되었으며(숫자 3), 29개의 RIL 계통은 줄기가 심하게 갈변되고 고추 식물체의 지상부가 거의 시들었으며, 낙엽이 많이 진행되었고(숫자 4), 21개의 RIL 계통은 풋마름병 감수성인 '태안'처럼 식물체가 고사되었다(숫자 5, 도 2).
실시예 2. 고밀도 유전자지도 작성
'YCM334' 유래 169개의 RIL 개체 간의 union SNP 매트릭스 작성을 통해 고밀도 유전자지도 작성을 위한 총 2,643개의 SNP 마커를 12개의 염색체로부터 선발하였다. SNP 마커 선발과정에서 결측값(missing value)은 20% 이하, 변형적분리(segregation distortion)는 0.01 수준으로 하였다. 또한 기존의 보고된 SSR(simple sequence repeat) 마커 25개를 추가하여 유전지도의 세밀화 및 GBS 기반 유전자지도의 마커 순서를 보정하는데 이용하였다.
결과적으로 총 2,492개의 SNP가 유전자지도 작성에 이용되었으며, 동일지역에 맵핑 된 마커들을 제거할 경우 총 1,820개의 고유한 유전자좌(unique loci)가 탐색되었다(표 1). 제작된 고밀도 유전자지도는 총 14개의 연결 그룹(총 12개의 고추 염색체)으로 나뉘어졌으며 총 길이는 1,250.7cM, 마커간 평균거리는 0.7cM으로 나타났다(표 1, 도 3).
제작된 고추 고밀도 유전자지도의 각 염색체 정보
염색체 번호 크기(cM) 전체 유전자좌 수 고유 유전자좌 수
1-1 84.4 215 146
1-2 49.6 50 42
2-1 17.2 40 26
2-2 66.7 151 119
3 154.8 315 230
4 81.2 193 120
5 92.7 176 123
6 123.3 238 169
7 136.4 167 138
8 73.5 183 176
9 101.7 143 69
10 104.2 212 169
11 68.8 193 122
12 96.2 216 171
총 합 1250.7 2492 1820
마커간 평균거리(cM) 0.7
실시예 3. 풋마름병 저항성 관련 QTL 탐색
CIM(composite interval mapping) 방법을 통해 총 5개의 저항성 관련 후보 QTL이 서로 다른 염색체에서 탐색되었다(표 2, 도 4). 이들 후보 QTL 중 5% 유의수준의 LOD 한계값(2.2)을 만족하는 두 개의 QTL이 7번과 8번 염색체에서 탐색되었다. 해당 QTL에 연관된 SNP 마커의 정보는 하기 표 3과 같다.
고추 풋마름병 저항성 관련 후보 QTL 목록
QTL 명 염색체 LOD R2 additive effect
BWQTL_ch02 2 1.4 3.0 0.20
BWQTL_ch07 7 2.4 5.6 -0.28
BWQTL_ch08 8 2.2 6.2 -0.69
BWQTL_ch11 11 1.65 3.8 0.22
BWQTL_ch12 12 1.33 3.2 0.2
탐색된 고추 풋마름병 저항성 QTL 연관 SNP 마커 정보
연관마커 염색체 위치
(Pepper.v.1.55)		 SNP 정보(YCM334/태안)
BWQTL1 7 823,371 AATCTATCTGGACCTGTGAATAACAGCCATATGTCACCCTTCGGTGCACCACCC[T/C]GCGGTTTTCCATTTCCCAATCTGCACCTCGACACGGCAGAAGCAACGGAAGAGG (서열번호 1)
BWQTL2 8 137,903,390 TGACATCCTTAGCAGTCTGCAGTCTCCACTAGTCCATTGCTATGCAGGACTGTT[T/A]ACATTTTCACTGCTGATACTAATTTTTAATGGTATATATTTTTCTCTAAAAAGT (서열번호 2)
특히 이들 탐색된 QTL 부근에서는 병저항성과 관련된 R-유전자, NBS-LRR 단백질 또는 토마토에서 탐색된 저항성 QTL들이 존재하는 것으로 나타나, 이 들 QTL이 고추 풋마름병 저항성에 관련이 있을 가능성을 보여주었다. 또한, 상기 두 QTL의 additive effect(상가적 효과) 값이 음으로 나타나는 것은 고추 풋마름병 저항성 대립유전자가 저항성 유전자원인 'YCM334'로부터 유래하였음을 의미하였다.
상기의 결과는, 본 발명에서 새로이 탐색된 QTL이 고추 풋마름병 저항성과 연관된 신규의 QTL이며, 이와 연관된 SNP 마커는 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 판별 등에 활용될 수 있음을 시사하였다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Single nucleotide polymorphism marker for selecting bacterial wilt-resistant or sensitive pepper cultivar and uses thereof <130> PN16458 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 109 <212> DNA <213> Capsicum annuum 'YCM334' <400> 1 aatctatctg gacctgtgaa taacagccat atgtcaccct tcggtgcacc accctgcggt 60 tttccatttc ccaatctgca cctcgacacg gcagaagcaa cggaagagg 109 <210> 2 <211> 109 <212> DNA <213> Capsicum annuum 'YCM334' <400> 2 tgacatcctt agcagtctgc agtctccact agtccattgc tatgcaggac tgtttacatt 60 ttcactgctg atactaattt ttaatggtat atatttttct ctaaaaagt 109

Claims (8)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP(single nucleotide polymorphism) 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  3. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종 판별용 프라이머.
  4. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각 SNP 위치(서열번호 1 및 서열번호 2 모두 55번째) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 고추 풋마름병 저항성 품종 또는 감수성 품종 판별용 프로브.
  5. 제1항에 기재된 SNP의 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 고추 풋마름병 저항성 진단용 마이크로어레이.
  6. 제3항의 프라이머; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 판별하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 판별하기 위한 키트.
  8. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및
    제1항에 기재된 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 각 SNP 위치 염기인 다형성 부위의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 고추 풋마름병에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법.
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KR20220160894A (ko) * 2021-05-28 2022-12-06 경상국립대학교산학협력단 잎 접종 방법을 이용한 풋마름병 저항성 고추 품종의 스크리닝 방법

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