KR20220160894A - 잎 접종 방법을 이용한 풋마름병 저항성 고추 품종의 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 잎 접종 방법을 이용한 풋마름병 저항성 고추 품종 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법을 이용하면 빠른 시일 내에 풋마름병에 대한 저항성 또는 감수성 표현형을 육안으로 확인할 수 있으며, 기존의 뿌리 접종 방법보다 더욱 안정적이고 명확한 결과를 얻을 수 있으므로, 풋마름병 저항성 품종을 효과적으로 스크리닝할 수 있고, 저항성에 관여하는 유전자 동정 및 규명에 대한 연구 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 잎 접종 방법을 이용한 풋마름병 저항성 고추 품종의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 풋마름병을 유발하는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 균주를 고추 식물체의 잎에 접종하고 재배하는 단계를 포함하는 풋마름병 저항성 고추 품종을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
풋마름병(Bacterial wilt)은 1896년에 처음 발견되었으며 고추, 토마토, 가지, 참깨, 무 등 150여 종의 식물에 발생하는 세균병이다. 초기에는 식물체의 지상부가 푸른 상태로 시들고, 초기 증상이 나타난 후 2~3일이 지나면 완전히 시든다. 풋마름병이 유발된 식물체의 줄기 내부는 갈색으로 변하며, 줄기를 잘라 물에 담가 보면 하얀 우유빛의 세균액이 분출된다. 풋마름병을 유발하는 대표적인 원인균인 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)은 토양 서식균으로, 주로 열대와 아열대 지역에서 서식하며 250여 종의 넓은 기주 범위를 가지고 있어 전세계적으로 피해가 극심하다. 특히, 지구온난화가 지속됨에 따라 고추를 포함한 여러 작물에 대한 피해도 증가하고 있다. 현재는 토양 소독과 같은 화학적 방제 방법으로 풋마름병을 예방 또는 치료하고 있지만 이는 일시적인 효과일 뿐이며 환경오염을 유발한다는 단점도 있다. 또한, 풋마름병에 대한 저항성 품종으로 밝혀진 것은 있으나 현재까지 상용 고추 품종으로 도입된 경우는 적다. 따라서, 풋마름병 저항성 품종 개발 및 육성에 관한 연구가 필요한 실정이다.
풋마름병 저항성은 양적 형질(Quantitative Trait Loci, QTL)에 의해 조절된다고 알려져 있다. R. solanacearum 균주의 다양성, 접종 방법 및 식물 재료에 따라 양적 형질 유전자좌 수와 위치는 다르며 현재까지 고추 풋마름병 저항성 주동 유전자좌(major QTL)는 정확히 밝혀진 바가 없다. 풋마름병 저항성에 관여하는 주동 유전자좌를 밝히기 위해선 품종들이 가진 정확한 유전 형질을 구분하는 것이 중요하다. 이를 확인하기 위해서는 안정적인 저항성 검정을 위한 방법이 필요하다. 현재 고추 풋마름병 스크리닝 연구에서 주로 사용되는 방법은 식물체 뿌리에 인위적인 상처를 내어 세균 현탁액을 직접 관주하는 방법이다. 그러나 이러한 방법은 상처 크기 정도 또는 접종을 수행하는 사람에 따라 결과의 편차가 커 고추 품종의 풋마름병 저항성 형질을 규명하는데 어려움이 따른다. 또한, 기존의 연구는 몇몇의 고추 품종에 뿌리 접종 방법을 수행하여 저항성 표현형 형질을 규명하였으나 연구마다 표현형 정보의 차이가 있으며, 동일한 연구 내에서도 접종 조건에 따라 표현형 결과가 다양하게 나타났다. 따라서, 정확하고 안정적인 표현형 규명이 가능한 방법에 대한 연구가 필요하다.
한편, 한국등록특허 제1970264호에는 '고추 풋마름병 저항성 품종 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2018-0055075호에는 '고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '잎 접종 방법을 이용한 풋마름병 저항성 고추 품종의 스크리닝 방법'에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 풋마름병을 유발하는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 균주를 다양한 농도로 풋마름병 저항성 및 감수성 고추 식물체의 잎에 접종한 후, 다양한 조건으로 재배하여 표현형을 확인한 결과, 105~107 CFU/㎖의 농도로 균주를 접종하고 28~32℃에서 8~12일 동안 재배하였을 때 풋마름병에 대한 저항성 및 감수성 품종을 가장 효과적으로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 캡시쿰(Capsicum) 속 식물에 병원체를 접종하고 재배하는 단계를 포함하는 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법을 이용하면 빠른 시일 내에 풋마름병에 대한 저항성 또는 감수성 표현형을 육안으로 확인할 수 있으며, 기존의 뿌리 접종 방법보다 더욱 안정적이고 명확한 결과를 얻을 수 있으므로, 풋마름병 저항성 품종을 효과적으로 스크리닝할 수 있고, 저항성에 관여하는 유전자 동정 및 규명에 대한 연구 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 R. solanacearum 균주를 풋마름병에 대한 저항성(MC4) 및 감수성(subicho) 품종의 잎에 접종한 후 잎 내 병징을 확인한 것으로, A는 균주 접종 후 4일 동안 매일 접종 부위를 확인한 결과이고, B는 균주 접종 0, 1, 3 및 5일 후, 잎 내 균주의 농도를 측정한 결과이며, C는 균주 접종 6, 12 및 24시간 후, 잎 내 CaHIN1, CaCDM 및 CaHsr203J 유전자의 발현양을 측정한 결과이다.
도 2는 R. solanacearum 균주를 풋마름병에 대한 저항성(MC4) 및 감수성(subicho) 품종의 잎에 접종한 후, 식물체 전체 표현형을 확인한 것으로, A는 균주 접종 0, 3, 5, 10 및 15일 후 식물체의 시들음을 확인한 결과이고, B는 균주 접종 후 15일 동안 매일 시들음 정도(Wilting rate)를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 풋마름병 저항성 품종을 판단하기 위해 사용한 질병 중증도 지수(disease severity index, DSI) 및 그에 따른 저항성 판정을 나타낸 것이다. R: 저항성(resistance), MR: 중도 저항성(moderate resistance), S: 감수성(susceptible)
도 4는 R. solanacearum 균주를 1×103, 1×104, 1×105 및 1×106 CFU/㎖의 농도로 풋마름병에 대한 저항성(MC4) 및 감수성(subicho) 품종의 잎에 접종하고 20일 동안 재배하며 매일 질병 중증도 지수를 측정한 결과이다.
도 5는 R. solanacearum 균주를 1×106 CFU/㎖의 농도로 풋마름병에 대한 저항성(MC4), PR-국가대표(중도 저항성), 슈퍼마니따(감수성) 및 수비초(감수성) 품종의 잎에 접종하고 25℃ 또는 30℃에서 20일 동안 재배한 후, 질병 중증도 지수를 측정한 결과이다.
도 6은 R. solanacearum 균주를 1×106 CFU/㎖의 농도로 14개의 시판 고추 품종의 잎에 접종하고 30℃에서 20일 동안 재배하며 매일 질병 중증도 지수를 측정한 결과로, 도면 내 *, **, ***은 저항성(MC4) 품종 대비 유의미한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 7은 R. solanacearum 균주를 1×106 CFU/㎖의 농도로 MC4(저항성)와 수비초(감수성) 품종을 부모로 한 F2 세대의 90개 개체의 잎에 접종하고 30℃에서 재배하며 접종 후 15(초록색 막대), 20(노란색 막대) 및 30일(주황색 막대)에 질병 중증도 지수를 측정한 결과이다.
도 2는 R. solanacearum 균주를 풋마름병에 대한 저항성(MC4) 및 감수성(subicho) 품종의 잎에 접종한 후, 식물체 전체 표현형을 확인한 것으로, A는 균주 접종 0, 3, 5, 10 및 15일 후 식물체의 시들음을 확인한 결과이고, B는 균주 접종 후 15일 동안 매일 시들음 정도(Wilting rate)를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 풋마름병 저항성 품종을 판단하기 위해 사용한 질병 중증도 지수(disease severity index, DSI) 및 그에 따른 저항성 판정을 나타낸 것이다. R: 저항성(resistance), MR: 중도 저항성(moderate resistance), S: 감수성(susceptible)
도 4는 R. solanacearum 균주를 1×103, 1×104, 1×105 및 1×106 CFU/㎖의 농도로 풋마름병에 대한 저항성(MC4) 및 감수성(subicho) 품종의 잎에 접종하고 20일 동안 재배하며 매일 질병 중증도 지수를 측정한 결과이다.
도 5는 R. solanacearum 균주를 1×106 CFU/㎖의 농도로 풋마름병에 대한 저항성(MC4), PR-국가대표(중도 저항성), 슈퍼마니따(감수성) 및 수비초(감수성) 품종의 잎에 접종하고 25℃ 또는 30℃에서 20일 동안 재배한 후, 질병 중증도 지수를 측정한 결과이다.
도 6은 R. solanacearum 균주를 1×106 CFU/㎖의 농도로 14개의 시판 고추 품종의 잎에 접종하고 30℃에서 20일 동안 재배하며 매일 질병 중증도 지수를 측정한 결과로, 도면 내 *, **, ***은 저항성(MC4) 품종 대비 유의미한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 7은 R. solanacearum 균주를 1×106 CFU/㎖의 농도로 MC4(저항성)와 수비초(감수성) 품종을 부모로 한 F2 세대의 90개 개체의 잎에 접종하고 30℃에서 재배하며 접종 후 15(초록색 막대), 20(노란색 막대) 및 30일(주황색 막대)에 질병 중증도 지수를 측정한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 캡시쿰(Capsicum) 속 식물에 병원체를 접종하고 재배하는 단계를 포함하는 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 병원체는 바람직하게는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 캡시쿰(Capsicum) 속 식물은 바람직하게는 고추(Capsicum annuum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 접종은 105~107 CFU/㎖ 랄스토니아 솔라나세아룸을 접종하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 106 CFU/㎖ 랄스토니아 솔라나세아룸을 접종하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 재배는 28~32℃에서 8~12일 동안 이루어지는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 28~32℃에서 9~11일 동안 이루어지는 것일 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 30℃에서 10일 동안 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법은, 구체적으로
(a) 105~107 CFU/㎖ 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 균주를 고추 식물체의 잎에 접종하는 단계; 및
(b) 상기 랄스토니아 솔라나세아룸 균주가 접종된 고추 식물체를 28~32℃에서 8~12일 동안 재배하며 식물의 표현형을 5단계로 분류하여 저항성 정도를 결정하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 표현형을 하기와 같이 5단계로 분류하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
1단계 : 작물의 줄기가 굵고, 색이 선명하고 진한 녹색이며 잎이 위로 뻗은 튼튼한 초형을 가진 상태
2단계 : 잎의 끝이 말리기 시작하며 식물체 색과 줄기의 굵기는 크게 변하지않는 상태
3단계 : 잎이 처지지는 않으나 1/3이 말리며 가장 바깥 잎부터 갈변하여 죽어가며, 전체적으로 녹색이 옅어지기 시작하는 상태
4단계 : 잎의 2/3가 말리고 줄기가 가늘어지며, 바깥 잎은 모두 갈변되어 죽은 상태 및
5단계 : 중심 줄기를 제외한 나머지가 완전히 가늘어지고 갈변하여 거의 죽은 상태.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 식물의 표현형이 상기 1 또는 2단계로 분류되면 저항성이고, 3단계로 분류되면 중도 저항성이며, 4 또는 5단계로 분류되면 감수성인 것으로 저항성 정도를 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물체 준비 및 환경 조건
고추 풋마름병 저항성 품종인 MC4, 감수성 품종인 수비초 및 12종의 시판 품종(저항성 품종 5개, 중도 저항성 품종 5개, 감수성 품종 2개)을 사용하였다(표 3 참고). 식물체는 바로커 상토(서울바이오)를 충전한 32구 연결포트에 심고 3주간 항온 항습실(29±1℃, 상대습도 50~60%)에서 16시간 광, 8시간 암 조건으로 재배하였다. 병원균을 접종한 후에도 상기와 동일한 조건으로 저면관수하여 재배하였다.
2. 접종원 준비 및 접종
고추 풋마름병 원인 균주인 Ralstonia solanacearum SL1931은 동아대학교로부터 분양받아 실험에 사용하였다. R. solanacearum을 CPG 액체배지(카사미노산 1 g, 펩톤 10 g, 글루코스 5 g, 멸균수 1 ℓ)에 접종하여 28℃에서 250 rpm으로 24시간 동안 전배양하였다. 전배양한 R. solanacearum을 5 ㎖의 CPG 액체배지에 1%(v/v)로 접종하고 28℃에서 250 rpm으로 24시간 동안 진탕배양한 후, 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛을 멸균수로 현탁하였다.
상기와 같이 준비된 세균 현탁액 0.1 ㎖을 고추 식물체 4엽기(four-leaf-stage)의 3번째 및 4번째 본엽에 바늘없는 주사기(needleless syringe)를 이용한 잎 침윤 방법(leaf-infiltration)으로 접종하였다.
3. 풋마름병 저항성 유전자의 발현값 분석
R. solanacearum을 접종한 고추 잎에서 Trizol 시약을 사용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하여 CaHIN1, CaCDM 및 CaHsr203J 유전자에 대한 qRT-PCR을 수행하였다. 각 유전자 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.
| 유전자 | 프라이머 서열(5'-3') | 서열번호 |
| CaHIN1 | F:ATCTTCACTATTCTCATCGTCCTTG | 서열번호 1 |
| R:TGCAAACTGCTAGTATTCTTGTGAC | 서열번호 2 | |
| CaCDM | F:AAAGGCGCAAACGGGAGCTG | 서열번호 3 |
| R:TCACAGCCAAACGCTTCGATCC | 서열번호 4 | |
| CaHsr203J | F:ATCTTCACTATTCTCATCGTCCTTG | 서열번호 5 |
| R:TGCAAACTGCTAGTATTCTTGTGAC | 서열번호 6 |
각 반응마다 주형 핵산 40 ng, 프라이머 10 pmole/㎕, 10x EasyTaq® 완충액(200 mM Tris-HCl pH 8.3, 200 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4), 2.5 mM dNTPs, EasyTaq® DNA 중합효소 0.5 U을 넣어 총 20 ㎕가 되도록 하였다. PCR은 94℃에서 3분간 유지시킨 다음 95℃에서 30초, 60℃ 또는 58℃에서 30초, 72℃에서 30초를 28번 반복 후, 72℃에서 5분 유지시키는 조건으로 수행하였고 이후, 고추 액틴 유전자(CaACT)에 대한 상대적 발현양을 분석하여 3회 반복 실험의 평균±표준오차로 나타내었다.
4. 풋마름병 저항성 표현형 분석 및 통계 분석
R. solanacearum을 각 품종의 고추 잎에 접종하고 20일 동안 매일 질병 중증도 지수(DSI, disease severity index)를 측정하였고, 병진전곡선하면적(area under disease progress curve, AUDPC)은 Simko 등(2012, Phytopathology. 102;381-389)에 기술된 방법에 따라 계산하였다. 또한, 감수성이 가장 높은 품종의 AUDPC 값에 대한 각 품종의 AUDPC 값을 백분율로 계산하여 상대적 AUDPC(relative AUDPC, rAUDPC)로 나타내었다.
모든 R. solanacearum 균주 접종 실험은 한 반복 실험 당 8개의 식물체를 사용하였고, 총 3번의 독립적인 실험을 수행하였다. 통계분석은 SAS(SAS 9.1, SAS Institute Inc., USA) 프로그램을 이용해서 ANOVA 분석 후 Duncan's multiple range test(P=0.05)를 통해 수행하였다.
실시예 1. 잎 접종 방법을 이용한 고추 풋마름병에 대한 저항성 반응 확인
1-1. 잎 내 병징 확인
R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 MC4(저항성)와 수비초(감수성)의 잎에 1×106 CFU/㎖ 농도로 접종하고 4일 동안 매일 잎의 병징을 관찰하였다. 그 결과, 수비초는 접종 후 3일차부터 잎의 괴사가 관찰된 반면, MC4는 접종 부위에서 일부 황화 현상만이 관찰된 것을 확인하였다(도 1A).
또한, R. solanacearum 균주 접종 0, 1, 3 및 5일 후, 6~8개의 잎 디스크(disc) 샘플을 마쇄하고, 증류수에 연속 희석 후 0.1%(v/v) 겐타마이신이 첨가된 CPG 고체배지에 2반복 분주한 후 형성되는 콜로니의 개수를 측정하여 잎 면적(cm2)당 균주의 농도를 계산하였다. 그 결과, 접종 3일 및 5일 후, 수비초 잎 내 균주의 농도는 MC4 잎 내 균주의 농도에 비해 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 1B).
또한, R. solanacearum 균주 접종 6, 12 및 24시간 후, 잎에서 추출한 RNA를 이용하여 풋마름병 저항성 유전자로 알려진 CaHIN1, CaCDM 및 CaHsr203J 유전자의 발현양을 측정하였다. 그 결과, 접종 후 수비초 잎 내 CaHIN1, CaCDM 및 CaHsr203J 유전자의 발현은 MC4 잎 내 유전자의 발현에 비해 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 1C).
1-2. 식물체 전체 표현형 확인
R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 MC4(저항성)와 수비초(감수성)의 잎에 1×106 CFU/㎖ 농도로 접종하고 15일 동안 매일 식물체 전체의 상태를 관찰하고 시들음 정도(Wilting rate)를 하기 식에 따라 계산하였다.
Wilting rate(%)=(시든 식물 개체 수/전체 접종한 식물 개체 수)×100
그 결과, 수비초는 접종 후 5일차에 탈리와 함께 시들음이 시작되어 15일 차에는 시들어 고사하는 풋마름병 증상을 나타낸 반면, MC4는 접종 후 10일차까지 건강한 상태를 유지하였고 15일차에는 접종한 잎만 탈락되거나 일부 황화 증상이 나타났으나 개체는 건강한 상태를 유지한 것을 확인하였다(도 2).
상기 결과를 통해, R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 풋마름병 저항성 및 감수성 품종에 접종하였을 때, 각 품종의 특성에 맞는 저항성 반응이 나타난 것을 확인함으로써, 잎 접종 방법을 이용하여 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종의 표현형 병징을 구분할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2. 효율적인 고추 풋마름병 스크리닝을 위한 조건 확립
R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 MC4(저항성)와 수비초(감수성)의 잎에 접종하고 질병 중증도 지수(disease severity index, DSI)를 이용한 저항성 판정(표 2, 도 3)을 통해 잎 접종 방법의 최적 조건을 확립하고자 하였다.
| 지수 | 증상 | 판정 |
| 0 | 증상 없음 | 저항성(resistance, R) |
| 1 | 전체 잎의 1~25% 시들음 증상 | |
| 2 | 전체 잎의 26~50% 시들음 증상 | 중도 저항성(moderate resistance, MR) |
| 3 | 전체 잎의 51~75% 시들음 증상 | 감수성(susceptible, S) |
| 4 | 전체 잎의 76~100% 시들음 증상 |
2-1. 접종 농도 및 재배 기간 조건 확립
R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 1×103, 1×104, 1×105 및 1×106 CFU/㎖의 농도로 MC4(저항성)와 수비초(감수성)의 잎에 각각 접종하고 29±1℃ 조건의 항온실에서 재배하며 20일 동안 매일 질병 중증도 지수를 조사하였다.
그 결과, 1×106 CFU/㎖ 농도로 접종 후 10일 차에 저항성 또는 감수성 품종의 표현형의 차이가 가장 빠르고 명확하게 나타나는 것을 확인하였다(도 4).
2-2. 재배 온도 조건 확립
R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 1×106 CFU/㎖의 농도로 MC4(저항성), PR-국가대표(중도 저항성), 슈퍼마니따(감수성) 및 수비초(감수성)의 잎에 각각 접종 후, 25℃ 또는 30℃ 조건의 항온실에서 각각 20일 동안 재배 후, 질병 중증도 지수를 조사하였다.
그 결과, 25℃에서 재배한 경우, 저항성 품종(MC4) 뿐만 아니라 감수성 고추 품종(수비초)에서도 풋마름병 발생이 낮았으며 실험한 모든 품종에서 1.6 이하의 낮은 발병도를 보였다. 그러나 30℃에서 재배한 경우, 저항성 또는 감수성 품종의 표현형의 차이가 극명하게 나타나는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 3. 확립된 조건의 검증
본 발명에서 확립된 잎 접종 방법의 최적 조건의 안정성 확인 및 검증을 위해서 기존의 저항성 품종 스크리닝 방법인 뿌리 접종 방법을 통해 표현형 정보가 존재하는(Hwang 등, 2017, Res. Plant. Dis. 23:334-347 및 Lee 등, 2018, Hortic. Sci. Technol. 36:569-576 참고) 14개의 시판 고추 품종에 대한 재평가를 수행하였다. R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 1×106 CFU/㎖의 농도로 각 품종의 고추의 잎에 접종한 후, 30℃ 조건의 항온실에서 각각 20일 동안 재배하며 매일 질병 중증도 지수를 조사하였다.
그 결과, 강력조생건, PR-대들보 및 슈퍼마니따 품종은 뿌리 접종 방법과 본 발명에 따른 잎 접종 방법에 의한 분석 결과가 모두 동일한 표현형으로 나타나는 것을 확인하였다. 그러나, 뿌리 접종 방법에 의한 분석 결과가 중도 저항성(MR) 또는 감수성(S)으로 나타내었던 PR-청양, 일송정 및 PR-장원급제 품종은 본 발명에 따른 잎 접종 방법에 의한 분석 결과, 모두 저항성(R)으로 나타나는 것을 확인하였으며, 뿌리 접종 방법에 의한 분석 결과가 감수성(S)으로 나타내었던 PR 국가대표 및 역강홍장군 품종은 본 발명에 따른 잎 접종 방법에 의한 분석 결과, 모두 중도 저항성(MR)으로 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 뿌리 접종 방법에 의한 분석 결과가 감염 방법 및 또는 균주에 따라 다양한 표현형 결과를 나타내었던 무한질주 및 멋진사나이는 잎 접종 방법에 의한 분석 결과, 저항성(R) 및 중도 저항성(MR)으로 나타나는 것을 확인하였다(표 3, 도 6).
e: Hwang 등(2017), f: Lee 등(2018), g: 서로 다른 문자 a~d는 서로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 잎 접종 방법을 이용하면 다양한 품종에서 쉽고 안정적으로 풋마름병 저항성 품종을 스크리닝할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 고추의 풋마름병 저항성 유전력 검정
고추의 풋마름병 저항성 유전인자를 분석하기 위해 MC4(저항성)와 수비초(감수성) 품종을 부모로 하여 F1 및 F2 세대를 만들었다. 이후, R. solanacearum을 잎 접종 방법으로 1×106 CFU/㎖의 농도로 각 개체의 잎에 접종한 후, 30℃ 조건의 항온실에서 각각 30일 동안 재배하며 표현형을 관찰하였다.
그 결과, 접종 20일 차에 F1 집단은 수비초(감수성)보다 시들음 진전이 느리게 나타났으며, F1 및 F2 집단의 시들음 정도(wilting rate)는 각각 46.7 및 38.8%로 나타나는 것을 확인하였다(표 4). 또한, 접종 후 시간이 지날수록 F2 집단의 질병 중증도 지수가 2 이상인 개체가 증가하는 것을 확인하였다(도 7). 따라서, 풋마름병 저항성은 양적형질유전자좌(QTL, quantitaive trait loci)에 의해 조절되는 것을 알 수 있었다.
| 집단 | 개체수 | 질병 중증도 지수(DSI) | Mean of DSI | wilting rate (%) |
AUDPC | ||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |||||
| MC4 | 30 | 6 | 24 | 0 | 0 | 0 | 0.8 | 0 | 7.5 |
| 수비초 | 30 | 0 | 0 | 0 | 0 | 30 | 4.0 | 100 | 50.3 |
| F1 | 30 | 0 | 12 | 4 | 0 | 14 | 2.5 | 46.7 | 22.7 |
| F2 | 90 | 0 | 44 | 11 | 1 | 34 | 2.3 | 38.8 | 21.9 |
또한, 풋마름병에 작용하는 저항성 유전인자를 확인하기 위해 전체 F2 집단(n=90)의 Chi-square 분석(Python, Statistical package scipy.stats v.0.18.1)을 통해 표현형 분리비 확인 및 유전력 검정을 수행하였다.
그 결과, 접종 후 15일 차에는 저항성 62개, 감수성 27개로 11:5(p>0.5) 및 3:1(p>0.1)의 분리비를 확인하였고, 20일 차에는 저항성 61개, 감수성 29개로 9:7 (P>0.5) 및 11:5(P>0.1)의 분리비를 확인하였으며, 마지막 30일 차에는 저항성 42개, 감수성 48개로 9:7(P>0.05)의 분리비를 확인하였다(표 5). 따라서, 풋마름병 저항성은 2개의 상보적인 우성 유전자가 관여하는 것을 알 수 있었다.
| Chi-square value | |||||||||||
| DAI | 3:1 | 9:7 | 15:1 | 3:13 | 11:5 | 9:6:1 | 12:3:1 | 9:3:4 | 7:6:3 | 9:3:3:1 | 3:6:3:4 |
| 15 | 1.2** | 6.9 | 86.6 | 155.2 | 0.1*** | 111.0 | 93.47 | 14.0 | 44.90 | 55.7 | 144.3 |
| 20 | 9.3 | 0.9*** | 163.6 | 106.0 | 2.4** | 169.6 | 163.6 | 9.9 | 35.4 | 161.0 | 79.8 |
| 30 | 38.5 | 3.4* | 340.5 | 46.0 | 20.4 | 383.2 | 386.8 | 79.6 | 110.1 | 208.7 | 51.1 |
(DAI: Days After Inocluation, *: p>0.05, **: p>0.1, ***: p>0.5)
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 잎 접종 방법을 이용하면 효과적으로 풋마름병 저항성 유전력 분석을 할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY
<120> Method for screening bacterial wilt-resistant pepper cultivar by
leaf inoculation
<130> PN21103
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
atcttcacta ttctcatcgt ccttg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
tgcaaactgc tagtattctt gtgac 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
aaaggcgcaa acgggagctg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
tcacagccaa acgcttcgat cc 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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atcttcacta ttctcatcgt ccttg 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
tgcaaactgc tagtattctt gtgac 25
Claims (7)
- 캡시쿰(Capsicum) 속 식물에 병원체를 접종하고 재배하는 단계를 포함하는 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 캡시쿰(Capsicum) 속 식물은 고추(Capsicum annuum) 식물체인 것을 특징으로 하는 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 병원체는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)인 것을 특징으로 하는 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 접종은 105~107 CFU/㎖의 랄스토니아 솔라나세아룸을 고추 식물체의 잎에 접종하는 것을 특징으로 하는 풋마름병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 재배는 28~32℃에서 8~12일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 식물병에 대한 저항성 품종을 스크리닝하는 방법.
- 제1항에 있어서,
(a) 105~107 CFU/㎖의 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum) 균주를 고추 식물체의 잎에 접종하는 단계; 및
(b) 상기 랄스토니아 솔라나세아룸 균주가 접종된 고추 식물체를 28~32℃에서 8~12일 동안 재배하며 식물의 표현형을 5단계로 분류하여 저항성 정도를 결정하는 단계;를 포함하는 풋마름병에 대한 저항성 고추 품종을 스크리닝하는 방법. - 제6항에 있어서, 상기 식물의 표현형을 하기 1 또는 2단계로 분류되면 저항성, 3단계로 분류되면 중도 저항성, 4 또는 5단계로 분류되면 감수성인 것으로 5단계로 분류하는 것을 특징으로 하는 방법:
1단계 : 작물의 줄기가 굵고, 색이 선명하고 진한 녹색이며 잎이 위로 뻗은 튼튼한 초형을 가진 상태
2단계 : 잎의 끝이 말리기 시작하며 식물체 색과 줄기의 굵기는 크게 변하지않는 상태
3단계 : 잎이 처지지는 않으나 1/3이 말리며 가장 바깥 잎부터 갈변하여 죽어가며, 전체적으로 녹색이 옅어지기 시작하는 상태
4단계 : 잎의 2/3가 말리고 줄기가 가늘어지며, 바깥 잎은 모두 갈변되어 죽은 상태 및
5단계 : 중심 줄기를 제외한 나머지가 완전히 가늘어지고 갈변하여 거의 죽은 상태.
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR20130054545A (ko) * | 2011-11-17 | 2013-05-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | 풋마름병에 저항성을 갖는 ＳｔＥＩＰ 유전자 및 이의 용도 |
| KR20180055075A (ko) * | 2016-11-16 | 2018-05-25 | 부산대학교 산학협력단 | 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 |
| KR101970264B1 (ko) * | 2017-10-25 | 2019-04-18 | 부산대학교 산학협력단 | 고추 풋마름병 저항성 품종 판별용 caps 마커 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-05-28 KR KR1020210069104A patent/KR102551518B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130054545A (ko) * | 2011-11-17 | 2013-05-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | 풋마름병에 저항성을 갖는 ＳｔＥＩＰ 유전자 및 이의 용도 |
| KR20180055075A (ko) * | 2016-11-16 | 2018-05-25 | 부산대학교 산학협력단 | 고추 풋마름병 저항성 또는 감수성 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 |
| KR101970264B1 (ko) * | 2017-10-25 | 2019-04-18 | 부산대학교 산학협력단 | 고추 풋마름병 저항성 품종 판별용 caps 마커 및 이의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 황성민 외., Research in Plant Disease, Vol. 23, No. 4, 2017, pp. 334-347.* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102551518B1 (ko) | 2023-07-04 |
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