KR102442563B1 - 밀의 출수기 예측용 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따라 규명된 밀의 출수기에 유의하게 영향을 미치는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 마커는 밀의 재배 특성을 재배 품종을 선택하는데 도움을 줄 수 있고, 밀 품종에 따라 적합한 재배 방법을 제시하는 것이 가능하다.

Description

밀의 출수기 예측용 바이오마커{A BIOMARKER FOR PREDICTING A HEAD STAGE OF WHEAT}
본 발명은 바이오마커로서 밀의 출수기를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커; 상기 마커를 이용하여 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법; 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 밀의 출수기 예측용 조성물; 및 상기 마커에 대한 프로브 또는 프라이머를 포함하는 밀의 출수기 예측용 키트에 관한 것이다.
밀은 동양에서 보조식량으로 쓰이지만 서양에서는 주식량이며, 쌀과 함께 세계의 2대 식량 작물이다. 90% 이상이 제분되어 제면, 제빵, 제과, 공업용 등으로 사용된다. 세계 밀 생산량은 최근 10년 동안 소비량 증가 추세에 맞추어 꾸준히 증가하고 있지만(FAO, 2018), 수량성 증대는 밀 육종 프로그램에서 여전히 제일 중요한 목표이다(Wurschum et al. 2018).
이상기후로 인한 재배 환경의 급격한 변화로 인하여 생산성 증진과 안정성을 동시에 확보해야 하기 때문에 세계 각국은 지속적인 관련 연구를 수행하고 있다(Asseng et al. 2017, Yang et al. 2017, Zampieri et al. 2017). 유럽은 최근에 기후 변화 대응을 위한 내건성 증진과 밀 수량 증대에 관한 연구가 활발하다(Senapati et al, 2018). 그러나, 국내에서의 밀에 대한 연구는 타국과 비교해서 매우 부진한 편이다.
밀의 수량은 단위면적당 분얼수, 1수립수 및 종자 무게의 영향을 가장 많이 받는 것으로 알려져 있으며, 이러한 측면에서, 밀 수량 증대를 위해 밀의 농업 형질과 유전적 특성을 연구하고, 국내 밀 육종 또는 밀 재배에 적용될 수 있는 한국형 밀 핵심집단의 SNP 분석 및 분자 마커를 개발하는 것이 필요하다.
본 발명은 상기 요구를 해소하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 밀의 출수기를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마커를 이용하여 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법; 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 밀의 출수기 예측용 조성물; 및 상기 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 밀의 출수기 예측용 키트를 제공하는데 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 발명자는 다양한 밀의 품종들로부터 주요 농업 형질을 구분할 수 있는 바이오마커 개발을 위해 노력한 결과, 밀의 출수기와 유의적 상관관계를 갖는 특정 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism) 마커를 발굴하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 밀의 재배에서, 밀의 출수기를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커 및 이의 용도를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 밀의 출수기를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커들 중에서 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 포함하는 밀의 출수기 예측용 마커를 제공한다.
본 발명의 밀의 출수기를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커는 밀 4B번 염색체(genome)의 BA00307905 및 밀 3B 염색체의 BA00204258로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 밀의 출수기 예측을 위한 단일 염기 다형성 마커를 2개를 모두 조합하여 사용할 수 있다.
밀은 6배체 작물로서, 42개의 염색체를 가지며, 이질배수성(allopolyploid)으로, 6개의 염색체가 상동염색체 2개씩 A, B, D 게놈(genome)으로 구분된다. 즉, 1번 염색체의 경우, 1A 상동염색체 2개, 1B 상동염색체 2개, 1D 상동염색제 2개를 가지며, 염색체 번호는 7번까지 존재한다.
본 명세서에서 용어 "출수기"란 화본과 식물에서 개화에 앞서 이삭목마디 사이가 신장하여 지엽의 잎집에서 이삭이 나오는 시기를 의미한다. 밀의 출수기는 필요에 따라 다른 기준으로 정의될 수 있다. 예를 들어, 전체 단위 면적당 이삭수 중 소정의 비율로 출수한 날을 출수기로 정의될 수 있다. 상기 소정의 비율은 전체 단위 면적 당 이삭 수 중 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상일 수 있으나, 이는 필요에 따라 출수기의 정의로서 달라질 수 있다. 또는, 상기 출수기는 표준 품종의 이삭이 나오는 시기를 기준으로 정의될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단일 염기 다형성 마커 밀 4B번 염색체(genome)의 BA00307905의 유전자형이 AA인 경우, 상기 SNP의 유전자형이 GG 또는 AG인 경우 대비 영양 생장이 길어지고 출수기가 늦어지는 것으로 예측될 수 있음을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명의 단일 염기 다형성 마커 밀 3B 염색체의 BA00204258의 유전자형이 AA인 경우, 상기 SNP의 유전자형이 AG인 경우 대비 영양생장이 길어지고 출수기가 늦어지는 것으로 예측될 수 있음을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어 '다형성(polymorphism)'은 엑손 및 인트론을 포함하는 핵산 또는 그 일부에 하나 이상의 형태가 공존하는 것을 일컫는다. '단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism)' 또는 'SNP'는 유전자의 특정한 위치에서 두 가지 이상의 단일 염기가 존재는 경우를 말한다. 대부분의 SNP는 두 개의 대립유전자를 갖는다. 상기 다형성의 하나의 대립유전자에 대해, 2개의 동일한 대립유전자를 가지면 대립유전자에 대해 동형접합성(SNP 위치에서 동일한 염기를 가짐)이라고 하고, 2개의 상이한 대립유전자를 가지면 대립유전자에 대해 이형접합성(SNP 위치에서 상이한 염기를 가짐)이라고 한다. 본 발명에서, SNP 명명은 BA 코드(BA code)로 나타낸다. BA 코드는 CerealsDB (https://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)에서 밀 (Triticum aestivum)의 게놈에 존재하는 각각의 SNP에 부여한 코드를 의미한다. CerealsDB의 BA 코드에 따른 염기의 위치는 밀의 표준 유전체(IWGSC RefSeq v1.0)와 일치하며, 상호 연동가능 하다.
본 발명에서 용어 '대립유전자(allele)'는 유전자 또는 그 일부와 관련된 인트론, 엑손, 인트론/엑손 접합(junction) 및 3' 및/또는 5' 비번역 영역을 포함하는 유전자의 대안적인 형태를 일컫는다. 일반적으로 대립유전자는 상동 염색체 상의 동일한 유전자 좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 특정 유전자의 대립유전자는 서로 단일 뉴클레오티드 또는 몇 개의 뉴클레오티드가 다를 수 있고 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 '마커(marker)', '다형성 마커' 또는 '단일 염기 다형성 마커'는 유전자의 다형성 부위(genomic polymorphic site)를 의미한다. 각 다형성 마커는 다형성 부위에서 특정한 대립유전자에 특징적인 두 개 이상의 서열 변이를 갖는다.
또한, 본 발명은 밀로부터 분리한 핵산 시료로부터 본 발명의 단일 염기 다형성 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 것을 포함하는 밀의 출수기를 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 밀로부터 분리한 핵산 시료로부터 본 발명의 단일 염기 다형성 마커들로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기를 확인하는 것을 포함하는 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 밀의 출수기를 예측하는 방법 또는 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 방법은 (a) 밀로부터 분리된 게놈 DNA를 준비하는 단계; (b) 상기 핵산시료에서 밀 4B번 염색체(genome)의 BA00307905 및 밀 3B 염색체의 BA00204258로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 부위를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 핵산시료에서 단일 염기 다형성 부위의 염기를 확인하여 유전자형에 따라서 밀의 출수기를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 밀의 출수기를 예측하는 방법 또는 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 방법은 (a) 밀로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 본 발명의 SNP에 대응하는 위치의 염기를 포함하는 5개 내지 100개의 연속적인 핵산서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프로브; 또는 이를 증폭할 수 있는 프라이머와 반응시키는 것; 및 (b) 상기 반응물을 확인하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 '핵산 시료(nucleic acid sample)'는 밀로부터 수득된 핵산(DNA 또는 RNA)을 포함하는 시료를 의미한다. 핵산 시료는, 밀로부터 채취한 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 낱알 등의 시료와 같은, 핵산을 포함하는 임의의 공급원(source)으로부터 수득될 수 있다. 밀로부터 핵산 시료를 수득하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
개체로부터 분리한 핵산 시료로부터, 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 프로브와 혼성화하여 다형성 부위의 염기를 확인할 수 있다.
예를 들어, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)을 이용하여 다형성 부위를 증폭할 수 있다.
다형성 부위의 염기의 확인은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석, TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ 및 SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadChip (Illumina의 HumanOmni2.5-8) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, SNP 칩을 이용하여 다형성 부위의 염기를 확인할 수 있다. SNP 칩은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.
시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 G에서 A로 치환된 경우, 상기 G를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 G인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 A로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향에 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.
이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.
본 발명에서, 게놈 DNA는 당업계에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법, CTAB 분리법 (Cetyl trimethyl Ammonium Bromide) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명에서의 PCR은, real-time PCR, qRT-PCR 또는 multiplex PCR로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 수행될 수 있으나, 후보 품종 또는 시료 내 전술한 단일 염기 다형성 부위를 증폭할 수 있는 방법이라면, 제한없이 포함될 수 있다. 이와 함께, 상기 PCR 산물에 제한 효소를 추가로 처리할 수 있다.
본 발명에서의 PCR에 의해 증폭된 산물을 확인하는 단계는, DNA 칩, 겔 전기영도, 방사성 측정, 형광 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중 하나로, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기 영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기 영동 또는 아크릴이미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.
구체적으로, 밀의 출수기를 예측할 수 있는 단일 염기 다형성 마커는 밀 4B번 염색체(genome)의 BA00307905 및 밀 3B 염색체의 BA00204258로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기에서,
밀 4B번 염색체의 BA00307905의 유전자형이 AA; 또는
밀 3B 염색체의 BA00204258의 유전자형이 AA인 경우, 출수기가 늦은 지표를 나타낸다. 이 경우, 밀의 영양생장 기간이 길어, 식물체가 상대적으로 큰 특성을 가질 수 있다.
또한, 상기에서,
밀 4B번 염색체의 BA00307905가 GG인 경우; 또는
밀 3B 염색체의 BA00204258가 AG인 경우, 밀의 출수기가 빠른 지표를 나타낸다. 이 경우 밀의 영양생장 기간이 짧아 식물체가 상대적으로 작고, 개화가 빠른 특성을 가질 수 있다.
상기 밀 4B번 염색체의 BA00307905는 4B번 염색체의 416,305,576bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP) 마커를 의미하며, 이는 단일 염기 다형성(SNP) 마커는 유전자형이 AA 또는 GG일 수 있다. 상기 단일 염기 다형성 마커의 위치는 밀 표준유전체(IWSGSC wheat reference genome sequence; IWGSC RefSeq v1.0)에서의 위치와 상호 연동될 수 있다. 상기 마커에서 유전자형이 AA인 경우, 해당 밀은 영양생장 기간이 길고, 출수기가 늦어지는 품종으로 구분할 수 있다. 상기 마커에서 염기가 GG인 경우, 해당 밀은 영양생장 기간이 짧고, 개화가 빠른 품종으로 구분할 수 있다.
상기 밀 3B 염색체의 BA00204258은 3B 염색체의 284,404,491bp에 대응하는 위치에 존재하는 단일 염기 다형성(SNP) 마커를 의미한다. 이는 단일 염기 다형성(SNP) 마커는 유전자형이 AA 또는 AG일 수 있다. 상기 단일 염기 다형성 마커의 위치는 밀 표준유전체(IWSGSC wheat reference genome sequence; IWGSC RefSeq v1.0)에서의 위치와 상호 연동될 수 있다. 상기 마커에서 유전자형이 AA인 경우, 해당 밀은 영양생장 기간이 길고, 출수기가 늦어지는 품종으로 구분할 수 있다. 상기 마커에서 염기가 AG인 경우, 해당 밀은 영양생장 기간이 짧고, 개화가 빠른 품종으로 구분할 수 있다.
또한, 본 발명은 밀 4B번 염색체(genome)의 BA00307905를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드; 및
밀 3B 염색체의 BA00204258를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 밀의 출수기 예측용 조성물을 제공한다.
상기 밀 4B번 염색체(genome)의 BA00307905를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 일 예로 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다.
상기 밀 3B 염색체의 BA00204258를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 일 예로 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제제를 포함하는 밀의 출수기 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 밀의 출수기 예측용 조성물 또는 키트는 모든 밀 품종의 출수기를 예측하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 둘 이상의 밀 품종간 교잡에 따른 후대 계통에도 적용될 수 있을 뿐만 아니라, 전술한 밀 품종을 주원료로 제조된 가공 생산품에도 확장 적용할 수 있다.
상기 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하거나, 이를 증폭할 수 있는 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 하여 밀 출수기를 예측할 수 있는 물질을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기일 수 있다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 프라이머는 밀의 출수기 예측과 유의적인 관련성을 나타내는 단일 염기 다형성 부위를 증폭시킨다.
상기 프라이머는 일 예로 서열번호 3(5'-GCTGCGTGTCAATGTGCTCTT-3') 및 서열번호 4(5'-GAATTCATACCCGCAGCCCT-3')의 프라이머 세트 또는 서열번호 5(5'-CTAGCTGCAGTTGCTGATGA-3') 및 서열번호 6(5'-CTTACTCACATATGAGCCCCT-3')의 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 이용해서 밀로부터 추출한 핵산 시료에서 BA00307905 SNP 상의 유전자형을 확인하여 출수기를 예측하였고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 이용해서 밀로부터 추출한 핵산 시료에서 BA0024258 SNP 상의 유전자형을 확인하여 출수기를 예측할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서, 키트는 상기 조성물 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행하게 하는 DNA 중합효소, dNTP, 및 PCR 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, 이 뿐만 아니라, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기 영동 수행에 필요한 구성 성분, 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 또한, 상기 키트는 프로브에 의한 반응을 효과적으로 수행하기 위한 공지의 구성을 추가로 포함할 수 있다.
상기 키트는 단일 염기 다형성 마커를 검출하거나, 확인할 수 있는 키트이면 제한 없이 사용 가능하다. 예를 들어, 키트는 DNA 칩 키트 또는 RT-PCR(real time- polymerase chain reaction) 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 다형성 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. RT-PCR 키트를 이용하여, 단일 염기 다형성 마커의 mRNA 발현 수준을 측정함으로써, 다형성 마커를 확인할 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.
본 발명의 키트는 또한 마이크로어레이를 포함한다. 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 다형성 마커의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다.
마이크로어레이는 공지된 마이크로어레이를 제한 없이 사용할 수 있으며, 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 핵산 시료를 형광 물질과 같은 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명에서 있어서, 상기 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보의 제공은 컴퓨터 프로그램을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 밀의 상기 단일 염기 다형성 마커의 다형성 부위의 염기 확인 결과를 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 통하여 출력하고, 그 결과, 예측 대상 밀의 출수기가 빠른지 또는 느린지 확인할 수 있다. 또는, 검사 대상 밀의 예측된 출수기에 맞추어 재배 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따라 규명된 밀의 출수기에 유의하게 영향을 미치는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 마커는 밀의 재배 특성을 재배 품종을 선택하는데 도움을 줄 수 있고, 밀 품종에 따라 적합한 재배 방법을 제시하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라서 수행된 출수기에 대한 GWAS 분석결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된, BA00307905에 대한 염기서열 분석(alignment) 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 수행된, BA00204258에 대한 염기서열 분석(alignment) 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
준비예 1. 밀 품종의 수집 및 전장유전체 연관분석(GWAS) 수행
국립 유전자원센터에서 분양 받은 국내외 재배 및 수집종 밀 1,969점(유전자원센터에서 1,269점, 진흥청 고세대 계통 CB700점)을 대립형질(allele) 특이적인 SSR마커 37쌍을 이용하여 약 73,000번의 PCR을 수행하고(표 1), Qiagen사의 QIAxcel 프로그램을 이용하여 디지털 전기영동을 수행하여 밴드 양상을 확인하였다.
프라이머 forward (5'-3') Reverse (5'-3')
Xgwm2-3A CTGCAAGCCTGTGATCAACT CATTCTCAAATGATGGAACA
Xgwm5-3A GCCAGCTACCTCGATACAACTC AGAAAGGGCCAGGCTAGTAGT
Xgwm11-1B GGATAGTCAGACAATTCTTGTG GTGAATTGTGTCTTGTATGCTTCC
Xgwm44-7D GTTGAGCTTTTCAGTTCGGC AGTGGCATCCACTGAGCTG
Xgwm46-7B GCACGTGAATGGATTGGAC TGACCCAATAGTGGTGGTCA
Xgwm99-1A AAGATGGACGTATGCATCACA GCCATATTTGATGACGCATA
Xgwm120-2B GATCCACCTTCCTCTCTCTC GATTATACTGGTGCCGAAAC
Xgwm135-1A TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG ACACTGTCAACCTGGCAATG
Xgwm149-4B CATTGTTTTCTGCCTCTAGCC CTAGCATCGAACCTGAACAAG
Xgwm196-6A ACCACTGCAGAGAACACATACG GTGCTCTGCTCTAAGTGTGGG
Xgwm186-5A GCAGAGCCTGGTTCAAAAAG CGCCTCTAGCGAGAGCTATG
Xgwm190-5D GTGCTTGCTGAGCTATGAGTC GTGCCACGTGGTACCTTTG
Xgwm219-6B GATGAGCGACACCTAGCCTC GGGGTCCGAGTCCACAAC
Xgwm233-7A TCAAAACATAAATGTTCATTGGA TCAACCGTGTGTAATTTTGTCC
Xgwm234-5B GAGTCCTGATGTGAAGCTGTTG CTCATTGGGGTGTGTACGTG
Xgwm251-4B CAACTGGTTGCTACACAAGCA GGGATGTCTGTTCCATCTTAG
Xgwm257-2B AGAGTGCATGGTGGGACG CCAAGACGATGCTGAAGTCA
Xgwm260-7A GCCCCCTTGCACAATC CGCAGCTACAGGAGGCC
Xgwm261-2D CTCCCTGTACGCCTAACGC CTCGCGCTACTAGCATTG
Xgwm272-5D TGCTCTTTGGCGAATATATGG GTTCAAAACAAATTAAAAGGCCC
Xgwm285-3B ATGACCCTTCTGCCAAACAC ATCGACCGCGATCTAGCC
Xgwm312-2A ATCGCATGATGCACGTAGAG ACATGCATGCCTACCTAATGG
Xgwm337-1D CCTCTTCCTCCCTCACTTAGC TGCTAACTGGCCTTTGCC
Xgwm372-2A AATAGAGCCCTGGGACTGGG GAAGGACGACATTCCACCTG
Xgwm400-7A GTGCTGCCACCACTTGC TGTAGGCACTGCTTGGGAG
Xgwm413-1B TGCTTGTCTAGATTGCTTGGG GATCGTCTCGTCCTTGGCA
Xgwm415-5A GATCTCCCATGTCCGCC CGACAGTCGTCACTTGCCTA
Xgwm427-6A AAACTTAGAACTGTAATTTCAGA AGTGTGTTCATTTGACAGTT
Xgwm437-7D GATCAAGACTTTTGTATCTCTC GATGTCCAACAGTTAGCTTA
Xgwm469-6D CAACTCAGTGCACACACAACG CGATAACCACTCATCCACACC
Xgwm480-3A TGCTGCTACTTGTACAGAGGAC CCGAATTGTCCGCCATAG
Xgwm539-2D CTGCTCTAAGATTCATGCAACC GAGGCTTGTGCCCTCTGTAG
Xgwm566-3B TCTGTCTACCCATGGGATTTG CTGGCTTCGAGGTAAGCAAC
Xgwm610-4A CTGCCTTCTCCATGGTTTGT AATGGCCAAAGGTTATGAAGG
Xgwm626-6B GATCTAAAATGTTATTTTCTCTC TGACTATCAGCTAAACGTGT
Xgwm642-1D ACGGCGAGAAGGTGCTC CATGAAAGGCAAGTTCGTCA
Xgwm664-3D CAGTCAGTGCCGTTTAGCAA AGCTTTGCTCTATTGGCGAG
GBS 분석도구로는 GBS-SNP-CROP (Melo et al. 2016)을 사용하였으며, Core Hunter (Crossa et al. 2009), GenoCore (Jeong et al.2017), MSTRAT (Gouesnard et al. 2001)), PowerCore (Kim et al. 2007) 등을 통하여 616점을 밀의 핵심집단으로 선정하였고, 그 중 575점에 대하여 SNP chip 분석을 진행하였다. SNP chip 분석 실험은 Axiom™ BreedWheat 35K Genotyping Array (384HT format)와 Axiom GeneTitan Multi-Channel Instrument를 이용하여 수행하였다.
준비예 2. 616점의 밀 핵심집단에 대한 농업형질 별 단일 염기 다형성 마커 연관 분석
616계통에 대하여 주요농업형질 조사를 진행하였고, GAPIT을 통해 지노타이핑(genotyping) 데이터와 페노타이핑(phenotyping) 데이타를 대입하여 전장유전체 연관분석(GWAS)를 수행하였다.
농업형질에 대한 모델 분석은 다음 식 1과 같다:
[식 1]
Figure 112020107928520-pat00001
상기 식 1에서, yi+ 값은 각각의 농업특성 형질을 의미하며, β0 은 방정식의 절편, β1 은 추가효과, x1i 는 설명변수, β2 는 우월효과, ei 는 확률오차이다.
밀 유전자원에 대하여 생육조사와 종실 특성 분석을 진행하였으며, 단일 염기 다형성 마커 분석을 통하여 출수기를 포함한 19개 농업형질에 대하여 LOD 값 5를 컷오프(cut-off)로 하여 총 1,248개의 연관마커 후보군을 선발하였다.
실험예 1. 출수기 관련 단일 염기 다형성 마커 탐색
GWAS 분석결과와 GAPIT을 통해 출수기에 대하여 LOD값 5이상을 선택하였으며 이를 통하여 SNP 탐색 및 NCBI를 통해 SNP와 연관되어 있는 유전자를 탐색하였다.
핵심집단 계통 및 SNP chip data를 활용 하여 SNP 염기서열을 배열하였으며 출수시기에 연관된 SNP를 탐색하였다.
그 중 2개의 SNP를 확보하였고, 밀 염색체 상의 각 SNP의 위치를 표 2에 나타내었다. 표 2에 기재된 각 SNP의 위치(position)은 cerealDB를 근거로 작성되었고, 이는 밀 표준유전체(IWGSC RefSeq v1.0) 상의 위치와 일치한다.
SNP Chromosom Position P.value maf effect LOD
BA00204258
(AX-95112052)		 3B 284,404,491 1.95E-08 NA -3.405535559 7.709965389
BA00307905
(AX-9484881)		 4B 416,305,576 8.63E-07 NA 1.49569339 6.063989204
BA00204258 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호 1(GAGCAAGCTGAACTGTGATGCGCGTGAGTTTGCTA[A/G]ACATACCAGGGGCTCATATGTGAGTAAGGAGATCA)로 나타낼 수 있다. 또한, BA00307905 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열번호2(AACCAGGAGTCACCGGTCTCAGCGAGCACTGCACT[A/G]TCACCCGTCAGCATGTCCTGGATGTGCTTGAAGAG)로 나타낼 수 있다. 상기에서 [A/G]는 해당 SNP 부위에 염기로 A 또는 G가 존재할 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 출수기 관련 단일 염기 다형성 마커의 특성 규명
실험예 1에서 탐색된 단일 염기 다형성 마커가 밀의 출수기를 예측할 수 있는지 확인 하기 위해서, 밀의 핵심집단 내의 품종에 대하여 임의로 선택하여 BA00307905(AX-94848813)의 유전자형과 출수기를 확인하였고, 국내 품종(금강, 청계, 다홍, 그루)에 적용하여 BA00307905 SNP 상 염기를 통해 출수기의 예측이 가능한지 확인하였다(표 5). 단일 염기 다형성 마커의 특성 규명에 사용된 밀은 표 3에 나타내었다. 또한, 밀의 핵심집단 내의 품종에 대하여 임의로 선택하여 BA00204258(AX-95112052)에서 유전자형과 출수기를 확인하여 표 4에 나타내었고, 국내품종(금강, 은파, 청계, 다홍, 그루)에 적용하여 BA0024258 SNP 상 염기를 통해 출수기의 예측이 가능한지 확인하고, 그 결과를 표 6에 나타내었다. BA00307905SNP를 확인하기 위한 HRM프라이머는 5'-GCTGCGTGTCAATGTGCTCTT-3'(서열번호 3)와 5'-GAATTCATACCCGCAGCCCT-3' (서열번호 4)를 사용하였고, BA0024258 SNP를 확인하기 위한 HRM프라이머는 5'-CTAGCTGCAGTTGCTGATGA-3'(서열번호 5)와 5'-CTTACTCACATATGAGCCCCT-3'(서열번호 6)을 이용하였다. 분석을 위한 HRM PCR은 95℃에서 5분 유지 후 95℃ 10초(1step), 65℃ 25초(2step)의 조건으로 1step과 2step을 1cycle로 하여 45번 반복 후에 0.1초마다 PCR증폭과정에서 온도에 따른 형광변화를 탐색하여 수행하였다.
핵심집단번호 시료번호 밀의 품종명 원산지
36 57 Eunpa Mil Korea, South
51 88 Dahong Mil Korea, South
57 98 Milyang 13 Korea, South
111 157 Cheonggye Mil Korea, South
115 162 Sae Mil Korea, South
301 676 Keumgang Mil Korea, South
338 829 CHN-AWS-2010-1 China
341 842 익산346호 Korea, South
402 1035 익산343호 Korea, South
480 1360 Bouquet France
564 1770 Cr 15146 Germany
573 1797 COR 61-545 United States
시료번호 밀 품종 BA00307905
유전자형		 BA00204258
유전자형		 출수기
(heading date; HD)
98 Milyang 13 GG AG 4/19
162 Sae Mil GG AG 4/17
829 CHN-AWS-2010-1 GG AG 4/18
842 익산346호 GG AG 4/16
1035 익산343호 GG AG 4/19
1360 Bouquet AA AA 5/21
1770 Cr 15146 AA AA 5/21
1797 COR 61-545 AA AA 5/16
표 4에 나타낸 바와 같이, BA00307905 SNP의 유전자형 또는 BA00204258 SNP의 유전자형이 AA인 경우, BA00307905 SNP의 유전자형이 GG인 밀 또는 BA00204258 SNP의 유전자형이 AG인 밀과 비교해서 출수기가 약 한달 가량 늦어지는 것을 확인하였다. 또한, 상기 Bouquet, Cr 15146, 및 COR 61-545 품종은 영양생장 길어지는 특성을 가지는 것으로 확인되었다.
이에 비하여, BA00307905 SNP의 유전자형이 GG인 경우 또는 BA00204258 SNP의 유전자형이 AG인 경우 출수기가 빠르고, 이에 따라 영양생장 기간이 짧아, 식물체의 크기가 작은 것으로 확인되었다.
상기 SNP를 통해서 출수기를 예측할 수 있는지 확인하기 위해서, 국내 품종(금강, 청계, 다홍, 그루)에 적용하여 BA00307905 SNP 상의 유전자형을 통해 출수기의 예측이 가능한지 확인한 결과는 표 5에 나타내었다. 또한, BA00204258 SNP 상의 유전자형을 통해 출수기 예측이 가능한지 확인한 결과는 표 6에 나타내었다.
시료번호 밀 품종 유전자형 출수기
88 Dahong Mil GG 4/27
157 Cheonggye Mil GG 4/24
676 Keumgang Mil GG 4/17
시료번호 밀 품종 유전자형 출수기
57 Eunpa Mil AG 4/22
88 Dahong Mil AG 4/27
157 Cheonggye Mil AG 4/24
676 Keumgang Mil AG 4/17
표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 다홍, 청계 및 금강 각각의 BA00307905 SNP 상 유전자형은 AG 또는 GG 였고, 이의 출수기는 4월로 출수기가 빠른 것으로 확인되었다. 또한, 다홍, 청계, 은파 및 금강 각각의 BA00204258 SNP 상 유전자형은 AG인 것으로 확인되었다. 이는 앞서 확인된 결과 및 SNP를 확인한 각 품종 간의 염기서열을 정렬하여 확인한 결과와도 동일한 경향성을 나타내는 것임을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 단일 염기 다형성 마커는 밀에서 출수기를 효과적으로 예측할 수 있음을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> A BIOMARKER FOR PREDICTING A HEAD STAGE OF WHEAT <130> P20U25C1737 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <223> n is a or g. <400> 1 gagcaagctg aactgtgatg cgcgtgagtt tgctanacat accaggggct catatgtgag 60 taaggagatc a 71 <210> 2 <211> 71 <212> DNA <213> Triticum aestivum <220> <221> misc_feature <223> n is a or g. <400> 2 aaccaggagt caccggtctc agcgagcact gcactntcac ccgtcagcat gtcctggatg 60 tgcttgaaga g 71 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM Primer <400> 3 gctgcgtgtc aatgtgctct t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM Primer <400> 4 gaattcatac ccgcagccct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM Primer <400> 5 ctagctgcag ttgctgatga 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRM Primer <400> 6 cttactcaca tatgagcccc t 21

Claims (9)

  1. 밀 시료로부터 밀 4B번 염색체에 존재하는 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커의 유전자형을 확인하는 것을 포함하고,
    상기 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에서 36번째 염기가 A 또는 G인 것인, 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    밀 4B번 염색체에 존재하는 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커의 유전자형이 AA이면 밀의 출수기가 늦은 지표를 나타내는 것인, 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    밀 4B번 염색체에 존재하는 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커의 유전자형이 GG이면 밀의 출수기가 빠른 지표를 나타내는 것인, 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 밀로부터 분리된 게놈 DNA를 준비하는 단계;
    (b) 상기 게놈 DNA에서 밀 4B번 염색체(genome)에 존재하는 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커를 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭된 시료에서 단일 염기 다형성 마커의 염기에 따라서 밀의 출수기를 분석하는 단계를 포함하는 것인, 밀의 출수기를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 밀 시료로부터 밀 4B번 염색체에 존재하는 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커의 유전자형을 확인하는 것을 포함하고,
    상기 BA00307905로 표시되는 단일 염기 다형성 마커는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에서 36번째 염기가 A 또는 G인 것인, 밀의 출수기를 예측하는 방법.
  6. 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 밀의 출수기 예측용 조성물로서,
    상기 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에서 36번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드인, 밀의 출수기 예측용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하거나, 이를 증폭할 수 있는 프로브 또는 프라이머인, 밀의 출수기 예측용 조성물.
  8. 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 밀의 출수기 예측용 키트로서,
    상기 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열에서 36번째 염기를 포함하는 5 내지 100개의 연속적인 핵산 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드인, 밀의 출수기 예측용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단일 염기 다형성 마커를 검출할 수 있는 제제는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하거나, 이를 증폭할 수 있는 프로브 또는 프라이머인, 밀의 출수기 예측용 키트.
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