CN112442544B - 一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法、试剂盒及应用 - Google Patents

一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法、试剂盒及应用。其中与番茄材料高糖性状相关的两个SNP位点为番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基C或T和番茄基因组第9号染色体3478110bp处的碱基A或G，通过这两个SNP位点标记，本发明公开了一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法，以及番茄基因组第6号染色体37559435bp处和番茄基因组第9号染色体3478110bp处SNP位点在番茄分子标记辅助选择育种中的应用，可以在苗期就鉴定出高糖的番茄材料，从而加快育种进程，提高育种效率。

Description

一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法、试剂盒及应用。
背景技术
番茄果实中的糖含量是番茄品质育种中重要的目标之一，因为番茄果实中糖含量对果实风味、色泽及营养成分有着重要影响，是决定番茄果实品质的主要因素。番茄果实糖含量对于加工番茄也非常重要，加工番茄的果肉、果酱和果汁的品质很大程度上取决于果实内所积累的糖的种类和含量。番茄果实中的糖含量是数量性状，众多研究者对于该性状进行了大量的QTL(数量性状位点)分析，发现了大部分QTL位点可解释的表型变异率都比较低，且多与果实重量轻和产量低等不利性状的位点连锁。影响番茄果实糖含量相关位点来源于番茄野生种，番茄野生种果实糖含量是番茄的2-3倍，是培育高糖番茄和研究果实糖代谢机制的重要资源。番茄野生种果实积累糖分分为两种类型，一种积累果糖和葡萄糖，例如契斯曼尼番茄、醋栗番茄、潘那利番茄等；另外一种积累蔗糖，例如克梅留斯基番茄、多毛番茄、秘鲁番茄等。樱桃番茄作为野生番茄向栽培番茄的过渡类型，糖度高且果实重量小，栽培番茄果实重量远大于樱桃番茄，但是糖度低。挖掘控制果实糖含量与单果重不连锁的关键基因位点并开发能够在育种实践当中辅助鉴定具有高糖性状的番茄材料的分子标记筛选技术，对于培育具有高糖性状的番茄材料以及番茄品质育种具有重要意义。
分子标记辅助选择育种，是指利用分子标记对育种材料进行选择，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法，可以很好的提高育种效率。在分子育种应用之前，需要鉴定与目标性状关联的分子标记。单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)是指染色体基因组含量上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1％其中包括单碱基的转换(包括C与T转换，在其互补链上则为G与A互换)、颠换(包括C与A、G与T、C与G，A与T互换)，以及单碱基的插入/缺失等。SNP作为新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点，利用序列的多态性开发用于检测番茄糖度性状的标记已成为可能，通过上述标记的筛选，可提高含糖量这一重要番茄品质性状选择的育种效率，节约育种成本并提升番茄产业经济效益，选择有效的分子标记一直是本领域技术人员努力的方向。番茄果实材料糖度＞8.0时,属于糖度较高,风味和口感都较好的番茄材料。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种筛选具有高糖性状番茄材料的方法，本发明所述高糖番茄材料特征为番茄果实材料糖度＞8.0，本发明可以提高含糖量这一重要番茄品质性状选择的育种效率，节约育种成本并提升番茄产业经济效益。
本发明还提供一种解决上述问题的试剂盒。
同时，本发明还提供番茄基因组第6号染色体37559435bp处和番茄基因组第9号染色体3478110bp处SNP位点在番茄分子标记辅助选择育种中的应用。
技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明的第一个方面，提供了一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，苗期提取番茄的基因组DNA；
S2，鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基和第9号染色体3478110bp处的碱基；
步骤S2中，鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基所用引物包括上游引物BR1-dCAPSF：5’-AGAAGGCTGGCCTTTCCGAT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物BR1-dCAPSR：5’-ATGCTGTATGGGTTTCCTTG-3’(SEQ ID NO：2)；
鉴定番茄基因组第9号染色体3478110bp处的碱基所用引物包括上游引物BR2-dCAPSF：5’-GTATTCCGCGACAAGTATGGGTA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物BR2-dCAPSR：5’-GGAAAAGTTGAAACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：4)。
S3，根据所述步骤S2的鉴定结果进行筛选。
作为优选，步骤S3中，鉴定结果的筛选：所述番茄材料基因组第6号染色体37559435bp处基因型为CT或TT且番茄基因组第9号染色体3478110bp处基因型为GG时，所述的番茄材料果实糖度高。
本发明的第二个方面，提供了
一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法使用的试剂盒，其特征在于，步骤S2中，鉴定番茄基因组时使用试剂盒，所述试剂盒包括引物，具体为：碱基序列为5’-AGAAGGCTGGCCTTTCCGAT-3’(SEQ ID NO：1)的上游引物BR1-dCAPSF和碱基序列为5’-ATGCTGTATGGGTTTCCTTG-3’(SEQ ID NO：2)的下游引物BR1-dCAPSR，；
碱基序列为5’-GTATTCCGCGACAAGTATGGGTA-3’(SEQ ID NO：3)的上游引物BR2-dCAPSF和碱基序列为5’-GGAAAAGTTGAAACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：4)的下游引物BR2-dCAPSR。
作为优选，该试剂盒还包括PCR扩增试剂和酶切试剂，所述的PCR扩增试剂包括GoTaq Flexi Buffer，MgCl2，dNTP Mixture，GoTaq DNA Polymerase和ddH2O，所述的酶切试剂包括ddH2O，10*bufferR，Hinf I，Cutsmart Buffer，AccI。
本发明的第三个方面，提供了番茄基因组第6号染色体37559435bp处和番茄基因组第9号染色体3478110bp处SNP位点在番茄分子标记辅助选择育种中的应用。
有益效果
应用上述的2个SNP标记与番茄果实糖度含量相关联，初步认为可以应用于筛选具有高糖性状的番茄材料以及高糖番茄育种和辅助育种中，无需田间统计和耗费大量人力即可快速筛选得到具有高糖性状的番茄材料，既避免了环境因子对表型鉴定的影响又大大缩短了育种周期，同时也为研究这2个SNP位点在番茄育种中的应用提供了重要理论实践基础。
附图说明
图1示出了BR1-dCAPSF、BR1-dCAPSR在所述群体中番茄材料基因组DNA中PCR产物经过酶切后电泳凝胶成像图，所示图中M表示DL500 DNA Marker，CC、TT、CT为样品对照；
图2示出了BR2-dCAPSF、BR2-dCAPSR在所述群体中番茄材料基因组DNA中PCR产物经过酶切后电泳凝胶成像图，所示图中M表示DL500 DNA Marker，AA、GG为样品对照；
图3示出了133份番茄材料中基因型同时为AA和CC的番茄材料与基因型同时为GG和TT/CT的番茄材料比较糖度和单果重的柱状图，所示图中A表示所述群体中全部番茄材料，B表示单果重＞50.00g的番茄材料，C表示单果重≤50.00g的番茄材料；
图4示出了在所述群体中番茄材料的糖度和单果重散点分布图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
利用传统的育种手段选择高糖的番茄材料不仅难度大、成本高，而且易受环境条件影响，为了解决这一技术难题，本发明开发出与番茄糖度相关联的2个SNP标记鉴定引物，可以在苗期就鉴定出具有高糖性状的番茄材料，从而加快育种进程，提高育种效率。
本发明的与番茄糖度性状相关联的2个SNP位点具体是通过如下步骤而获得的:
(一)番茄基因组第6号染色体上SNP突变位点的获得,参考已知文献：Petit,J.(2014).Master thesis:Identification of introgression region(s)related to brixcontent with increased fruit soluble solids.Wageningen university。按标准设计上游引物序列SNPJCF：5’-CCGACTTGTCATCAATACTGTG-3’(SEQ ID NO：5)和下游引物序列SNPJCR：5’-GTTCTATTTGATGCTGTATGGG-3’(SEQ ID NO：6)。对已知糖度不同的育种材料(试验材料来自上海市农业科学院，糖度的获得均是所述群体中每份材料果实的平均值)进行PCR扩增后sanger测序，发现SL3.0版本的番茄基因组第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处的核苷酸有一个SNP位点，呈现C或T多态性。
(二)番茄基因组第9号染色体上SNP突变位点的获得,参考已知文献：DeniseTieman,Guangtao Zhu,Marcio F.R.Resende,Tao Lin,Cuong Nguyen,Dawn Bies,JoseLuis Rambla,Kristty Stephanie Ortiz Beltran,Mark Taylor,Bo Zhang,HirokiIkeda,Zhongyuan Liu,Josef Fisher,Itay Zemach,Antonio Monforte,Dani Zamir,Antonio Granell,Matias Kirst,Sanwen Huang,Harry Klee.A chemical geneticroadmap to improved tomato flavor[J].Science,2017,355(6323)，发现番茄基因组第9号染色体3478110bp处有一个SNP位点,呈现A或G多态性。
(三)2个SNP特异性酶切位点分析及引物设计
(1)特异性酶切位点分析：根据(一)中获得的第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处碱基C或T，利用在线酶识别软件dCAPS Finder2.0(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)查找突变所引起的限制性内切酶信息，选用内切酶Hinf I，该酶的酶切识别序列为GANTC，需要在第6号染色体37559431bp(SL3.0ch06,37559431)碱基位置处人工引入错配碱基(C→G)。
(2)特异性酶切位点分析：根据(二)中获得的与番茄糖度含量最为显著关联的第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处碱基。利用在线酶识别软件dCAPS Finder 2.0(http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)查找突变所引起的限制性内切酶信息，选用内切酶AccI，该酶的酶切识别序列为GTMKAC，需要在第9号染色体3478107bp(SL3.0ch09,3478107)碱基位置处人工引入错配碱基(C→G)。
(3)引物设计：利用Primer 5.0软件设计PCR引物，引物设计标准：片段为15-30bp；GC含量为40％-60％；退火温度为55℃-65℃最佳；上下游引物的GC含量和退火温度尽量保持接近；无引物二聚体及发卡结构；鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处的碱基用的引物，根据标准设计引物BR1-dCAPS，包括上游引物序列为BR1-dCAPSF：5’-AGAAGGCTGGCCTTTCCGAT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物序列BR1-dCAPSR:5’-ATGCTGTATGGGTTTCCTTG-3’(SEQ ID NO：2)；鉴定番茄基因组第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处的碱基用的引物，根据标准设计引物BR2-dCAPS，包括上游引物序列BR2-dCAPSF：5’-GTATTCCGCGACAAGTATGGGTA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物序列BR2-dCAPSR：5’-GGAAAAGTTGAAACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：4)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种辅助筛选番茄材料高糖性状相关的SNP位点，该SNP位点为番茄基因组第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处的碱基C或T和番茄基因组第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处的碱基A或G。
应用上述的2个SNP标记与番茄果实糖度含量相关联，初步认为可以应用于筛选具有高糖性状的番茄材料以及高糖番茄育种和辅助育种中，无需田间统计和耗费大量人力即可快速筛选得到具有高糖性状的番茄材料，既避免了环境因子对表型鉴定的影响又大大缩短了育种周期，同时也为研究这2个SNP位点在番茄育种中的应用提供了重要理论实践基础。
根据本发明的一种典型的实施方式，提供了一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法，包括以下步骤：
S1，苗期提取番茄的基因组DNA；
S2，鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基和第9号染色体3478110bp处的碱基；
S3，根据所述步骤S2的鉴定结果进行筛选。
采用该方法筛选高糖番茄材料，在番茄生长的苗期就能够高效、准确地鉴定出具有高糖性状的番茄材料以及高糖番茄材料，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。
本发明的发明人发现，番茄基因组第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处基因型为CT或TT且番茄基因组第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处基因型为GG时，所述的番茄材料果实糖度高。番茄基因组第6号染色体37559435bp处基因型为CC且番茄基因组第9号染色体3478110bp处基因型为AA时，所述的番茄材料果实糖度可能较低。
也就是说，上述2个SNP位点基因型同时是GG和CT或TT时，番茄果实糖度高；上述2个SNP位点基因型同时是AA和CC时，番茄果实糖度较低的可能性大。因此，本领域技术人员可以同时根据这2个SNP位点的碱基预测番茄糖度高低。
步骤S2中鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基用的引物包括上游引物序列BR1-dCAPSF：5’-AGAAGGCTGGCCTTTCCGAT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物序列为BR1-dCAPSR：5’-ATGCTGTATGGGTTTCCTTG-3’(SEQ ID NO：2)，鉴定番茄基因组第9号染色体3478110bp处的碱基用的引物包括上游引物序列BR2-dCAPSF：5’-GTATTCCGCGACAAGTATGGGTA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物序列为BR2-dCAPSR：5’-GGAAAAGTTGAAACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：4)。引物设计详情见表1。
表1 BR1-dCAPS、BR2-dCAPS标记引物信息。
Figure BDA0002191925830000081
采用上述引物，能够高效、准确地鉴定出SNP位点的碱基。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种辅助筛选番茄材料高糖性状的试剂盒，该试剂盒用于鉴定上述方法中S2步骤番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基和第9号染色体3478110bp处的碱基，该试剂盒包括碱基序列5’-AGAAGGCTGGCCTTTCCGAT-3’(SEQ ID NO：1)的上游引物BR1-dCAPSF和碱基序列5’-ATGCTGTATGGGTTTCCTTG-3’(SEQ IDNO：2)的下游引物BR1-dCAPSR，碱基序列5’-GTATTCCGCGACAAGTATGGGTA-3’(SEQ ID NO：3)的上游引物BR2-dCAPSF和碱基序列5’-GGAAAAGTTGAAACCTGTGATG-3’(SEQ ID NO：4)的下游引物BR2-dCAPSR。采用上述引物，能够高效、准确地鉴定出与番茄糖度性状关联的2个SNP标记，在番茄生长的苗期就能够高效、准确地鉴定出具有高糖性状的番茄材料以及高糖番茄材料，从而大大加速育种进程，缩短了选育周期。
作为优选，该试剂盒还包括PCR扩增试剂和酶切试剂，所述的PCR扩增试剂包括GoTaq Flexi Buffer，MgCl2，dNTP Mixture，GoTaq DNA Polymerase和ddH2O，所述的酶切试剂包括ddH2O，10*bufferR，Hinf I，Cutsmart Buffer，AccI。
根据本发明一种典型的实施方式，提供了番茄基因组第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处的SNP位点和番茄基因组第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处的SNP位点在辅助筛选具有高糖性状的番茄材料以及高糖番茄材料育种中的应用。
本发明中提及的分子生物学技术，本领域技术人员均可按照常规操作进行，以下对本发明优选的实验步骤做详细的描述:
(1)DNA提取
采用CTAB提取法提取了所述群体中番茄材料的基因组DNA，通过核酸鉴定仪鉴定其浓度和纯度后，用ddH2O稀释至100ng/μL后备用。
(2)扩增目的基因
用上述设计的BR1-dCAPS、BR2-dCAPS引物对所述群体中番茄材料进行扩增，获得目的片段。应用20μLDNA聚合酶链反应(PCR)体系，其中包括GoTaq Flexi Buffer：4μL，MgCl2：1.6μL，dNTP Mixture：1.6μL，Primer1：1μL，Primer2：1μL，GoTaq DNA Polymerase：0.25μL，ddH2O：11.6μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃预变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。对PCR产物采用4％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得的条带明显无弥散，说明引物特异性好。
(3)PCR产物酶切
在对于步骤中的(2)中BR1-dCAPS扩增获得的PCR产物进行37℃酶切2h。酶切的反应体系为32μL：PCR产物：10μL(0.1-0.5μg of DNA)，ddH2O：18μL，10*bufferR：2μL，Hinf I：1-2μL。并对酶切产物用4％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，通过BIO-RAD凝胶成像仪成像。根据成像结果，即PCR产物酶切带型，分析第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处的基因型，共有CC、TT纯合和CT杂合3种基因型。Hinf I酶切结果为：CC基因型的PCR产物不能酶切，酶切产物电泳检测条带长度为172bp；TT基因型PCR产物可以完全酶切，酶切产物电泳检测条带长度为151bp；CT基因型PCR产物可以部分酶切，酶切产物的电泳检测结果包含2条主带172bp和151bp。
在对于步骤中的(2)中BR2-dCAPS扩增获得的PCR产物进行37℃酶切3h。酶切反应体系为10μL：PCR产物：5μL，ddH2O：3.75μL，Cutsmart Buffer：1μL，AccI：0.25μL。并对酶切产物用4％琼脂糖凝胶进行电泳检测，溴化乙锭染色，通过BIO-RAD凝胶成像仪成像。根据成像结果，即PCR产物酶切带型，分析第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处的基因型，共有AA和GG 2种基因型。AccI酶切后结果为：AA基因型不能酶切，酶切产物电泳检测条带长度为172bp；GG基因型可以酶切完全，酶切产物电泳检测条带长度为149bp。
(4)表型的测定
选取所述群体中番茄材料的红熟期果实，进行糖度和单果重测定，测定糖度仪器是ATAGO PAL-1数显测糖仪，测定单果重的仪器是电子称。测定结果分别用Excel 2016软件计算平均表型值，结果详情见表2
表2 所述群体中番茄材料的表型测定结果
Figure BDA0002191925830000101
Figure BDA0002191925830000111
Figure BDA0002191925830000121
Figure BDA0002191925830000131
Figure BDA0002191925830000141
Figure BDA0002191925830000151
Figure BDA0002191925830000161
(5)表型和基因型分析根据(4)的统计结果发现，所述群体的番茄材料中，有53份番茄材料基因型同时为AA和CC，占整体比例的39.8％，糖度平均值为7.1；有18份番茄材料基因型同时为GG和TT/CT，糖度平均值为8.5，占整体比列的13.5％(表3)，不同基因型之间的糖度差异极显著(P<0.01)(表4)。在所述群体的番茄材料中发现5份糖度＞8.0且单果重＞100.00g的番茄材料，基因型分析发现这5份番茄材料在番茄基因组第6号染色体37559435bp(SL3.0ch06,37559435)处基因型为CT或TT且在番茄基因组第9号染色体3478110bp(SL3.0ch09,3478110)处基因型为GG，为后期高品质番茄育种和研究番茄糖分积累机制奠定了基础。应用2个SNP标记同时筛选具有高糖性状的番茄材料符合了我们的预期。
表3 不同基因型群体的糖度分析
Figure BDA0002191925830000171
注：组1为基因型同时为AA和CC的番茄材料，组2为基因型同时为GG和TT/CT的番茄材料。
表4 根据表3中组1和组2番茄材料糖度的方差分析
Figure BDA0002191925830000172
本发明上述使用的试剂均可包含在辅助筛选番茄材料高糖性状的试剂盒中。
从以上实验数据可以看出，本发明阐述的2个SNP标记与番茄果实糖度含量相关联，初步认为可以应用于具有高糖性状的番茄材料以及高糖番茄育种和辅助育种中，无需田间统计和耗费大量人力即可快速筛选得到具有高糖性状的番茄材料，既避免了环境因子对表型鉴定的影响又大大缩短了育种周期，同时也为研究这2个SNP位点在番茄育种中的应用提供了重要理论和实践基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法、试剂盒及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaggctgg cctttccgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgctgtatg ggtttccttg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtattccgcg acaagtatgg gta 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaaaagttg aaacctgtga tg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgacttgtc atcaatactg tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttctatttg atgctgtatg gg 22

Claims (1)

1.一种辅助筛选具有高糖性状番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，苗期提取番茄的基因组DNA；
S2，鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基和第9号染色体3478110bp处的碱基；
步骤S2中，鉴定番茄基因组第6号染色体37559435bp处的碱基所用引物包括上游引物BR1-dCAPSF：5’-AGAAGGCTGGCCTTTCCGAT-3’和下游引物BR1-dCAPSR：5’-ATGCTGTATGGGTTTCCTTG-3’；
鉴定番茄基因组第9号染色体3478110bp处的碱基所用引物包括上游引物BR2-dCAPSF：5’-GTATTCCGCGACAAGTATGGGTA-3’和下游引物BR2-dCAPSR：5’-GGAAAAGTTGAAACCTGTGATG-3’；
S3，根据所述步骤S2的鉴定结果进行筛选：所述番茄材料基因组第6号染色体37559435bp处基因型为CT或TT且番茄基因组第9号染色体3478110bp处基因型为GG时，所述的番茄材料果实糖度高。
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