KR102396581B1

KR102396581B1 - 콩 내탈립성 판별 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102396581B1
Application number: KR1020200132084A
Authority: KR
Inventors: 서정현; 강범규; 김홍식; 조광수; 김현태; 신상욱; 백인열; 정찬식
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2022-05-12
Also published as: KR20220048794A

Abstract

본 발명은 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 키트, 및 (a) 콩 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커의 다형성 부위 또는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법은 육안으로 구별되지 않는 콩의 내탈립성을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으며, KASP 분석 등을 통해 콩 탈립 저항성 품종의 대량 검정이 가능하고, 탈립 저항성을 갖는 콩 품종 개발에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

Description

콩 내탈립성 판별 마커 및 이의 용도 {Marker for selecting resistance to pod-shattering of soy bean and the use thereof}

본 발명은 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 키트, 및 (a) 콩 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커의 다형성 부위 또는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법에 관한 것이다.

식물은 이동능력이 없기 때문에 종자분산은 온전한 유전정보를 가진 자손을 퍼트리기 위한 필수적인 절차이다.

꼬투리를 가진 식물종에서, 탈립성은 성공적인 종자분산과 다양한 환경조건 하에서 생존하기 위한 필수 메커니즘이다. 야생에서의 콩은 높은 탈립성을 가져 종자를 널리 퍼트리기에 유리한 방향으로 진화하지만 작물에서의 경우 높은 탈립성은 농작물 수확량 저하의 원인이 되기 때문에 탈립성을 조절해 줄 필요가 있다.

세계 최대의 콩 생산지 중 하나인 미국 등에서는 수확 시기가 건조하기 쉬운 기상인 데다 오래 전부터 대규모 콤바인 수확이 이루어져 왔다는 점에서 탈립 저항성을 갖춘 품종이 주류가 되고 있다. 일본과 우리나라의 콩은 비교적 소규모로 재배하고 손으로 수확하며, 수확기인 가을이 비교적 습기가 많은 점도 있어 내탈립성을 갖추지 못한 품종이 많이 재배되어 왔다.

그러나 최근 콩 재배가 대규모화되어 콤바인 수확이 증가하고 있으며, 온난화가 심해지면 수확시기에 건조해질 우려도 있다. 따라서 콩 안정생산을 위해 탈립 저항성이 중요시되면서 그러한 특성을 갖고 있는 품종을 효율적으로 개발하기 위해 분자 기반의 해명이 요구되고 있다. 일본 농업연구기구는 홋카이도대학, 가가와대학과 공동으로 탈립에 강한 유전자를 밝히고 그 작용기구를 규명하기 위해 연구한 결과, 콩의 16번 염색체에 존재하는 1개의 유전자가 그 기능을 잃으면서 탈립 저항성이 나타남을 확인하였다 (Funatsuki, Hideyuki, 외, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111.50: 17797-17802). 또한, Bailey 외 (Journal of Heredity, 1997, 88.2: 152-154)는 B122-1 RFLP 마커를 이용하여 탈립 저항성 품종과 탈립 감수성 품종의 재조합 근교 계통(RIL) 집단에서 44%의 표현형 분산 설명 값을 보여주어 연관그룹 J (16번 염색체)에서 QTL의 존재를 발견하였다. 하지만 한국의 콩 탈립 저항성 품종을 위한 연구는 아직도 부족한 실정이다.

국내공개특허 10-2005-0090237에서는 초다뿌리혹 형성 콩 변이체에 대한 단일뉴클레오타이드 다형성 마커를 이용하여 뿌리혹 형성 변이체의 동정 방법에 대하여 개시하고 있고, 국내등록특허 10-1763465에서는 콩 자외선(UV-B) 저항성 유전자 연관 표지인자를 이용하여 자외선 저항성 콩을 선별하는 방법에 대하여 개시하고 있으나, 본 발명의 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커에 대하여 직접적으로 개시하고 있는 내용은 공개되지 않았으며, 본 발명자에 의해서 최초로 규명되었다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 콩 탈립 저항성 품종의 판별 기술을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 콩의 유전체에서 탈립 저항성과 관련된 신규 SNP마커를 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 141번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 콩 시료의 DNA로부터 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커의 다형성부위를 증폭하거나 검출하는 단계로서,

상기 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 141번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 141번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커를 제공한다.

본 발명에서는 유전체 시퀀싱을 통해 콩 유전체의 SNP를 탐색한 결과, 콩 탈립 저항성 품종에서 16번째 염색체의 majorQTL 내 5개의 SNP를 발견하였으며, 이 중 주변 SNP를 확인하고 콩 탈립 저항성 및 감수성 품종의 표현형 결과를 비교하여, 저항성 품종과 감수성 품종을 명확하게 구별할 수 있는 단일 염기 다형성을 찾아내 콩 탈립 저항성 특이적인 마커를 제작하였으며, 상기 마커를 이용한 CAPS(Cleaved Amplification Polymorphic Sequence), KASP (kompetitive allele specific PCR)를 통하여 저항성 품종과 감수성 품종을 명확하게 구별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 마커는 콩의 16번 염색체의 LOC100784475(Glyma.16g141200) 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 콩의 16번 염색체의 29,916,524bp 위치일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 번역시작 위치에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개, 구체적으로 5 내지 200개, 보다 구체적으로 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩 탈립(pod-shattering) 저항성 품종 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커일 수 있다.

또한, 상기 마커는 150번째 염기가 A이고 151번째 염기가 결실된 경우, 콩 탈립 저항성 품종으로 판별하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 서열번호 9의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함할 경우 콩 탈립 저항성 품종으로 판별할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 마커는 콩의 16번 염색체의 BZIP117(Glyma.16g141500) 유전자의 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 콩의 16번 염색체의 29,964,216bp 위치일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드의 번역시작 위치에서 141번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개, 구체적으로 5 내지 200개, 보다 구체적으로 5 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩 탈립(pod-shattering) 저항성 품종 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커일 수 있다.

또한, 상기 마커는 141번째 염기가 G인 경우, 콩 탈립 저항성 품종으로 판별하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예로 서열번호 10의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함할 경우 콩 탈립 저항성 품종으로 판별할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 용어, “콩(soybean)”은 장미목의 콩과식물이며 식용작물로 널리 재배되고 있다. 줄기는 높이가 60∼100cm이고 곧게 서며 덩굴성인 품종도 있다. 뿌리에는 많은 근류(뿌리혹)가 있다. 종자를 품는 꼬투리를 가지며 완전히 익으면 꼬투리가 터져서 종자가 흩어지는 특징을 가진다. 본 발명의 SNP 마커로 탈립 저항성을 판별할 수 있는 콩의 예는 특별하게 제한은 없으나, 대원콩, 태광콩, 대풍, 새단백, 진풍, 선풍, 새금, 대풍2호, 대찬, 평원, 청자3호, 청미인, 소청자, 청자4호, 태청, 청자5호, 미소, 청엽1호, 새올, 황금올, 참올, 장올, 두루올, 누리올, 단미2호, 녹원, 풍산나물콩, 풍원, 해품, 해원, 소연, 아람, 다원콩 및 상기 품종을 모본 및/또는 부본으로 하는 상기 품종 유래로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로 대원콩 또는 대원콩 유래의 품종일 수 있다.

본 발명에서의 용어, “탈립 저항성”은 종자가 식물로부터 떨어져 나오는 것이 감소되는 특성으로, 본 명세서에서 내탈립성 또는 탈립 내성과 동일한 의미로 사용될 수 있다.

상기 용어, “탈립(pod-shattering)”, 또는 “탈립성(shattering property)”은 종자가 식물로부터 떨어져 나오는 특성을 의미하는 것으로 콩 또는 벼와 같은 농작물의 수확량에 영향을 준다.

본 발명의 "콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커"는 "콩 탈립 감수성 품종 판별용 SNP 마커"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "SNP(single nucleotide polymorphism)마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 콩 탈립 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "개체"란, 콩 탈립 저항성을 확인하고자 하는 대상인 콩을 의미하며, 상기 콩으로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 콩 탈립 저항성이 있는 콩 품종을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 탈립 저항성 품종인 대원콩, 감수성 품종인 다원콩 및 새올을 채종하여, RIL 집단을 양성한 뒤, 콩 품종별 탈립 저항성 검정을 실시하고(도 1), 상기 품종의 유전자 검사를 통해 16번째 염색체 내 QTL에서 콩 탈립 저항성과 관련한 차이가 있음을 확인하였으며, 상기 QTL을 분석하여 5개의 SNP를 발견하였고, Glyma.16g141200 유전자 및 Glyma.16g141500 유전자에 포함된 본 발명의 SNP만이 콩 탈립 저항성 품종을 판별할 수 있어, 탈립 저항성 품종인 대원콩과 감수성 품종인 다원콩, 새올 품종을 정확히 구별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다.

이때, 상기 용어 “콩”, “탈립 저항성”, “SNP 마커”는 전술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, “SNP 마커를 검출할 수 있는 제제”는 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 콩 탈립 저항성 품종을 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트; 또는 또는 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어, "프로브"는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 KASP 분석 키트, CAPS 분석 키트 또는 DNA 칩 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 본 발명에서 제공하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적 프라이머 세트, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자, dNTPs, 완충액, 표지 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "KASP(kompetitive allele specific PCR)"이란 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립유전자(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술을 의미한다.

본 발명의 KASP 분석 키트는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커의 유전자형을 증폭 및 증폭된 서열에 표지된 물질(형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질)을 감지함으로서 콩 탈립 저항성 품종을 판별할 수 있다.

본 발명의 용어, "CAPS(Cleaved Amplification Polymorphic Sequence)"는 증폭된 PCR 산물에 제한효소를 처리하여 절단 위치에 따른 DNA 단편의 크기 차이를 확인하는 방법으로, DNA에 존재하는 염기쌍 하나의 치환인 SNP의 변이를 예측할 수 있는 분석방법을 의미하는 것으로, 본 발명의 CAPS 분석 키트는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커의 유전자형을 증폭 및 증폭된 서열을 제한효소로 처리하여 절단된 DNA 단편의 크기를 전기영동으로 확인함으로서 콩 탈립 저항성 품종을 판별할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 콩 시료의 DNA로부터 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계로서, 상기 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 141번째 염기가 G 또는 C이고, 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법을 제공한다.

이때, 상기 용어 “SNP 마커”, “콩”, “탈립 저항성”은 전술한 바와 같다.

상기 판별 방법은 상기 증폭 또는 검출된 다형성 부위가 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 150번째 염기가 A이고 151번째 염기가 결실된 경우 콩탈립 저항성 품종으로 판단하는 (c)단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

또는, 상기 증폭 또는 검출된 다형성 부위가 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드의 141번째 염기가 G인 경우, 콩 탈립 저항성 품종으로 판단하는 (c)단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

상기 판별 방법에서 (a) 단계의 DNA 시료로부터 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예로, 상기 (a) 단계는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트; 또는 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것일 수 있다.

상기 판별 방법에서 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 KASP 분석, CAPS 분석, 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예로, 실시예에서는 본 발명의 SNP 마커를 이용하여 HinfI 제한효소를 이용한 CAPS 분석을 하였고, SNP 마커의 다형성 부위를 인식하여 제한효소에 의해 절단된 DNA 단편을 대원콩 품종에서 확인하여 콩 탈립 저항성 품종을 판별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 구체예로, 실시예에서는 본 발명의 SNP 마커를 이용하여 RIL집단의 총 308계통 KASP 분석을 한 결과, 콩 탈립 저항성 품종인 대원콩 유래 계통과 감수성 품종인 다원콩, 새올 계통의 품종이 유전형이 구별됨을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 이는 상기 대원콩 유래 계통의 탈립률이 14.7%이며, 다원콩 및 새올 계통이 80.52%의 탈립률의 표현형을 보임을 확인하여 유전형과 일치됨을 확인하였고(표 5), 상기 방법을 통해 콩 탈립 저항성 품종을 판별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 신규 SNP 마커 및 이를 이용한 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법은 육안으로 구별되지 않는 콩의 내탈립성을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으며, KASP 분석 등을 통해 콩 탈립 저항성 품종의 대량 검정이 가능하고, 탈립 저항성을 갖는 콩 품종 개발에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.

도 1은 건조 72시간 후 탈립률 빈도분포를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 SNP 마커를 이용한 CAPS 분석결과로, 콩 품종별 PCR 산물 크기를 비교한 결과이다(DW: 대원콩, TW: 다원콩, SO: 새올).
도 3은 본 SNP 마커를 이용한 KASP 분석결과로, 유전형 검정 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 시험 콩 집단 양성

탈립 저항성 품종인 대원콩과 탈립 감수성 품종인 다원콩 및 새올을 교배하여 두 개의 F1, F2 집단을 채종하였다. 이후, 후대 계통을 단립계통육종법(single seed decent;SSD)으로 세대진전하여 고세대(F6, F7, F8)의 RIL집단을 양성하였다.

구체적으로, 대원콩×다원콩 조합에서 154 계통, 대원콩×새올 조합에서 153 계통의 RIL(recombinant inbred line) 집단을 양성하였다.

실험예 2. 콩 탈립 저항성 검정

성숙기의 콩 꼬투리를 채취하고, 일주일간 상온에 처리한 뒤 40℃건조기에서 24, 48, 및 72시간 건조하여 탈립률을 계산하였다. 이때, 계산식은 하기와 같다.

탈립률 = 탈립된 꼬투리 수/총 꼬투리 수×100%

실험예 3. QTL 분석

180K SNP chip을 활용하여 연관군지도를 작성하고, 실내 탈립 저항성 검정 결과를 표현형 정보로하여 양적형질매핑(Quantitative trait locus; QTL) 분석을 수행하였다. 이때, QTL 분석은 QTL icimapping (ver. 4.1)을 이용하여 수행하였다.

실험예 4. 염기서열정보 분석(re-sequencing) 방법

Williams82(Wm82.a2.v1)를 표준유전체로 하여 각 집단 모·부본의 염기서열 정보를 분석하였다.

실험예 5. 마커 제작

QTL 영역 내 SNP 변이 중 앞뒤로 100bp 이상 다른 SNP가 존재하지 않는 SNP를 선발하여 해당 염기서열 기반의 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 및 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR genotyping system) 마커를 제작하였다.

실시예 1. 콩 탈립 저항성 검정 분석 결과

콩 품종별 탈립 저항성 검정을 실시하였다.

구체적으로, 2016년부터 2018년까지 3년간 검정을 실시하였으며, 보다 구체적으로, 상기 탈립 저항성 검정은 실험예 2의 방법을 통해 실내에서 실시하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 탈립 저항성 품종인 대원콩은 탈립된 꼬투리의 비율이 0%였고, 탈립 감수성 품종인 다원콩의 탈립된 꼬투리 비율은 80%, 새올의 탈립된 꼬투리 비율은 100% 임을 확인하였다.

이를 통해, 두 집단에서 저항성 계통과 감수성 계통이 뚜렷하게 구분되는 것을 확인하였다.

실시예 2. QTL 분석 결과

상기 실시예 1에서 분석한 탈립 저항성 검정 결과를 표현형 정보로 하기 위하여, DNA를 추출 후 이의 QTL 분석을 실시하였다. 구체적으로, 상기 QTL 분석은 실험예 3의 방법을 통해 실시하였다.

두 집단에서 공통으로 나타난 major QTL locus

population	chromosome	Physical position (kbp)	LOD	PVE (%)	Add
대원콩×다원콩	16	29,913-29,972	63.1	82.8	-42.3
대원콩×새올	16	29,858-30,146	39.1	68.6	-30.2

그 결과, 표 1에서 볼 수 있듯이, 16번 염색체에서 탐색된 majorQTL은 williams82 표준 유전체(Wm82.a2.v1) 상에서 qPDH1 locus(Funatski et al. 2014)를 포함하는 것으로 나타났으며, 탐색된 QTL의 PVE(phenotypic variation explained)값의 최대값은 82.8%로 매우 높게 나타났다(표 1).

major QTL 내의 후보 유전자 정보

Chromosome	Gene name (ver. 2.1)	Annotation description
16	LOC100784475 (Glyma.16g141200)	Protein phosphate 2C family
16	LOC100785004(Glyma.16g141300)	GRAS domain family
16	-(Glyma.16g141400)	Unknown
16	BZIP117(Glyma.16g141500)	bZIP transcription factor G-box binding protein MFMR
16	LOC106796450(Glyma.16g141600)	Serine-Threonine protein kinase

또한, 상기 표 2와 같이 해당 locus 영역 내에는 총 5개의 유전자가 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 염기서열 정보 분석(re-sequencing)을 통한 SNP 탐색

실험예 4의 방법을 통해, 각 집단 모·부본의 염기서열 정보를 분석하였다.

그 결과, 표 3에서 볼 수 있듯이, intron variant를 제외하고 두 집단에서 공통으로 탐색된 SNP는 glyma16g141200 유전자에서 1개, glyma16g141500 유전자에서 2개, glyma16g141600 유전자에서 2개, 총 5개의 SNP를 확인할 수 있었다.

major QTL 영역 내의 염기서열 변이

Gene model	Position (bp)	Polymorphism site	DNA	Amino acid change	distance from nearest SNP (bp)
LOC100784475 (Glyma.16g141200)	29,916,524	3’UTR	deletion (AG > A)	-	141
BZIP117 (Glyma.16g141500)	29,964,216	5’UTR	T > G	-	29
BZIP117 (Glyma.16g141500)	29,966,815	5’UTR	A > C	-	144
LOC106796450 (Glyma.16g141600)	29,970,894	coding region	A > G	Asp > Gly	63
LOC106796450 (Glyma.16g141600)	29,970,957	coding region	A > G	Asn > Ser	19

이 중, SNP 마커 개발을 위하여, 총 5개의 SNP 중, 앞·뒤로 100bp 이상 다른 SNP가 없는 2개의 SNP(Glyma.16g141200(deletion(AG > A)), Glyma.16g141500(T > G))를 확인하여 이를 기반으로 SNP 마커를 제작하였다.

실시예 5. 콩 탈립 저항성 마커 확인

상기 실시예 4에서 선택한 2개의 SNP 마커를 확인하기 위해 HinfI 제한효소를 이용한 CAPS 마커를 제작하였으며, 모·부본에서 마커 검정을 실시하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, 콩 탈립 저항성 품종인 대원콩의 PCR product size가 280bp에서 137bp로 변화하는 반면, 탈립 감수성 품종에는 변화가 없음을 확인하여 SNP 마커로 적합함을 알 수 있었다.

또한, 두 RIL집단의 총 308계통의 SNP 확인을 위하여 실시예 4에서 선택한 2개의 SNP를 기반으로 KASP마커를 의뢰제작하였다.

상기 KASP 통한 SNP 마커의 검정을 위해 프라이머를 제작하였고 이는 표 4와 같다.

Gene model(SNP)	Allele 1 Primer Seq (FAM allele)	Allele 2 Primer Seq (HEX allele)	Primer Seq common
Glyma.16g141200 (deletion(AG > A)	CTACAAAAAGACAACCCTCAGTG (서열번호 3)	CCTCTACAAAAAGACAACCCTCAGTA (서열번호 4)	CAATGGTGTAACGGAGGTTGATTAATGAT (서열번호 5)
Glyma.16g141500 (T > G)	CAACTACTGCAACCATATCAAACCAAA (서열번호 6)	AACTACTGCAACCATATCAAACCAAC (서열번호 7)	TTTCTGAGTCAATAATTCCACACAATGCTT (서열번호 8)

SNP 마커 검정 결과, 콩 탈립 저항성 품종의 PCR 산물 크기(PCR product size)의 변화로 인해 두 SNP 마커 모두 콩 탈립 저항성 품종과 콩 탈립 감수성 품종의 유전형이 명확하게 구분되는 것을 확인하였다(도 3).

KASP 검정 및 표현형 결과 종합(RIL 집단)

집단	유전형	자원수	탈립률(24시간)	탈립률(48시간)	탈립률(72시간)
대원콩×다원콩	대원콩	57	1.6	5.1	9.0
	다원콩	89	26.1	55.4	75.4
	hetero	4	-	-	-
	undetermined	6	-	-	-
t-value			-11.8***	-16.6***	-20.9***
대원콩×새올	대원콩	73	4.9	12.8	19.2
	새올	79	44.0	80.4	86.3
	hetero	3	-	-	-
	undetermined	0	-	-	-
t-value			-13.3***	-20.1***	-20.0***
종합	내탈립	130	3.5	9.4	14.7
	탈립	168	34.5	67.1	80.5
	hetero	7	-	-	-
	undetermined	6	-	-	-
t-value			-16.1***	-23.0***	-27.3***

또한, 표 5에서 볼 수 있듯이, 표현형 결과 또한 콩 탈립 저항성 품종인 대원콩의 유전형인 계통의 경우 72시간 건조 시 탈립률이 14.7%, 콩 탈립 감수성 품종인 다원콩과 새올의 유전형인 계통의 경우 탈립률이 80.5% 가 나타나는 것을 확인하였다(표 5).

이에, 상기의 SNP 마커를 이용한 유전자형 결과와 탈립 저항성/감수성 품종의 표현형 결과를 비교한 결과, 품종별 내탈립성 결과가 일치하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명에서의 SNP 마커를 이용하여 탈립 저항성 품종 및 감수성 콩 품종을 효과적으로 판별할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에서의 SNP 마커가 콩 품종의 내탈립성을 판별하는 마커로서 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Marker for selecting resistance to pod-shattering of soy bean and the use thereof <130> KPA200427-KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 280 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Glyma.16g141200 cDNA sequence <400> 1 tgtgcaatgt ggttttggtg ttgtgcaatt gttaaagttg gtccatgtct aggatgattg 60 gagccaggct agtgtgttcg tggaagtcaa tgagggtttt ggaatggcaa caatggtgta 120 acggaggttg attaatgatt cactgagggt tgtctttttg tagaggttga tagtgttctt 180 ttctgattaa tttgattgca aatggtgttg tttcctggaa ataggtgttt gagtttggtg 240 aggtggatgg cagcgcacaa tggaaagact ttgtagtatg 280 <210> 2 <211> 261 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Glyma.16g141500 cDNA sequence <400> 2 gagagagaag aaagaaagag agcctgacct attttcatgg cgttgagaaa aaggggtgag 60 gtggaagtcc aagtgggatg ggacaaagtg gttttcaaat ttctgagtca ataattccac 120 acaatgcttc tttggtttga tatggttgca gtagttgtat tgtactatta ctactatagc 180 aaaaaccgaa acaactctta ttgtgttgtg tttgagtttg aggttgttct caaggtagaa 240 cggtaacaac agtaaaatgt t 261 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Allele 1 Primer <400> 3 ctacaaaaag acaaccctca gtg 23 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Allele 2 Primer <400> 4 cctctacaaa aagacaaccc tcagta 26 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common primer <400> 5 caatggtgta acggaggttg attaatgat 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Allele 1 Primer <400> 6 caactactgc aaccatatca aaccaaa 27 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Allele 2 Primer <400> 7 aactactgca accatatcaa accaac 26 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> common primer <400> 8 tttctgagtc aataattcca cacaatgctt 30 <210> 9 <211> 279 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Glyma.16g141200 variant sequence <400> 9 tgtgcaatgt ggttttggtg ttgtgcaatt gttaaagttg gtccatgtct aggatgattg 60 gagccaggct agtgtgttcg tggaagtcaa tgagggtttt ggaatggcaa caatggtgta 120 acggaggttg attaatgatt actgagggtt gtctttttgt agaggttgat agtgttcttt 180 tctgattaat ttgattgcaa atggtgttgt ttcctggaaa taggtgtttg agtttggtga 240 ggtggatggc agcgcacaat ggaaagactt tgtagtatg 279 <210> 10 <211> 261 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Glyma.16g141500 variant sequence <400> 10 gagagagaag aaagaaagag agcctgacct attttcatgg cgttgagaaa aaggggtgag 60 gtggaagtcc aagtgggatg ggacaaagtg gttttcaaat ttctgagtca ataattccac 120 acaatgcttc gttggtttga tatggttgca gtagttgtat tgtactatta ctactatagc 180 aaaaaccgaa acaactctta ttgtgttgtg tttgagtttg aggttgttct caaggtagaa 240 cggtaacaac agtaaaatgt t 261

Claims

서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커용 조성물.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A이고 151번째 염기가 결실된, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 콩 탈립 저항성 품종은 대원콩 유래인 것인, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커용 조성물.
제1항의 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 제제는 프라이머 세트 또는 프로브인 것인, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트인 것인, 콩 탈립 저항성 품종 판별용 조성물.
제4항의 조성물을 포함하는 콩 탈립 저항성 품종 판별용 키트.
(a) 콩 시료의 DNA로부터 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커의 다형성부위를 증폭하거나 검출하는 단계로서,
상기 콩 탈립 저항성 품종 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 150번째 염기가 A 또는 T이고 151번째 염기가 결실된 상기 염기를 포함하는 5 내지 300개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드; 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 콩 탈립 저항성 품종 판별 방법.
제8항에 있어서, 상기 증폭 또는 검출된 다형성 부위가 150번째 염기가 A이고 151번째 염기가 결실된 경우, 콩 탈립 저항성 품종으로 판단하는 것인, 판별 방법.
제8항에 있어서, 상기 (a)단계는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 검출하는 것인, 판별 방법.
제8항에 있어서, 상기 콩 탈립 저항성 품종은 대원콩 유래인 것인, 판별 방법.