BR112015023134B1 - Método para identificar uma planta de soja ou um germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à mancha foliar olho-de-rã - Google Patents
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Abstract
métodos para identificar uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à mancha foliar olho-de-rã e à podridão parda da haste e método de melhoramento de uma planta de soja ou de um germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à mancha foliar olho-de-rã e resistência aprimorada à podridão parda da haste são fornecidos vários métodos e composições para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou germoplasma de soja com resistência aprimorada à mancha foliar olho-de-rã e/ou podridão parda da haste. em certas realizações, o método compreende detectar pelo menos um locus marcador que está associado com resistência à mancha foliar olho-de-rã e/ou podridão parda da haste. em outras realizações, o método ainda compreende detectar pelo menos um perfil de marcador ou haplótipo associado com resistência à mancha foliar olho-de-rã e/ou podridão parda da haste. em realizações adicionais, o método compreende cruzar uma planta de soja selecionada com uma segunda planta de soja. são ainda fornecidos marcadores, primers, sondas e kits úteis para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou germoplasma de soja com resistência aprimorada à mancha foliar olho-de-rã e/ou podridão parda da haste.
Description
[001] Esta invenção refere-se a métodos para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou germoplasma que exibem resistência aumentada à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste na soja.
[002] A cópia oficial da lista de sequências é apresentada simultaneamente com a especificação, como um arquivo de texto através da EFS-Web, em conformidade com o Código Padrão Americano para Intercâmbio de Informações (ASCII), com nome de arquivo de 428801seqlist.txt, data de criação de 14 de março de 2013 e tamanho de 26 KB. A lista de sequências depositada através da EFS-Web é parte do relatório descritivo e é integralmente incorporada ao presente pedido como referência.
[003] A soja (Glycine max L. Merr.) é uma das principais culturas comerciais e commodity para investimento na América do Norte e em outros lugares. O óleo de soja é um dos principais óleos comestíveis mais amplamente usado e a soja é usada em todo o mundo, tanto na alimentação animal como na produção de alimentos humanos. Além disso, a soja está se expandindo para aplicações industriais, de produção e farmacêuticas.
[004] Marcadores moleculares têm sido usados para aprimorar seletivamente culturas de soja através do uso de seleção assistida de marcadores. Qualquer característica polimórfica detectável pode ser usada como um marcador, contanto que ela seja herdada diferencialmente e exiba desequilíbrio de ligação com uma característica fenotípica de interesse. Uma série de marcadores de soja foi mapeada e grupos de ligação foram criados, conforme descrito em Cregan, P.B., et al., “An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome” (1999) Crop Science 39:1464-90, e mais recentemente em Choi, et al., “A Soybean Transcript Map: Gene Distribution, Haplotype and Single-Nucleotide Polymorphism Analysis” (2007) Genetics 176:685-96. Muitos marcadores de soja estão publicamente disponíveis no website da soja afiliado a USDA (www.soybase.org).
[005] A maioria das características de plantas de importância agronômica são poligênicas, de outro modo conhecidas como características quantitativas. Uma característica quantitativa é controlada por vários genes localizados em vários locais, ou loci, no genoma da planta. Os múltiplos genes têm um efeito cumulativo, o que contribui para a faixa contínua de fenótipos observados em muitas características da planta. Esses genes são citados como loci de características quantitativas (QTLS). Medições de frequência de recombinação medem o grau que um marcador molecular está relacionado com um QTL. As frequências de recombinação inferiores, tipicamente medidas em centimorgans (cM), indicam maior ligação entre o QTL e o marcador molecular. O grau pelo qual duas características estão ligadas é muitas vezes citado como a distância genética. A distância genética também está tipicamente relacionada com a distância física entre o marcador e o QTL; no entanto, certos fenômenos biológicos (incluindo “hot spots” de recombinação) podem afetar a relação entre distância física e distância genética. Geralmente, a utilidade de um marcador molecular é determinada pela distância genética e física entre o marcador e a característica selecionável de interesse.
[006] Em alguns casos, vários marcadores estreitamente ligados, como marcadores de Polimorfismo de Nucleotídeo Único (SNP), podem ser encontrados em uma determinada região de um genoma de planta englobando um ou mais QTLs. Nesses casos, determinando-se o presente alelo em cada um desses loci de marcador, um haplótipo para essa região do genoma da planta pode ser determinado. Além disso, determinando-se os presentes alelos ou haplótipos em várias regiões do genoma da planta relacionadas com a mesma característica fenotípica, um perfil de marcador para essa característica pode ser determinado. Essa informação de haplótipo e perfil de marcador pode ser útil para identificar e selecionar plantas com determinadas características desejadas.
[007] A Podridão Parda da Haste (BSR) de soja (Glycine max (L.) Merrill) é causada pelo patógeno fúngico Phialophora gregata. A Podridão Parda da Haste está amplamente difundida no Canadá e no Centro-Oeste e Sudeste dos Estados Unidos. As perdas de produção até 25% podem ocorrer principalmente através da redução do número e tamanho das sementes. Mancha Foliar Olho-De-Rã (FEY) é causada por Cercospora sojina e também ameaça a produção de soja e pode reduzir substancialmente a produção. A caracterização molecular de ambas, BSR e FEY teria importantes implicações para o aprimoramento de cultivares de soja.
[008] Há ainda uma necessidade para plantas de soja com resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste e/ou Mancha Foliar Olho- De-Rã métodos para identificar e selecionar essas plantas. DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO São fornecidos vários métodos e composições para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou germoplasma de soja com resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã (FEY) e/ou Podridão Parda da Haste (BSR). Em certas realizações o método compreende detectar pelo menos um locus marcador que está associado à resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste. Em outras realizações, o método ainda compreende detectar pelo menos um perfil de marcador ou haplótipo associado à resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste. Em realizações adicionais, o método compreende cruzar uma planta de soja selecionada com uma segunda planta de soja. São ainda fornecidos marcadores, primers, sondas e kits úteis para identificar e/ou selecionar plantas de soja ou germoplasma de soja com resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste.
[009] A Figura 1 mostra a distribuição fenotípica do marcador S06363-1 entre 184 progênies na população de mapeamento RIL mostrada na Figura 1.
[0010] A Figura 2 fornece uma visualização da ligação e recombinação para linhagens isogênicas BSR recombinantes em combinação com Rcs3.
[0011] A Figura 3 fornece uma lista de marcadores no grupo de ligação J_(16) entre a posição no mapa genético 2,34 a 88,93 de soja.
[0012] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se entender que esta invenção não está limitada a realizações específicas, que podem certamente variar. Entende-se também que a terminologia usada no presente pedido é somente para os propósitos das realizações específicas descritas, e não tem a intenção de ser limitante.
[0013] Certas definições usadas no relatório descritivo e nas reivindicações são fornecidas abaixo. A fim de fornecer um entendimento claro e coerente do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado nesses termos, são fornecidas as seguintes definições:
[0014] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, os termos no singular a as formas no singular “um", “uma” e “o/a” incluem os plurais referentes, a menos que o conteúdo dite claramente de outra forma. Dessa forma, por exemplo, a referência a “planta”, “a planta” ou “uma planta” também inclui uma pluralidade de plantas; além disso, dependendo do contexto, o uso do termo “planta” também pode incluir progênie da planta geneticamente similar ou idêntica; o uso do termo “um ácido nucleico” opcionalmente inclui, como uma questão prática, muitas cópias da molécula de ácido nucleico; de maneira similar, o termo “sonda” opcionalmente (e tipicamente) engloba muitas moléculas de sonda similares ou idênticas.
[0015] Adicionalmente, como usado no presente pedido, o termo “que compreende” deve ser interpretado como especificando a presença das características estabelecidas, números inteiros, etapas ou componentes conforme citados nas reivindicações, mas que não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. Dessa forma, por exemplo, um kit que compreende um par de primers de oligonucloetídeos pode ter um ou mais pares de primers de oligonucloetídeos. Adicionalmente, o termo “que compreende” tem a intenção de incluir exemplos englobados pelos termos “que consiste essencialmente em” e “que consiste em”. De maneira similar, o termo “que consiste essencialmente em” tem a intenção de incluir exemplos englobados pelo termo “que consiste em”.
[0016] “Agronômica”, “características agronômicas” e “desempenho agronômico” refere-se às características (e elementos genéticos subjacentes) de uma dada variedade de planta que contribui para produção ao longo do curso de um período de crescimento. Características agronômicas individuais incluem vigor de surgimento, resistência ao estresse, vigor vegetativo, tolerância ao estresse, resistência a doenças, resistência a insetos, resistência a herbicidas, ramificação, florescimento, conjunto de sementes, tamanho da semente, densidade da semente, padronização, capacidade de debulhamento e similares.
[0017] “Alelo” significa qualquer uma de uma ou mais formas alternativas de uma sequência genética. Em uma célula ou organismo diploide, os dois alelos de uma dada sequência normalmente ocupam loci correspondentes em um par de cromossomos homólogos. Com relação a um marcador SNP, alelo refere-se à base de nucleotídeo específica presente nesse locus de SNP nessa planta individual.
[0018] O termo “amplificar” no contexto de amplificação de ácido nucleico é qualquer processo pelo qual cópias adicionais de um ácido nucleico selecionado (ou um transcrito do mesmo) são produzidas. Métodos típicos de amplificação incluem vários métodos de replicação baseados na polimerase, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR), métodos mediados por ligase como a reação em cadeia da ligase (LCR) e métodos de amplificação baseada em RNA polimerase (por exemplo, por transcrição). Um “amplicon” é um ácido nucleico amplificado, por exemplo, um ácido nucleico que é produzido por amplificação de um ácido nucleico molde por qualquer método de amplificação disponível (por exemplo, PCR, LCR, transcrição ou similares).
[0019] Uma “linhagem ancestral” é uma linhagem parental usada como uma fonte de genes, por exemplo, para o desenvolvimento de linhagens elite.
[0020] Uma “população ancestral” é um grupo de ancestrais que contribuiu com a maior parte da variação genética que foi usada para desenvolver linhagens elite.
[0021] “Retrocruzamento” é um processo no qual um produtor cruza uma variedade da progênie anterior com um dos genótipos parentais, uma ou mais vezes.
[0022] O termo “segmento cromossômico” designa um trecho linear contíguo de DNA genômico que reside na planta em um único cromossomo.
[0023] “Cultivar” e “variedade” são usados como sinônimos e significam um grupo de plantas dentro de uma mesma espécie (por exemplo, Glycine max) que compartilham certas características genéticas que separam as mesmas de outras variedades possíveis dentro dessa espécie. Cultivares de soja normalmente são linhagens endogâmicas produzidas após várias gerações de autopolinização, no entanto, as variedades híbridas também podem ser produzidas. Ambas, linhagens endogâmicas ou variedades híbridas podem ser desenvolvidas em um programa de melhoramento com a tecnologia de duplo-haploide. Os indivíduos dentro de um cultivar de soja são homogêneos, quase idênticos geneticamente, com a maioria dos loci no estado de homozigoto.
[0024] Uma “linhagem elite” é uma linhagem agronomicamente superior que resultou de muitos ciclos de melhoramento e seleção para desempenho agronômico superior. Muitas linhagens elite estão disponíveis e são conhecidas pelos técnicos no assunto no melhoramento de soja.
[0025] Uma população elite é uma seleção de indivíduos de elite ou linhagens que podem ser usadas para representar o estado da técnica em termos de genótipos agronomicamente superiores de uma dada espécie de cultura, como soja.
[0026] Uma “linhagem de soja exótica” ou um “germoplasma de soja exótica” é uma linhagem ou germoplasma derivado de uma soja não pertencente a uma linhagem elite de soja disponível ou de uma linhagem de germoplasma. No contexto de um cruzamento entre duas plantas de soja ou linhagens de germoplasma, um germoplasma exótico não é estreitamente relacionado por descendência com o germoplasma elite com o qual foi cruzado. Mais comumente, o germoplasma exótico não é derivado de qualquer linhagem elite de soja conhecida, mas é especialmente selecionado para introduzir novos elementos genéticos (tipicamente novos alelos) em um programa de melhoramento.
[0027] Um “mapa genético” é uma descrição de relações de ligações genéticas entre loci em um ou mais cromossomos (ou grupos ligantes) em uma determinada espécie, geralmente representado sob a forma de diagrama ou de tabela.
[0028] “Genótipo” é uma descrição do estado alélico em um ou mais loci.
[0029] “Germoplasma” significa que o material genético que compreende a fundação física das qualidades hereditárias de um organismo. Como usado no presente pedido, germoplasma inclui sementes ou tecidos vivos a partir dos quais novas plantas podem ser cultivadas, ou outra parte da planta, como folhas, caules, pólen ou células, que podem ser cultivados até uma planta inteira. Recursos de germoplasma fornecem fontes de características genéticas usadas pelos produtores de plantas para melhorar cultivares comerciais.
[0030] Um indivíduo é “homozigoto” se o indivíduo tiver apenas um tipo de alelo em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide tem uma cópia do mesmo alelo em um locus para cada um dos dois cromossomos homólogos). Um indivíduo é “heterozigoto” se mais de um tipo de alelo estiver presente em um determinado locus (por exemplo, um indivíduo diploide com uma cópia de cada um dos dois diferentes alelos). O termo “homogeneidade” indica que os membros de um grupo têm o mesmo genótipo em um ou mais loci específicos. Ao contrário, o termo “heterogeneidade” é usado para indicar que os indivíduos dentro do grupo diferem no genótipo em um ou mais loci específicos.
[0031] “Introgressão” significa a entrada ou introdução de um gene, QTL, haplótipo, perfil de marcador, característica ou locus de característica do genoma de uma planta no genoma de outra planta.
[0032] Os termos “marcador” ou “marcador detectável” referem-se a uma molécula com capacidade para detecção. Um marcador detectável também pode incluir uma combinação de um repórter e de um supressor, como os que são empregados nas sondas FRET as sondas ou sondas TaqMan™. O termo “repórter” refere-se a uma substância ou uma porção do mesmo que é capaz de exibir um sinal detectável, o qual o sinal pode ser suprimido por um supressor. O sinal detectável do repórter é, por exemplo, fluorescência na faixa detectável. O termo “supressor” refere-se a uma substância ou porção do mesmo que é capaz de suprimir, reduzir, inibir, etc., o sinal detectável produzido pelo repórter. Como usado no presente pedido, os termos “supressão” e “transferência de energia por fluorescência” referem-se ao processo através do qual, quando um repórter e um supressor estão muito próximos, e o repórter está excitado por uma fonte de energia, uma porção substancial da energia do estado excitado de modo não radioativo se transfere para o supressor onde esta se dissipa tanto de modo não radioativo como é emitida em um comprimento de onda de emissão diferente que a do repórter.
[0033] Uma “linha” ou “linhagem” é um grupo de indivíduos da mesma ascendência, que são geralmente linhagens puras em algum grau, e que geralmente são homozigotos e homogêneos na maioria dos loci (camundongos isogênicos ou quase isogênicos). Uma “sublinhagem” refere-se a um subgrupo de linhagem pura de descendentes que são geneticamente distintos de outros subgrupos de linhagem pura similarmente descendentes do mesmo progenitor. Tradicionalmente, uma sublinhagem foi derivada por endocruzamento da semente de uma planta de soja individual selecionada nas gerações F3 a F5 até os loci segregantes residuais serem “fixados” ou homizigotos ao longo da maioria dos loci. Variedades de soja comerciais (ou linhagens) são tipicamente produzidas por agregação (“bulking”) da progênie autopolinizada de uma única planta F3 a F5 de um cruzamento controlado entre dois parentais geneticamente diferentes. Embora a variedade pareça tipicamente uniforme, a variedade de autopolinização derivada da planta selecionada eventualmente (por exemplo, F8) torna-se uma mistura de plantas homozigotas que podem variar no genótipo em qualquer locus que seja homozigoto na planta F3 a F5 originalmente selecionada. Sublinhagens baseadas em marcadores que diferem entre si com base no polimorfismo qualitativo no nível de DNA em um ou mais loci marcadores específicos são derivadas por genotipagem de uma amostra de sementes derivada de progênie autopolinizada individual derivada de uma planta F3-F5 selecionada. A amostra de sementes pode ser genotipada diretamente como uma semente, ou como tecido vegetal cultivado a partir dessa amostra de sementes. Opcionalmente, as sementes que compartilham um genótipo comum no locus específico (ou loci) são agregadas fornecendo uma sublinhagem que é geneticamente homogênea nos loci identificados como importante para uma característica de interesse (por exemplo, produção, resistência, etc.).
[0034] “Ligação” refere-se a um fenômeno no qual alelos tendem a segregar juntos, mais frequentemente do que o esperado pelo acaso se sua transmissão fosse independente. A recombinação genética ocorre com uma frequência aleatória assumida ao longo de todo o genoma. Mapas genéticos são construídos por medição da frequência de recombinação entre pares de características ou marcadores. Características ou marcadores são considerados no presente pedido como estando associados ou ligados, se eles geralmente cosegregam. Uma probabilidade de recombinação 1/100 por geração é definida como uma distância no mapa de 1,0 centimorgan (1,0 cM). Os elementos genéticos ou genes localizados em um único segmento cromossômicas são fisicamente ligados. Dois loci podem estar localizados em estreita proximidade, de modo que a recombinação entre pares de cromossomos homólogos não ocorra entre os dois loci durante a meiose com alta frequência, por exemplo, de modo que o loci cosegrega pelo menos cerca de 90% do tempo, por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 %, 99,75%, ou mais tempo. Os elementos genéticos localizados dentro de um segmento cromossômico também são geneticamente ligados, tipicamente dentro de uma distância de recombinação genética menor que ou igual a 50 centimorgans (cM), por exemplo, cerca de 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,75, 0,5 ou 0,25 cM ou menor. Ou seja, os dois elementos genéticos dentro de um único segmento cromossômico sofrem recombinação entre si durante a meiose em uma frequência menor ou igual a cerca de 50%, por exemplo, cerca de 49%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,75%, 0,5%, ou 0,25% ou menor. Marcadores “estreitamente ligados” exibem frequência de crossing-over com um dado marcador de cerca de 10% ou menor (o dado marcador está dentro de cerca de 10cm de um marcador estreitamente relacionado). Em realizações específicas, um marcador estreitamente ligado está entre 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM ou 1 cM de um determinado marcador divulgado no presente pedido. Em realizações adicionais, um marcador associado com um dos marcadores divulgados no presente pedido pode estar dentro de 75 Kb, 60 Kb, 50 Kb, 40 Kb, 30 Kb, 20 Kb, 10 Kb, 5 Kb ou menos do marcador divulgado. Colocado de outra forma, loci estreitamente ligados cosegregam em pelo menos cerca de 90% do tempo. Ligação genética, conforme avaliado por frequência de recombinação é afetada pela estrutura da cromatina da região que compreende os loci. Tipicamente, presume-se que a região tenha uma estrutura de eucromatina durante as avaliações iniciais. No entanto, algumas regiões, como regiões mais próximas aos centrossomos têm uma estrutura de heterocromatina. Sem informação adicional, a distância física prevista entre as posições no mapa genético baseia-se no pressuposto de que a região é eucromática, no entanto, se a região compreende heterocromatina, os marcadores podem estar fisicamente mais próximos. No que diz respeito à posição física em um cromossomo, marcadores estreitamente ligados podem ser separados, por exemplo, por cerca de 1 megabases (Mb; 1 milhão de nucleotídeos), cerca de 500 kilobases (Kb; 1.000 nucleotídeos), cerca de 400 Kb, cerca de 300 Kb, cerca de 200 Kb, cerca de 100 Kb, cerca de 50 Kb, cerca de 25 Kb, cerca de 10 Kb, cerca de 5 Kb, cerca de 2 Kb, cerca de 1 Kb, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos ou menos.
[0035] Ao se referir à relação entre dois elementos genéticos, esses elementos genéticos que contribuem para resistência e um marcador próximo, a ligação da fase de “acoplamento” indica o estado em que o alelo “favorável” no locus de resistência está fisicamente associado na mesma fita do cromossomo como o alelo “favorável” do respectivo locus de marcador ligado. Na fase de acoplamento, ambos os alelos favoráveis são herdados em conjunto pela progênie que herda a fita do cromossomo. Na ligação de fase de “repulsão”, o alelo “favorável” no locus de interesse (por exemplo, um QTL para resistência) está fisicamente ligado a um alelo “desfavorável” no locus de marcador próximo, e os dois alelos “favoráveis” não são herdados juntos (isto é, os dois loci estão “fora de fase” entre si).
[0036] “Desequilíbrio de ligação” ou “LD” não é uma associação aleatória de alelos de dois ou mais loci e pode ocorrer entre marcadores não ligados. Ela está baseada nas frequências alélicas dentro de uma população e é influenciada, mas não dependente da ligação.
[0037] “Grupo de ligação” (LG) refere-se a características ou marcadores que geralmente cosegregam. Um grupo de ligação geralmente corresponde a uma região cromossômica que contém material genético que codifica as características de marcadores.
[0038] “Locus” é um segmento definido de DNA.
[0039] Uma “localização no mapa” ou “posição no mapa” é um local designado em um mapa genético em relação a marcadores genéticos ligados onde um determinado marcador pode ser encontrado dentro de uma dada espécie. Posições no mapa são geralmente fornecidas em centimorgans. Uma “posição física”, “localização física” ou “localização física no mapa” é a posição, tipicamente nas bases de nucleotídeos, de um nucleotídeo específico, como um nucleotídeo SNP, em um cromossomo.
[0040] “Mapeamento genético” é o processo de definição das relações de ligação dos loci através do uso de marcadores genéticos, populações segregantes para os marcadores, e princípios genéticos padrão de frequência de recombinação.
[0041] “Marcador”, “marcador molecular” ou “locus marcador” é um termo utilizado para designar um ácido nucleico ou sequência de aminoácidos que é suficientemente exclusiva para caracterizar um locus específico no genoma. Qualquer característica polimórfica detectável pode ser usada como um marcador, contanto que ela seja herdada diferencialmente e exiba desequilíbrio de ligação com uma característica fenotípica de interesse. Uma série de marcadores de soja foi mapeada e grupos de ligação foram criados, conforme descrito em Cregan, P.B., et al., “An Integrated Genetic Linkage Map of the Soybean Genome” (1999) Crop Science 39:1464-90, e mais recentemente em Choi, et al., “A Soybean Transcript Map: Gene Distribution, Haplotype and Single-Nucleotide Polymorphism Analysis” (2007) Genetics 176:685-96, e Hyten, et al. “A High Density Integrated Genetic Linkage Map of Soybean and the Development of a 1536 Universal Soy Linkage Panel for Quantitative Trait Locus Mapping” (2010) Crop Science 50:960-968. Muitos marcadores de soja estão publicamente disponíveis no website da soja afiliado a USDA (www.soybase.org). Todos os marcadores são usados para definir um locus específico no genoma da soja. Um grande número desses marcadores foi mapeado. Cada marcador é, portanto, um indicador de um segmento específico de DNA que tem uma única sequência de nucleotídeos. As posições no mapa fornecem uma medida das posições relativas de marcadores específicos com relação um ao outro. Quando uma característica é estabelecida como sendo ligada a um determinado marcador, entende-se que o segmento real de DNA cuja sequência afeta a característica genética geralmente cosegrega com o marcador. Localização mais precisa e definida de uma característica pode ser obtida se os marcadores são identificados em ambos os lados da característica. Por medição do aparecimento do(s) marcador(es) na progênie de cruzamentos, a existência da característica pode ser detectada por testes moleculares relativamente simples sem realmente avaliar o aparecimento da característica propriamente dita, o que pode ser difícil e demorado porque a real avaliação da característica necessita do cultivo de plantas até um estágio e/ou sob condições ambientais onde a característica pode ser expressa. Os marcadores moleculares têm sido amplamente usados para determinar a composição genética da soja. “Seleção assistida por marcador” refere-se ao processo de seleção de uma característica ou características desejadas em uma planta ou plantas por detecção de um ou mais ácidos nucleicos da planta, onde o ácido nucleico é ligado à característica desejada, e então, selecionando-se a planta ou germoplasma que possui esses um ou mais ácidos nucleicos.
[0042] “Haplótipo” refere-se a uma combinação de alelos específicos presentes dentro de um genoma de planta específico em dois ou mais loci marcadores ligados, por exemplo, em dois ou mais loci em um grupo de ligação específico. Por exemplo, em um exemplo, dois loci marcadores específicos em Lg_(16) são usados para definir um haplótipo para uma planta específica. Ainda em outros exemplos, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais loci marcadores ligados são usados para definir um haplótipo para uma planta específica.
[0043] Em certos exemplos, loci marcadores múltiplos ou haplótipos são usados para definir um “perfil marcador”. Como usado no presente pedido, “perfil marcador” significa a combinação de dois ou mais loci marcadores ou haplótipos dentro de um genoma da planta específica. Por exemplo, em um exemplo, uma combinação específica de loci marcadores ou uma combinação específica de haplótipos definem o perfil marcador de uma planta específica.
[0044] O termo “planta” inclui referência a uma planta inteira imatura ou madura, incluindo uma planta a partir da qual as sementes, grãos ou anteras foram removidos. Semente ou embrião que produzirá a planta também é considerado como sendo planta.
[0045] “Partes da planta” significa qualquer porção ou pedaço de uma planta, incluindo folhas, caules, botões, raízes, pontas da raiz, anteras, sementes, grãos, embrião, pólen, óvulos, flores, cotilédones, hipocótilos, vagens, flores, brotos, caules, tecidos, culturas de tecidos, células e similares.
[0046] “Polimorfismo” significa uma mudança ou diferença entre dois ácidos nucleicos relacionados. Um “polimorfismo de nucleotídeo” refere-se a um nucleotídeo que é diferente em uma sequência, em comparação a uma sequência relacionada quando os dois ácidos nucleicos estão alinhados para a máxima correspondência.
[0047] “Polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeos”, “ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “sequência de ácido nucleico”, “fragmento de ácido nucleico” e “oligonucleotídeo” são usados alternadamente no presente pedido. Esses termos englobam sequências de nucleotídeos e similares. Um polinucleotídeo é um polímero de nucleotídeos que é fita simples ou dupla, que opcionalmente contém bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou de DNA ou RNA alterados. Um polinucleotídeo de DNA pode ser compreendido por uma ou mais fitas de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou misturas dos mesmos.
[0048] “Primer” refere-se a um oligonucleotídeo (sintético ou que ocorre naturalmente) o qual é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese de ácido nucleico ou replicação ao longo de uma fita complementar quando colocado sob condições em que a síntese de uma fita complementar é catalisada por uma polimerase. Tipicamente, primers têm cerca de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, mas sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregadas. Podem ser fornecidos primers sob a forma de fita dupla, embora a forma de fita simples seja mais tipicamente usada. Um primer ainda pode conter um marcador detectável, por exemplo um marcador de extremidade 5’.
[0049] “Sonda” refere-se a um oligonucleotídeo (sintético ou que ocorre naturalmente) que é complementar (embora não necessariamente completamente complementar) a um polinucleotídeo de interesse e forma uma estrutura duplexada por hibridização com pelo menos uma fita do polinucleotídeo de interesse. Tipicamente, sondas são oligonucleotídeos com 10 a 50 nucleotídeos de comprimento, mas sequências mais longas ou mais curtas podem ser empregadas. Uma sonda ainda pode conter um marcador detectável.
[0050] “Loci de característica quantitativa” ou “QTL” refere-se a elementos genéticos que controlam uma característica quantitativa.
[0051] “Frequência de Recombinação” é a frequência de um evento de sobrecruzamento (recombinação) entre dois loci gênicos. A frequência de recombinação pode ser observada após a segregação dos marcadores e/ou características durante a meiose.
[0052] “Resistência” e “resistência aprimorada” são usados de forma intercambiável no presente pedido e referem-se a qualquer tipo de resistência ou aumento na resistência, ou qualquer tipo de diminuição de suscetibilidade. Uma “planta resistente” ou “variedade de planta resistente” não precisa possuir resistência absoluta ou completa. Em vez disso, uma “planta resistente”, “variedade de planta resistente” ou uma planta ou variedade de planta com “resistência aprimorada” terá um nível de resistência ou resistência que é maior do que a de uma planta ou variedade suscetível comparável.
[0053] “Autocruzamento”, “autopolinização” ou “autofecundação” é um processo através do qual um reprodutor cruza uma planta com ela mesma, por exemplo, uma segunda geração híbrida F2 com ela mesma para produzir progênie designada F2:3.
[0054] “SNP” ou “polimorfismo de nucleotídeo único” significa uma variação de sequência que ocorre quando um único nucleotídeo (A, T, C ou G) na sequência genômica é alterado ou variável. “Marcadores SNP” existem quando SNPs são mapeados para sítios no genoma da soja.
[0055] O termo “produção” refere-se à produtividade por unidade de área de um produto vegetal específico de valor comercial. Por exemplo, a produção de soja é comumente medida em bushels de sementes por acre ou toneladas métricas de sementes por hectare por período. A produção é afetada tanto por fatores genéticos como ambientais. Produção é a culminação final de todas as características agronômicas.
[0056] Uma “planta sujeito ou célula vegetal” é aquela em que a alteração genética, como transformação, foi afetada em relação a um gene de interesse, ou está em uma planta ou célula vegetal que é descendente de uma planta ou célula então alterada e que compreende a alteração. Um “controle”, “planta de controle” ou “célula vegetal de controle” fornece um ponto de referência para medir alterações no fenótipo da planta ou célula vegetal em estudo.
[0057] Uma planta de controle ou célula vegetal pode compreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula tipo selvagem, isto é, do mesmo genótipo que o material de partida para a alteração genética que resultou na planta ou célula objeto de estudo; (b) uma planta ou célula vegetal do mesmo genótipo que o material de partida, mas que foi transformada com um construto nulo (isto é, com um construto que não tem o efeito conhecido na característica de interesse, como um constructo que compreende um gene marcador); (c) uma planta ou célula vegetal que é um segregante não transformado entre progênie de uma planta ou célula vegetal objeto de estudo; (d) uma planta ou célula vegetal geneticamente idêntica à planta ou célula vegetal objeto de estudo, mas que não é exposta a condições ou estímulos que induziriam a expressão do gene de interesse; ou (e) a própria planta ou célula vegetal objeto de estudo, sob condições em que o gene de interesse não é expresso.
[0058] Como usado no presente pedido, um polinucleotídeo, polipeptídeo “isolado” ou “purificado”, ou porção biologicamente ativa dos mesmos, é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou polipeptídeo, como encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Dessa forma, um polinucleotídeo ou polipeptídeo isolado ou purificado é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura, quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Idealmente, um polinucleotídeo “isolado” é livre de sequências (idealmente sequências que codificam proteína) que naturalmente ladeiam o polinucleotídeo (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5’ e 3’ do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em várias realizações, o polinucleotídeo isolado pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequência de nucleotídeo que naturalmente ladeia o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado. Um polipeptídeo que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de polipeptídeos com menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o polipeptídeo da invenção ou porção biologicamente ativa do mesmo é produzida de forma recombinante, o meio de cultura ideal representa menos que 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos não proteína de interesse.
[0059] Técnicas padrão de DNA recombinante e de clonagem molecular usadas no presente pedido são bem conhecidas na técnica e são descritas de maneira mais completa em Sambrook, J., Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (desse ponto em diante “Sambrook”).
[0060] São fornecidos métodos para identificar e/ou selecionar uma planta de soja ou germoplasma de soja que exibem resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã (FEY) e/ou Podridão Parda da Haste (BSR). O método compreende detectar na planta de soja ou germoplasma, ou uma parte da mesma, pelo menos um locus marcador e/ou de um haplótipo associado com resistência à FEY e/ou BSR. São também fornecidos polinucleotídeos isolados e kits para uso na identificação e/ou detecção de uma planta de soja ou germoplasma de soja que exibe maior resistência à FEY e/ou BSR. São ainda fornecidos métodos e composições para melhorar uma planta de soja ou um germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à FEY, resistência aprimorada à BSR ou resistência aprimorada à FEY e BSR.
[0061] Estes achados têm implicações importantes para produção de soja, visto que identificar marcadores que podem ser usados para seleção de resistência à FEY e/ou resistência à BSR irá agilizar muito o desenvolvimento dessas resistências nos cultivares elite.
[0062] São fornecidos loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores associados com resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã. Ainda são fornecidos loci genômicos que estão associados com resistência aprimorada da soja à FEY.
[0063] Em certas realizações, plantas de soja ou germoplasma são identificados que têm pelo menos um alelo favorável, locus marcador, haplótipo ou perfil marcador que se correlaciona positivamente com resistência ou resistência aprimorada à FEY. No entanto, em outras realizações, é útil para propósitos excludentes durante o melhoramento identificar alelos, loci marcadores, haplótipos ou perfis marcadores que se correlacionam negativamente com resistência, por exemplo, para eliminar essas plantas ou germoplasma de ciclos subsequentes de melhoramento.
[0064] Em uma realização, loci marcadores úteis para identificar uma primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada a FEY compreende S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Consulte a Tabela 1. Exemplos não limitantes de loci marcadores localizados dentro, ligados a ou estreitamente ligados a esses loci genômicos são fornecidos na Figura 3. TABELA 1 POSIÇÕES DE MARCADORES PARA LOCI MARCADORES ASSOCIADOS COM RESISTÊNCIA À MACHA FOLIAR OLHO-DE-RÃ *Mapa Genético Composto Gm (Hyten et al. (2010) Crop Sci. 50:960-968)
[0065] São fornecidos marcadores, primers, haplótipos, perfis marcadores e métodos de seu uso para identificar e/ou selecionar plantas de soja com resistência à FEY aprimorada. O método para determinar a presença/ausência/alelo de um marcador específico associado com resistência à FEY de soja e dentro de ou ligado a um intervalo na planta de soja ou germoplasma e, por sua vez, determinar o haplótipo FEY ou haplótipo Rcs3 e/ou perfil marcador da planta/germoplasma, compreende analisar DNA genômico de uma planta de soja ou germoplasma para determinar se pelo menos um, ou uma pluralidade desses marcadores está presente ou ausente, e em qual forma alélica. O uso dessa informação em relação aos marcadores associados à FEY presentes na planta específica ou germoplasma, por sua vez, permite que um haplótipo FEY e/ou Rcs3 seja atribuído a essa planta/germoplasma. Se múltiplos haplótipos FEY ou haplótipos Rcs3 são deduzidos para uma planta, um perfil marcador pode, por sua vez, ser atribuído por combinação desses haplótipos FEY ou haplótipos Rcs3.
[0066] Em certos exemplos, plantas ou germoplasma são identificados, que têm pelo menos um alelo favorável, haplótipo, ou perfil marcador que se correlaciona positivamente com resistência ou resistência aprimorada. No entanto, em outros exemplos, é útil para propósitos excludentes durante o melhoramento identificar alelos, haplótipos ou perfis marcadores que se correlacionam negativamente com resistência, por exemplo, para eliminar essas plantas ou germoplasma de ciclos subsequentes de melhoramento.
[0067] Loci marcadores são especialmente úteis quando eles são estreitamente ligados a S00005-01, S06363-1 ou S14236-1. Dessa forma, em um exemplo, poderiam ser usados loci marcadores que exibem uma frequência de crossing-over inter-locus de cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,75% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, ou cerca de 0,25% ou menos para qualquer um dentre S00005-01, S06363-1 ou S14236-1. Dessa forma, os loci são separados de qualquer um dentre S00005-01, S06363-1 ou S14236-1 por cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos.
[0068] Em alguns exemplos são investigados múltiplos loci marcadores que formam coletivamente o haplótipo FEY de interesse, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais loci marcadores.
[0069] Em certos exemplos, marcadores úteis para definir um haplótipo FEY ou o haplótipo Rsc3 são ligadas ou são estreitamente ligados ao intervalo flanqueado e incluindo os loci marcadores BARC-032663-09006 e Satt431 no banco de dados Soybase (soybase.org). Consulte a Figura 3.
[0070] Os marcadores dentro de, ligados a, ou estreitamente ligados a esses intervalos são ilustrados no mapa genético da Figura 3. Muitos desses marcadores são também bem conhecidos na técnica e, por exemplo, são descritos no banco de dados de soja do USDA, disponível em www.soybase.org, e Hyten et al. (2010) Crop Sci. 50:960-968.
[0071] Marcadores exemplares úteis para definir o haplótipo FEY ou o haplótipo Rcs3 são fornecidos na Tabela 1. As Tabelas 5, 6, 7 e 8 fornecem as regiões alvo contendo os marcadores, bem como primers e sondas que podem ser usadas para amplificar e detectar os marcadores. Em certos exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo FEY ou o haplótipo Rcs3 são um ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em outros exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo FEY ou o haplótipo Rcs3 são dois ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Nos exemplos adicionais, os loci marcadores usados para definir o haplótipo FEY são cada um dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. A Tabela 2 fornece exemplos não limitantes de haplótipos FEY e também combinações de marcadores para o tipo de haplótipo Rcs3 que também exibe maior resistência à FEY.
[0072] A tabela denota várias combinações de marcadores e o alelo requer o determinado haplótipo.
[0073] Em uma realização, o método para identificar a primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à FEY compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou no genoma do primeiro germoplasma de soja pelo menos um haplótipo que está associada à resistência, em que pelo menos um haplótipo compreende pelo menos dois dos vários loci marcadores fornecidos no presente pedido ou qualquer combinação de marcadores conforme apresentada na Tabela 2. Não apenas se pode detectar os diversos marcadores no presente pedido, é reconhecido que se poderia detectar qualquer marcador que esteja estreitamente ligado a diversos marcadores discutidos no presente pedido.
[0074] Além dos marcadores discutidos no presente pedido, informações úteis em relação a marcadores de soja podem ser encontradas, por exemplo, no website de banco de dados de soja do USDA, disponível em www.soybase.org. Um técnico no assunto reconhecerá que a identificação de alelos marcadores favoráveis podem ser germoplasma-específico. A determinação de quais marcador alelos se correlacionam com resistência (ou suscetibilidade) é determinada para o germoplasma específico em estudo. Um técnico no assunto reconhecerá que os métodos para identificar os alelos favoráveis são rotineiros e conhecidos na técnica, e que, além disso, a identificação e uso desses alelos favoráveis está dentro do escopo da invenção.
[0075] São fornecidos loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores associados com resistência à FEY. Ainda são fornecidos loci genômicos que estão associados com resistência da soja à FEY.
[0076] Em uma realização, o método para identificar a primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à FEY compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou no genoma do primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que (A) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-024115-04764 e BARC-040393-07727 no grupo de ligação J_(16); (B) pode compreender um ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16); (C) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo T ou C em S00005-01 e um alelo G em S14236-1; (D) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo T ou C em S00005-01; (E) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo G em S14236-1; e/ou, (F) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1, um alelo G em S14236-1, e um alelo T ou um alelo C em S00005-01.
[0077] São fornecidos loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores associados com resistência à BSR. Ainda são fornecidos loci genômicos que estão associados com resistência aprimorada da soja à BSR.
[0078] Em certas realizações, plantas de soja ou germoplasma são identificados que têm pelo menos um alelo favorável, locus marcador, haplótipo ou perfil marcador que se correlaciona positivamente com resistência ou resistência aprimorada à BSR. No entanto, em outras realizações, é útil para propósitos excludentes durante o melhoramento identificar alelos, loci marcadores, haplótipos ou perfis marcadores que se correlacionam negativamente com resistência, por exemplo, para eliminar essas plantas ou germoplasma de ciclos subsequentes de melhoramento.
[0079] Em uma realização, loci marcadores úteis para identificar uma primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à BSR compreendem S01584-1, S04831-1, S16015- 001, S07157-1, S07157-2, S04857-1 e/ou S16023-001. Consulte a Tabela 3. Exemplos não limitantes de loci marcadores localizados dentro, ligados a ou estreitamente ligados a esses loci genômicos são fornecidos na Figura 3. TABELA 3 POSIÇÕES DE MARCADOR PARA LOCI MARCADORES ASSOCIADOS COM RESISTÊNCIA À PODRIDÃO PARDA DA HASTE
*Mapa Genético Composto Gm (Hyten et al. (2010) Crop Sci 50:960-968.)
[0080] São fornecidos marcadores, primers, haplótipos, perfis marcadores e métodos de seu uso para identificar e/ou selecionar plantas de soja com resistência à BSR aprimorada. O método para determinar a presença/ausência/alelo de um marcador específico associado com resistência à BSR de soja e dentro de ou ligado a um intervalo na planta de soja ou germoplasma e, por sua vez, determinar o haplótipo BSR e/ou perfil marcador da planta/germoplasma, compreende analisar DNA genômico de uma planta de soja ou germoplasma para determinar se pelo menos um, ou uma pluralidade desses marcadores está presente ou ausente, e em qual forma alélica. O uso dessa informação em relação aos marcadores associados à BSR presentes na planta específica ou germoplasma, por sua vez, permite que um haplótipo BSR seja atribuído a essa planta/germoplasma. Se múltiplos haplótipos BSR são deduzidos para uma planta, um perfil marcador pode, por sua vez, ser atribuído por combinação desses haplótipos BSR.
[0081] Em certos exemplos, plantas ou germoplasma são identificados, que têm pelo menos um alelo favorável, haplótipo, ou perfil marcador que se correlaciona positivamente com resistência ou resistência aprimorada. No entanto, em outros exemplos, é útil para propósitos excludentes durante o melhoramento identificar alelos, haplótipos ou perfis marcadores que se correlacionam negativamente com resistência, por exemplo, para eliminar essas plantas ou germoplasma de ciclos subsequentes de melhoramento.
[0082] Loci marcadores são especialmente úteis quando eles são estreitamente ligados a S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, S04857-1 e/ou S16023-001. Dessa forma, em um exemplo, poderiam ser usados loci marcadores que exibem uma frequência de crossing-o ver inter-locus de cerca de 10% ou menos, cerca de 9% ou menos, cerca de 8% ou menos, cerca de 7% ou menos, cerca de 6% ou menos, cerca de 5% ou menos, cerca de 4% ou menos, cerca de 3% ou menos, cerca de 2% ou menos, cerca de 1% ou menos, cerca de 0,75% ou menos, cerca de 0,5% ou menos, ou cerca de 0,25% ou menos para qualquer um dentre S01584-1, S04857-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001. Dessa forma, os loci são separados de qualquer um dentre S01584-1, S04831-1, S04857-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 por cerca de 10 cM, 9 cM, 8 cM, 7 cM, 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,75 cM, 0,5 cM ou 0,25 cM ou menos.
[0083] Em alguns exemplos são investigados múltiplos loci marcadores que formam coletivamente o haplótipo BSR de interesse, por exemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, ou mais loci marcadores.
[0084] Em certos exemplos, marcadores úteis para definir um haplótipo BSR são ligadas ou são estreitamente ligados ao intervalo flanqueado e incluindo os loci marcadores BARC-042193- 08207 e BARC-011625-00310 no banco de dados Soybase (soybase.org).
[0085] Os marcadores dentro de, ligados a, ou estreitamente ligados a esses intervalos são ilustrados no mapa genético da Figura 3. Muitos desses marcadores são também bem conhecidos na técnica e, por exemplo, são descritos no banco de dados de soja do USDA, disponível em www. soybase. org.
[0086] Marcadores exemplares úteis para definir haplótipos BSR são fornecidos na Tabela 4. As Tabelas 9, 10, 11 e 12 fornecem as regiões alvo contendo os marcadores, bem como primers e sondas que podem ser usadas para amplificar e detectar os marcadores. Em certos exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são um ou mais dentre S01584-1 , S04831-1, S16015-001, S07157-1, S04857-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em outros exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são dois ou mais dentre S04857-1, S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em outros exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são três ou mais dentre S04857-1, S01584-1, S04831- 1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em outros exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são quatro ou mais dentre S04857-1, S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em outros exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são cinco ou mais dentre S04857-1, S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em outros exemplos, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são seis ou mais dentre S04857-1, S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses. Em exemplos adicionais, os loci marcadores usados para definir o haplótipo BSR são cada um dentre S04857-1, S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses.
[0087] A tabela denota várias combinações de marcadores e o alelo requer o determinado haplótipo
[0088] Em uma realização, o método para identificar a primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à BSR compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou no genoma do primeiro germoplasma de soja pelo menos um haplótipo que está associada à resistência, em que pelo menos um haplótipo compreende pelo menos dois dos vários loci marcadores fornecidos no presente pedido (isto é, S04857-1, S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2 e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses) ou qualquer combinação de marcadores conforme apresentado na Tabela 4. Não apenas se pode detectar os diversos marcadores no presente pedido, é reconhecido que se poderia detectar qualquer marcador que esteja estreitamente ligado a diversos marcadores discutidos no presente pedido.
[0089] Além dos marcadores discutidos no presente pedido, informações úteis em relação a marcadores de soja podem ser encontradas, por exemplo, no website de banco de dados de soja do USDA, disponível em www.soybase.org, e Hyten et al. (2010) Crop Sci. 50:960-968. Um técnico no assunto reconhecerá que a identificação de alelos marcadores favoráveis podem ser germoplasma-específico. A determinação de quais marcador alelos se correlacionam com resistência (ou suscetibilidade) é determinada para o germoplasma específico em estudo. Um técnico no assunto reconhecerá que os métodos para identificar os alelos favoráveis são rotineiros e conhecidos na técnica, e que, além disso, a identificação e uso desses alelos favoráveis está dentro do escopo da invenção.
[0090] São fornecidos loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores associados com resistência à BSR. Ainda são fornecidos loci genômicos que estão associados com resistência da soja à BSR.
[0091] Em uma realização, o método para identificar uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à BSR compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou no genoma do primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que: (a) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-042193-08207 e BARC-011625-00310 no grupo de ligação J_(16); (b) pode compreender um ou mais dentre S01584-1, S04857-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2 e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esse no grupo de ligação J_(16); (c) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (d) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo J_(16) compreendendo um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (e) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S07157-1; (f) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (g) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S16015-1; (h) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (i) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; (j) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S07157-1; (k) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S16015-1; (l) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S07157-1; (m) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo C em S16015-1; (n) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1, e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (o) pode compreender um haplótipo Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo A em S07157-2, um alelo C em S16023- 001, e/ou um alelo C em S04857-1; (p) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcador no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (q) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (r) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (s) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S07157-1; (t) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16015-1; (u) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (v) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (w) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S07157-1; (x) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S16015-1; (y) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (z) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S16015-1; (aa) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo A em S04831-1; (ab) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (ac) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (ad) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S04857-1; (ae) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S04831-1; (af) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S04831-1 e um alelo C em S04857-1; (ag) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S07157-2; (ah) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16023-1; (ai) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S14236-1; (aj) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2, e um alelo T S16023-1; ou qualquer outra combinação apresentada na Tabela 4.
[0092] Não apenas se pode detectar os diversos marcadores no presente pedido, é reconhecido que se poderia detectar qualquer marcador que esteja estreitamente ligado a diversos marcadores discutidos no presente pedido.
[0093] São fornecidos vários métodos para identificar plantas de soja e/ou germoplasma com resistência aprimorada à BSR e/ou FEY. Em uma realização, o método para identificar compreende detectar pelo menos, um locus marcador associado com resistência à BSR e/ou FEY. O termo “associado com”, em conexão com uma relação entre um locus marcador e um fenótipo refere-se a uma dependência estatisticamente significativa de frequência de marcador em relação a uma escala quantitativa ou gradação qualitativa do fenótipo. Dessa forma, um alelo de um marcador está associado com uma característica de interesse quando o alelo do locus marcador e os fenótipos característicos são encontrados juntos na progênie de um organismo mais frequentemente do que se os genótipos marcadores e fenótipos característicos segregados separadamente.
[0094] Qualquer combinação dos loci marcadores fornecidos no presente pedido pode ser usada no métodos para identificar uma planta de soja ou germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à FEY. Qualquer locus marcador ou qualquer combinação dos conjuntos de marcadores apresentados na Tabela 1 ou 2, ou qualquer marcador estreitamente ligado pode ser usado para ajudar na identificação e seleção de plantas de soja ou germoplasma de soja com resistência aprimorada à FEY.
[0095] Em uma realização é fornecido um método de identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à FEY. O método compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado com resistência. Nesse método, pelo menos um locus marcador: (A) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-024115-04764 e BARC-040393-07727 no grupo de ligação J_(16); (B) pode compreender um ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16); (C) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo T ou C em S00005-01 e um alelo G em S14236-1; (D) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo T ou C em S00005-01; (E) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo G em S14236-1; e/ou, (F) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1, um alelo G em S14236-1, e um alelo T ou um alelo C em S00005- 01.
[0096] Qualquer combinação dos loci marcadores fornecidos no presente pedido pode ser usada no métodos para identificar uma planta de soja ou germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à BSR. Qualquer locus marcador ou qualquer combinação dos conjuntos de marcadores apresentados na Tabela 3 ou 4, ou qualquer marcador estreitamente ligado pode ser usado para ajudar na identificação e seleção de plantas de soja ou germoplasma de soja com resistência aprimorada à BSR.
[0097] Em uma realização é fornecido um método de identificação de uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à BSR. O método compreende detectar no genoma da primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado com resistência. Nesse método, pelo menos um locus marcador: (a) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-042193-08207 e BARC-011625-00310 no grupo de ligação J_(16); (b) pode compreender um ou mais dentre S01584-1, S04857-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2 e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esse no grupo de ligação J_(16); (c) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157- 1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (d) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo J_(16) compreendendo um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (e) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S07157-1; (f) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (g) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S16015-1; (h) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (i) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; (j) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S07157-1; (k) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S16015-1; (l) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S07157-1; (m) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo C em S16015-1; (n) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1, e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (o) pode compreender um haplótipo Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo A em S07157-2, um alelo C em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (p) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcador no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (q) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (r) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (s) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S07157-1; (t) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16015-1; (u) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (v) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (w) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S07157-1; (x) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S16015-1; (y) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (z) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S16015-1; (aa) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo A em S04831-1; (ab) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (ac) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (ad) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S04857-1; (ae) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S04831-1; (af) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S04831-1 e um alelo C em S04857-1; (ag) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S07157-2; (ah) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16023-1; (ai) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S14236-1; (aj) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2, e um alelo T S16023-1; ou qualquer outra combinação apresentada na Tabela 4.
[0098] Em outras realizações, dois ou mais loci marcadores são detectados no método. Enquanto em outras realizações é fornecido um método para identificar uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à BSR e resistência aprimorada à FEY. Esses métodos podem empregar uma ou mais loci marcadores associados à BSR em combinação com um ou mais loci marcadores associados à FEY. Em uma realização específica, o germoplasma é uma variedade de soja.
[0099] Em outras realizações, o método ainda compreende cruzar a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja selecionados com uma segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja. Em uma realização adicional do método, a segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja compreende uma linhagem exótica de soja ou uma linhagem elite de soja.
[00100] Em realizações específicas, a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja compreende uma variedade de soja. Qualquer linhagem de soja conhecida na técnica ou divulgada no presente pedido pode ser usada. Exemplos não limitantes de variedades de soja e seus alelos de resistência à BSR e/ou FEY associados são englobadas pelos métodos fornecidos no presente pedido.
[00101] Em outra realização, o método de detecção compreende amplificar pelo menos um locus marcador e detectar o amplicon marcador amplificado resultante. Nesse método, amplificar compreende (a) adicionar e misturar um primer de amplificação ou par de primer de amplificação para cada locus marcador sendo amplificado com um ácido nucleico isolado a partir da primeira planta de soja ou do primeiro germoplasma de soja, de modo que o primer ou par de primer é complementar ou parcialmente complementar a um variante ou fragmento do locus genômico que compreende o locus marcador, e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA polimerase com o uso do ácido nucleico de soja como um molde; e (b) estender o primer ou par de primer em uma reação de polimerização de DNA que compreende uma DNA polimerase e um ácido nucleico molde para gerar pelo menos um amplicon. Nesse método, o primer ou par de primer pode compreender um variante de um ou mais dentre os loci genômicos fornecidos no presente pedido.
[00102] Métodos e composições são ainda fornecidos para empilhar resistência robusta à BSR com resistência robusta à Mancha Foliar Olho-De-Rã. O haplótipo genético citado no presente pedido como Rbs3a tem um nível muito alto de resistência à Podridão Parda da Haste. O haplótipo genético citado no presente pedido como “Rbs3b” tem níveis moderados de resistência à Podridão Parda da Haste. Rbs3b (resistência à Podridão Parda da Haste) e Rcs3 (resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã) estão ligadas no acoplamento no Lg J e nossos dados sugerem que esses dois genes estão distantes 3 cM.
[00103] Métodos e composições são fornecidos para rastrear diretamente a resistência à FEY e uso desses marcadores para empilhar a resistência à FEY com o haplótipo Rbs3a. Dessa forma, métodos de melhoramento de uma planta de soja ou de um germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à FEY e resistência aprimorada à BSR são fornecidos e compreendem: (a) detectar no genoma de uma primeira planta de soja ou no genoma do primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado a uma resistência aprimorada à FEY e selecionar a dita primeira planta de soja ou do primeiro germoplasma de soja que tem o dito locus marcador; (b) detectar no genoma de uma segunda planta de soja ou no genoma do segundo germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a, que está associado à resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste e selecionar a segunda planta de soja ou o segundo germoplasma de soja que tem o dito locus marcador; e (d) selecionar progênie que tem em seu genoma pelo menos um locus marcador que está associado a uma resistência aprimorada à FEY e pelo menos um locus marcador que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a.
[00104] Embora qualquer marcador conhecido associado à resistência à FEY possa ser usado nesse método, na realização específica o marcador FEY empregado (A) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-024115-04764 e BARC-040393-07727 no grupo de ligação J_(16); (B) pode compreender um ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16); (C) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo T ou C em S00005-01 e um alelo G em S14236-1; (D) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo T ou C em S00005-01; (E) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo G em S14236-1; e/ou, (F) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1, um alelo G em S14236-1, e um alelo T ou um alelo C em S00005-01. Em um exemplo não limitante, o marcador FEY empregado é S00005-01a. Nesses métodos, o haplótipo BSR Rbs3a pode ser seguido pelo uso de marcadores associados ao haplótipo BSR Rbs3a o qual pode compreender (a) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo J_(16) compreendendo um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (c) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584- 1 e um alelo T em S07157-1; (d) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (e) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S16015-1; (f) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (g) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; (h) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S07157-1; (i) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S16015-1; (j) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S07157-1; (k) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo C em S16015-1; (l) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1, e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (m) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; ou (n) qualquer haplótipo de marcador de combinação apresentado na Tabela 4.
[00105] Ainda em outras realizações, a tolerância à BSR pode ser seguida com o uso de combinações de marcadores apresentados na Tabela 4 incluindo marcadores que (a) podem ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-042193-08207 e BARC-011625-00310 no grupo de ligação J_(16); (b) pode compreender um ou mais dentre S01584-1, S04857-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2 e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esse no grupo de ligação J_(16); (c) pode compreender um haplótipo Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo A em S07157-2, um alelo C em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (d) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcador no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (d) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (f) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (j) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S07157-1; (k) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16015-1; (l) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857- 1 e um alelo C em S07157-1; (m) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (n) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S07157-1; (o) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S16015-1; (p) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584- 1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (q) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S16015-1; (r) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo A em S04831-1; (s) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (t) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (u) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S04857-1; (v) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S04831-1; (w) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S04831-1 e um alelo C em S04857-1; (x) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S07157-2; (y) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16023-1; (z) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S14236-1; (aa) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584- 1, um alelo G em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2, e um alelo T S16023-1; ou qualquer outra combinação apresentada na Tabela 4.
[00106] Em uma realização não limitante, (a) pelo menos um locus que está associado a uma maior resistência à FEY compreende um haplótipo que está associado à dita resistência à FEY e o haplótipo compreende os seguintes loci marcadores: um alelo G em S14236-1 e um alelo T ou C em S00005-01; e, (b) um haplótipo que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a e mostra uma resistência aprimorada à BSR, cujo dito haplótipo compreende o seguinte locus marcador: um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1.
[00107] Em uma realização, o método envolve amplificar um variante ou fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 77 e/ou 78, ou variantes ou fragmentos das mesmas. Em uma realização, o primer ou par de primer pode compreender um variante de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 77 e/ou 78, ou complementos das mesmas. Em realizações específicas, o primer ou par de primer compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 73 ou 74, ou variantes ou fragmentos das mesmas.
[00108] Em uma realização específica, o par de primer compreende SEQ ID NOs: 1 e 2; SEQ ID NOs: 3 e 4; SEQ ID NOs: 5 e 6; SEQ ID NOs: 25 e 26; SEQ ID NOs: 27 e 28; SEQ ID NOs: 29 e 30; SEQ ID NOs: 31 e 32; SEQ ID NOs: 33 e 34; SEQ ID NOs: 35 e 36; ou SEQ ID NOs: 73 e 74.
[00109] Em outra realização, o método ainda compreende fornecer uma ou mais sondas de ácido nucleico marcadas adequadas para detecção de cada locus marcador sendo amplificado. Nesse método, a sonda de ácido nucleico marcada pode compreender uma sequência que compreende um variante ou fragmento de um ou mais dos loci genôminos fornecidos no presente pedido. Em uma realização, a sonda de ácido nucleico marcada pode compreender uma sequência que compreende um variante ou um fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 77 e/ou 78. Em realizações específicas, a sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 75 e/ou 76 ou variantes ou fragmentos das mesmas.
[00110] Exemplos não limitantes de primers, sondas, loci genômicos e amplicons que podem ser usados nos métodos e composições fornecidos no presente pedido estão resumidos nas Tabelas 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12. TABELA 5 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE SEQUÊNCIAS DE PRIMER RELACIONADAS AOS MARCADORES DE RESSITÊNCIA À MANCHA FOLIAR OLHO-DE-RÃ TABELA 6 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE SEQUÊNCIAS DE SONDAS PARA MARCADORES DE RESISTÊNCIA À FEY TABELA 7 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE LOCI GENÔMICOS QUE COMPREENDEM OS VÁRIOS LOCI MARCADORES DE FEY FORNECIDOS NO PRESENTE PEDIDO
TABELA 8 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE AMPLICONS GENÔMICOS QUE COMPREENDEM OS VÁRIOS LOCI MARCADORES DE FEY FORNECIDOS NO PRESENTE PEDIDO TABELA 9 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE SEQUÊNCIAS DE PRIMER RELACIONADAS AOS MARCADORES DE RESSITÊNCIA À PODRIDÃO PARDA DA HASTE TABELA 10 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE SEQUÊNCIAS DE SONDAS PARA MARCADORES DE RESISTÊNCIA À BSR
TABELA 11 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE LOCI GENÔMICOS QUE COMPREENDEM OS VÁRIOS LOCI MARCADORES DE BSR FORNECIDOS NO PRESENTE PEDIDO
TABELA 12 EXEMPLOS NÃO LIMITANTES DE AMPLICONS GENÔMICOS QUE COMPREENDEM OS VÁRIOS LOCI MARCADORES DE BSR FORNECIDOS NO PRESENTE PEDIDO
[00111] Em outra realização, o método para detectar compreende sequenciamento de DNA de pelo menos um dos loci marcadores no presente pedido. Como usado no presente pedido, “sequenciamento” refere-se aos métodos de sequenciamento para determinar a ordem de nucleotídeos em uma molécula de DNA. Qualquer método de sequenciamento conhecido na técnica pode ser usado nos métodos fornecidos no presente pedido. Exemplos não limitantes de métodos de sequenciamento de DNA úteis nos métodos fornecidos no presente pedido incluem tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração (NGS), por exemplo, conforme descrito em Egan, A. N, et al. (2012) American Journal of Botany 99(2):175-185; genotipagem por métodos de sequenciamento (GBS), por exemplo, conforme descrito em Elshire, R.J., et al. (2011) PLoS ONE 6(5):e19379; genotipagem por Molecular Inversion Probe (MIP), conforme descrito, por exemplo, em Hardenbol, P., et al. (2003) Nature Biotechnology 21(6):673-678; ou genotipagem de alto rendimento por resequenciamento do genoma inteiro, conforme descrito, por exemplo, em Huang, X et al., (2009) Genome Research 19:1068-1076. Cada uma das referências acima está incorporada ao presente pedido como referência em sua totalidade.
[00112] Uma variante ativa de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 1 a 78 pode compreender um polinucleotídeo que tem pelo menos 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às SEQ ID NOs: 1 a 78, desde que seja capaz de amplificar e/ou detectar o locus marcador de interesse. Por “fragmento” entende-se uma porção dos polinucleotídeos. Um fragmento ou porção pode compreender pelo menos, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1 a 78, desde que seja capaz de amplificar e/ou detectar o locus marcador de interesse.
[00113] A menos que estabelecido de outra forma, valores de identidade/similaridade da sequência fornecidos no presente pedido referem-se aos valores obtidos com o uso de GAP Versão 10 com o uso dos seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos com o uso de Peso de GAP de 50 e Peso de Extensão de 3 a matriz de escore nwsgapdna.cmp; ou qualquer programa equivalente do mesmo. Por “programa equivalente” entende-se qualquer programa de comparação de sequência que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento que tem compatibilidade de resíduo de nucleotídeo idêntico e um percentual de identidade de sequência idêntico em comparação ao alinhamento correspondente gerado por GAP Versão 10.
[00114] É fornecido o uso de seleção assistida por marcadores (MAS) para selecionar uma planta de soja ou germoplasma que tem um determinado locus marcador, haplótipo ou perfil marcador. Por exemplo, em certos exemplos uma planta de soja ou germoplasma que possui um determinado locus marcador ou haplótipo favorável pré-determinado será selecionado através de MAS. Em outros exemplos uma planta de soja ou germoplasma que possui um determinado perfil marcador favorável pré- determinado será selecionado através de MAS.
[00115] Com o uso de MAS, plantas de soja ou germoplasma podem ser selecionados para marcadores ou alelos marcadores que se correlacionam positivamente com resistência à BSR e/ou resistência à FEY, sem real crescimento da soja e medição de resistência (ou, de outro modo, plantas de soja podem ser selecionadas contra se eles se possuírem marcadores que se correlacionam negativamente com resistência). MAS é uma ferramenta poderosa para selecionar fenótipos desejados e para introgredir características desejadas nos cultivares de soja (por exemplo, introgredir características desejadas nas linhagens elite). MAS é facilmente adaptada para métodos de análise molecular de alta produtividade que podem triar rapidamente grandes números de plantas ou material genético de germoplasma para os marcadores de interesse, e é muito mais econômica do que cultivar e observar plantas para características visíveis.
[00116] Em algumas realizações, os marcadores moleculares ou loci marcadores são detectados com o uso de um método de detecção baseado em amplificação adequado. Nesses tipos de métodos, primers de ácido nucleico são tipicamente hibridizados com as regiões conservadas flanqueando a região de marcador polimórfico. Em certos métodos, sondas de ácido nucleico que se ligam à região amplificada também são empregadas. Em geral, métodos sintéticos para produzir oligonucleotídeos, incluindo primers e sondas, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente de acordo com o método de fosforamidita triéster em fase sólida descrito por Beaucage e Caruthers (1981) Tetrahedron Letts 22:1859-1862, por exemplo, com o uso de um sintetizador automatizado disponível comercialmente, por exemplo, conforme descrito em Needham-VanDevanter, et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-6168. Oligonucleotídeos, incluindo oligonucleotídeos modificados, também podem ser solicitados a partir de uma variedade de fontes comerciais conhecidas pelos técnicos no assunto.
[00117] Considera-se que primers e sondas adequados para serem usados podem ser projetados com o uso de qualquer método adequado. Não se pretende que a invenção seja limitada por qualquer primer, par de primer ou sonda específicos. Por exemplo, podem ser projetados primers com o uso de qualquer programa de computação adequado, como LASERGENE® ou Primer3.
[00118] Não se pretende que os primers sejam limitados para gerar um amplicon de qualquer tamanho específico. Por exemplo, os primers usados para amplificar os loci marcadores e alelos no presente pedido não são limitados a amplificar a região inteira do locus relevante. Em algumas realizações, amplificação de marcador produz um amplicon com pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento ou, alternativamente, pelo menos 200 nucleotídeos de comprimento.
[00119] Exemplos não limitantes de primers de polinucleotídeos úteis para detectar os loci marcadores fornecidos no presente pedido são fornecidos nas Tabelas 5 e 9 e incluem, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 a 78 ou variantes ou fragmentos das mesmas.
[00120] PCR, RT-PCR e LCR são particularmente de amplo uso como métodos de amplificação e de detecção de amplificação para amplificar ácidos nucleicos de interesse (por exemplo, os que compreendem loci marcadores), facilitando a detecção dos marcadores. Detalhes com relação ao uso desses e de outros métodos de amplificação são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados em qualquer um de uma variedade de textos padrão. Detalhes para essas técnicas também podem ser encontrados em numerosas publicações científicas e referências de patentes, como Mullis, et al. (1987) patente US 4.683.202; Arnheim & Levinson (1 de outubro de 1990) C&EN 36-47; Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173; Guatelli, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell, et al., (1989) J. Clin. Chem. 35:1826; Landegren, et al., (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt, (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu e Wallace, (1989) Gene 4:560; Barringer, et al., (1990) Gene 89:117, e Sooknanan e Malek, (1995) Biotechnology 13:563-564.
[00121] Essas técnicas de amplificação de ácidos nucleicos podem ser aplicadas para amplificar e/ou detectar ácidos nucleicos de interesse, como ácidos nucleicos que compreendem loci marcadores. São fornecidos primers de amplificação para amplificar loci marcadores úteis e sondas adequadas para detectar loci marcadores ou para genótipo de alelo SNP. Por exemplo, primers e sondas exemplares são fornecidos nas SEQ ID NOs: 1 a 78 e nas Tabelas 5, 6, 9 e 10, e os loci genômicos que compreendem os vários loci marcadores fornecidos no presente pedido são fornecidos nas SEQ ID NOs: 13 a 18 e 49 a 60 e nas Tabelas 7 e 11. Exemplos não limitantes de sequências de amplicon que compreendem os loci marcadores são fornecidos nas Tabelas 8 e 12. No entanto, um técnico no assunto reconhecerá imediatamente que outras sequências de primer e sonda também poderiam ser usadas. Por exemplo, primers para ambos os lados do primer determinado podem ser usados no lugar do primer determinado, contanto que os primers possam amplificar uma região que inclui o alelo a ser detectado, como podem os primers e sondas direcionados a outros loci marcadores SNP. Além disso, considera-se que a sonda precisa a ser usada para a detecção pode variar, por exemplo, qualquer sonda que possa identificar a região de um amplicon marcador a ser detectado pode ser substituída por esses exemplos fornecidos no presente pedido. Além disso, a configuração dos primers de amplificação e sondas de detecção podem variar, é claro. Dessa forma, composições e métodos não são limitados aos primers e sondas especificamente citados no presente pedido.
[00122] Em certos exemplos, as sondas possuirão um marcador detectável. Qualquer marcador útil pode ser usado com uma sonda. Marcadores detectáveis adequados para uso com sondas de ácido nucleico incluem, por exemplo, qualquer composição detectável por espectroscopia, meios radioisotópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Marcadores úteis incluem biotina para coloração com estreptavidina marcada conjugada, microesferas magnéticas, corantes fluorescentes, radiomarcadores, enzimas e marcadores colorimétricos. Outros marcadores incluem ligantes, que se ligam a anticorpos marcados com fluoróforos, agentes quimioluminescentes e enzimas. Uma sonda também pode constituir primers de PCR radiomarcados usados para gerar um amplicon radiomarcado. Estratégias de marcação para ácidos nucleicos de marcação e estratégias de detecção correspondentes podem ser encontradas, por exemplo, em Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sexta Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR); ou Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Oitava Edição por Molecular Probes, Inc. (Eugene OR).
[00123] Marcadores detectáveis também podem incluir pares de supressores repórter, como os empregados em sondas de Baliza Molecular e TaqManTM. O repórter pode ser um corante orgânico fluorescente modificado com um grupo de ligação adequado para fixação ao oligonucleotídeo, como ao carbono 3’ terminal ou carbono 5’ terminal. O supressor também pode ter um corante orgânico, que pode ou não ser fluorescente, dependendo da realização. Geralmente, se o supressor é fluorescente ou simplesmente libera a energia transferida a partir do repórter por desintegração não radioativa, a faixa de absorção do supressor deveria pelo menos substancialmente sobrepor a faixa de emissão fluorescente do repórter para otimizar a supressão. Supressores não fluorescentes ou supressores escuros tipicamente funcionam absorvendo energia de repórteres excitados, mas não liberam a energia de maneira radioativa.
[00124] A seleção de pares de repórter-supressores apropriados para sondas específicas pode ser realizada de acordo com técnicas conhecidas. Supressores fluorescentes e escuros e suas propriedades óticas relevantes das quais pares de repórter-supressores exemplares podem ser selecionados são listados e descritos, por exemplo, em Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a ed., Academic Press, Nova York, 1971, cujo conteúdo é incorporado ao presente pedido como referência. Exemplos de modificação de repórteres e supressores para fixação covalente através de grupos reativos comuns que podem ser adicionados a um oligonucleotídeo na presente invenção podem ser encontrados, por exemplo, em Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes of Eugene, Oreg., 1992, cujo conteúdo é incorporado ao presente pedido como referência.
[00125] Em certos exemplos, pares de repórter-supressores preferenciais são selecionados a partir de corantes de xanteno incluindo corantes fluoresceína e rodamina. Muitas formas adequadas desses compostos estão disponíveis comercialmente com substituintes nos grupos fenila, que podem ser usados como o local para ligação ou como a funcionalidade de ligação para fixação a um oligonucleotídeo. Outro grupo útil de compostos fluorescentes para uso como repórteres são as naftilaminas, que têm um grupo amino na posição alfa ou beta. Incluído entre esses compostos naftilaminos estão sulfonato de 1-dimetilaminonaptil-5, sulfonato de 1-anilino-8- naftaleno e sulfonato de 2-p-touidinil-6-naftaleno. Outros corantes incluem 3- fenil-7-isocianato cumarina; acridinas como 9 isotiocianato acridina; N-(p-(2- benzoxazolil)fenil)maleimida; benzoxadiazolas; estilbenos; pirenos e similares. Em outros exemplos, os repórteres e supressores são selecionados a partir de corantes de fluoresceína e rodamina. Esses corantes e metodologias de ligação apropriadas para fixação a oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica.
[00126] Exemplos adequados de repórteres podem ser selecionados a partir de corantes como verde SYBR, 5-carboxifluoresceína (5- FAM™ disponível junto à Applied Biosystems de Foster City, Calif.), 6- carboxifluoresceína (6-FAM), tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET), 2,7- dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxifluoresceína, hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), 6-carboxi-2’,4,7,7’-tetraclorofluoresceína (6-TET™ disponível junto à Applied Biosystems), carbóxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4’,5’-dicloro-2’,7’- dimetoxifluoresceína (6-JOE™ disponível junto à Applied Biosystems), produtos corantes VIC™ disponível junto à Molecular Probes, Inc., produtos corantes NED™ disponível junto à Applied Biosystems, e similares. Exemplos adequados de supressores podem ser selecionados a partir de 6-carboxi- tetrametil-rodamina, ácido benzoico 4-(4-dimetilaminofenilazo) (DABYL), tetrametilrodamina (TAMRA), BHQ-0™, BHQ-1™, BHQ-2™ e BHQ-3™, cada um dos quais estão disponíveis junto à Biosearch Technologies, Inc. de Novato, Calif., QSY-7™, QSY-9™, QSY-21™ e QSY-35™, cada um dos quais estão disponíveis junto à Molecular Probes, Inc., e similares.
[00127] Em um aspecto, PCR em tempo real ou LCR é realizada nas misturas para amplificação descritas no presente pedido, por exemplo, com o uso de sondas balizas moleculares ou TaqMan™. Uma baliza molecular (MB) é um oligonucleotídeo que, sob condições de hibridização apropriadas, se autohibridiza para formar uma estrutura de haste e alça. A MB tem um marcador e um supressor no término dos oligonucleotídeos, dessa forma, sob condições que permitam a hibridização intramolecular, o marcador é tipicamente suprimido (ou pelo menos alterado em sua fluorescência) pelo supressor. Sob condições em que a MB não exibe hibridização intramolecular (por exemplo, quando ligada a um ácido nucleico alvo, como a uma região de um amplicon durante a amplificação), o marcador MB não é suprimido. Detalhes em relação aos métodos padrão para produzir e usar MBs são bem estabelecidos na literatura e MBs estão disponíveis a partir de várias fontes de reagentes comerciais. See also, e.g., Leone, et al., (1995) Molecular beacon probes combined with amplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA, Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; Tyagi e Kramer, (1996) Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization, Nature Biotechnology 14:303-308; Blok e Kramer, (1997) Amplifiable hybridization probes containing a molecular switch, Mol Cell Probes 11:187-194; Hsuih. et al., (1997) Novel, ligation-dependent PCR assay for detection of hepatitis C in serum, J Clin Microbiol 34:501-507; Kostrikis, et al., (1998) Molecular beacons: spectral genotyping of human alleles, Science 279:1228-1229; Sokol, et al., (1998) Real time detection of DNA:RNA hybridization in living cells, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 95:11538-11543; Tyagi, et al., (1998) Multicolor molecular beacons for allele discrimination, Nature Biotechnology 16:49-53; Bonnet, et al., (1999) Thermodynamic basis of the chemical specificity of structured DNA probes, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 96:6171-6176; Fang, et al. (1999) Designing a novel molecular beacon for surface-immobilized DNA hybridization studies, J. Am. Chem. Soc. 121:2921-2922; Marras, et al., (1999) Multiplex detection of single-nucleotide variation using molecular beacons, Genet. Anal. Biomol. Eng. 14:151-156; e Vet, et al., (1999) Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA. 96:6394-6399. Detalhes adicionais em relação à construção de MB e uso são encontrados na literatura de patente, por exemplo, patentes US 5.925.517, 6.150.097 e 6.037.130.
[00128] Outro método de detecção em tempo real é o método de detecção de exonuclease 5’, também chamado ensaio TaqManTM, conforme apresentado nas patentes 5.804.375, 5.538.848, 5.487.972 e 5.210.015, cada uma das quais é integralmente incorporada ao presente pedido como referência. No ensaio TaqManTM, uma sonda modificada, tipicamente com 10 a 25 ácidos nucleicos de comprimento, é empregada durante PCR que liga intermediários ou entre os dois membros do par de primer de amplificação. A sonda modificada possui um repórter e um supressor e é projetada para gerar um sinal detectável para indicar que ela foi hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo durante PCR. Desde que ambos, repórter e supressor estejam na sonda, o supressor interrompe o repórter de emitir um sinal detectável. No entanto, como a polimerase estende o primer durante a amplificação, a atividade de nuclease 5’ para 3’ da polimerase degrada a sonda, separando o repórter do supressor, e permitindo que o sinal detectável seja emitido. Em geral, a quantidade de sinal detectável gerado durante o ciclo de amplificação é proporcional à quantidade de produto gerado em cada ciclo.
[00129] É bem conhecido que a eficiência do supressor é uma forte função da proximidade do repórter e do supressor, isto é, conforme as duas moléculas se aproximam, o supressor aumenta a eficiência. Como a supressão é fortemente dependente da proximidade física do repórter e do supressor, o repórter e o supressor estão preferencialmente fixados à sonda dentro de poucos nucleotídeos um do outro, geralmente dentro de 30 nucleotídeos um do outro, mais preferencialmente com uma separação de cerca de 6 a 16 nucleotídeos. Tipicamente, essa separação é obtida por fixação de um membro de um par repórter-supressor à extremidade 5’ da sonda, e o outro membro a um nucleotídeo cerca de 6 a 16 nucleotídeos distantes, em alguns casos, na extremidade 3’ da sonda.
[00130] Sondas de detecção separadas também podem ser omitidas nos métodos de amplificação/detecção, por exemplo, realizando uma reação de amplificação em tempo real que detecta formação de produto por modificação do primer de amplificação relevante mediante incorporação em um produto, incorporação de nucleotídeos marcados em um amplicon, ou por monitoramento de alterações nas propriedades de rotação molecular de amplicons, em comparação aos precursores não amplificados (por exemplo, por polarização de fluorescência).
[00131] Além disso, considera-se que a amplificação não é uma necessidade para detecção de marcador, por exemplo, pode-se detectar diretamente o DNA genômico simplesmente realizando um Southern blot em uma amostra de DNA genômico. Procedimentos para realização de Southern blotting, amplificação, por exemplo, (PCR, LCR ou similares), e muitos outros métodos de detecção de ácido nucleico são bem estabelecidos e são ensinados, por exemplo, em Sambrook, et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3a ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 2000 (“Sambrook”); Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementada até 2002) (“Ausubel”)) e PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis). Detalhes adicionais relativos a detecção de ácidos nucleicos em plantas também podem ser encontrados, por exemplo, em Plant Molecular Biology (1993) Croy (ed.) BIOS Scientific Publishers, Inc.
[00132] Outras técnicas para detectar SNPs também podem ser empregadas, como hibridização alelo-específica (ASH). A tecnologia ASH é baseada no anelamento estável de uma sonda de oligonucleotídeos curta, fita simples, a um ácido nucleico alvo fita simples completamente complementar ao ácido nucleico alvo fita simples. A detecção é através de um marcador isotópico ou não isotópico fixado à sonda. Para cada polimorfismo, duas ou mais sondas ASH diferentes são projetadas para ter sequências de DNA idênticas, exceto nos nucleotídeos polimórficos. Cada sonda terá homologia exata com uma sequência de alelo, de modo que a faixa de sondas pode distinguir todas as sequências alélicas alternativas conhecidas. Cada sonda é hibridizada ao DNA alvo. Com o projeto de sonda e condições de hibridização apropriados, uma incompatibilidade de única base entre a sonda e o DNA irá prevenir hibridização.
[00133] Ensaios de amplificação em tempo real, incluindo MB ou TaqManTM são especialmente úteis para detectar alelos SNP. Nesses casos, sondas são tipicamente projetadas para se ligar à região de amplicon que inclui o locus SNP, com uma sonda alelo-específica sendo projetada para cada alelo SNP possível. Por exemplo, se houver dois alelos SNP conhecidos para um locus SNP específico, “A” ou “C”, então uma sonda é projetada com uma posição “A” na posição SNP, embora uma sonda separada seja projetada com um “C” na posição SNP. Embora as sondas sejam tipicamente idênticas entre si, exceto na posição SNP, elas não precisariam ser. Por exemplo, duas sondas alelo-específicas poderão ser deslocadas a montante ou a jusante em relação uma a outra, por uma ou mais bases. No entanto, se as sondas não são idênticas, elas devem ser projetadas de modo que elas se liguem com eficiência aproximadamente igual, que pode ser realizada por meio do projeto sob um rigoroso conjunto de parâmetros que restringem as propriedades químicas das sondas. Além disso, um marcador detectável diferente, por exemplo, um par repórter-supressor, é tipicamente empregado em cada sonda alelo-específica para permitir detecção diferencial de cada sonda. Em certos exemplos, cada sonda alelo-específica para um determinado locus SNP tem 11 a 20 nucleotídeos de comprimento, duplamente marcada com um supressor de fluorescência na extremidade 3’ e tanto 6-FAM (6-carboxifluoresceína) como VIC (4,7,2‘-tricloro-7‘-fenil-6-carboxifluoresceína) fluoróforo na extremidade 5’.
[00134] Para efetuar a detecção de SNP, uma reação PCR em tempo real pode ser realizada com o uso de primers que amplificam a região, incluindo o locus SNP, por exemplo, as sequências listadas na Tabela 5, cuja reação sendo realizado na presença de todas as sondas alelo-específicas para o determinado locus SNP. Detectando então o sinal para cada marcador detectável empregado e determinando qual(is) marcador(es) detectável(is) demonstraram um aumento de sinal, pode ser feita uma determinação de qual(is) sonda(s) alelo-específica(s) se ligaram ao amplicon, dessa forma, qual(is) alelo(s) SNP o amplicon possuía. Por exemplo, quando sondas marcadas com 6-FAM e VIC são empregadas, a emissão de diferentes comprimentos de onda de 6-FAM (518 nm) e VIC (554 nm) podem ser capturados. Uma amostra que é homozigota para um alelo terá fluorescência apenas do respectivos fluoróforo 6-FAM ou VIC, enquanto uma amostra que é heterozigota no locus analisado terá tanto fluorescência 6-FAM como VIC.
[00135] Os sistemas de detecção KASPar® e Illumina® são exemplos adicionais de sistemas de detecção de marcador comercialmente disponíveis. KASPar® é um sistema de genotipagem fluorescente homogêneo que utiliza hibridização alelo-específica e uma forma única de PCR alelo- específica (extensão de primer) a fim de identificar marcadores genéticos (por exemplo, um SNP associado ao locus específico com resistência à BSR e/ou resistência à FEY). Sistemas de detecção Illumina® utilizam tecnologia similar em um formato de plataforma fixa. A plataforma fixa utiliza uma placa física que pode ser criada com no máximo 384 marcadores. O sistema Illumina® é criado com um único conjunto de marcadores que não podem ser alterados e utiliza corantes para indicar detecção de marcadores.
[00136] Esses sistemas e métodos representam uma ampla variedade de métodos de detecção que podem ser utilizados para detectar marcadores associados com resistência à BSR e/ou FEY, mas qualquer outro método adequado também pode ser usado.
[00137] É fornecida introgressão de resistência à BSR e/ou FEY no germoplasma de soja não resistente ou menos resistente. Qualquer método para introgressão de um ou mais loci marcadores em plantas de soja conhecidos por um técnico no assunto podem ser usado. Tipicamente, são fornecidos um primeiro germoplasma de soja que contém resistência à BSR e/ou resistência à FEY derivadas de um locus marcador específico derivadas de um locus marcador específico, haplótipo ou perfil marcador e um segundo germoplasma de soja que é desprovido dessa resistência derivada do locus marcador, haplótipo ou perfil marcador. O primeiro germoplasma de soja pode ser cruzado com o segundo germoplasma de soja para fornecer progênie de germoplasma de soja. Esses germoplasmas de progênie são triados para determinar a presença de resistência à BSR e/ou resistência à FEY derivada do locus marcador, haplótipo ou perfil marcador e a progênie que testa positivo quanto à presença de uma resistência derivada do locus marcador, haplótipo ou perfil marcador é selecionada como sendo germoplasma de soja no qual o locus marcador, haplótipo ou perfil marcador foi introgredido. Métodos para realizar essa triagem são bem conhecidos na técnica e qualquer método adequado pode ser usado.
[00138] Uma aplicação de MAS é usar os marcadores de resistência, haplótipos ou perfis marcadores para aumentar a eficiência de uma introgressão ou esforço de retrocruzamento visando a introdução de uma característica de resistência em um antecedente desejado (normalmente alta produtividade). No retrocruzamento assistido por marcador de marcadores específicos de uma fonte doadora, por exemplo, um antecedente genético (genetic background) elite, seleciona-se entre progênie de retrocruzamento para a característica doadora, e então se usa repetidos retrocruzamentos para a linhagem elite para reconstituir o máximo quanto possível do genoma antecedente elite.
[00139] Dessa forma, os marcadores e métodos podem ser utilizados para guiar seleção assistida por marcadores ou melhoramento de variedades de soja com o complemento desejado (conjunto) de formas alélicas de segmentos cromossômicos associados com desempenho agronômico superior (resistência, juntamente com quaisquer outros marcadores disponíveis para produção, resistência a doenças, etc.). Qualquer um dos loci marcadores divulgados, alelos marcadores, haplótipos ou perfis marcadores podem ser introduzidos em uma linhagem de soja através de introgressão, por melhoramento tradicional (ou introduzidos através de transformação, ou ambos) para produzir uma planta de soja com desempenho agronômico superior. O número de alelos associados com resistência que pode ser introduzido ou estar presente em uma planta de soja varia de 1 até o número de alelos divulgados no presente pedido, cada número inteiro destes é incorporado no presente pedido como se explicitamente citado.
[00140] Os marcadores e métodos fornecidos no presente pedido também podem ser utilizados para guiar seleção assistida por marcador ou melhoramento de variedades de soja que compreendem outros marcadores de resistência à BSR e/ou marcadores de resistência à FEY ou alelos para criar uma pilha molecular para resistência à BSR e/ou resistência à FEY.
[00141] Este também fornece um método para produzir uma progênie de planta de soja e essas progênies de plantas de soja, per se. O método compreende cruzar uma primeira planta de soja parental com uma segunda planta de soja e cultivar a plantas de soja feminina sob condições de crescimento para produzir progênie de planta de soja. Métodos de cruzamento e cultivo de plantas de soja estão dentro da capacidade dos técnicos no assunto. Essa progênie de plantas de soja pode ser avaliada quanto aos alelos associados com resistência e, assim, a progênie desejada selecionada. Essas plantas ou sementes de progênie podem ser vendidas comercialmente para produção de soja, usadas para alimentos, processadas para obtenção de um componente desejado da soja, ou ainda utilizadas em ciclos subsequentes de melhoramento. Pelo menos uma dentre primeira ou segunda planta de soja é uma planta de soja que compreende pelo menos um dentre loci marcadores ou perfis marcadores, de modo que a progênie seja capaz de herdar o locus marcador ou perfil marcador.
[00142] Muitas vezes, é aplicado um método para pelo menos uma planta de soja relacionada como das linhagens progenitoras ou descendentes na genealogia das plantas de soja objeto de estudo, de modo que a herança da resistência desejada possa ser rastreada. O número de gerações que separam as plantas de soja sendo submetidas aos métodos fornecidos no presente pedido serão geralmente de 1 a 20, comumente 1 a 5, e tipicamente 1, 2 ou 3 gerações de separação, e muito frequentemente um descendente direto ou parental da planta de soja será submetido ao método (isto é, 1 geração de separação).
[00143] A diversidade genética é importante para ganho genético em longo prazo em qualquer programa de melhoramento. Com diversidade limitada, o ganho genético eventualmente formará um platô quando todos os alelos favoráveis forem fixados na população elite. Um objetivo é incorporar a diversidade em um pool elite sem perder o ganho genético que já foi produzido e com o mínimo possível de investimento. MAS fornece uma indicação de quais regiões genômicas e quais alelos favoráveis dos ancestrais originais foram selecionados e conservados ao longo do tempo, o que facilita os esforços para incorporar variação favorável das fontes de germoplasma exótico (parentais que não estão relacionados com o pool de genes elite) com a esperança de encontrar alelos favoráveis que atualmente não existem no pool de genes elite.
[00144] Por exemplo, os marcadores, haplótipos, primers, sondas e perfis marcadores podem ser usados para MAS em cruzamentos envolvendo linhagens elite x exóticas, submetendo a progênie segregante a MAS para manter grande produção de alelos, juntamente com os alelos marcadores de resistência no presente pedido.
[00145] Como uma alternativa aos métodos de melhoramento padrão de introdução de características de interesse na soja (por exemplo, introgressão), abordagens transgênicas também podem ser usadas para criar plantas transgênicas com as características desejadas. Nesses métodos, ácidos nucleicos exógenos que codificam um loci marcador desejado, perfil marcador ou haplótipo são introduzidos nas plantas alvo ou germoplasma. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica uma característica de resistência é clonado, por exemplo, através de clonagem posicional, e introduzido em uma planta alvo ou germoplasma.
[00146] Técnicos em melhoramento de plantas com experiência podem reconhecer plantas de soja resistentes no campo, e podem selecionar os indivíduos ou populações resistentes para propósitos de melhoramento ou para propagação. Nesse contexto, técnicos em melhoramento de plantas reconhecem plantas de soja resistentes e não resistentes ou suscetíveis. No entanto, resistência da planta é um espectro fenotípico que consiste em extremos de resistência e suscetibilidade, bem como uma série contínua de fenótipos de resistência intermediária. A avaliação desses fenótipos intermediários com o uso de ensaios reproduzíveis é de valor para os cientistas que procuram identificar loci gênicos que conferem resistência, para conduzir seleção assistida por marcador para populações resistentes, e para usar técnicas de introgressão para melhorar uma característica de resistência em uma linhagem de soja elite, por exemplo.
[00147] Por “resistência aprimorada” entende-se que as plantas mostram uma diminuição nos sintomas da doença que são o resultado da exposição da planta à Podridão Parda da Haste e/ou Mancha Foliar Olho-De- Rã. Ou seja, os danos causados pela Podridão Parda da Haste e/ou Mancha Foliar Olho-De-Rã são prevenidos ou, alternativamente, os sintomas da doença causada por Podridão Parda da Haste e/ou Mancha Foliar Olho-De-Rã são minimizados ou diminuídos. Dessa forma, a resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste e/ou Mancha Foliar Olho-De-Rã pode resultar em redução dos sintomas da doença por pelo menos cerca de 2% a pelo menos cerca de 6%, em pelo menos cerca de 5% a cerca de 50%, em pelo menos cerca de 10% a cerca de 60%, em pelo menos cerca de 30% a cerca de 70%, em pelo menos cerca de 40% a cerca de 80% ou em pelo menos cerca de 50% a cerca de 90% ou mais. Então, os métodos fornecidos no presente pedido podem ser utilizados para proteger as plantas da Podridão Parda da Haste e/ou Mancha Foliar Olho-De-Rã.
[00148] A Podridão Parda da Haste (BSR) de soja (Glycine max (L.) Merrill) é causada pelo patógeno fúngico Phialophora gregata. A triagem e seleção de plantas resistentes à Podridão Parda da Haste pode ser realizada, por exemplo, por exposição das plantas a Phialophora gregata e seleção dessas plantas que mostram resistência à Podridão Parda da Haste. Vários ensaios podem ser usados para medir resistência ou resistência aprimorada à BSR. Por exemplo, resistência à BSR pode ser determinada por observações visuais após exposição da planta a Phialophora gregata. As faixas de escore variam de 1 a 9 e indicam as observações visuais de resistência, em comparação a outros genótipos no teste. Um escore de 1 indica que Phialophora gregata é capaz de infectar a planta e causar perda de produção.
[00149] Exemplos não limitantes de triagem fenotípica de BSR são descritos em detalhes abaixo. A resistência fenotípica ou tolerância à podridão parda da haste pode ser avaliada no campo. Os campos são selecionados com base em um histórico forte de infecção por BSR. Geralmente, a severidade de BSR aumenta conforme o pH do solo diminui. A severidade de BSR é geralmente maior em pH 6,0 e diminui conforme o pH aumenta. Observou-se que temperaturas frias durante o estágio de preenchimento das vagens também pode ser um fator importante no desenvolvimento de BSR. Locais de estudos de produção também são fontes valiosas de boas classificações de BSR. Variedade suscetíveis e resistentes são cultivadas como verificações.
[00150] As plantas são observadas em meados de agosto quanto a qualquer escurecimento do caule ou clorose foliar. A infecção por BSR pode ser pontuada com o uso de tecidos do caule e/ou das folhas. (i) Sintomas de divisão do caule (BRSTM) e/ou (ii) sintomas de queima de folhas (BSRLF).
[00151] O sistema de pontuação para a característica de BSRLF é uma estimativa da área foliar afetada com base em uma avaliação visual de incidência por severidade para o lote. Uma escala de 1 a 9 é usada com base na área foliar total do lote afetado:
[00152] 9 = sem sintomas,
[00153] 8 = sintomas leves (algumas manchas cloróticas podem ser encontradas),
[00154] 7 = cerca de 15% de área foliar afetada,
[00155] 6 = 30% de área foliar afetada,
[00156] 5 = cerca de 40% de área foliar total afetada,
[00157] 4 = 50% de área foliar afetada,
[00158] 3 = 60% de área foliar afetada,
[00159] 2 = 70% de área foliar afetada,
[00160] 1 = > 80% de área foliar afetada).
[00161] As hastes são periodicamente divididas para confirmar se escurecimento da haste está presente em plantas que exibem sintomas nas folhas. Como é conhecido pelos técnicos no assunto, há dois tipos de patógenos de BSR. Tipo A produz sintomas na haste e nas folhas enquanto que o tipo B produz sintomas somente na haste. As hastes divididas são pontuadas com base na porcentagem de nós castanhos da seguinte forma:
[00162] 9 = claro
[00163] 8 = ligeiro acastanhamento (1 ou 2 nós)
[00164] 1 = quase toda a planta com nós castanhos
[00165] A patologia das plantas afetadas é avaliada para assegurar que os sintomas não sejam confundidos com síndrome da morte súbita.
[00166] Os plots são pontuados aproximadamente 2 ou 3 vezes em intervalos de 5 a 7 dias até que o plot atingisse R7. R7 é um estágio no início da maturidade, com sementes em uma ou mais vagens que estão fisiologicamente maduras.
[00167] Mancha Foliar Olho-De-Rã é causada por Cercospora sojina. A triagem e seleção de plantas resistentes à Mancha Foliar Olho-De-Rã pode ser realizada, por exemplo, por exposição das plantas a Cercospora sojina e seleção dessas plantas que mostram resistência ao desenvolvimento de Mancha Foliar Olho-De-Rã. Vários ensaios podem ser usados para medir resistência ou resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã. Por exemplo, resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã pode ser determinada por observações visuais após exposição da planta a Cercospora sojina. As faixas de escore variam de 1 a 9 e indicam as observações visuais de resistência, em comparação a outros genótipos no teste. Consulte a Tabela 15. Um escore de 1 indica que Cercospora sojina é capaz de infectar a planta e causar perda de produção. Os sintomas da doença Mancha Foliar Olho-De-Rã podem ser visualmente avaliados e pontuados de 1 a 9 comparando todos os genótipos em um determinado estudo com resistentes e suscetíveis checagens no estudo. A pontuação baseia-se no número e tamanho das lesões foliares. Um escore de 1 indica lesões de necrose foliar grave, enquanto que um escore de 9 indica que não há lesões. Os sintomas da doença também podem aparecer na haste, vagem e sementes.
[00168] Em alguns exemplos, é fornecido um kit ou um sistema automatizado para detectar loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores e/ou correlacionar os loci marcadores, haplótipos e perfis marcadores com um fenótipo desejado (por exemplo, resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste). Como usado no presente pedido, “kit” refere-se a um conjunto de reagentes para os propósitos de realização de vários métodos de detecção ou identificação no presente pedido, mais particularmente, a identificação e/ou a detecção de uma planta de soja ou germoplasma que tem resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste.
[00169] Em uma realização, é fornecido um kit para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou germoplasma de soja com resistência aumentada à Mancha Foliar Olho-De-Rã. Esse kit compreende (a) primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores associados à resistência à FEY, em que pelo menos um dos primers e sondas no kit são capazes de detectar um locus marcador, em que o locus marcador que: (A) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC- 024115-04764 e BARC-040393-07727 no grupo de ligação J_(16); (B) pode compreender um ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16); (C) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo T ou C em S00005-01 e um alelo G em S14236-1; (D) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo T ou C em S00005-01; (E) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1 e um alelo G em S14236-1; e/ou, (F) pode compreender um haplótipo de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S06363-1, um alelo G em S14236-1, e um alelo T ou um alelo C em S00005-01; (b) instruções para uso dos primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores e correlacionar os loci marcadores detectados com a resistência prevista para FEY.
[00170] Em outra realização, é fornecido um kit para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou germoplasma de soja com resistência aumentada à Podridão Parda da Haste. Esse kit compreende (a) primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores associados à resistência à BSR, em que pelo menos um dos primers e sondas no kit são capazes de detectar um locus marcador, em que o locus marcador é: (a) pode ter intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-042193- 08207 e BARC-011625-00310 no grupo de ligação J_(16); (b) pode compreender um ou mais dentre S01584-1, S04857-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2 e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esse no grupo de ligação J_(16); (c) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015- 001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (d) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo J_(16) compreendendo um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (e) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S07157-1; (f) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (g) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S16015-1; (h) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (i) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; (j) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S07157-1; (k) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S16015-1; (l) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S07157-1; (m) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo C em S16015-1; (n) pode compreender um haplótipo Rbs3a de loci marcadores J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1, e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (o) pode compreender um haplótipo Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157- 1, um alelo A em S07157-2, um alelo C em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (p) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcador no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023- 001, e/ou um alelo C em S04857-1; (q) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (r) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (s) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S07157-1; (t) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16015-1; (u) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (v) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (w) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S07157-1; (x) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S16015-1; (y) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (z) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1, e um alelo T em S16015-1; (aa) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo A em S04831-1; (ab) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (ac) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001, e/ou um alelo C em S04857-1; (ad) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S04857-1; (ae) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S04831-1; (af) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S04831-1 e um alelo C em S04857-1; (ag) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S07157-2; (ah) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16023-1; (ai) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S14236-1; (aj) pode compreender um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreendem um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2, e um alelo T S16023-1; ou qualquer outra combinação apresentada na Tabela 4; e (b) instruções para uso dos primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores e correlacionar os loci marcadores detectados com a resistência prevista para BSR.
[00171] Ainda em outra realização, é fornecido um kit para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou germoplasma de soja com resistência aumentada à Mancha Foliar Olho-De-Rã e Podridão Parda da Haste. Esse kit compreende (a) primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores associados com resistência à BSR e (b) primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores associados com FEY. Nesse kit, os loci marcadores ou haplótipos associados com BSR e quaisquer loci marcadores associados com FEY podem ser usados, incluindo qualquer combinação de loci marcadores ou haplótipos apresentados em qualquer uma das Tabelas 5 a 12 ou os loci marcadores mostrados na Figura 3.
[00172] Dessa forma, um kit ou sistema típico pode incluir um conjunto de sondas ou primers marcadores configurados para detectar, pelo menos um alelo favorável de um ou mais loci marcadores associados com resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e/ou Podridão Parda da Haste, por exemplo, um locus marcador favorável, haplótipo ou perfil marcador. Essas sondas ou primers podem ser configurados, por exemplo, para detectar os loci marcadores apontados nas tabelas e exemplos no presente pedido, por exemplo, com o uso de qualquer formato para detecção de alelo disponível, como detecção baseada em arranjo em fase sólida ou líquida, detecção de amostra baseada em microfluídico, etc. Os sistemas e kits podem ainda incluir materiais de embalagem para embalar as sondas, primers ou instruções, controles como reações de amplificação de controle que incluem as sondas, primers ou ácidos nucleicos molde para amplificações, marcadores de tamanho molecular, ou similares.
[00173] Um sistema típico também pode incluir um detector que está configurado para detectar uma ou mais saídas de sinal do conjunto de sondas marcadoras ou primers, ou amplicon dos mesmos, identificando assim a presença ou ausência do alelo. Uma ampla variedade de aparelhos de detecção de sinal está disponível, incluindo tubos multiplicadores de fotos, espectrofotômetros, arranjos de CCD, detectores de digitalização, fototubos e fotodiodos, estações microscópicas, galvo-scans, aparelhos de detecção de amplificação de ácido nucleico microfluídico e similares. A configuração precisa do detector dependerá, em parte, do tipo de marcador usado para detectar o alelo marcador, bem como a instrumentação que é mais convenientemente obtida para o usuário. Os detectores que detectar fluorescência, fosforescência, radioatividade, pH, carga, absorvância, luminescência, temperatura, magnetismo ou similares podem ser usados. Exemplos típicos de detector incluem detectores de luz (por exemplo, fluorescência) ou detectores de radioatividade. Por exemplo, a detecção de uma emissão de luz (por exemplo, emissão de fluorescência) ou outro marcador de sonda é indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. A detecção fluorescente é geralmente usada para detecção de ácidos nucleicos amplificados (no entanto, operações a montante e/ou a jusante também podem ser realizadas nos amplicons, que podem envolver outros métodos de detecção). Em geral, o detector detecta uma ou mais emissões de marcadores (por exemplo, luz), que é indicativo da presença ou ausência de um alelo marcador. O(s) detector(es) opcionalmente monitoram) um ou uma pluralidade de sinais de uma reação de amplificação. Por exemplo, o detector pode monitorar sinais ópticos que correspondem aos resultados do ensaio de amplificação em “tempo real”.
[00174] Instruções sobre sistema ou kit que descrevem como usar o sistema ou kit, ou que correlacionam a presença ou ausência do alelo favorável com a resistência prevista também são fornecidas. Por exemplo, as instruções podem incluir pelo menos uma consulta na tabela que inclui uma correlação entre a presença ou ausência dos alelos favoráveis, haplótipos, ou perfis marcadores e a resistência prevista. A forma precisa das instruções pode variar dependendo dos componentes do sistema, por exemplo, elas podem estar presentes como programa de computação de sistema em uma ou mais unidades integradas do sistema (por exemplo, um microprocessador, computador ou meio legível de computador), ou pode estar presente em uma ou mais unidades (por exemplo, computadores ou meios legíveis de computador) acoplados de maneira funcional ao detector. Como apontado, em um exemplo típico, as instruções do sistema incluem, pelo menos, uma consulta na tabela que inclui uma correlação entre a presença ou ausência dos alelos favoráveis e resistência prevista. As instruções também tipicamente incluem instruções que fornecem uma interface de usuário com o sistema, por exemplo, para permitir que um usuário veja os resultados de uma análise da amostra e para dar entrada nos parâmetros no sistema.
[00175] Polinucleotídeos isolados que compreendem as sequências de ácidos nucleicos dos primers e sondas fornecidos no presente pedido também estão englobados no presente pedido. Em uma realização, o polinucleotídeo isolado compreende um polinucleotídeo capaz de detectar um locus marcador do genoma de soja (A) intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-032663-09006 e Satt431 no grupo de ligação J_(16); (B) que compreende um ou mais dentre S06363-1, S14236-1, S00005-01 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16); (C) intervalo flanqueado por, e incluindo os loci marcadores BARC-042193-08207 e BARC-011625-00310 no grupo de ligação J_(16); ou (D) pode compreender um ou mais dentre S01584-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, S04857-1 e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16).
[00176] Em realizações específicas, o polinucleotídeo isolado compreende: (a) um polinucleotídeo que compreende SEQ ID NOs: 1 a 78; (b) um polinucleotídeo que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência às SEQ ID NOs: 1 a 78; ou (c) um polinucleotídeo que compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1 a 78.
[00177] Em algumas realizações, os ácidos nucleicos isolados são capazes de hibridizar sob condições estringentes a ácidos nucleicos de um cultivar de soja resistente à FEY e/ou BSR, por exemplo, SNPs específicos que compreendem um locus, haplótipo ou perfil marcador.
[00178] Como usado no presente pedido, uma sequência substancialmente idêntica ou complementar é um polinucleotídeo que hibridiza especificamente ao complemento da molécula de ácido nucleico à qual está sendo comparado sob condições de alta estringência. Um polinucleotídeo é dito como o “complemento” de outro polinucleotídeo se ele exibe complementaridade. Como usado no presente pedido, moléculas são ditas como exibindo “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas de polinucleotídeo é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas como sendo “minimamente complementares” se elas podem hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra, pelo menos sob condições convencionais de “baixa estringência”. De maneira similar, as moléculas são ditas como sendo “complementares” se elas podem hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições convencionais de “alta estringência”.
[00179] Condições apropriadas de estringência que promovem hibridização de DNA, por exemplo, 6 X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em torno de 45°C, seguido por uma lavagem de 2 X SSC a 50°C, são conhecidas pelos técnicos no assunto ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Tipicamente, condições estringentes para hibridização e detecção serão aquelas em que a concentração de sal é menor que cerca de 1,5 M de íon de Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, como formamida. As condições de baixa estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de formamida 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em 1X a 2X de SSC (20X de SSC = NaCI 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) em 50 a 55°C. Condições de estringência moderada exemplares incluem hibridização em formamida a 40% até 45%, NaCl a 1,0 M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 50°C até 60°C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,1X SSC a 60°C até 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem conter cerca de 0,1% a cerca de 1% de SDS. A duração da hibridização é geralmente menor que cerca de 24 horas, geralmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelo menos um período de tempo suficiente para alcançar o equilíbrio.
[00180] Realizações não limitantes incluem: 1. Método, para identificar uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã, cujo método compreende detectar no genoma da dita primeira planta de soja ou no genoma do dito primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado à resistência, em que pelo menos um locus marcador compreende S06363-1, S00005-01, S14236-1 ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16). 2. Método, de acordo com a realização 1 (a), em que pelo menos dois loci marcadores são detectados. 3. Método, de acordo com a realização 2, em que pelo menos dois loci marcadores compreendem um haplótipo que está associado à dita resistência. 4. Método, de acordo com a realização 3, em que o dito haplótipo associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã compreende: (a) um alelo T ou C em S00005-01 e um alelo G em S14236-1; (b) um alelo C em S06363-1 e um alelo T ou C em S00005-01; (c) um alelo C em S06363-1 e um alelo G em S14236-1; e/ou, (d) um alelo C em S06363-1, um alelo G em S14236-1, e um alelo T ou C em S00005-01. 5. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 4, em que o germoplasma é uma variedade de soja. 6. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 5, em que o método ainda compreende selecionar a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja ou uma progênie da mesma que tem pelo menos um locus marcador. 7. Método, de acordo com a realização 6, que ainda compreende cruzar a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja selecionados com uma segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja. 8. Método, de acordo com a realização 7, em que a segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja compreende uma linhagem exótica de soja ou uma linhagem elite de soja. 9. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 8, em que a detecção compreende amplificar pelo menos um dos ditos loci marcadores e detectar o amplicon marcador amplificado resultante. 10. MÉTODO, de acordo com a realização 9, em que a amplificação compreende: a) adicionar e misturar um primer de amplificação ou par de primer de amplificação para cada locus marcador sendo amplificado com um ácido nucleico isolado a partir da primeira planta de soja ou do primeiro germoplasma de soja, em que o primer ou par de primer é complementar ou parcialmente complementar a um variante ou fragmento do locus genômico que compreende o locus marcador, e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA polimerase com o uso do ácido nucleico de soja como um molde; e b) estender o primer ou par de primer em uma reação de polimerização de DNA que compreende uma DNA polimerase e um ácido nucleico molde para gerar pelo menos um amplicon. 11. MÉTODO, de acordo com a realização 10, em que o dito método compreende amplificar um variante ou fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e/ou 18. 12. Método, de acordo com a realização 10, em que o dito primer ou par de primer compreende um variante de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e/ou 18 ou complementos das mesmas. 13. Método, de acordo com a realização 12, em que o dito primer ou par de primer compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5 e/ou 6 ou variantes ou fragmentos das mesmas. 14. Método, de acordo com a realização 13, em que o dito par de primer compreende: a) SEQ ID NOs: 1 e 2; b) SEQ ID NOs: 3 e 4; e/ou c) SEQ ID NOs: 5 e 6. 15. Método, de acordo com a realização 10, em que o método ainda compreende fornecer uma ou mais sondas de ácido nucleico marcadas adequadas para detecção de cada locus marcador sendo amplificado. 16. Método, de acordo com a realização 15, em que a dita sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um variante ou fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17 e/ou 18 ou complementos das mesmas. 17. Método, de acordo com a realização 16, em que a sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 e/ou 12. 18. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 8, em que a detecção compreende sequenciamento de DNA de pelo menos um dos ditos loci marcadores. 19. Polinucleotídeo, isolado, capaz de detectar um locus marcador do genoma de soja que está associado com resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã que compreende S14236-1, S06363-1, S00005-01 ou um marcador estreitamente ligado a esses. 20. Polinucleotídeo, isolado, de acordo com a realização 19, em que o polinucleotídeo compreende: (a) um polinucleotídeo que compreende SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e/ou 12; (b) um polinucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência aos polinucleotídeos apresentados na parte (a); ou (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos dos polinucleotídeos apresentados na parte (a). 21. Kit, para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou germoplasma de soja com resistência aumentada à Mancha Foliar Olho-De-Rã, cujo kit compreende: a) pelo menos um primeiro primer ou uma primeira sonda para detectar um ou mais loci marcadores associados com resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã, em que o primer ou sonda são capazes de detectar um locus marcador que compreende S06363-1, S00005-01, S14236-1 ou um marcador estreitamente relacionadas a esse no grupo de ligação J_(16); e, b) instruções para uso dos primers ou sondas para detectar um ou mais loci marcadores e correlacionar os loci marcadores detectados com a resistência prevista para Mancha Foliar Olho-De-Rã. 22. Kit, de acordo com a realização 21, em que o kit compreende a primeira e uma segunda sonda ou o primeiro e um segundo primer para detectar um ou mais loci marcadores associados com resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã, em que: (a) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo C em S06363-1 e a segunda sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo G em S14236-1; ou, (b) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo C em S06363-1 e a segunda sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo A ou um alelo G em S00005-01. (c) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo T ou C em S00005-01 e a segunda sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo G em S14236-1, (d) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo C em S06363-1 e a segunda sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo T ou C em S00005-01; e/ou (e) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador; que compreende um alelo C em S06363-1 e a segunda sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo G em S14236-1. 23. Kit, de acordo com a realização 21, em que o kit compreende uma primeira, uma segunda e uma terceira sonda, ou o primeiro, um segundo ou um terceiro primer para detectar um ou mais loci marcadores associados com resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã, em que: (a) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo C em S06363-1; (b) a primeira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo G em S14236-1; e, (c) a terceira sonda ou primer é capaz de detectar um locus marcador que compreende um alelo T ou C em S00005-01. 24. Método, para identificar uma primeira planta de soja ou um primeiro germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste (BSR), cujo dito método compreende detectar no genoma da dita primeira planta de soja ou no genoma do dito primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado à resistência, em pelo menos um locus marcador compreende um ou mais dentre S01584-1, S04857- 1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2, e/ou S16023-001 e/ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16). 25. Método, de acordo com a realização 24, em que pelo menos dois loci marcadores são detectados e compreendem: (a) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (c) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S07157-1; (d) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (e) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um G em S01584-1 e um alelo C em S16015- 1; (f) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (g) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (h) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (i) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S16015-1; (j) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (k) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; ou, (l) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1 e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1. 26. Método, de acordo com a realização 24, em que pelo menos dois loci marcadores são detectados e compreendem um haplótipo Rbs3b de loci marcadores no grupo J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo A em S07157-2, um alelo C em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1. 27. Método, de acordo com a realização 24, em que pelo menos dois loci marcadores são detectados e compreendem: (a) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (c) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (d) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S07157-1; (e) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16015-1; (f) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (g) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (h) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (i) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (j) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (k) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (l) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo A em S04831-1; ou, (m) um haplótipo oculto Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S07157-1 e um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1. 28. Método, de acordo com a realização 24, em que pelo menos dois loci marcadores compreendem um haplótipo que está associado à dita resistência à BSR e compreendem: (a) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S04857-1; (c) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S04831-1; (d) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S04831-1 e um alelo C em S04857-1; (e) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S07157-2; (f) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16023-1; (g) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S14236-1; ou, (h) um haplótipo oculto Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo C em S07157-1, um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1. 29. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 24 a 28, em que o germoplasma é uma variedade de soja. 30. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 24 a 29, em que o método ainda compreende selecionar a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja ou uma progênie da mesma que tem o dito haplótipo. 31. Método, de acordo com a realização 30, que ainda compreende cruzar a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja selecionados com uma segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja. 32. Método, de acordo com a realização 31, em que a segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja compreende uma linhagem exótica de soja ou uma linhagem elite de soja. 33. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 24 a 28, em que a detecção compreende amplificar os ditos loci marcadores do dito haplótipo e detectar o amplicon marcador amplificado resultante. 34. Método, de acordo com a realização 33, em que a amplificação compreende: a) adicionar e misturar um primer de amplificação ou par de primer de amplificação para cada locus marcador sendo amplificado com um ácido nucleico isolado a partir da primeira planta de soja ou do primeiro germoplasma de soja, em que o primer ou par de primer é complementar ou parcialmente complementar a um variante ou fragmento do locus genômico que compreende o locus marcador, e é capaz de iniciar a polimerização de DNA por uma DNA polimerase com o uso do ácido nucleico de soja como um molde; e b) estender o primer ou par de primer em uma reação de polimerização de DNA que compreende uma DNA polimerase e um ácido nucleico molde para gerar pelo menos um amplicon. 35. Método, de acordo com a realização 33, em que o dito método compreende amplificar um variante ou fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 77 e/ou 78. 36. Método, de acordo com a realização 33, em que o dito primer ou par de primer compreende um variante de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 77 e/ou 78. 37. Método, de acordo com a realização 36, em que o dito primer ou par de primer compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 73 e/ou 74 ou variantes ou fragmentos das mesmas. 38. Método, de acordo com a realização 37, em que o dito par de primer compreende: a) SEQ ID NOs: 25 e 26; b) SEQ ID NOs: 27 e 28; c) SEQ ID NOs: 29 e 30; d) SEQ ID NOs: 31 e 32; e) SEQ ID NOs: 33 e 34; f) SEQ ID NOs: 35 e 36; ou, g) SEQ ID NOs: 73 e 74. 39. Método, de acordo com a realização 33, em que o método ainda compreende fornecer uma ou mais sondas de ácido nucleico marcadas adequadas para detecção de cada locus marcador sendo amplificado. 40. Método, de acordo com a realização 39, em que a dita sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende um variante ou fragmento de um ou mais polinucleotídeos que compreendem SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 77 e/ou 78 ou complementos das mesmas. 41. Método, de acordo com a realização 40, em que a sonda de ácido nucleico marcada compreende uma sequência de ácido nucleico que compreende SEQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 75 e/ou 76. 42. Método, de acordo com qualquer uma das realizações 24 a 28, em que a detecção compreende sequenciamento de DNA de pelo menos um dos ditos loci marcadores. 43. Polinucleotídeo, isolado, capaz de detectar um locus marcador do genoma de soja que está associado com resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste (BSR) que compreende S01584-1, S04831-1, S16015-001, S04857-1, S07157-1, S07157-2 ou S16023-001 ou um marcador estreitamente ligado a esse. 44. Polinucleotídeo, isolado, de acordo com a realização 43, em que o polinucleotídeo compreende: (a) um polinucleotídeo que compreende SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 75 e/ou 76; (b) um polinucleotídeo que tem pelo menos 90% de identidade de sequência aos polinucleotídeos apresentados na parte (a); ou (d) um polinucleotídeo que compreende pelo menos 10 nucleotídeos contíguos dos polinucleotídeos apresentados na parte (a). 45. Kit, para detectar ou selecionar pelo menos uma planta de soja ou germoplasma de soja com resistência aumentada à Podridão Parda da Haste, cujo kit compreende: a) um conjunto de primers ou um conjunto de sondas para detectar pelo menos um locus marcador que compreende S01584-1, S04857-1, S04831-1, S16015-001, S07157-1, S07157-2 ou S16023-001 ou um marcador estreitamente ligado a esses no grupo de ligação J_(16); e, b) instruções para uso do conjunto de primers ou do conjunto de sondas para detectar o haplótipo e correlacionar os loci marcadores detectados com resistência prevista à Podridão Parda da Haste. 46. Kit, de acordo com a realização 45, em que o dito kit compreende conjuntos de primers ou sondas que podem detectar um haplótipo Rbs3a de loci marcadores em um grupo de ligação J_(16), em que cada par de primer ou cada sonda no dito kit pode detectar um dos locus marcador que compreende: (a) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (c) um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S07157-1; (d) um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (e) um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S16015-1; (f) um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (g) um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; (h) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo T em S07157-1; (i) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S16015-1; (j) um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (k) um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; ou, (l) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1, e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1. 47. Kit, de acordo com a realização 45, em que o dito kit compreende conjuntos de primers ou sondas que podem detectar um haplótipo Rbs3b de loci marcadores no grupo de ligação J_(16), em que cada par de primer ou cada sonda no kit pode detectar um dos locus marcador que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1 e/ou um alelo C em S04857-1. 48. Kit, de acordo com a realização 45, em que o dito kit compreende conjuntos de primers ou sondas que podem detectar um haplótipo Rbs3a oculto de loci marcadores em um grupo de ligação J_(16), em que cada par de primer ou cada sonda no dito kit pode detectar um dos locus marcador que compreende: (a) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S07157-1; (c) um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (d) um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S07157-1; (e) um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16015-1; (f) um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (g) um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (h) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, e um alelo C em S07157-1; (i) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S16015-1; (j) um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S07157-1; (k) um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (l) um alelo G em S01584-1 e um alelo A em S04831-1; ou, (m) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S07157-1, e um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1. 49. Kit, de acordo com a realização 45, em que o dito kit compreende conjuntos de primers ou sondas que podem detectar um haplótipo Rbs3b oculto de loci marcadores em um grupo de ligação J_(16), em que cada par de primer ou cada sonda no dito kit pode detectar um dos locus marcador que compreende: (a) um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S16015-001, um alelo C em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um alelo G em S01584-1 e um alelo C em S04857-1; (c) um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S04831-1; (d) um alelo G em S04831-1 e um alelo C em S04857-1; (e) um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S07157-2; (f) um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S16023-1; (g) um alelo G em S01584-1 e um alelo G em S16023-1; ou, (h) um alelo G em S01584-1, um alelo G em S04831-1, um alelo C em S07157-1, e um alelo T em S16015-1, um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1. 50. Método, de melhoramento de uma planta de soja ou de um germoplasma de soja que exibe resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho- De-Rã e resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste (BSR), que compreende: (a) detectar no genoma de uma primeira planta de soja ou no genoma do dito primeiro germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado com uma resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De- Rã e selecionar a dita primeira planta de soja ou o dito primeiro germoplasma de soja que tem o dito locus marcador; (b) detectar no genoma de uma segunda planta de soja ou no genoma do dito segundo germoplasma de soja pelo menos um locus marcador que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a, que está associado à resistência aprimorada à Podridão Parda da Haste e selecionar a dita segunda planta de soja ou o dito segundo germoplasma de soja que tem o dito locus marcador; (c) cruzar a primeira planta de soja ou primeiro germoplasma de soja selecionados com a segunda planta de soja ou segundo germoplasma de soja selecionados; e, (d) selecionar progênie que tem em seu genoma pelo menos um locus marcador que está associado a uma resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã e pelo menos um locus marcador que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a. 51. Método, de acordo com a realização 50, em que pelo menos um locus marcador que está associado com uma resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã compreende: (a) S06363-1, S00005-01, S14236-1 ou um marcador estreitamente ligado a esses; (b) um haplótipo que está associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e o dito haplótipo compreende o seguinte locus marcador: um alelo C em S06363-1 e um alelo A ou C em S00005-01; (c) um haplótipo que está associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e o dito haplótipo compreende o seguinte locus marcador: um alelo T ou C em S00005-01 e um alelo G em S14236-1; ou, (d) um haplótipo que está associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e o dito haplótipo compreende o seguinte locus marcador: um alelo C em S06363-1 e um alelo T ou C em S00005-01; ou, (e) um haplótipo que está associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e o dito haplótipo compreende o seguinte locus marcador: um alelo C em S06363-1 e um alelo G em S14236-1; e/ou, (f) um haplótipo que está associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e o dito haplótipo compreende o seguinte locus marcador: um alelo C em S06363-1, um alelo G em S14236-1 e um alelo T ou C em S00005-01. 52. Método, de acordo com a realização 50, em que pelo menos um locus marcador que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a e mostra uma resistência aprimorada à BSR compreende: (a) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; (b) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (c) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1 e um alelo T em S07157-1; (d) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S16015-1 e um alelo A em S04831-1; (e) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um G em S01584-1 e um alelo C em S16015- 1; (f) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (g) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S16015-1; (h) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1; (i) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1 e um alelo C em S16015-1; (j) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo T em S07157-1; (k) m haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo C em S04857-1 e um alelo C em S16015-1; (l) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo T em S07157-1 e um alelo C em S16015-1; um alelo G em S07157-2 e um alelo T em S16023-1; (m) um haplótipo Rbs3a de loci marcadores no grupo de ligação J_(16) que compreende um ou mais dos seguintes: um alelo G em S01584-1, um alelo A em S04831-1, um alelo C em S16015-001, um alelo T em S07157-1, um alelo G em S07157-2, um alelo T em S16023-001 e/ou um alelo C em S04857-1; ou (n) qualquer haplótipo do conjunto de combinação de marcador apresentado na Tabela 4. 53. MÉTODO, de acordo com a realização 50, em que: (a) pelo menos um locus marcador que está associado a uma resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã compreende um haplótipo que está associado à dita resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã e o dito haplótipo compreende os seguintes locus marcador: um alelo G em S14236-1 e um alelo T ou C em S00005-01; e, (b) um haplótipo que está associado ao haplótipo BSR Rbs3a e mostra uma resistência aprimorada à BSR, cujo dito haplótipo compreende os seguintes loci marcadores: um alelo A em S04831-1 e um alelo T em S07157-1.
[00181] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada. Entende-se que os exemplos e realizações descritas no presente pedido são somente para propósitos ilustrativos, e os técnicos no assunto reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações anexas.
[00182] Foram desenvolvidos marcadores para caracterizar, identificar e/ou selecionar alelos resistentes ou suscetíveis no locus Rcs3 no grupo de ligação J (ch 16). Os marcadores foram triados contra várias linhagens endogâmicas resistentes e suscetíveis conhecidas.
[00183] Ensaios para loci marcadores S00005-01, S06363-1 e S14236-1 foram desenvolvidos para identificar alelos no locus RCS3 que estão associados com resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã (FEY). Associações genotípicas a fenotípicas nesses loci foram validadas em um painel de 23 variedades FEY resistentes e 26 suscetíveis, o que incluía as linhagens experimentais de propriedade e linhagens experimentais de propriedade comercial (Tabela 13). O nível de resistência à FEY varia de escores mais suscetíveis de 1 a um escore completamente resistente de 9. Ambas, triagem de mudas na câmara de crescimento e triagem no campo nos locais e ao longo dos anos foram usadas para caracterizar a reação das linhagens à Mancha Foliar Olho-de-Rã. Para garantir desempenho robusto do ensaio em uma configuração de genotipagem de alta produtividade, a otimização de ensaio de marcador foi concluída pela triagem de uma variedade de combinações de primer/sonda. Os ensaios otimizados S00005-01-A, S06363-1-Q1 e S14236-1- Q3 foram selecionados; no entanto, outras variações de ensaios podem ser usadas para detectar o polimorfismo.
[00184] Ambas, triagem de mudas na câmara de crescimento e triagem no campo nos locais e ao longo dos anos foram usadas para caracterizar a reação das linhagens à Mancha Foliar Olho-de-Rã.
[00185] Foram realizados ensaios TaqMan sob as seguintes condições ou similares.
[00186] O DNA genômico foi extraído para testes com o uso de um protocolo CTAB padrão e condições de amplificação exemplares são descritas abaixo na Tabela 14A e 14B. TABELA 14A TABELA 14B MIX DE AMPLIFICAÇÃO (EM MICROLITROS)
[00187] A associação entre o marcador S06363-1 e resistência à FEY foi adicionalmente validado por genotipagem de uma população de mapeamento RIL segregante para o fenótipo de resistência à FEY. A progênie cem e oitenta e quatro derivadas do cruzamento entre o cultivar resistente 93B66 e o cultivar suscetível XB29K04 foram usadas na análise. Cada progênie foi genotipada com quatro marcadores no intervalo de mapeamento Lg J. e a análise de regressão de marcador único sugere um QTL significativo em Lg J. que está fortemente associado com o marcador S06363-1.
[00188] Análise de Ligação: Gerenciador de Mapa QPX.b20 foi usado para construir o mapa de ligação e realizar análise QTL. Os Parâmetros de Gerenciamento de Mapa Iniciais foram configurados para: 1) Avaliação da Ligação: Intercruzamento 2) Critério de Busca: P = 1e-5 3) Função do Mapa: Kosambi 4) Tipo de Cruzamento: Cruzamento de Linhagem
[00189] Análise QTL: A análise de marcador único foi realizada com o uso de um modelo de regressão aditivo. O mapeamento do intervalo foi realizado com o uso de um modelo aditivo constrito. Um teste de permutação foi executado 1.000 vezes com o uso do modelo livre para estabelecer o limiar para significância estatística (estatística de razão LOD - LRS) para determinar QTL putativo. TABELA 15 DESCRIÇÃO DE ESCORES DE FEY TABELA 16 RESULTADOS DE MAPEAMENTO DE QTL NO MARCADOR S06363-1
[00190] Foram desenvolvidos marcadores para caracterizar, identificar e/ou selecionar alelos resistentes ou suscetíveis no locus Rbs3 no grupo de ligação J (ch 16). Os marcadores foram triados contra vários parentais resistentes e suscetíveis conhecidos.
[00191] Ensaios para loci marcadores S01584-1, S04831-1, S07157-1, S07157-2, S16015-001 e S16023-001 foram desenvolvidos para identificar os alelos de resistência à podridão parda da haste (BSR) Rbs3a e Rbs3b. Esses ensaios de marcador foram validados contra um painel de 12 variedades resistentes e 22 suscetíveis (Tabela 17). Para garantir desempenho robusto do ensaio em uma configuração de genotipagem de alta produtividade, a otimização de ensaio de marcador foi concluída pela triagem de uma variedade de combinações de primer/sonda. Os ensaios otimizados S01584-1- Q5, S04831-1-Q2, S07157-1-Q1, S07157-2-Q1, S16015-001-Q001 e S16023- 001-Q002 foram selecionados; no entanto, outras versões de ensaio podem ser usadas para detectar o polimorfismo. TABELA 17 ALELO REQUER LOCI MARCADORES ASSOCIADOS COM RESISTÊNCIA À BSR EM UM PAINEL DE LINHAGENS RESISTENTES E SUSCETÍVEIS CONHECIDAS
*o genótipo “Resistente” à BSR denotado na Tabela 17 é similar ao fenótipo Rbs3b, mas sem o alelo RES o marcador S07157-2. Esse genótipo prediz e calcula a média para resistência média acima.
[00192] S07157-1 e S07157-2 têm apenas três nucleotídeos fora e não estão em desequilíbrio de ligação. As sondas para ensaios, S07157-1- Q1 e S07157-2-Q1, são projetadas de modo que sobrepõem SNPs S07157-1 e S07157-2. S07157-1 serve como um marcador para o haplótipo Rbs3a, e o ensaio S07157-1-Q1 sonda “T/C” em S07157-1 e “G” em S07157-2. Ao contrário, S07157-2 serve como um marcador para o alelo Rbs3b, e o ensaio S07157-2-Q1 sonda “C” em S07157-1 e “A/G” em S07157-2. Dessa forma, S07157-1-Q1 falha em amostras com o haplótipo Rbs3b e S07157-2-Q1 falha em amostras com o haplótipo Rbs3a (Tabela 18).
[00193] Superior: Resumo de alelos em S07157-1 e S07157-2 em linhagens com Rbs3b, Rbs3a ou linhagens suscetíveis (SUS). Inferior: Resumo do resultado do ensaio marcador com o uso de S07157-1-Q1 e S07157-2-Q1 quando a genotipagem indicou antecedentes genéticas (Rbs3b, Rbs3a e SUS).
[00194] Descobriu-se que os SNPs S16015-001 e S16023-001 estão em estreita proximidade genômica e em alto desequilíbrio de ligação com S07157-1 e S07157-2, e dessa forma poderiam servir como marcadores Rbs3 adicionais que estão estreitamente associados a resistência à BSR. Os ensaios marcadores S16015-001-Q001 e S16023-001-Q002 foram desenvolvidos para consultar esses SNPs. Alelo “C” em S16015 -001 está associado com um alelo Rbs3a, embora o alelo “C” em S16023-001 esteja associado com o alelo Rbs3b.
[00195] Embora S07157-1, S16015-001, S07157-2 e S16023-001 sejam robustos para seleção de Rbs3a e Rbs3b, respectivamente, eles não estão em completo desequilíbrio de ligação com os alelos Rbs3a e Rbs3b. Para assegurar seleção desses alelos em antecedentes genéticos adicionais, foram desenvolvidos ensaios para loci de SNP S01584-1 e S04831-1. Os haplótipos associados com a Rbs3a e Rbs3b, e linhagens suscetíveis são mostrados na Tabela 19. Em certos casos, S01584-1-Q5 e S04831-1-Q2 podem ser usados de forma independente para diferenciar alelos resistentes e suscetíveis em Rbs3a e Rbs3b. TABELA 19 RBS3B E RBS3A E HAPLÓTIPOS SUSCETÍVEIS COM O USO DO PAINEL DE MARCADORES DE BSR
[00196] Resumo de seleções de resistência Parda da Haste e resistência através de marcadores moleculares: • S01584-1 indicará resistência à Podridão Parda da Haste ou resistência de várias fontes selecionando o alelo G. • Seleções de S01584-1 funciona efetivamente em quase todos os casos, exceto onde S16015-001 é o alelo C e S04831-1 é o alelo G. Esse genótipo (S01584-1 = G, S16015-001 = C e S04831-1 = G) produziria um fenótipo suscetível. • Para definir melhor o fenótipo esperado, poderia se executar o S01584-1 e selecionar os com alelo G e, em seguida, ao mesmo tempo ou simultaneamente executar o S04831-1, S16015-001 e S16023-001 para refinar o fenótipo esperado e descarte adicional daqueles com o genótipo suscetível. • As linhagens com o genótipo Rbs3a fornecem um alto nível de resistência. • As linhagens com o genótipo Rbs3a “Oculto” também fornecem um alto nível de resistência. • As linhagens com o genótipo Rbs3b ou com o genótipo Resistente fornecem um nível de moderado a alto de resistência. • Todos os outros genótipos são tipicamente suscetíveis ou moderadamente suscetíveis.
[00197] O DNA genômico foi extraído para testes com o uso de um protocolo CTAB padrão e condições de amplificação exemplares são descritas abaixo na Tabela 20A e B. TABELA 20A CONFIGURAÇÕES DO CICLO: ENSAIO TAQMAN™ TABELA 20B MIX DE AMPLIFICAÇÃO (EM MICROLITROS)
[00198] O haplótipo genético que nos referimos como Rbs3a tem um nível muito alto de resistência à Podridão Parda da Haste. O haplótipo genético que nos referimos como “Rbs3b” tem níveis moderados de resistência à Podridão Parda da Haste. Rbs3b (resistência à Podridão Parda da Haste) e Rcs3 (resistência à Mancha Foliar Olho-De-Rã) estão ligados no acoplamento no Lg J. Nossos mapas moleculares sugerem que esses dois genes são separados por 3 cm.
[00199] Historicamente um marcador BSR foi usado em muitos programas de melhoramento para selecionar resistência à BSR Rbs3b, que também traria o gene Rcs3 ligado. Nós começamos a empregar um marcador para caracterizar diretamente e selecionar Rcs3 (S00005-01). Temos provas através de vários ciclos de melhoramento que a recombinação é rara entre marcadores Rbs3b e Rcs3, nós nunca encontramos uma linhagem para carregar Rbs3b e não ser resistente à Mancha Foliar Olho-De-Rã no campo. As nossas estimativas de recombinação genética baseadas em mapas indicariam que a recombinação pode ocorrer em 3% do tempo. Os dados apresentados abaixo confirmam que a recombinação é rara entre esses dois genes, e provavelmente ocorre em 3% ou menos do tempo.
[00200] Duas populações F3 foram avaliadas com o uso de marcadores MAS, incluindo um marcador para Rbs3a, Rbs3b e Rcs3 (S00005- 01a). As populações foram cruzadas entre um parental que possui Rbs3a (o outro locus de resistência à Podridão Parda da Haste, alélico para Rbs3b) e outro parental que possuía Rbs3b/Rcs3. Isso foi feito por duas razões: 1. Capaz de medir as taxas de recombinação entre marcadores Rbs3b e Rcs3. 2. Adquirir linhagem(s) que tinha(m) Rbs3a e Rcs3 ligados no acoplamento para criar germoplasma com Rbs3a e Rcs3.
[00201] Abaixo estão os resultados do estudo da população F3. 1. população F3 a. 737 plantas F3 perfuradas b. Encontradas 4 plantas que eram homozigotas Rbs3a e Rcs3 c. Encontradas 11 plantas que eram heterozigotas Rbs3a/Rbs3b e homozigotas Rcs3 d. Encontradas 10 plantas que eram homozigotas Rbs3a e heterozigotas Rcs3 2. população F3 a. 1105 plantas F3 perfuradas b. Encontradas 3 plantas que eram homozigotas Rbs3a e Rcs3 c. Encontradas 6 plantas que eram heterozigotas Rbs3a/Rbs3b e homozigotas Rcs3 d. Encontradas 4 plantas que eram homozigotas Rbs3a e heterozigotas Rcs3
[00202] Selecionamos algumas das linhagens de recombinação para testes adicionais. Nós testamos novamente as mesmas com MAS adicionais (8 sementes únicas de cada planta) para ver se elas eram realmente recombinações que eram homozigotas. Temos linhagens de ambas as populações confirmadas em todas as 8 sementes como sendo linhagens homozigotas Rbs3a e Rcs3. Outras linhagens e as parentais foram testadas ao mesmo tempo para comparar e confirmar os genótipos.
[00203] Queríamos confirmar que o gene Rcs3 ainda oferece resistência à FEY (Mancha Foliar Olho-De-Rã) nas linhagens recombinantes. 21 plantas de 3 das plantas recombinantes foram selecionadas. Os escores na Tabela 21 abaixo mostram que as linhagens recombinantes têm alto nível de resistência similares ao parental Rcs3 conhecido. TABELA 21
[00204] Não fomos capazes de confirmar a reação à Podridão Parda da Haste por meio de campo ou observações de laboratório. Não há dados disponíveis.
[00205] Medir os efeitos agronômicos e de produção rendimento de empilhamento de Rcs3 (a resistência a FEY) com o haplótipo BSR Rbs3a. Rcs3 já está comumente ligado no acoplamento com o haplótipo BSR Rbs3b. Nos resultados da triagem de BSR, tipicamente observamos o nível mais robusto e estável de resistência à BSR vindo do haplótipo BSR Rbs3a. Também observamos que Rcs3 é o gene de resistência à FEY mais afetivo identificado até a presente data.
[00206] Nosso haplótipo BSR consiste em dois marcadores separados por 8 cM e o marcador Rcs3 situa-se entre eles, mais próximo a S07157-2. Nós usamos marcadores moleculares para selecionar linhagens recombinantes nessa região e desenvolver um conjunto de isolinhagens para validação adicional do valor comercial desses recombinantes. DESENVOLVIMENTO DE MATERIAL E ANTECEDENTE PARA RECOMBINANTE ÚNICO 1. (Rbs3b + Rcs3) foi cruzada com (Rbs3a), a população foi autofecundada até F3, no momento em que nós selecionamos uma planta recombinante da população que tinha o marcador S07157-1 do haplótipo Rbs3a e empilhadas no acoplamento. 2. (S07157-1 RES + Rcs3) foi cruzada com (Rbs3b + Rcs3) e a população foi autofecundada até a geração F3, no momento em que nós usamos marcadores para selecionar plantas heterozigotas nessa região no J. 3. Cinco linhagens R1 foram selecionadas, que eram agronomicamente aceitáveis e de alta produção (não necessariamente melhor do que as de verificação, mas melhores que as irmãs). 4. Através de dados de marcador de duas plantas heterogêneas (segregantes na região BSR, todas as plantas fixadas para Rcs3) nós derivamos cada uma dessas linhagens F3:F5 R1. Essas plantas F3:F5:F6 resselecionadas avançaram para o campo. 5. 92 plantas F3:F5:F7 tiveram as folhas perfuradas de cada uma das 10 entradas (F3:F5:F6) para genotipagem. • 4 plantas heterozigotas foram selecionadas a partir de cada entrada. • 17 plantas homozigotas Rbs3b+Rcs e 23 Rbs3a + Rcs3 (recombinantes únicos) foram selecionadas a partir de cada população para testes de avaliação de produção e características agronômicas. EXPERIMENTOS COM RECOMBINANTES ÚNICOS 1. Desenvolvimento de Isolinhagens para Estudos. a. Sementes de 1 planta heterozigota F3:F5:F7 de cada uma das 10 entradas foram plantadas. b. Amostras de 36 plantas de cada linha durante o verão foram selecionadas. Em seguida, 4 ou 5 plantas dentro de cada linha que eram homozigotas Rbs3b+Rcs3 ou homozigotas Rbs3a + Rcs3 (meio recombinantes) foram selecionadas. c. Descobriu-se que 3 linhas atenderam os critérios acima e 6 plantas homozigotas (3 com recombinação e 3 sem) de uma das linhas e 8 plantas homozigotas (4 com recombinação e 4 sem) de ambas as outras duas linhas foram selecionadas. Isso deve fornecer linhagens isogênicas altamente endogâmicas para comparar a recombinação às isolinhagens tipo não recombinantes. d. Essas 22 plantas foram enviadas para (F3, F5, F8 NIL’s) para aumento de semente e, em seguida, colocados em estudos quanto à avaliação de produção, maturidade e doença. O estudo será plantado em 7 localizações com 2 repetições por localização. DESENVOLVIMENTO DE MATERIAL E ANTECEDENTE PARA DUPLOS RECOMBINANTES 1. Três linhagens R1 que são homozigotas para eventos de recombinação única foram selecionados para estudos de características agronômicas e alta produção. 2. Essas 3 linhagens foram cruzadas com linhagens que carregam Rbs3a. Ao fazer esses cruzamentos, recombinação adicional pode ser selecionada para obter o haplótipo para BSR em ambos os lados do locus Rcs3 para que seja similar ao haplótipo BSR Rbs3a original. A intenção é encontrar plantas com alelo resistente para o haplótipo Rbs3a, em ambos, marcador S04831-1- e os marcadores S07157-1 e manter o alelo resistente para Rcs3 em S00005-01 e S14236-1.
[00207] Trabalho de empilhamento Rbs3a + Rcs3: • Entradas de recombinantes únicos foram cruzadas com uma variedade que carrega o haplótipo Rbs3 (S16015 e o marcador de flanqueamento S04831). A população foi autofecundada para a geração F3. • Os marcadores foram aplicados a 2208 indivíduos e as plantas recombinantes que criam o haplótipo Rbs3a, mas com o requerimento de marcador resistente no meio. Nossa hipótese era de que essas plantas teriam alto nível de resistência à BSR como Rbs3a e alto nível de resistência à FEY como Rcs3. • Os dados genotípicos para os duplos recombinantes foram obtidos. O número de recombinantes que encontramos em cada população está resumido abaixo na Tabela 22. • Dois pontos de recombinação diferentes podem ser identificados nessas populações. Um envolve uma recombinação entre S04831-1 e S00134-1. O outro evento de recombinação envolve uma recombinação entre S00134-1 e S014236-1. TABELA 22 # plantas que são resistentes homozigotas são ambas Rcs3 (S14236-1) e no S04831-1 • plantas que são resistentes homozigotas para Rcs3 (S14236-1) e são homozigotas para S04831-1
[00208] Uma população F3:5 de variedade 1 x variedade 2 e uma população F3:5 de variedade 1 x variedade 3 segregantes para resposta à podridão parda da haste foi usada para avaliação de marcador Rbs#. A variedade 1 de linhagem parental carrega os alelos suscetíveis Rbs#, variedade 2 e variedade 3 são suscetíveis à Podridão Parda da Haste. Essas populações confirmaram a associação de S04857-1 no LG J (16) com resistência à BSR, em que a progênie que tem o alelo favorável tem um escore médio de resistência de cerca de 5 pontos a mais do que a progênie suscetível na população. TABELA 23
Claims (2)
1. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UMA PLANTA DE SOJA OU UM GERMOPLASMA DE SOJA QUE EXIBE RESISTÊNCIA APRIMORADA À MANCHA FOLIAR OLHO-DE-RÃ caracterizado pelo método compreender: (a) detectar, no genoma de uma planta de soja ou no genoma do dito germoplasma de soja, pelo menos um locus marcador que está associado à resistência aprimorada à mancha foliar Olho-De-Rã, em que o pelo menos um locus marcador que está associado à resistência aprimorada à mancha foliar Olho-De-Rã compreende S14236-1, em que o locus marcador S14236-1 compreende um alelo G em Gm16:33368242 e em que o locus genômico compreendendo S14236-1 consiste na SEQ ID NO: 17, e (b) identificar a planta de soja ou germoplasma de soja que tem o locus marcador que está associado à resistência aprimorada à Mancha Foliar Olho-De-Rã, em que a planta de soja ou germoplasma de soja compreende o referido alelo G em Gm16:33368242.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende adicionalmente detectar pelo menos um locus marcador adicional que está associado à resistência aprimorada à mancha foliar Olho-De-Rã selecionado do grupo que consiste no locus marcador S00005-01 e S06363-1, em que o locus marcador S00005-01 compreende um alelo T em Gm16:33387556 ou um alelo C em Gm16:33387560 e o locus genômico compreendendo S00005-01 consiste na SEQ ID NO: 13 e em que o locus marcador S06363-1 compreende um alelo C em Gm16:33328806 e o locus genômico compreendendo S06363-1 consiste na SEQ ID NO: 15.
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