KR101763465B1

KR101763465B1 - 콩 자외선(uv-b) 저항성 유전자 연관 표지인자

Info

Publication number: KR101763465B1
Application number: KR1020150064823A
Authority: KR
Inventors: 강성택; 이주석; 김경륜; 김성민
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2015-05-08
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2017-08-03
Also published as: KR20160132289A

Abstract

본 발명은 자외선(280~320 nm) 조사에 대해 저항성을 나타내는 콩 유래 자외선 저항성 형질 마커에 관한 것으로, 자외선 조사에 대해 저항성에 관여하는 게놈 상의 핵산 분자의 위치를 특정하는 표지인자를 제공할 수 있다. 아울러, 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 자외선 저항성 선별용 키트 및 자외선 저항성 콩 선별 방법을 제공할 수 있다.

Description

콩 자외선(UV-B) 저항성 유전자 연관 표지인자{Soybean Ultarviolet(UV-B) Resistance Gene related Marker}

본 발명은 자외선(280~320 nm) 조사에 대해 저항성을 나타내는 콩 유래 자외선 저항성 형질에 관여하는 게놈 상의 핵산 분자의 위치를 특정하는 표지인자의 개발에 관한 것이다. 구체적으로 콩 유래 자외선 저항성 형질에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 게놈상의 위치를 제공하고 그 위치에 연관된 분자표지인자를 개발, 이를 이용하여 자외선에 저항성을 가지는 콩 품종개발에 이용하는 방법의 기술에 관한 것이다.

태양 자외선(Ultraviolet)은 일반적으로 UV-C(≤280 nm), UV-B (280-320 nm), UV-A (320-400 nm) 세 가지로 구분되는 비전리 에너지의 한 형태이다. UV-C는 높은 에너지를 갖고 있어 생물 시스템에 매우 해롭지만 오존층에 모두 흡수되어 위험성이 낮고 UV-B는 일부 오존층에 흡수되지만 일부는 지표면에 도달하며 비교적 높은 에너지를 갖고 있어 대부분의 피해를 유발하고, UV-A는 에너지가 적어 위험성이 가장 적다. 성층권의 오존층은 모든 UV-C와 97.99%의 UV-B 조사를 차단하지만(Caldwell et al. 1989) 오존층의 파괴로 지구 표면에 도달하는 UV-B조사가 증가하고 있는 실정이다(Blumthaler and Ambach 1990).

화학기후모델 시나리오는 21세기 중반 지상에서 UV-B 조사로 인해 온실 가스 및 할로겐이 높은 농도로 증가할 것으로 보고 있다(Taalas et al. 2000). 높은 수준의 UV-B조사는 식물의 잎 면적과 식물의 성장(Reed et al. 1992; Teramura and Caldwell 1981), 엽록소 함량(Zuk-Golaszewska et al. 2003; Choudhary and Agrawal 2014a), 바이오매스(biomass)와 생산량(Choudhary and Agrawal 2014b; Yuan et al. 2000), 광합성(Li et al. 2013), DNA(D'Surney et al. 1993) 등에 악영향을 끼치며 완두콩, 녹두에서는 뿌리혹의 질소 고정을 억제하는 것으로 알려져 있다.

한편, 콩은 UV-B에 매우 민감한 작물이다. 콩 품종 Essex는 UV-B의 조사(오존층 16-25% 파괴시 선량) 로 인하여 20%의 수율 감소를 보였고 각 품종 별로 경장, 건물중, 엽수, 바이오매스 등의 감소를 확인할 수 있었다(Teramura 등 1990). 이 전 연구에서 콩 품종 간 UV-B조사에 대한 민감도의 유전적 차이도 보고되었다. UV-B조사에 대하여 식물체 무게(-44 to +21 %), 잎면적 (-87 to +186 %), 건물중(-46 to +64 %), 수량성(-41 to +46 %), 엽록소 함량(-42 to 8%), flavonoid 함량(-30 to 50 %) 등이 유전자형에 따라 다양한 변화를 보였다(Kakani et al. 2003, in review; Yanqun et al. 2003). 따라서, UV-B 조사량이 증가하는 환경으로 인한 생산성 저하를 극복하기 위해 UV-B에 대한 저항성을 가지는 콩 품종을 개발하는 것이 시급하다.

몇몇 작물의 경우, UV-저항성을 가지는 유전형을 확인하였다. 예로써, 벼(Oryza sativa L.) (Teranishi et al. 2004), 밀(Triticum aestivum L.) (Yuan et al. 2000), 옥수수(Zea mays L.) (Correia et al. 1998), 콩(Glycine max L.) (Baroniya et al. 2011)이 있다.

콩에서는 품종별 UV-B조사를 통해 반응 차이를 확인하거나 경장, 건물중, 엽 수 감소, 바이오매스 감소 등에 관련된 연구가 진행되었다. 예를 들어, UV-B 저항성 콩의 경우, UV-B에 민감한 콩보다 더 많은 플라보놀(flavonol)을 포함하였고 플라보노이드가 감소된 콩이 UV-B에 반응하였을 때 보통의 콩보다 더 많은 산화성 스트레스가 일어남을 확인하였다(Teramura 등 1990: Kim et al.,; Li et al., 1998). 많은 연구자들이 UV-B조사에 대한 품종의 차이를 확인하기 위해 노력하고 있지만 UV-B 저항성 QTL(quantitative trait loci) 또는 유전자의 확인은 진행되지 않았다.

상기와 같은 배경하에, 본 발명자는 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 추적하기 위하여 노력한 결과, Recombinant Inbred Lines(RILs)를 이용하여 자외선 저항성 형질과 연관된 QTL을 탐색하여, 기존에 알려져 있지 않은 콩의 7번째 염색체에 존재하는 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 발견하여 본 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 콩의 7번 염색체의 226,695번째 염기 내지 297,755번째 염기 범위에 존재하는 염기다형성 마커를 포함하는 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 단일 염기다형성 마커의 다형성 부위를 확인하는 단계를 포함하는 자외선 저항성 콩 선별 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 콩의 7번 염색체의 226,695번째 염기 내지 297,755번째 염기 범위에 존재하는 염기다형성 마커를 포함하는, 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 제공한다.

본 발명에서 용어, "다형성(polymorphism)"이란 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 말하며, 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 특히 10% 또는 20% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가질 수 있다. 본 발명에서, 다형성 마커는 마이크로새틀라이트, 단일 염기다형성 또는 다른 종류의 다형성 마커일 수 있으며, 특히 본 발명에서는 상기 염기다형성 마커는 단일 염기다형성마커인 것인 콩의 자외선 저항성 형질 마커일 수 있다. 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다.

상기 대립유전자(allele)는 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 말한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자 (biallele)를 갖는다.

본 발명에서 용어 "자외선"은 UV-A, UV-B 또는 UV-C일 수 있으며, 특히 UV-B일 수 있다. 본 발명에서 UV-B는 중파장 자외선을 말하며, 통상적으로 280~320 nm의 파장 범위이다.

본 발명의 일 실시예에서 UV-B를 단독 처리하기 위해서 UV-B 처리구에 0.1 mm 두께의 cellulose diacetate 필름(Cadillac Plastics Co., Baltimore, MD, USA)을 설치하여 290 nm 이하의 자외선을 제거하였다. 상기 자외선 처리 시간은 3~5 시간 일 수 있다. 바람직하게는 식물체 파종 후 첫 복엽이 완전히 전개하는 V2 단계부터 1일 4시간씩 2주간 조사하였다. 상기 자외선 강도는 1~2.5 W/m²일 수 있으나, 바람직하게는 1.5~2 W/m²일 수 있다.

본 발명에서 용어 "자외선 저항성"은 콩에 UV-B를 조사하였을 때, 치사효과, 돌연변이 유발효과 등이 쉽게 일어나지 않는 내성을 말한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, UV 저항성의 유전양상을 검정하기 위해서 익산 10호 x 대풍, 신팔달 x 익산 10호의 조합으로 교배하여 F2 집단을 육성하였으며, 식물체에 UV-B를 조사하여 식물체의 엽의 색상변화정도, 엽의 형태적 변화정도, 엽맥의 색상변화정도 및 전체 식물체의 생육 및 형태적 변화 정도를 등급을 나누어 측정하였다

본 발명에서 용어, "자외선 저항성 형질 마커"는 콩의 7번 염색체의 222,695번째 염기 내지 297,755번째 염기 범위에 존재하는 단일 염기다형성 마커일 수 있으며, 특히 222,695번째 염기, 223,377번째 염기, 224,883번째 염기, 229,340번째 염기, 255,042번째 염기, 297,755번째 염기 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 염기다형성 마커일 수 있다. 구체적으로 콩의 7번 염색체의 222,695번째 염기가 C 또는 A인 단일 염기다형성 마커, 223,377번째 염기가 T 또는 C인 단일 염기다형성 마커, 224,883번째 염기가 A 또는 G인 단일 염기다형성 마커, 229,340번째 염기가 A 또는 G인 단일 염기다형성 마커, 255,042번째 염기가 A 또는 C인 단일 염기다형성 마커, 297,755번째 염기가 G 또는 A인 단일 염기다형성 마커 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 염기다형성 마커일 수 있다. 더 구체적으로, 콩의 7번 염색체의 222,695번째 염기가 A, 223,377번째 염기가 C, 224,883번째 염기가 G, 229,340번째 염기가 G, 255,042번째 염기가 C, 297,755번째 염기가 A인 인 경우, 저항성을 나타내는 마커로 판단할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 자외선 저항성 형질 선별용 마커 조성물은, 콩의 7번 염색체의 222,695번째 염기를 50번째 염기로 포함하는 99개의 염기서열 (서열번호 13) 에서 50번째 염기를 단일 염기다형성 마커로 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 콩의 7번 염색체의 223,377번째 염기를 50번째 염기로 포함하는 99개의 염기서열 (서열번호 14) 에서 50번째 염기를 단일 염기다형성 마커로 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 콩의 7번 염색체의 224,883번째 염기를 50번째 염기로 포함하는 99개의 염기서열 (서열번호 15) 에서 50번째 염기를 단일 염기다형성 마커로 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 콩의 7번 염색체의 229,340번째 염기를 50번째 염기로 포함하는 99개의 염기서열 (서열번호 16) 에서 50번째 염기를 단일 염기다형성 마커로 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 콩의 7번 염색체의 255,042번째 염기를 50번째 염기로 포함하는 99개의 염기서열 (서열번호 17) 에서 50번째 염기를 단일 염기다형성 마커로 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으며, 콩의 7번 염색체의 297,755번째 염기를 50번째 염기로 포함하는 99개의 염기서열 (서열번호 18) 에서 50번째 염기를 단일 염기다형성 마커로 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, RIL 집단에서 조사된 표현형과 유전형 분석 결과를 이용하여 Inclusive Composite Interval mapping을 통해 7번 염색체의 226,695 bp와 297,755 bp 지역의 근접 마커 사이 영역이 자외선에 의한 콩의 엽의 색상, 엽모양 및 전체 식물체 피해 정도에 연관된 높은 LOD 값을 가지는 것을 알 수 있었다.

본 발명에서 용어 “Inclusive composite interval mapping”은 양친교배를 통해 얻은 개체군에 대한 양적형질 유전자좌 지도 작성을 위한 접근법을 의미한다.

본 발명에서 용어 “양적형질 유전자좌”는 유전적으로 분명한 RIL 집단에서 양적으로 다양한 표현형을 나타내는 유전자 지도상의 위치를 의미하는 것으로, 분자 표지인자를 이용하고 측정이 가능한 형질에 관여하는 염색체의 특정부분을 확인함으로써 특정 환경에서 수량성, 과실 무게, 출수기 등 주요 형질에 관여하는 유전자의 수 및 염색체의 위치, 개개 유전자의 영향력 상위작용, 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 유전적인 배경과의 상호작용 등 주요 농업형질의 유전적 배경에 대한 전반적이고 직접적인 정보를 얻을 수 있다.

본 발명에서 용어, “RIL(Recombinant Inbred line)”이란 양적형질 유전자좌에 대한 지도를 제작하기 위해 사용되는 식물의 집단으로써, 부모의 식물은 동종교배를 통해 동질성을 가지는 재조합체를 만들고 상기의 재조합체는 형질 지도 제작 및 분석을 위한 자료로 사용된다.

본 발명에서 용어, “유전자 지도”는 유전자 연관지도라 하며, 유전자의 상대적인 위치를 나타내는 유전지도로써, DNA 마커들(유전자와 다른 식별 가능한 DNA 서열/SNP, SSR)의 유전적 성질 패턴에 따라 그들의 상대적인 염색체 위치를 나타낸다. 지도에서 마커간 거리는 그들이 얼마나 자주 함께 유전되는지에 대한 빈도를 나타낸다. 유전적 연관 지도는 가계 트리 내에서 두 개의 마커가 얼마나 빈번하게 같이 유전되는지를 관찰함으로써 구축된다. 상기 연관지도는 임의로 육성된 어떤 실험집단에서 양친 사이에 다형성을 보이는 표지를 상호간의 재조합 값(recombination value)을 거리로 환산하고 이들의 순서를 정하여 표지간의 연관군(Linkage group)을 만드는 맵핑 작업을 통해 완성된다(Jones et al., 1997).

본 발명에서 용어 “LOD”는 특정 표현형질과 대립형질 간의 관련 정도를 나타내는 지표이며 로그 수치로 표현될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는, 자외선 저항성 콩 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "콩의 자외선 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브"는 상기와 같은 유전자의 다형성 부위와 특이적으로 혼성화 반응을 통해 확인하여 콩의 자외선 저항성 형질을 진단할 수 있는 조성물을 의미하며, 이와 같은 유전자 분석의 구체적 방법은 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 유전자 검출 방법에 의하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 프로브는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 핵산 서열이거나 상기 서열과 혼성화하는 서열인 것인 자외선 저항성 콩 선별용 조성물일 수 있다.

본 발명의 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는, 자외선 저항성 콩 선별용 조성물을 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, SNP 칩 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 자외선 저항성 콩 선별용 마커인 SNP 다형성 마커를 증폭을 통해 확인하거나, SNP 다형성 마커의 발현 수준을 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 콩의 자외선 저항성 형질을 진단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 자외선 저항성 콩 선별용 마커의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 자외선 저항성 콩 선별용 마커의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 콩으로부터 DNA를 수득하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계로부터 수득한 DNA로부터 제1항의 염기다형성 마커의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 자외선 저항성 콩 선별 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 (b) 단계의 염기 다형성 마커는 단일 염기다형성 마커인 것인 자외선 콩 선별 방법일 일 수 있다. 상기 단일 염기다형성 마커는 콩의 7번 염색체의 226,695번째 염기 내지 297,755번째 염기 범위에 존재하는 단일 염기다형성마커인 자외선 저항성 콩 선별 방법일 수 있으며 특히, 222,695번째 염기, 223,377번째 염기, 224,883번째 염기, 229,340번째 염기, 255,042번째 염기, 297,755번째 염기 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단일 염기다형성 마커인 자외선 저항성 콩 선별 방법일 수 있다. 구체적으로, 콩의 7번 염색체의 222,695번째 염기가 C 또는 A 인 염기다형성 마커, 223,377번째 염기가 T 또는 C인 단일 염기다형성 마커, 224,883번째 염기가 A 또는 G인 단일 염기다형성 마커, 229,340번째 염기가 A 또는 G인 단일 염기다형성 마커, 255,042번째 염기가 A 또는 C인 단일 염기다형성 마커, 297,755번째 염기가 G 또는 A인 단일 염기다형성 마커 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 자외선 저항성 콩 선별 방법일 수 있다. 더 구체적으로, 콩의 7번 염색체의 222,695번째 염기가 A, 223,377번째 염기가 C, 224,883번째 염기가 G, 229,340번째 염기가 G, 255,042번째 염기가 C, 297,755번째 염기가 A인 경우에는 자외선 저항성 콩으로 판단하는 것인 자외선 저항성 콩 선별방법일 수 있다.

상기 (a) 단계의 게놈 DNA 수득 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 특히 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)로 핵산과 결합하여 복합체 형성을 통해서 Genomic DNA를 추출하는 방법을 사용할 수 있다.

상기 (b) 단계의 (a) 단계에서 수득한 DNA로부터 상기 단일 염기다형성 마커의 다형성 부위를 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다.

상기 방법 중 (c)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 SNP 칩은 수십만개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기에서, 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일 염기다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

본 발명은 자외선(280~320 nm) 조사에 대해 저항성을 나타내는 콩 유래 자외선 저항성 형질 마커에 관한 것으로, 자외선 조사에 대해 저항성에 관여하는 게놈 상의 핵산 분자의 위치를 특정하는 표지인자를 제공할 수 있다.아울러, 콩의 자외선 저항성 형질 마커를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 자외선 저항성 선별용 키트 및 자외선 저항성 콩 선별 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 UV-B 조사에 따른 식물체 피해등급을 나타낸 것이다.
도 2는 콩의 7번 염색체에서 UV-B연관 QTL의 위치를 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유전분석집단 제작

콩 자외선 저항성의 유전양상을 검정하기 위한 유전 분석집단으로, 익산 10호x대풍, 신팔달x익산 10호를 교배조합하여 F2 집단을 육성하였다.

유전자 지도작성을 위해 큰올콩과 익산 10호의 교배(큰올콩x익산 10호)를 제작된 F_8:12(recombinant inbred line) 116 계통을 이용하였다.

실시예 2. 자외선 검정장치 제작 및 자외선 저항성 검정

UV-B는 각 처리구당 8개의 자외선(UV-B)램프(G40T10E UV-B lamps, Sankyo Denki, Japan)로 구성된 인공조사장치를 제작하여 사용하였다. 자외선(UV-B)램프는 UV-B (280 ~320 nm) 영역뿐만 아니라 UV-C (≤280 nm) 영역의 광도를 포함하고 있기 때문에 UV-B 처리구에는 0.1 mm 두께의 cellulose diacetate 필름(Cadillac Plastics Co., Baltimore, MD, USA)을 램프에 설치하여 290 nm 이하의 자외선(UV-C)을 제거하였다.

검정용 재료가 2본엽 전개되기 전에 UV-B 저항성 검정용 장치로 이동하였다.

식물체는 파종 후 첫 복엽이 완전히 전개하는 V2 단계(stage)부터 1일 4시간(10시~14시)씩 2주간 UV-B 조사 실험을 수행하였고 자외선(UV-B)램프와 식물체간격은 식물 생장에 맞추어 20 cm를 유지시켜 UV-B의 강도를 일정하게 유지하였다.

UV-B의 강도는 1.5 ~ 2 W/m²이며, LP 471 UVB, LP 471 UVC sensor가 장착된 UV-radiometer(DO 9847, Delta OHM)로 측정하였다.

실시예 3. 식물체 반응조사

식물체 반응조사는 UV-B 처리 2주 후에 각각 실시하였으며, 주요 조사형질은 엽의 색상변화정도, 엽의 형태적 변화정도, 엽맥의 색상변화정도 및 전체 식물체의 생육 및 형태적 변화 정도를 등급을 나누어 측정하였다.

실험예 1. 자외선 저항성 유전양상규명

식물체의 엽의 모양변화 및 엽의 색상변화를 조사형질로 하여, 자외선 저항성의 유전양상을 조사한 결과, 단인자 열성 유전함을 확인하였다(표 1, 표 2)

형질	UV-B 반응성		기대비율	x² 값	P
형질	저항성	감수성	기대비율	x² 값	P
엽의 색깔 변화	38	116	1:3	0.009	0.9259
엽의 모양 변화	35	119	1:3	0.424	0.5148

형질	UV-B 반응성		기대비율	x² 값	P
형질	저항성	감수성	기대비율	x² 값	P
엽의 색깔 변화	28	72	1:3	0.480	0.4884
엽의 모양 변화	29	71	1:3	0.853	0.3556

실험예 2. 초고밀도 유전자지도에 의한 콩 자외선 저항성 유전자 근접 분자마커 탐색

UV-B 저항성에 대한 콩의 초고밀도 유전자지도를 제작하기 위하여 일반적인 CTAB방법을 사용하여 추출한 RIL 집단의 Genomic DNA하였고, 상기 Genomic DNA를 180K SNP soybean chip(Axiom® Soybean Genotyping Array, affymetrix)을 활용하여 genotyping을 실시한 후 초고밀도 유전자지도를 작성하였다.

초고밀도 유전자지도에는 모부본 다형성을 보인 23,500여개 마커중 6,600여개의 마커를 활용하여 유전자지도를 작성하여 총 거리 5,000 cM, 염색체당 평균 251개 SNP로 구성되고 마커 간 평균 0.76 cM인 고밀도 유전자지도를 작성하였다(표 3).

염색체	연관 그룹	길이(cM)^§	시험한 총 SNP 마커 수	다형성을 가지는 SNP 마커 수	지도에 그려진 SNP 마커 수	SNP간의 평균거리 (cM)
1	D1a	201	8379	1070	379	0.5
2	D1b	318	9514	1203	456	0.7
3	N	247	7673	959	399	0.6
4	C1	275	8399	1676	542	0.5
5	A1	252	7577	1081	398	0.6
6	C2	273	9392	1299	513	0.5
7	M	276	8126	940	390	0.7
8	A2	295	10475	1738	534	0.6
9	K	221	8621	1639	467	0.5
10	O	235	8820	1416	471	0.5
11	B1	245	7481	1171	390	0.6
12	H	171	7222	887	304	0.6
13	F	305	10338	1500	486	0.8
14	B2	186	7195	1496	481	0.4
15	E	370	9423	1651	498	0.8
16	J	235	6980	1210	415	0.6
17	D2	261	8347	1316	432	0.6
18	G	250	9103	1560	616	0.4
19	L	155	8166	1335	374	0.4
20	I	278	7797	907	422	0.7
평 균		253	8451	1303	448	0.6
총 계		5050	169028	26054	8967	12.2

§센티모건에서 염색체 길이

실험예 3. 콩에서 자외선( UV -B) 저항성 연관 QTL( Quantitative trait loci , QTL) 분석

UV-B 저항성 및 감수성 계통으로 만들어진 RIL 120여 계통에 180K SNP chip 및 UV-B 반응 검정결과를 이용하여 Inclusive composite Interval mapping으로 연관 QTL을 분석한 결과, 7번 염색체에서 엽의 색상, 엽모양 및 전체 식물체 피해 정도 모두에 연관된 높은 LOD 값을 가진 major QTL의 존재가 확인되었다(표 4, 도 2).

형질	염색체수	위치 (cM)	마커 (좌)	마커 (우)	LOD^a	PVE(%)^b	Add^c	물리적 거리 (kbp)	유전적 거리 (cM)
엽의 색 변화	3 7	226 52	AX-9037471 AX-9042450	AX-9045074 AX-9045776	3.12 24.87	4.47 57.58	- 0.51 - 1.90	249 75	0.94 0.89
엽의 모양 변화	7	52	AX-9042450	AX-9045776	26.95	58.02	- 1.89	75	0.89
총 식물의 변화	3 7	224 52	AX-9037001 AX-9042450	AX-9037471 AX-9045776	3.49 27.42	4.31 58.67	- 0.49 - 1.89	131 75	1.85 0.89

^aLog of odds, ^bPhenotypic variance explained, ^cAdditive effect

확인된 근접 마커는 AX-90424508과 AX-90457760로써, 각각 7번 염색체의 226,695bp와 297,755bp 지역에 존재하고, major QTL은 이 두 개의 근접 마커 사이에 존재하는 것으로 분석되었다. 자세한 정보는 다음과 같다(표 5).

SNP 프로브세트 ID	염색체 (soybean reference genome;william82)	물리적 위치 (soybean reference genome;william82)	프로브 서열 (5'-> 3')	큰올 (감수성)	익산 10 (저항성)
AX-90424508	Chr07	222695	A[A/C]ATTCATGTTAAAAGTGGAGGCCTACAAAGTTATAA (서열번호 1 및 2)	CC	AA
AX-90317546	Chr07	223377	AATTAGGTCCTACAGGAACTGCTCCAGAAGACATA[C/T]C (서열번호 3 및 4)	TT	CC
AX-90428072	Chr07	224883	A[G/A]AGCACTACATCTGGATGGAGGTGACTTGCCTAAGC (서열번호 5 및 6)	AA	GG
AX-90504064	Chr07	229340	T[G/A]TTGACCACCCTAACGTTCTCAAATCACTCTGCTCC (서열번호 7 및 8)	AA	GG
AX-90369410	Chr07	255042	GATCTCCAGAGGAACGTATACATTTGTCCTGCCTA[C/A]A (서열번호 9 및 10)	AA	CC
AX-90457760	Chr07	297755	C[A/G]AAAGCAGTGCTAAGAAGGCCTCCATCAAGGCGAGC (서열번호 11 및 12)	GG	AA

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Soybean Ultarviolet(UV-B) Resistance Gene related Marker <130> KPA150242-KR <140> 10-2015-0064823 <141> 2015-05-08 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90424508_Resistant <400> 1 aaattcatgt taaaagtgga ggcctacaaa gttataa 37 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-9042508-Sensitive <400> 2 acattcatgt taaaagtgga ggcctacaaa gttataa 37 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90317546_Resistant <400> 3 aattaggtcc tacaggaact gctccagaag acatacc 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90317546_Sensitive <400> 4 aattaggtcc tacaggaact gctccagaag acatatc 37 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90428072_Resistant <400> 5 agagcactac atctggatgg aggtgacttg cctaagc 37 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90428072_Sensitive <400> 6 aaagcactac atctggatgg aggtgacttg cctaagc 37 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90504064_Resistant <400> 7 tgttgaccac cctaacgttc tcaaatcact ctgctcc 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90504064_Sensitive <400> 8 tattgaccac cctaacgttc tcaaatcact ctgctcc 37 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90369410_Resistant <400> 9 gatctccaga ggaacgtata catttgtcct gcctaca 37 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90369410_Sensitive <400> 10 gatctccaga ggaacgtata catttgtcct gcctaaa 37 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90457760_Resistant <400> 11 caaaagcagt gctaagaagg cctccatcaa ggcgagc 37 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX_90457760_Sensitive <400> 12 cgaaagcagt gctaagaagg cctccatcaa ggcgagc 37 <210> 13 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90424508 <400> 13 ttaaagaatg acaacatttt tattcatgta aaaatgtagt acatgggtam attcatgtta 60 aaagtggagg cctacaaagt tataaatcca aaaattgta 99 <210> 14 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90317546 <400> 14 atttaaggga gatgaattag gtcctacagg aactgctcca gaagacatay cagctgtttg 60 aggaactggc acagcaactt cggctgcttc agggattcc 99 <210> 15 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90428072 <400> 15 atctctgtat ctaaaaatta tacaaataaa atttcactat caacaagtar agcactacat 60 ctggatggag gtgacttgcc taagcaattg tttggcaag 99 <210> 16 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90504064 <400> 16 gcaatgctgg cagaacaacg tttctcgtga ggcccagaca atgttccttr ttgaccaccc 60 taacgttctc aaatcactct gctccttcgt cagcgagca 99 <210> 17 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90369410 <400> 17 gacaagttcg aatcgatctc cagaggaacg tatacatttg tcctgcctam atatatctca 60 atgtctaact tatccaaaaa ttacatcatc atcaccact 99 <210> 18 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AX-90457760 <400> 18 gcatggagtt tgctatgaga agcctctgga actcaagttc tagtttgtcr aaagcagtgc 60 taagaaggcc tccatcaagg cgagcacttt cctccttga 99

Claims

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콩의 7번 염색체에 존재하는 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콩의 자외선 저항성 형질 선별용 마커 조성물로서,
상기 콩의 7번 염색체에 존재하는 단일 염기다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 13 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 염기서열 중, 50번째 염기를 SNP로서 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 것으로서,
(i) 상기 서열번호 13의 50번째 염기는 C 또는 A이고,
(ii) 상기 서열번호 14의 50번째 염기는 T 또는 C이고,
(iii) 상기 서열번호 15의 50번째 염기는 A 또는 G이고,
(iv) 상기 서열번호 16의 50번째 염기는 A 또는 G이고,
(v) 상기 서열번호 17의 50번째 염기는 A 또는 C이고,
(vi) 상기 서열번호 18의 50번째 염기는 G 또는 A인,
콩의 자외선 저항성 형질 선별용 마커 조성물.
제4항에 있어서,
(i) 상기 서열번호 13의 50번째 염기가 A,
(ii) 상기 서열번호 14의 50번째 염기가 C,
(iii) 상기 서열번호 15의 50번째 염기가 G,
(iv) 상기 서열번호 16의 50번째 염기가 G,
(v) 상기 서열번호 17의 50번째 염기가 C, 또는
(vi) 상기 서열번호 18의 50번째 염기가 A인 경우 저항성을 나타내는,
콩의 자외선 저항성 형질 선별용 마커 조성물.
제4항에 있어서, 상기 자외선은 UV-B인, 콩의 자외선 저항성 형질 선별용 마커 조성물.
콩의 7번 염색체에 존재하는 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브를 포함하는, 자외선 저항성 콩 선별용 조성물로서,
상기 콩의 7번 염색체에 존재하는 단일 염기다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 13 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 염기서열 중, 50번째 염기를 SNP로서 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 것으로서,
(i) 상기 서열번호 13의 50번째 염기는 C 또는 A이고,
(ii) 상기 서열번호 14의 50번째 염기는 T 또는 C이고,
(iii) 상기 서열번호 15의 50번째 염기는 A 또는 G이고,
(iv) 상기 서열번호 16의 50번째 염기는 A 또는 G이고,
(v) 상기 서열번호 17의 50번째 염기는 A 또는 C이고,
(vi) 상기 서열번호 18의 50번째 염기는 G 또는 A인,
자외선 저항성 콩 선별용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 핵산 서열이거나 상기 서열과 혼성화하는 서열인 것인, 자외선 저항성 콩 선별용 조성물.
제7항의 조성물을 포함하는 자외선 저항성 콩 선별용 키트.
제9항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCT 키트, DNA 칩 키트, SNP 칩 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트인, 자외선 저항성 콩 선별용 키트.
(a) 콩으로부터 DNA를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계로부터 수득한 DNA로부터 콩의 7번 염색체에 존재하는 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있는 프로브와 혼성화하는 단계로,
상기 콩의 7번 염색체에 존재하는 단일 염기다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 13 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택된 1 이상의 염기서열 중, 50번째 염기를 SNP로서 포함하면서 5 내지 50개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드인 것으로서,
(i) 상기 서열번호 13의 50번째 염기는 C 또는 A이고,
(ii) 상기 서열번호 14의 50번째 염기는 T 또는 C이고,
(iii) 상기 서열번호 15의 50번째 염기는 A 또는 G이고,
(iv) 상기 서열번호 16의 50번째 염기는 A 또는 G이고,
(v) 상기 서열번호 17의 50번째 염기는 A 또는 C이고,
(vi) 상기 서열번호 18의 50번째 염기는 G 또는 A인 것인 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 혼성화된 다형성 부위의 염기를 확인하는 단계를 포함하는, 자외선 저항성 콩 선별 방법.
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삭제
제11항에 있어서,
(i) 상기 서열번호 13의 50번째 염기가 A,
(ii) 상기 서열번호 14의 50번째 염기가 C,
(iii) 상기 서열번호 15의 50번째 염기가 G,
(iv) 상기 서열번호 16의 50번째 염기가 G,
(v) 상기 서열번호 17의 50번째 염기가 C, 또는
(vi) 상기 서열번호 18의 50번째 염기가 A인 경우 저항성 콩으로 판단하는 것인, 자외선 저항성 콩 선별 방법.