JP4775945B2 - Pb1遺伝子と連鎖する分子マーカーを指標にイネの穂いもち抵抗性を識別する方法 - Google Patents
Pb1遺伝子と連鎖する分子マーカーを指標にイネの穂いもち抵抗性を識別する方法 Download PDFInfo
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Description
(1)イネの穂いもち抵抗性遺伝子Pb1と連鎖する分子マーカーであって、図1の連鎖地図に示される分子マーカーのうち、少なくとも1つの分子マーカーを指標に、被検イネの穂いもち抵抗性を識別する方法、
(2)分子マーカーが、穂いもち抵抗性の形質を有するイネと同様の遺伝子型を示す場合に、被検イネが穂いもち抵抗性であると判定される、上記(1)に記載の方法、
(3)分子マーカーが配列番号:3、6、17、20、25、36、39、44、51のいずれかに記載の塩基配列またはその部分配列からなる分子マーカーである、上記(1)または(2)に記載の方法、
(4)以下の工程を含む、穂いもち抵抗性の形質を有するイネを選抜する方法
(a)穂いもち抵抗性の形質を有するイネ、およびその他の形質を有するイネを交配する工程
(b)交配させて得られるイネから、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の方法を使用して、穂いもち抵抗性の形質を有するイネを選抜する工程、
(5)配列番号:3、6、17、20、25、36、39、44、51のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、
(6)以下(a)から(u)のいずれかに示す、少なくとも1つのプライマーセット
(a)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA
(b)配列番号:4に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:5に記載の塩基配列からなるDNA
(c)配列番号:7に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:8に記載の塩基配列からなるDNA
(d)配列番号:9に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:10に記載の塩基配列からなるDNA
(e)配列番号:11に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:12に記載の塩基配列からなるDNA
(f)配列番号:13に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:14に記載の塩基配列からなるDNA
(g)配列番号:15に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:16に記載の塩基配列からなるDNA
(h)配列番号:18に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:19に記載の塩基配列からなるDNA
(i)配列番号:21に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:22に記載の塩基配列からなるDNA
(j)配列番号:23に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:24に記載の塩基配列からなるDNA
(k)配列番号:26に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:27に記載の塩基配列からなるDNA
(l)配列番号:28に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:29に記載の塩基配列からなるDNA
(m)配列番号:30に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:31に記載の塩基配列からなるDNA
(n)配列番号:32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:33に記載の塩基配列からなるDNA
(o)配列番号:34に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:35に記載の塩基配列からなるDNA
(p)配列番号:37に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:38に記載の塩基配列からなるDNA
(q)配列番号:40に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:41に記載の塩基配列からなるDNA
(r)配列番号:42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:43に記載の塩基配列からなるDNA
(s)配列番号:45に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:46に記載の塩基配列からなるDNA
(t)配列番号:47に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:48に記載の塩基配列からなるDNA
(u)配列番号:49に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:50に記載の塩基配列からなるDNA、
(7)以下の(a)から(i)のいずれかに示す組み合わせを少なくとも一つ以上含む、穂いもち抵抗性識別キット。
(a)配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:2に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:TaqI
(b)配列番号:4に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:5に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:Sau3AI
(c)配列番号:15に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:16に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:RsaI
(d)配列番号:18に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:19に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:AluI
(e)配列番号:23に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:24に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:EcoT22I
(f)配列番号:32に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:33に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:Sau3AI
(g)配列番号:37に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:38に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:BclI
(h)配列番号:42に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:43に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:MspI
(i)配列番号:45に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:46に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:BanIII。
STSマーカーのプライマーセットとしては、
プライマーN4-1F(配列番号28)およびプライマーN4-1R(配列番号29)からなるプライマーセットN4-1、
プライマーN3-2F(配列番号34)およびプライマーN3-2R(配列番号35)からなるプライマーセットN3-2、
プライマーK1F(配列番号47)およびプライマーK1R(配列番号48)からなるプライマーセットK1、
プライマーPb3810/16F(配列番号49)およびプライマーPb3810/16R(配列番号50)からなるプライマーセットPb3810/16、
の4つのプライマーセットを例示することができる。
また、CAPSマーカーのプライマーセットおよび制限酵素として、
プライマーN6-1F(配列番号1)およびプライマーN6-1R (配列番号2)からなるプライマーセットN6-1、並びに制限酵素:TaqI、
プライマーN6-3F(配列番号4)およびプライマーN6-3R(配列番号5)からなるプライマーセットN6-3、並びに制限酵素:Sau3AI、
プライマーNA-2RG-4F(配列番号15)およびプライマーNA-2RG-4R(配列番号16)からなるプライマーセットNA-2RG-4、並びに制限酵素:RsaI、
プライマーNA-16RGF(配列番号18)およびプライマーNA-16RGR(配列番号19)からなるプライマーセットNA-16RG、並びに制限酵素:AluI、
プライマーN4-3RG1F(配列番号23)およびプライマーN4-3RG1R(配列番号24)からなるプライマーセットN4-3RG1、並びに制限酵素:EcoT22I
プライマーK3F(配列番号32)およびプライマーK3R(配列番号33)からなるプライマーセットK3、並びに制限酵素:Sau3AI
プライマーN2-3RGF(配列番号37)およびプライマーN2-3RGR(配列番号38)からなるプライマーセットN2-3RG、並びに制限酵素:BclI
プライマーN2-2RGF(配列番号42)およびプライマーN2-2RGR(配列番号43)からなるプライマーセットN2-2RG、並びに制限酵素:MspI
プライマーN2-1RGF(配列番号45)およびプライマーN2-1RGR(配列番号46)からなるプライマーセットN2-1RG、並びに制限酵素:BanIII
の9つのプライマーセットを例示することができる。
さらに、SSRマーカーのプライマーセットとして、
プライマーSSR-16F(配列番号7)およびプライマーSSR-16R(配列番号8)からなるプライマーセットSSR-16、
プライマーSSR-2F(配列番号9)およびプライマーSSR-2R(配列番号10)からなるプライマーセットSSR-2、
プライマーSSR-24F(配列番号11)およびプライマーSSR-24R(配列番号12)からなるプライマーセットSSR-24、
プライマーSSR-11F(配列番号13)およびプライマーSSR-11R(配列番号14)からなるプライマーセットSSR-11、
プライマーSSR-4F(配列番号21)およびプライマーSSR-4R(配列番号22)からなるプライマーセットSSR-4、
プライマーSSR-34F(配列番号26)およびプライマーSSR-34R(配列番号27)からなるプライマーセットSSR-34、
プライマーSSR-39F(配列番号30)およびプライマーSSR-39R(配列番号31)からなるプライマーセットSSR-39、
プライマーSSR-6F(配列番号40)およびプライマーSSR-6R(配列番号41)からなるプライマーセットSSR-6、
の8つのプライマーセットを例示することができる。
公開されているイネ(品種:日本晴)の塩基配列の情報を利用した。Pb1の分子遺伝地図を参考に、国際イネゲノム塩基配列解読プロジェクト(IRGSP)が公開しているBAC/PACの物理地図から、11番染色体85.7cMに位置するマーカー「S723」と90.1cMに位置するマーカー「R2458」の間に夾まれた10個のクローンについて、次の3つの方法により全部で21個のPb1周辺マーカーを作製した。
上記で作製したマーカー21個のそれぞれについて、簡単な説明を下記に記す。
プライマーN6-1F :5’-GCCCAGTAGTACCACCTCCA-3’ (配列番号1)
プライマーN6-1R :5’-CAGTCTTCTACCGCGAAAGG-3’ (配列番号2)
制限酵素の種類:TaqI
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたときのPCR産物の塩基配列:942bp の部分配列:774bpを配列番号3に示す。該774bp部分配列(配列番号3)の529位から532位にかけてTaqIの制限酵素切断位置が存在する。そのため、942bpからなる上記PCR産物のみならず、774bp部分配列も、穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
プライマーN6-3F :5’-TCATGTCTCCTCTCCCATCC-3’ (配列番号4)
プライマーN6-3R :5’-GACCAAGAAGGCGTCAAGAG-3’ (配列番号5)
制限酵素の種類:Sau3AI
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたときのPCR産物の塩基配列:953bpの部分配列: 784bpを配列番号6に示す。該784bp部分配列(配列番号6)の631位から634位にかけてSau3AIの制限酵素切断位置が存在する。そのため、953bpからなるPCR産物のみならず、784部分配列も、穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
プライマーSSR-16F :5’-TGATGACCATACAAGTGGGG-3’ (配列番号7)
プライマーSSR-16R :5’-GACTGTTCATCGAATGCCCT-3’ (配列番号8)
d)分子マーカー番号4:「SSR2」 SSRマーカー
プライマーSSR-2F :5’-CACATGCAACACAACACAGG-3’ (配列番号9)
プライマーSSR-2R :5’-ATGGAGGTGGAGAAGGGG-3’ (配列番号10)
e)分子マーカー番号5:「SSR24」 SSRマーカー
プライマーSSR-24F :5’-GGAGAGGGGGAGGATTAGAA-3’ (配列番号11)
プライマーSSR-24R :5’-TAGGACGAGCCAAGCTCAAG-3’ (配列番号12)
f)分子マーカー番号6:「SSR11」 SSRマーカー
プライマーSSR-11F :5’-CCGATATCCAATTAACAATGC-3’ (配列番号13)
プライマーSSR-11R :5’-CAACCCTCCACCACTCACTT-3’ (配列番号14)
プライマーNA-2RG-4F :5’-CAGGATGGACAGGATATGTGG-3’ (配列番号15)
プライマーNA-2RG-4R :5’-CATGTGCCTTGCATTTCTTC-3’ (配列番号16)
制限酵素の種類:RsaIまたはClaI
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたとき、塩基配列:323bpのPCR産物が得られる。上記PCR産物323bpの前後を含む配列906bpを配列番号17に示す。上記PCR産物323bpは、上記906bp(配列番号17)の535位から857位に位置する。上記906bp(配列番号17)における763位から766位(PCR産物323bpの228位から231位)の配列(ATAC)は、制限酵素によって切断されないが、日本晴、農林8号(両品種ともPb1無)における対応する配列は、RsaIの制限酵素切断位置となる。したがって、上記PCR産物323bpは、RsaIと組み合わせることで、穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
また、同様に906bp(配列番号17)の619位から624位(PCR産物323bpの84位から89位)の配列ATCTATは制限酵素で切断されないが、日本晴、農林8号における対応する配列は、ClaIの制限酵素切断位置となる。したがって、上記PCR産物323bpは、ClaIと組み合わせることで、穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
さらに、906bpの172位から177bp位の配列ACTAGTは制限酵素SpeIによって切断されるが、日本晴、農林8号における対応する配列は切断されない。したがって、上記906bp(配列番号17)は、SpeIと組み合わせることで、日本晴や農林8号と区別できるマーカーとして利用できる。
プライマーNA-16RGF :5’-GACAGCCTTATCGTTCAGCA-3’ (配列番号18)
プライマーNA-16RGR :5’-TTGAAGCAATCTAATAATGGAGGA-3’ (配列番号19)
制限酵素の種類:AluI
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたとき、塩基配列:336bpのPCR産物が得られる。上記PCR産物336bpの前後を含む配列1118bpを配列番号20に示す。上記PCR産物336bpは、上記1118bp(配列番号20)の552位から887位に位置する。上記1118bp(配列番号20)における624位から627位(PCR産物336bpの72位から75位)の配列(AGCC)は、制限酵素で切断されないが、日本晴、農林8号における対応する配列は、AluIの制限酵素切断位置となる。したがって、上記PCR産物336bpは、AluIと組み合わせることで、穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
プライマーSSR-4F :5’-GTTGATGAGCTCCATCGCTC-3’ (配列番号21)
プライマーSSR-4R :5’-TCCTCTTAAGCAGCCACCAT-3’ (配列番号22)
プライマーN4-3RG1F :5’-CGCCAAGCTACCCAAGTTAC-3’ (配列番号23)
プライマーN4-3RG1R :5’-TTGCAGCATTGTCTTCATCC-3’ (配列番号24)
制限酵素の種類:EcoT22I
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたとき、塩基配列 :378bpのPCR産物が得られる。上記PCR産物378bpの前後を含む配列1150bpを配列番号25に示す。上記PCR産物378bpは、1150bp(配列番号25)の270位から647位に位置する。上記1150bp(配列番号25)における315位から320位(PCR産物378bpの45位から50位)の配列(ATGCAT)は、制限酵素EcoT22Iで切断される。上記PCR産物378bpは、EcoT221との組み合わせにより穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
プライマーSSR-34F :5’-GCGGGGAGTAGAACTCCAG-3’ (配列番号26)
プライマーSSR-34R :5’-CTGGCTCTTCAAGTCCATCC-3’ (配列番号27)
l)分子マーカー番号12:「N4-1」 STSマーカー(優性マーカー)
プライマーN4-1F :5’-GAGAGGCTGAACCGTTGAAG-3’ (配列番号28)
プライマーN4-1R :5’-CCAATGCTACCACCACTCCT-3’ (配列番号29)
m)分子マーカー番号13:「SSR39」 SSRマーカー
プライマーSSR-39F :5’-CGCTGAAGTGAGGGGAAGT-3’ (配列番号30)
プライマーSSR-39R :5’-GACAACACGCAAACATGACC-3’ (配列番号31)
n)分子マーカー番号14「K3」 CAPSマーカー
プライマーK3F :5’-AAAACGATTTCCACGGAGAC-3’ (配列番号32)
プライマーK3R :5’-AATCTCGGCAGCTGATAGGA-3’ (配列番号33)
制限酵素の種類:Sau3AI
プライマーN3-2F :5’-CGCAGCGTTTTTATGGATTT-3’ (配列番号34)
プライマーN3-2R :5’-ACGTCCATCCAGCGTTTATC-3’ (配列番号35)
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたときのPCR産物の塩基配列:1131bpの部分配列:775bpを配列番号36に示す。上記部分配列775bpについて、日本晴及び農林8号の相当する配列と比較すると、775bp(配列番号36)における349位から3bpの欠失および368位から27bpの欠失がみられる。上記欠失を挟んでプライマーを設計すれば、部分配列:775bpも、穂いもち抵抗性識別マーカーとしての利用が可能である。
プライマーN2-3RGF :5’-TGACGCAGCAACTAAGATGG-3’ (配列番号37)
プライマーN2-3RGR :5’-TCTTCTAGTTCATTCTGGATTCTAAA-3’ (配列番号38)
制限酵素の種類:BclIまたはSau3AI
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたとき、塩基配列 :224bpのPCR産物が得られる。上記PCR産物224bpの前後を含む配列812bpを配列番号39に示す。上記PCR産物224bpは、上記812bp(配列番号39)の46位から270位に位置する。上記812bpにおける166位から171位(PCR産物224位の120位から125位)の配列(TGATCA)は制限酵素BclIで切断される。また、同様に812bpにおける167位から170位(PCR産物224bpの121位から124位)の配列GATCは制限酵素Sau3AIで切断され、日本晴、農林8号の対応する配列は切断されないため、上記PCR産物224bpは、BclIまたはSau3AIとの組み合わせにより、穂いもち抵抗性識別マーカーとして利用できる。
プライマーSSR-6F :5’-TTTTTATGGGATTGAGGGAGT-3’ (配列番号40)
プライマーSSR-6R :5’-GTCAAGCTAGGCGGATTGTC-3’ (配列番号41)
プライマーN2-2RGF :5’-TCTTGGGTGTCAGGTTTGAA-3’ (配列番号42)
プライマーN2-2RGR :5’-ATAGCTGTGATGGAGGTGGG-3’ (配列番号43)
制限酵素の種類:MspI
上記プライマーを用いてイネ品種「St. No. 1」を鋳型としたとき、塩基配列:202bpのPCR産物が得られる。上記PCR産物202bpの前後を含む配列762bpを配列番号44に示す。上記PCR産物202bpは、上記762bp(配列番号44)の386位から670位に位置する。上記762bpにおける425位から428位(PCR産物202bpの39位から42位)の配列(CCGG)は、制限酵素MspIで切断される。
プライマーN2-1RGF :5’-CCTTTAGGTCCACCGAATCA-3’ (配列番号45)
プライマーN2-1RGR :5’-GACACTATGCAGGTGCAGGA-3’ (配列番号46)
制限酵素の種類:BanIII
t)分子マーカー番号20:「K1」 STSマーカー
プライマーK1F :5’-TCTGGATAAAAATGGCGGAG-3’ (配列番号47)
プライマーK1R :5’-CCAGGCCGAACCCTAATATC-3’ (配列番号48)
プライマーPb3810/16F :5’-TCTACGAGAGTTACAGCTTCTCC-3’ (配列番号49)
プライマーPb3810/16R :5’-GAGTTGCATGGTACACCTAGCC-3’ (配列番号50)
PCR産物の塩基配列 240bp(イネ品種「St. No. 1」を鋳型としたときのPCR産物)(配列番号51)
「農林8号」/「St.No.1」のF2植物7,279個体について、幼苗の葉からアルカリ法によりDNAを簡易抽出した。21個の分子マーカーのうち、最も外側に位置する「N6-1」(マーカー番号1)及び「Pb3810/16」(マーカー番号21)のプライマー(図1参照)を用いてPCRを行い、「N6-1」及び「Pb3810/16」の間で組換えを起こした334個体を選抜した。
主に愛知県育成の品種を含む96品種・系統について、本発明のPb1連鎖マーカーを用いて穂いもち検定を行った。使用した品種・系統は穂いもち抵抗性の有無が確認されており、本発明のマーカーによる検定結果が正しいものであるかどうかを検討した。
Claims (5)
- イネの穂いもち抵抗性遺伝子Pb1と連鎖する分子マーカーであって、配列番号:25で示される分子マーカーを指標に、被検イネの穂いもち抵抗性を識別する方法。
- 分子マーカーが、穂いもち抵抗性の形質を有するイネと同様の遺伝子型を示す場合に、被検イネが穂いもち抵抗性であると判定される、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含む、穂いもち抵抗性の形質を有するイネを選抜する方法。
(a)穂いもち抵抗性の形質を有するイネ、およびその他の形質を有するイネを交配する工程
(b)交配させて得られるイネから、請求項1又は2に記載の方法を使用して、穂いもち抵抗性の形質を有するイネを選抜する工程 - 以下に示す、プライマーセット。
配列番号:23に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:24に記載の塩基配列からなるDNA - 以下に示す組み合わせを含む、穂いもち抵抗性識別キット。
配列番号:23に記載の塩基配列からなるDNAおよび配列番号:24に記載の塩基配列からなるDNA、並びに制限酵素:EcoT22I
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