JP2024019017A - タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法、大玉性のタマネギ種植物を製造する製造方法、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカー、及び大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キット - Google Patents

タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法、大玉性のタマネギ種植物を製造する製造方法、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカー、及び大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キット Download PDF

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大輔 関根
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光 塚▲崎▼
Hikaru Tsukazaki
聡史 奥
Satoshi Oku
聡子 日浦
Satoko Hiura
歌子 山内
Utako Yamauchi
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Abstract

【課題】大玉性のタマネギ個体を選別するための技術を提供する。
【解決手段】タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法であって、
タマネギ種植物において、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカーとして判定する工程を含む、方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法、大玉性のタマネギ種植物を製造する製造方法、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカー、及び大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キットに関する。
国産タマネギの約６割は業務加工用に利用されており、業務加工用の需要が高い。タマネギの加工時には皮むきやカット作業を行うが、大玉性のタマネギは一般的なタマネギに比べて、より少ない球数で必要な加工量を得ることができるため、加工適性が高い。また、タマネギは単位面積あたりの栽培できる株数（個体数）が限られており、各個体の球重が収量に直結するため、大玉性のタマネギは単収増加にも大きく貢献する。加えて、タマネギの主要産地である北海道において、２０２１年は高温少雨によりタマネギが小玉化し、前年比の３０％減の収量となったが、大玉性のタマネギは、異常気象年での球重確保や収量安定化にも貢献する。このように、大玉性のタマネギは、今後の業務加工野菜の産地拡大や、サプライチェーン形成に不可欠である。
従来、大玉性のタマネギの育種方法として、実際にタマネギを栽培し、収穫した球の重さ等の形質を測定して大玉の個体を選抜することで系統化して品種育成する方法が用いられている。タマネギの育種方法としては、特許文献１に記載された、分子マーカーを利用した辛み及び催涙性のないタマネギの育種方法が知られている。
特開2019-058087号公報
従来の大玉性のタマネギの育種方法では、タマネギの栽培、収穫、形質測定等に多くの時間と労力を要する。特に、タマネギは２年生作物であることから、従来の形質評価に基づいた育種選抜では開発に１０年以上の長い年月を要する。また、タマネギの生育は栽培環境の影響を強く受けるため、ある年に選抜した大玉の個体の後代が別の年では大玉にならないことも多く、大玉性のポテンシャルが高い個体を正確に選抜することが難しい。さらに、特許文献１に記載されているような分子マーカーを利用した、大玉性のタマネギの育種方法は知られていない。そして、業務加工向けの大玉性のタマネギ品種は開発されていないことから、効率的に大玉性のタマネギを育種する方法が求められている。
本発明の一態様は、このような問題に鑑み、大玉性のタマネギ個体を選別するための技術を提供することを目的とする。
本発明の一態様に係るタマネギ種植物における球重の程度を判定する方法は、
タマネギ種植物において、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカーとして判定する工程を含む。
本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物を製造する製造方法は、タマネギ種植物において、請求項１又は２に記載された方法によって、大玉性のタマネギ種植物を選抜する選抜工程を含む。
本発明の一態様に係るタマネギ種植物における球重に関する分子マーカーは、
下記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基（ＳＮＰ）：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基の塩基；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを含む。
本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キットは、
タマネギ種植物において、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基の塩基；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを含む領域を増幅するプライマーを含む。
本発明の一態様によれば、大玉性のタマネギ個体を選別するための技術を提供することができる。
実施例１において作成した分子マーカーの分布図である。 実施例１のアソシエーション解析結果を示す図である。 実施例１における各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。 実施例２における各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。 実施例２における第２マーカーの波形データを示す図である。 実施例３における第１マーカー及び第４マーカーの遺伝子型の判定結果を示す図である。 実施例４におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例５において作成した連鎖地図を示す図である。 実施例５におけるＱＴＬ解析の結果を示す図である。 実施例５における各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。 実施例６におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例６におけるフラグメント解析の結果を示す図である。 実施例６におけるマーカーのフラグメント解析の結果を示す図である。 実施例６におけるマーカーのフラグメント解析の結果を示す図である。 実施例６における各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。
本発明の一態様において、タマネギ種植物には、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）及びタマネギの変種であるシャロットが含まれる。タマネギの品種は、一例として、「札幌黄」、「もみじ３号」、「北もみじ2000」等が挙げられる。
タマネギ種植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物であり得る。育種素材の候補植物としては、例えば、交配に用いる親植物、及び、遺伝子組換え技術を利用した分子育種に用いられる植物が含まれる。また、育種のプロセスで得られた植物としては、例えば、タマネギ種植物の上述したような品種に属する植物を種内交雑した植物、及びこれらの後代系統である。また、タマネギ種植物は、ある品種に属するタマネギ種植物と他の品種に属するタマネギ種植物との交雑植物のように種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。さらに、タマネギ種植物は、大玉性であることが分かっている品種同士を種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。また、タマネギ種植物は、大玉性であることが分かっている個体同士を種内交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。
本明細書において、植物とは、植物体の一部又は全部であってもよい。植物体の一部としては、例えば、繁殖素材（種子、鱗茎等）、鱗葉、花、根等が挙げられる。
本明細書において、タマネギ種植物が大玉性であるとは、タマネギ種植物の球重が、他のタマネギ種植物の球重と比較して相対的に重いことが意図される。ここで、タマネギ種植物の球重は、タマネギ種植物個体の鱗茎の重さが意図され、鱗茎重とも称される。なお、タマネギ種植物における球重は鱗茎の横径と比例するため、大玉性の指標として、球重に替えて又は球重と共に、鱗茎の横径を用いてもよい。
〔タマネギ種植物における球重に関する分子マーカー〕
本発明の一態様に係る分子マーカーは、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカーである。分子マーカーは、大玉性のタマネギ種植物を選抜可能な分子マーカーであり、大玉性を有するタマネギ種植物を選抜可能な一塩基多型（ＳＮＰ）のアレル、又は、塩基の挿入及び欠失（ＩｎＤｅｌ）を検出するための分子マーカーである。
分子マーカーは、下記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを含む。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、タマネギ種植物の第８染色体上の球重に関する遺伝子座を特定するために用いることができる。球重に関する遺伝子座とは、球重に影響する量的形質遺伝子座又は遺伝子領域を意味する。前記量的形質遺伝子座（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｉｔ Ｌｏｃｉ；ＱＴＬ）は、一般に、量的形質の発現に関与する染色体領域を意味する。ＱＴＬは、染色体上の特定の座を示す分子マーカーを使用して規定できる。前記分子マーカーを使用してＱＴＬを規定する技術は、当該技術分野において周知である。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、一例として、ＳＮＰマーカー、ＡＦＬＰ（分子増幅断片長多型）マーカー、ＲＦＬＰマーカー、マイクロサテライトマーカー、ＳＣＡＲマーカー、ＣＡＰＳマーカー、ＩｎＤｅｌマーカー等である。
上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドは、一例として、本実施例に記載されたＳＮＰマーカー又はこれと同一視できるＳＮＰマーカーである。本実施例に記載されたＳＮＰマーカーと同一視できるＳＮＰマーカーは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーから５ｃＭ以内の遺伝距離にあるＳＮＰマーカーである。
本発明の一態様において、分子マーカーは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基である。上述したように、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基の近傍に、球重に関わる遺伝子が存在すると予測できる。したがって、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基は、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と同様に、球重に関する分子マーカーとして使用可能である。後述する実施例に示すように、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基は、それぞれ５ｃＭ以内の遺伝距離にある。分子マーカーは、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基からの３ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基であることが好ましく、より好ましく２ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基である。
本発明の他の態様において、分子マーカーは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基から１０ｋｂの範囲内にある塩基である。後述する実施例に示すように、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基はそれぞれ、同じ連鎖群上に位置しており、それらの近傍に強いＱＴＬが検出されている。したがって、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基の近傍に、球重に関わる遺伝子が存在すると予測できる。すなわち、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基から１０ｋｂの範囲内にある塩基は、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と同様に、球重に関する分子マーカーとして使用可能である。分子マーカーは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基から、好ましくは８ｋｂの範囲内にある塩基であり、より好ましくは５ｋｂの範囲内にある塩基である。
本発明のさらに他の態様において、分子マーカーは、上記（ａ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にあり、かつ、上記（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基である。また、分子マーカーは、上記（ａ）の塩基に相当する塩基から３ｃＭ、２ｃＭ、又は１ｃＭ以内の遺伝距離にあり、かつ、上記（ｄ）の塩基に相当する塩基から３ｃＭ、２ｃＭ、又は１ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基である。
なお、本発明の一態様において、分子マーカーは、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡である塩基であってもよい。「連鎖不平衡」とは、２つの対立遺伝子がそれぞれ独立に遺伝する場合よりも大きな頻度で互いに連鎖して遺伝することをいう。本発明の一態様において、分子マーカーは、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡である塩基であり、好ましくは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基と連鎖不平衡係数ｒ２≧０．９の関係にある塩基である。
また、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡である塩基は、より好ましくは、上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基と連鎖不平衡係数ｒ２≧０．９５の関係にある塩基である。また、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡である塩基は、さらに好ましくは、上記（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基と連鎖不平衡係数ｒ２≧１の関係にある塩基である。上記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基と連鎖不平衡である塩基は、一例として、複数のタマネギ種植物から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にある塩基を探索することにより同定することができる。
ＳＮＰマーカーは、（ｉ）ＳＮＰに相当する塩基自体、（ｉｉ）ＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）２以上のＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチドであり得る。
（ｉ：ＳＮＰマーカー）
本発明の一態様に係る分子マーカーを用いれば、タマネギ種植物における球重の程度を判定することができる。
ここで、ＳＮＰは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。ＳＮＰマーカーにおいて、ＳＮＰは、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）のゲノム配列を基準とした一塩基多型である。基準植物であるタマネギのゲノム配列（Onion genome sequence v1.2）は、ゲノムデータベース（https://www.oniongenome.wur.nl）に公表されている。
「（ａ）～（ｄ）の塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーである。「（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーと同一視できるＳＮＰマーカーである。「（ａ）～（ｄ）の塩基」は、第８染色体上の球重に関する遺伝子領域上の変異である。第８染色体上の球重に関する遺伝子座は、基準となるタマネギ種植物由来の塩基配列からなる。他のタマネギ種植物においては、基準となる塩基配列に対してＳＮＰ以外の部分でも塩基配列が異なる部分が含まれ得る。このＳＮＰマーカーが位置するゲノム上の領域は、多数のタマネギ種植物間で保存されているため、ホモロジー検索等の手法によって、このＳＮＰマーカーを特定することができる。
すなわち、他のタマネギ種植物において、第８染色体上の球重に関する遺伝子座（すなわち植物間で高度に保存されている遺伝子座）が存在する場合、「（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基」とは、ホモロジー検索等の手法によって、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当するとされた第８染色体上の球重に関する遺伝子座上の塩基を指す。例えば、後述する（ａ２）～（ｄ２）に記載のポリヌクレオチドや、（ａ３）～（ｄ３）に記載のポリヌクレオチドが、第８染色体上の球重に関する遺伝子座の一例である。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、上記の（ａ）～（ｄ）ＳＮＰを含むＳＮＰマーカーである。このＳＮＰマーカーは、本発明者らが新たに同定したＳＮＰマーカーであり、当業者は、このＳＮＰマーカーのそれぞれのＳＮＰを表す塩基配列に基づき、当該ＳＮＰマーカーのゲノム上の位置を特定することができる。
（ａ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ａ）ともいう）は、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。また、（ｂ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ｂ）ともいう）は、配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。さらに、（ｃ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ｃ）ともいう）は、配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目若しくは１１７番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。また、（ｄ）のＳＮＰ（以下、ＳＮＰ（ｄ）ともいう）は、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している。なお、ＳＮＰ（ａ）、ＳＮＰ（ｂ）、ＳＮＰ（ｃ）、及びＳＮＰ（ｄ）は、それぞれ、後述する実施例におけるCHR8_77892311（第１マーカー）、Scaffold_9797_10963（第２マーカー）、CHR8_82152739(82152741)（第３マーカー）、及びScaffold_62471_59198（第４マーカー）に対応している。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基のアレルが、Ｃのホモ接合型又はＣ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。さらに、ＳＮＰ（ｃ）に相当する塩基のアレルについて、１１５番目の塩基がＴのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型、あるいは、１１７番目の塩基がＡのホモ接合型又はＡ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、ＳＮＰ（ｄ）に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）～（ｄ）の少なくとも２つをハプロタイプブロックとして解析することにより、タマネギ種植物における球重の程度、又は、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定してもよい。
（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基であるＳＮＰは、一例として、配列番号２１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの８９番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している（実施例における第５マーカー）。また、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基であるＳＮＰの他の例は、配列番号２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１０９番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している（実施例における第６マーカー）。また、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基であるＳＮＰの他の例は、配列番号２３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７０番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している（実施例における第７マーカー）。また、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基であるＳＮＰの他の例は、配列番号２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの６７番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している（実施例における第８マーカー）。また、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基であるＳＮＰの他の例は、配列番号２５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３４番目の塩基又はこれに相当する塩基の多型を示している（実施例における第９マーカー）。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、配列番号２１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの８９番目の塩基に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＣ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、配列番号２２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１０９番目の塩基に相当する塩基のアレルが、Ｃのホモ接合型又はＣ／Ａのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。さらに、配列番号２３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７０番目の塩基に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、配列番号２４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの６７番目の塩基に相当する塩基のアレルが、Ａのホモ接合型又はＡ／Ｇのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、配列番号２５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３４番目の塩基に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＧ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。
また、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から１０ｋｂの範囲内にある塩基、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを含む分子マーカーの他の例として、以下に示す第１０～第２６マーカーが挙げられる。分子マーカーは、第１～第２６マーカーの少なくとも２つをハプロタイプブロックとするものであってもよい。
第１０マーカーは、配列番号３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９９番目の塩基に相当する塩基における挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）多型である。第１１マーカーは、配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１３番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第１２マーカーは、配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２０７番目から２０８番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。
第１３マーカーは、配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４１番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第１４マーカーは、配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２９９番目の塩基に相当する塩基から３００番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第１５マーカーは、配列番号３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４９番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第１６マーカーは、配列番号４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの８４番目から８６番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。
第１７マーカーは、配列番号４１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７０番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第１８マーカーは、配列番号４２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５５番目から７０番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第１９マーカーは、配列番号４３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第２０マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４３番目から４４番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第２１マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９２番目から９４番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第２２マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１４７番目から１４８番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第２３マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２１５番目から２３３番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。
第２４マーカーは、配列番号４５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２９番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第２５マーカーは、配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７８番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。第２６マーカーは、配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１９４番目の塩基に相当する塩基におけるＩｎＤｅｌ多型である。
第１０マーカーは、配列番号３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９９番目の塩基に相当する塩基がＡであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１０マーカーにおいて、配列番号３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９９番目の塩基に相当する塩基が、３６塩基（AAAACATTTTTGATGATGATCATGAAGTGAAGAGTA）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１１マーカーは、配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１３番目の塩基に相当する塩基がＧであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１１マーカーにおいて、配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１３番目の塩基に相当する塩基が、２７塩基（GTGTTGCACAATGACACTTTTGTCGG）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１２マーカーは、配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２０７番目から２０８番目の塩基に相当する塩基がＴＧであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１２マーカーにおいて、配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２０７番目から２０８番目の塩基に相当する塩基がＴである欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１３マーカーは、配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４１番目の塩基に相当する塩基がＴであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１３マーカーにおいて、配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４１番目の塩基に相当する塩基が、８９塩基（TTTGCAAGACGATTTGAAAGAAAAAGAAAACGAGGGAAAAAGAAAAGAAAGTAAAAAGAAATAAATAATGGTTGGTCGACCGATAAAAT）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１４マーカーは、配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２９９番目から３００番目の塩基に相当する塩基がＣＣであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１４マーカーにおいて、配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２９９番目から３００番目の塩基に相当する塩基がＣである欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１５マーカーは、配列番号３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４９番目の塩基に相当する塩基がＡであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１５マーカーにおいて、配列番号３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４９番目の塩基に相当する塩基が、５塩基（ATTTA）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１６マーカーは、配列番号４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの８４番目から８６番目の塩基に相当する塩基がＡＡＡであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１６マーカーにおいて、配列番号４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの８４番目から８６番目の塩基に相当する塩基がＡの欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１７マーカーは、配列番号４１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７０番目の塩基に相当する塩基がＡであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１７マーカーにおいて、配列番号４１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７０番目の塩基に相当する塩基が、２０塩基（ATATATATAGGCCATGTGTG）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１８マーカーは、配列番号４２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５５番目から７０番目の塩基に相当する塩基がＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１８マーカーにおいて、配列番号４２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５５番目から７０番目の塩基に相当する塩基がＴの欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第１９マーカーは、配列番号４３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基に相当する塩基がＣであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第１９マーカーにおいて、配列番号４３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基に相当する塩基が、１４塩基（CCATCTATTCCATC）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第２０マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４３番目から４４番目の塩基に相当する塩基がＡＣであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２０マーカーにおいて、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４３番目から４４番目の塩基に相当する塩基がＡの欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第２１マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９２番目から９４番目の塩基に相当する塩基がＡＡＡであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２１マーカーにおいて、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９２番目から９４番目の塩基に相当する塩基がＡの欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第２２マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１４７番目から１４８番目の塩基に相当する塩基がＴＣであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２２マーカーにおいて、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１４７番目から１４８番目の塩基に相当する塩基がＴの欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第２３マーカーは、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２１５番目から２３３番目の塩基に相当する塩基がＧＴＣＴＴＡＧＧＧＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２３マーカーにおいて、配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２１５番目から２３３番目の塩基に相当する塩基がＧの欠失型であるとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第２４マーカーは、配列番号４５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２９番目の塩基に相当する塩基がＴであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２４マーカーにおいて、配列番号４５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２９番目の塩基に相当する塩基が、６塩基（TAAAAT）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
第２５マーカーは、配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７８番目の塩基に相当する塩基がＴであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２５マーカーにおいて、配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７８番目の塩基に相当する塩基が、３塩基（TGT）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
また、第２６マーカーは、配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１９４番目の塩基に相当する塩基がＴであるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。第２６マーカーにおいて、配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１９４番目の塩基に相当する塩基が、２２塩基（TGTCACAGACGTCTATCACCTG）に置換されているとき、当該タマネギ種植物は小玉性であると判定することができる。
（ｉｉ：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ａ）ともいう）、ＳＮＰ（ｂ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｂ）ともいう）、ＳＮＰ（ｃ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｃ）ともいう）、又はＳＮＰ（ｄ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｄ）ともいう）であってもよい。
ポリヌクレオチド（ａ）は、（ａ１）配列番号１に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ａ２）（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ａ３）（ａ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチドである。
ポリヌクレオチド（ｂ）は、（ｂ１）配列番号２に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ２）（ｂ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｂ３）（ｂ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチドである。
ポリヌクレオチド（ｃ）は、（ｃ１）配列番号３に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｃ２）（ｃ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｃ３）（ｃ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｃ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチドである。
ポリヌクレオチド（ｄ）は、（ｄ１）配列番号４に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｄ）を含む領域の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｄ２）（ｄ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｄ）以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｄ３）（ｄ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ｄ）以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する機能を有するポリヌクレオチドである。
（ａ１）～（ｄ１）のポリヌクレオチドは、例えば、第８染色体上の球重に関する遺伝子座の塩基配列に基づき、大玉性のタマネギ種植物から得ることができる。
（ａ２）～（ｄ２）のポリヌクレオチドは、（ａ１）～（ｄ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）～（ｄ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に、数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２又は３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入又は付加）を含むものであり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したタマネギのゲノム配列を参照することにより、又は、大玉性のタマネギ種植物のゲノム上におけるＳＮＰの近傍領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
（ａ３）～（ｄ３）のポリヌクレオチドは、（ａ１）～（ｄ１）のポリヌクレオチドの塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）～（ｄ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に対して、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するものであり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントとすることによって決定することができる。
ポリヌクレオチド（ａ）におけるＳＮＰ（ａ）に相当する塩基のアレルが、Ｃのホモ接合型又はＣ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。ポリヌクレオチド（ｂ）におけるＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。ポリヌクレオチド（ｃ）におけるＳＮＰ（ｃ）に相当する塩基のアレルが、ＴＡＡのホモ接合型又はＴＡＡ／ＣＡＴのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。ポリヌクレオチド（ｄ）におけるＳＮＰ（ｄ）に相当する塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定することができる。また、分子マーカーは、ポリヌクレオチド（ａ）～（ｄ）の少なくとも２つをハプロタイプブロックとして解析することにより、タマネギ種植物が大玉性であるか否かを判定することができる。
（ｉｉｉ：３つのＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）の少なくとも２つを含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｅ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｅ）は、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）の少なくとも２つの部位間の領域を、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）の少なくとも２つの部位と共に含んでいる。ポリヌクレオチド（ｅ）は、例えば、大玉性のタマネギ種植物における対応するＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）の少なくとも２つの部位間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド（ｅ）の塩基配列は、大玉性のタマネギ種植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。
本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法、及び、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する方法としては特に限定されず、例えば、ＳＮＰを検出する公知のＳＮＰ分析方法を用いることができる。このような公知のＳＮＰ分析方法には、タマネギ種植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が含まれる。タマネギ種植物の被検体は、幼苗の葉、茎、根等であり得、また、鱗茎であってもよい。また、本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法、及び、タマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定する方法の一態様は、後述する本発明の一態様に係るタマネギ種植物における球重の程度を判定する方法である。
〔大玉性のタマネギ種植物〕
本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物は、後述する製造方法によって得られる植物である。大玉性のタマネギ種植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したＳＮＰを有し、他のタマネギ種植物よりも球重の重いタマネギ種植物である。
本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物は、後述する製造方法に示すように、タマネギ種植物同士を交雑して得られた植物及びその後代系統、又は、タマネギ種植物の自殖後代から、上述した分子マーカーを用いて大玉性のタマネギ種植物を判別することで得られる。なお、上述したＳＮＰを有するように遺伝子工学的に改変した大玉性のタマネギ種植物についても、本発明の範疇に含まれる。
〔タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法〕
本発明の一態様に係るタマネギ種植物における球重の程度を判定する方法（判定方法）は、タマネギ種植物において、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基；及び
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカーとして判定する工程を含む。
本発明の一態様に係る判定方法は、上述した本発明の一態様に係る分子マーカーを用いて、タマネギ種植物の被検体において、球重の程度を判定する。本発明の一態様に係る判定方法は、タマネギ種植物の被検体のゲノム上において、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）から５ｃＭ以内の遺伝距離にあるＳＮＰ又はＩｎＤｅｌのいずれかを特定することで、被験タマネギ種植物が、大玉性を有するか否かを判定する。
本発明の一態様に係る判定方法において、被検体であるタマネギ種植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である。被検体であるタマネギ種植物は、例えば、大玉性のタマネギ種植物と大玉性のタマネギ種植物との交雑植物、大玉性のタマネギ種植物と小玉性のタマネギ種植物との交雑植物、又は、小玉性のタマネギ種植物と小玉性のタマネギ種植物との交雑植物、及び、これらの後代系統であり得る。また、被検体であるタマネギ種植物は、球重が既知のタマネギ種植物と球重が不明なタマネギ種植物との交雑植物、又は、球重が不明なタマネギ種植物同士を交雑した交雑植物、及び、それらの後代系統であり得る。さらに、被検体であるタマネギ種植物は、大玉性のタマネギ種植物の自殖後代であり得る。タマネギ種植物の被検体は、葉、茎、根等であり得、また、鱗茎であってもよい。
本発明の一態様に係る判定方法は、（ａ’）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基のアレルが、Ｃのホモ接合型又はＣ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定する。また、判定方法は、（ｂ’）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定する。さらに、判定方法は、（ｃ’）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５又は１１７番目の塩基のアレルが、１１５番目の塩基がＴのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型、あるいは、１１７番目の塩基がＡのホモ接合型又はＡ／Ｔのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定する。また、判定方法は、（ｄ’）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基のアレルが、Ｔのホモ接合型又はＴ／Ｃのヘテロ接合型であるとき、当該タマネギ種植物は大玉性であると判定する。
本発明の一態様に係る判定方法において用いる分子マーカーの詳細については、上述した本発明の一態様に係る分子マーカーの説明を援用する。
本発明の一態様に係る判定方法において、分子マーカーを用いてタマネギ種植物における球重の程度を検査する方法としては特に限定されず、公知のＳＮＰ分析方法を用いることができ、例えば、タマネギ種植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が挙げられる。本発明の一態様に係る判定方法は、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーを用いて、前記タマネギ種植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅してもよい。このようなプライマーは、一例として、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）のいずれかを含む領域を増幅するプライマーである。すなわち、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）のいずれかを含む領域を増幅するプライマーは、本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キットであり得る。
タマネギ種植物の被検体のＤＮＡにおける前記領域の増幅は、一例として、タマネギ種植物の被検体から抽出したＤＮＡを鋳型にして、ＳＮＰを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。そして、得られた増幅断片におけるＳＮＰの塩基（遺伝子型）を決定し、決定された塩基（遺伝子型）とタマネギ種植物における球重の程度との関係を示すデータに基づいて、タマネギ種植物における球重の程度を判定する。増幅断片における遺伝子型の決定方法については、従来公知の方法を用いることができ、一例として、ＤＮＡシーケンス解析、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、リアルタイムＰＣＲを用いたＴａｑＭａｎ解析等である。
ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットは、標的のＳＮＰを含む領域のＤＮＡ断片を増幅することができるものである限り、特に限定されず、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計してもよい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、好ましくは、２００塩基対（ｂｐ）以下、１６０ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、１４０ｂｐ以下、１３０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーと、リバースプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、１９ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、又は２５ｂｐ以上であってもよく、５０塩基ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、又は３０ｂｐ以下であってもよい。
以下に示すようなＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）の少なくとも１つを含む領域を増幅するプライマーセットは、本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キットであり得る。
ＳＮＰ（ａ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のプライマーセットを含む：
（Ｉ）配列番号５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマーと、配列番号６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマーとからなるプライマーセット；
（ＩＩ）配列番号７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマーと、配列番号８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマーと、配列番号９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第５のプライマーとからなるプライマーセット。
上記（Ｉ）のプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号１に示す塩基配列の１２５番目の塩基がＣであるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基を検出することができる。また、上記（ＩＩ）のプライマーセットを用いれば、ＳＮＰ（ａ）を含む領域を特異的に増幅し、蛍光量の測定により遺伝子型を決定することができる。
ＳＮＰ（ｂ）を含む領域を増幅するプライマーセット（ＩＩＩ）は、例えば、配列番号１０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第６のプライマーと、配列番号１１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第７のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号２に示す塩基配列の５７番目の塩基がＴであるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基を検出することができる。
ＳＮＰ（ｃ）を含む領域を増幅するプライマーセット（ＩＶ）は、例えば、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第８のプライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第９のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号３に示す塩基配列の１１５番目の塩基がＴ及び１１７番目の塩基がＡの少なくとも一方であるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｃ）に相当する塩基を検出することができる。
ＳＮＰ（ｄ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、下記（Ｖ）～（ＶＩＩ）のプライマーセットを含む：
（Ｖ）配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１０のプライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１１のプライマーとからなるプライマーセット；
（ＶＩ）配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１２のプライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１３のプライマーと、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１４のプライマーとからなるプライマーセット；
（ＶＩＩ）配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１５のプライマーと、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１６のプライマーとからなるプライマーセット。
上記（Ｖ）のプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４に示す塩基配列の４５番目の塩基がＴであるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｄ）に相当する塩基を検出することができる。また、上記（ＶＩ）のプライマーセットを用いれば、ＳＮＰ（ｄ）を含む領域を特異的に増幅し、蛍光量の測定により遺伝子型を決定することができる。さらに、上記（ＶＩＩ）のプライマーセットを用いれば、ＳＮＰ（ｄ）を含む領域を特異的に増幅し、アガロース電気泳動により遺伝子型を決定することができる。
また、プライマーセットは、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基を検出するための以下のプライマーセットであってもよい。例えば、配列番号２６示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号２１に示す塩基配列の８９番目の塩基がＴであるＰＣＲ増幅産物が得られ、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基に相当する塩基を検出することができる。
また、例えば、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号２２に示す塩基配列の１０９番目の塩基がＣであるＰＣＲ増幅産物が得られ、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基に相当する塩基を検出することができる。
また、例えば、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号２３に示す塩基配列の７０番目の塩基がＴであるＰＣＲ増幅産物が得られ、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基に相当する塩基を検出することができる。
また、例えば、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号２４に示す塩基配列の６７番目の塩基がＡであるＰＣＲ増幅産物が得られ、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基に相当する塩基を検出することができる。
また、例えば、配列番号３４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号３５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号２５に示す塩基配列の３４番目の塩基がＴであるＰＣＲ増幅産物が得られ、（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基に相当する塩基を検出することができる。
（ａ）～（ｄ）の塩基に相当する塩基から１０ｋｂの範囲内にある塩基を検出するためのプライマーセットの他の例として、以下に示す、第１０～第２６マーカーの少なくとも１つを含む領域を増幅するプライマーセットが挙げられる。
例えば、配列番号４７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号４８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１０マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号３６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの９９番目の塩基に相当する塩基がＡであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号４９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号５０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１１及び第１２マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号３７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１３番目の塩基に相当する塩基がＧであるか、２０７番目から２０８番目の塩基に相当する塩基がＴＧであるの少なくとも一方であるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号５１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号５２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１３及び第１４マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号３８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４１番目の塩基に相当する塩基がＴであるか、２９９番目から３００番目の塩基に相当する塩基がＣＣであるの少なくとも一方であるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号５３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号５４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１５マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号３９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの２４９番目の塩基に相当する塩基がＡであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号５５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号５６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１６マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの８４番目から８６番目の塩基に相当する塩基がＡＡＡであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号５７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号５８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１７マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７０番目の塩基に相当する塩基がＡであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号５９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号６０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１８マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５５番目から７０番目の塩基に相当する塩基がＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号６１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号６２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第１９マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基に相当する塩基がＣであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号６３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号６４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第２０及び第２３マーカーを含む領域が増幅される。そして、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４３番目から４４番目の塩基に相当する塩基がＡＣであるか、９２番目から９４番目の塩基に相当する塩基がＡＡＡであるか、１４７番目から１４８番目の塩基に相当する塩基がＴＣであるか、２１５番目から２３３番目の塩基に相当する塩基がＧＴＣＴＴＡＧＧＧＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴであるかの少なくともいずれかであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号６５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号６６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第２４マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２９番目の塩基に相当する塩基がＴであるＰＣＲ増幅産物が得られる。
また、例えば、配列番号６７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーと、配列番号６８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含むプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、第２５及び第２６マーカーを含む領域が増幅され、大玉性のタマネギ種植物においては配列番号４６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの７８番目の塩基に相当する塩基がＴであるか、１９４番目の塩基に相当する塩基がＴであるの少なくとも一方であるＰＣＲ増幅産物が得られる。
ＳＮＰ分析におけるＰＣＲは、単独のプライマーセットを含む反応系でＤＮＡ断片を増幅するシングルプレックスＰＣＲ、又は、複数のプライマーセットを含む反応系で遺伝子増幅するマルチプレックスＰＣＲ、のいずれであってもよい。マルチプレックスＰＣＲの場合は、異なる波長を有する蛍光物質（例えば、ＮＥＤ、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＥＴ、ＨＥＸ）により標識したプライマーセットを混合してもよい。
ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程及び伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、及び、変性工程とアニーリング及び伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。３ステップＰＣＲにおける反応条件の一例としては、９０～１００℃で４０～６０秒（例えば、９４℃で３０秒）の変性工程、１０～６０秒（例えば、３０秒）のアニーリング工程、及び６５～８０℃で１０～９０秒（例えば、７２℃で６０秒）の伸長工程を、１０～４０サイクル（例えば１５サイクル）行う。アニーリング温度は、一例として、５５～７０℃（例えば、６０℃）の初期アニーリング温度から４０～６０℃（例えば、４５℃）の最終アニーリング温度まで、所定サイクル毎に段階的に低下させる条件（例えば、１サイクル毎に１℃低下）が挙げられる。鋳型となるＤＮＡの状態に応じて、ＳＮＰを安定的に検出するために、ＰＣＲ反応条件を調整してもよい。
ＳＮＰ分析におけるＰＣＲとして、ＰＣＲによる増幅及びＳＮＰマーカーの特定を行うＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法のようなリアルタイムＰＣＲを用いてもよい。すなわち、プライマーセットを用いて増幅した増幅断片に含まれるＳＮＰを検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをさらに用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、高処理能力の判別方法を提供することができる。なお、ＰＣＲにより増幅した増幅断片においてＳＮＰを特定する方法としては、自動ＤＮＡシークエンサー等を用いて増幅断片の塩基配列を決定することにより、解析してもよい。
タマネギ種植物の被検体から、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。被検体の種類及び夾雑物の量等に応じて、ＤＮＡ抽出工程の前に、適宜に前処理を行ってもよい。また、被検体から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲ反応において鋳型として用いるために、必要に応じて洗浄又は精製してもよい。さらに、被検体から抽出されたＤＮＡを２種類の制限酵素で消化した制限酵素切断断片をＰＣＲにより増幅してもよい。
また、本発明の一態様に係る判定方法においては、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）と連鎖不平衡状態にある遺伝子多型を分析し、ＳＮＰ（ａ）～ＳＮＰ（ｄ）を同定してもよい。上記連鎖不平衡状態は、一例として、連鎖不平衡係数が０．９以上の連鎖不平衡状態である。
本発明の一態様に係る判定方法によれば、分子マーカーにより、被験タマネギ種植物が、大玉性であるか否かを判定することができる。したがって、判定結果に基づき大玉性のタマネギ種植物及びその後代系統を選抜することができる。
本発明の一態様に係る判定方法によれば、幼苗の段階で大玉性のタマネギ種植物を選抜することが可能であり、育種選抜のための期間を大幅に短縮することができる。また、幼苗の段階で選抜された大玉性の幼苗のみを栽植して生育することで、圃場の利用効率を向上させることができる。
〔大玉性のタマネギ種植物を製造する製造方法〕
本発明の一態様に係る製造方法は、大玉性のタマネギ種植物を製造する方法であって、タマネギ種植物において、本発明の一態様に係る判定方法によって、大玉性のタマネギ種植物を選抜する選抜工程を含む。また、製造方法は、前記選抜工程において選抜された大玉性のタマネギ種植物の後代において、前記選抜工程を１又は複数回繰り返し行ってもよい。
また、製造方法は、選抜工程の前に、タマネギ種植物同士を交雑する交雑工程を包含し、選抜工程において、前記交雑工程により得られたタマネギ種植物又はその他殖後代のタマネギ種植物から、本発明の一態様に係る判定方法によって、大玉性のタマネギ種植物を選抜してもよい。
さらに、製造方法は、選抜工程の前に、大玉性のタマネギ種植物の自殖後代を取得する工程を包含し、選抜工程において、取得された大玉性のタマネギ種植物の自殖後代から、本発明の一態様に係る判定方法によって、大玉性のタマネギ種植物を選抜してもよい。
したがって、本発明の一態様に係る分子マーカー、大玉性のタマネギ種植物、及び判定方法に関する説明を、大玉性のタマネギ種植物を製造する方法の説明に援用する。
交雑工程において、親植物として使用するタマネギ種植物は、例えば、大玉性のタマネギ種植物、小玉性のタマネギ種植物、球重の程度が不明なタマネギ種植物、並びにこれらの後代系統であり得る。
また、交雑工程において、親植物として使用するタマネギ種植物は、本発明の一態様に係る大玉性のタマネギ種植物であってもよい。また、交雑工程において用いるタマネギ種植物は、本発明の一態様に係る判定方法により選抜された大玉性のタマネギ種植物であってもよい。すなわち、本発明の一態様に係る製造方法は、前記交雑工程の前に、本発明の一態様に係る判定方法により、被験タマネギ種植物から大玉性のタマネギ種植物を判別する判別工程をさらに含み得る。
判別工程は、本発明の一態様に係る判定方法により、交雑工程により得られたタマネギ種植物又はその後代系統のタマネギ種植物から、大玉性のタマネギ種植物を判別する。
本発明の一態様に係る製造方法によれば、分子マーカーによりタマネギ種植物が大玉性を有するか否かを判定し、判定結果に基づき選抜した大玉性のタマネギ種植物を製造することができる。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔実施例１〕
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構において育成したタマネギ系統について、２３０個体を東北農業研究センター内の圃場（盛岡）において、２０１９年に栽培した。収穫した各個体の鱗茎重を測定した。
栽培したタマネギ系統について、系統内多型を取得するために、１５７の分子マーカーを作成した。これらの分子マーカーの分布を、図１に示す。図１は、実施例において作成した分子マーカーの分布図である。
解析材料の各個体について、図１に示した１５７の分子マーカーの遺伝子型を取得した。１５７の分子マーカーのそれぞれに対するプライマーセットを４つに分割し（１プライマープレックスあたり約４０プライマーセット）、プライマープレックスごとにマルチプレックスＰＣＲを行った（１ｓｔ ＰＣＲ）。１ｓｔ ＰＣＲの組成を表１に示し、ＰＣＲ条件を表２に示す。
１ｓｔ ＰＣＲ産物は、AMPure XP Reagentにより精製した。精製したテンプレートを１００倍希釈して、２ｎｄ ＰＣＲに用いた。２ｎｄ ＰＣＲでは、１ｓｔ ＰＣＲ産物に次世代シーケンサーでの解析用のアダプター配列及び個体識別用のバーコード配列を添加した。２ｎｄ ＰＣＲの組成を表３に示し、ＰＣＲ条件を表４に示す。
作成したＰＣＲ産物について、１９２検体と３８検体との２つに分割し、各々で１つにまとめて次世代シーケンサー（Thermo Fisher Scientific社Ion Torrent Proton system）により解析した。ソフトウェアTorrent Suite ver. 5（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、得られた配列データを検体ごとに分けた後、各検体の配列データをリファレンス配列にマッピングした。ソフトウェアTorrent Variant Callerを用いて、各増幅領域内の多型情報(マーカー遺伝子型)を抽出した。
得られた各個体の遺伝子型データと球重データを用いて、アソシエーション解析を行った。アソシエーション解析には、R package [rrBLUP]を使用した。第８染色体の４０ｃＭ近傍領域（図１に示す矢印の位置）のマーカーにおいて、有意水準を上回る－ｌｏｇ（ｐ）値を検出した。結果を図２に示す。図２は、実施例のアソシエーション解析結果を示す図である。
第８染色体の４０ｃＭ近傍領域における、第１マーカー～第４マーカーの４つのマーカーを選抜した。第１マーカー（CHR8_77892311）、第２マーカー（Scaffold_9797_10963）、第３マーカー（CHR8_82152739）、及び第４マーカー（Scaffold_62471_59198）の詳細を表５にし、各マーカーのプライマー配列及び増幅産物の配列を表６に示す。なお、表６中の増幅産物の配列は、参照配列から抽出した塩基配列情報である。
第１マーカーから第４マーカーのそれぞれについて、解析材料の各遺伝子型と球重の分布を比較し、スティール・ドゥワス(Steel-Dwass)の方法による多重検定を行った。結果を図３に示す。図３は、実施例１における、各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。
図３に示すように、第１マーカーにおいては、遺伝子型がＣのホモ接合型及びＣ/Ｔのヘテロ接合型である個体が、遺伝子型がＴのホモ接合型である個体と比較して、球重が有意に重かった。また、第２マーカーにおいては、遺伝子型がＴのホモ接合型及びＴ/Ｃのヘテロ接合型である個体が、遺伝子型がＣのホモ接合型である個体と比較して、球重が有意に重かった。第３マーカーにおいては、遺伝子型がＴＡＡのホモ接合型及びＴＡＡ/ＣＡＴのヘテロ接合型である個体が、遺伝子型がＣＡＴのホモ接合型である個体と比較して、球重が有意に重かった。第４マーカーにおいては、遺伝子型がＴのホモ接合型及びＴ/Ｃのヘテロ接合型である個体が、遺伝子型がＣのホモ接合型である個体と比較して、球重が有意に重かった。
〔実施例２〕
図３に示す、４マーカーが全てヘテロ型の個体を選抜し、その自殖後代の９９個体を東北農業研究センター内の圃場（盛岡）において、２０２１年に栽培した。収穫した各個体の鱗茎重を測定した。以下に示すように、サンガー法により４マーカーの遺伝子型を取得した。
各個体について、表６に示すプライマーセットを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの組成を表７に示し、ＰＣＲ条件を表８に示す。
ＰＣＲ増幅産物について、ＰＣＲ産物 ５に対してExo-SAP IT Express regent １を使用して、Exo-SAP IT処理を行い、残ったプライマー等のヌクレオチドを分解した。Exo-SAP IT処理条件を表９に示す。
Exo-SAP IT処理後のＰＣＲ産物を鋳型として、シーケンスＰＣＲ反応を行った。シーケンスＰＣＲ反応の組成を表１０に示し、ＰＣＲ条件を表１１に示す。
シーケンスＰＣＲ産物はエタノール沈殿後、１０μｌのホルムアミドに融解した。ホルムアミドに融解したシーケンスＰＣＲ産物について、ＤＮＡシーケンサー（ABI社 3730xl）での泳動を行い、波形データを取得した。４マーカーについて、各遺伝子型と球重の分布を比較し、スティール・ドゥワス(Steel-Dwass)の方法による多重検定を行った。結果を、図４に示す。図４は、実施例２における、各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。
また、第２マーカーについて、サンガー法による波形解析のデータを図５に示す。図５は、実施例２の第２マーカーの波形データを示す図である。
実施例２においても、実施例１と同様に、４つのマーカーが大玉性のタマネギの選抜において有用であることが示された。
〔実施例３〕
第１マーカー及び第４マーカーについて、ＫＡＳＰマーカーを作成し、遺伝子型の特定に用いた。ＫＡＳＰプライマーミックスを、１００μＭ アレル特異的ＦＡＭプライマー：１００ｕＭ アレル特異的ＨＥＸプライマー：１００μＭ 共通プライマーの比率が３：３：５の比率になるように調製した。プライマー配列を表１２に示す。
ＰＣＲ反応の組成を表１３に示し、ＰＣＲ条件を表１４に示す。KASP Master Mixとして、プライムテック製のKASP-TF V4.0 2X Master mix 96/384 Std Roxを用いた。
ＰＣＲ反応後、ＦＡＭ及びＨＥＸの蛍光量をリアルタイムＰＣＲ装置で測定し、ドットプロット図から遺伝子型を判定した。蛍光量の測定は、２５℃で１分間行った。結果を図６に示す。図６は、実施例３の第１マーカー及び第４マーカーの遺伝子型の判定結果を示す図である。図６に示すように、ＫＡＳＰマーカーにより、第１マーカー及び第４マーカーの遺伝子型が特定可能であった。
〔実施例４〕
第４マーカーについて、ＣＡＰＳマーカーを作成し、遺伝子型の特定に用いた。プライマー配列を表１５に示す。
ＰＣＲの組成及び条件を表１６及び表１７に示す。Taq DNA Polymeraseとして、NEB社製のTaq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer(M0267X)を用いた。
ＰＣＲ産物 ４μｌに、NEB社製のRsaI（#R0167S）を１ユニット及び１０×バッファを０．７μｌ添加して７μｌとし、３７℃で一晩制限酵素処理した。
ＴＢＥ溶液に４％（ｗ／ｖ）の濃度となるようにアガロースゲルを作成し、制限酵素処理したＰＣＲ産物を電気泳動した。ＰＣＲ産物の両側には１００ｂｐラダーを泳動した。結果を図７に示す。図７は、実施例４におけるアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
図７に示すように、ＣＡＰＳマーカーにより、第４マーカーの遺伝子型が特定可能であった。
〔実施例５〕
異なる２つのタマネギ品種（ＯＰＰ－６（農研機構育成）、もみじ３号）の交雑から育成した個体（Ｆ１）を自殖して、交雑後代集団（Ｆ２、２４５個体）を育成し、圃場で栽培した。収穫した各個体の球重を測定した。
４４１の分子マーカーを用いて、各個体の遺伝子型を取得した。４４１の分子マーカーのそれぞれに対するプライマーセットを１０個に分割し（１プライマープレックス：約４４プライマーセット）、プライマープレックスごとにマルチプレックスＰＣＲを行った（１ｓｔ ＰＣＲ）。１ｓｔ ＰＣＲの組成を表１８に示し、ＰＣＲ条件を表１９に示す。
１ｓｔ ＰＣＲ産物は、AMPure XP Reagentにより精製した。精製したテンプレートを１００倍希釈して、２ｎｄ ＰＣＲに用いた。２ｎｄ ＰＣＲでは、１ｓｔ ＰＣＲ産物に次世代シーケンサーでの解析用のアダプター配列及び個体識別用のバーコード配列を添加した。２ｎｄ ＰＣＲの組成を表２０に示し、ＰＣＲ条件を表２１に示す。
作成したＰＣＲ産物について、１９２検体と５３検体との２つに分割し、各々で１つにまとめて次世代シーケンサー（Thermo Fisher Scientific社Ion Torrent Proton system）により解析した。ソフトウェアTorrent Suite ver. 5（Thermo Fisher Scientific社）を用いて、得られた配列データを検体ごとに分けた後、各検体の配列データをリファレンス配列にマッピングした。ソフトウェアTorrent Variant Callerを用いて、各増幅領域内の多型情報(マーカー遺伝子型)を抽出した。
得られた各個体のマーカー遺伝子型を用いて、連鎖地図を作成した(ソフトウェア Join map 4.0)。作成した連鎖地図を図８に示す。各マーカーを連鎖群（染色体）ごとに分類し、連鎖群でのマーカー間の遺伝距離を推定した。連鎖地図に沿って各個体のマーカー遺伝子型を並べ替えた後、取得した球重を用いてＱＴＬ解析を行った（ソフトウェアR/qtl）。解析結果を図９に示す。
図９に示すピーク近傍の５つのマーカーを選抜した。第８マーカー（CHR8_82147275）は、第３マーカー近傍のＳＮＰであり、第９マーカー（Scaffold_62471_59187）は、第４マーカー近傍のＳＮＰである。第５マーカー～第９マーカーの５つのマーカーと、比較として用いた第１マーカーとの詳細を表２２に示し、各マーカーのプライマー配列及び増幅産物の配列を表２３に示す。なお、表２３中の増幅産物の配列は、参照配列から抽出した塩基配列情報である。
５つのマーカーそれぞれについて、遺伝子型と球重との分布を比較し、スティール・ドゥワス(Steel-Dwass)の方法による多重検定を行った。結果を図１０に示す。図１０は、実施例５における各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。
図１０においては、比較としての第１マーカーと、第５マーカーから第９マーカーの結果を示す。第１マーカーから第９マーカーまでのマーカーのうち、最も遺伝距離が離れている第１マーカーと第９マーカーとは、５ｃＭ程度離れていた。また、実施例１の第３マーカーと第８マーカーとの間の距離は５４６４ｂｐであり、実施例１の第４マーカーと第９マーカーとの間の距離は１１ｂｐであった。
図１０に示すように、第５マーカーから第９マーカーについても、第１マーカーから第４マーカーと同様に、大玉性のタマネギの選抜に有用であった。
〔実施例６〕
大玉性のタマネギを判別するための候補マーカーとして、第１０～２６のマーカーを選抜した。各マーカーについて、第１～第４マーカーのいずれかからの距離を含む詳細を、表２４に示し、各マーカーのプライマー配列及び増幅産物の配列を表２５に示す。表２４に示すように、第１０マーカーは第１マーカーとの距離１０ｋｂ程度であり、第１１～２６マーカーは、それぞれ第１～第４マーカーのいずれかからの距離が１０ｋｂ以内である。
第１８～第２０マーカーについて、アガロースゲル電気泳動及びフラグメント解析を行なった。まず、第１８～第２０マーカーのそれぞれに対するプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ組成及び条件を表２６及び表２７に示す。
得られたＰＣＲ産物の全量を４％アガロースゲル（3％Sigma Type I-A, low EEO+1% LONZA MetaPhor）にアプライし、２段、３：１ゲル、２５０Ｖの条件において２時間電気泳動した。結果を図１１に示す。図１１は、第１８～第２０マーカーの３つのマーカーのアガロース電気泳動の結果を示す図である。図１１に示すように、第１８～第２０マーカーの電気泳動により、これらのマーカーの遺伝子型が特定可能であった。
次に、第１８～第２０マーカーのフラグメント解析を以下の通り行なった。まず、第１８～第２０マーカーのそれぞれに対するプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ組成及び条件を表２８及び表２９に示す。
電気泳動用プレートを作製した。まず、HiDi-Formamide(Thermo/4311320) １０００μｌと、GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 (Thermo/4408399) １０μｌとを混合して、懸濁液を作成した。９６ウエルＰＣＲプレートに作製した懸濁液を１０μｌずつ分注し、さらに、ＰＣＲ産物を０．５μｌ添加した。空きウエルには滅菌水を１０μｌ分注した。ＰＣＲプレートを９５℃で５分加熱処理した後、氷上において急冷した。準備した電気泳動用プレートについて、ＡＢＩ３７３０シーケンサーを用いて電気泳動した。電気泳動条件を表３０に示す。
電気泳動により得られた結果について、GeneMapper software（Applied Biosystems社製）を用い、フラグメントデータ解析を行った。結果を図１２に示す。図１２に示すように、第１８～第２０マーカーのフラグメント解析により、これらのマーカーの遺伝子型が特定可能であった。
第１３～第１７マーカーについて、フラグメント解析を行なった。まず、第１３～第１７マーカーのそれぞれに対するプライマーセットを用いて、各々ＰＣＲを行った。ＰＣＲ組成及び条件を表３１及び表３２に示す。
電気泳動用プレートを作製した。まず、HiDi-Formamide(Thermo/4311320) １０００μｌと、GeneScan 600 LIZ dye Size Standard v2.0 (Thermo/4408399) １０μｌとを混合して、懸濁液を作成した。９６ウエルＰＣＲプレートに作製した懸濁液を１０μｌずつ分注し、さらに、ＰＣＲ産物を０．５μｌアプライした。空きウエルには滅菌水を１０μｌ分注した。ＰＣＲプレートを９５℃で５分加熱処理した後、氷上において急冷した。準備したＰＣＲプレートについて、ＡＢＩ３７３０シーケンサーを用いて電気泳動した。電気泳動条件を表３３に示す。
電気泳動により得られた結果について、GeneMapper software（Applied Biosystems社製）を用い、フラグメントデータ解析を行った。結果を図１３及び１４に示す。図１３及び１４に示すように、第１３～第１７マーカーのフラグメント解析により、これらのマーカーの遺伝子型が特定可能であった。
また、遺伝子型と球重との分布を比較し、スティール・ドゥワス(Steel-Dwass)の方法による多重検定を行った。結果を図１５に示す。図１５は、実施例６における各マーカーの遺伝子型毎の球重を示す図である。図１５に示すように、第１８～２０マーカーは、第１～４マーカーと同様に大玉性のタマネギの判別に有用であることが示された。第１８～２０マーカーは、いずれも第３マーカーとの距離が１０ｋｂ以内である。第１０マーカーは第１マーカーとの距離が１０ｋｂ程度であり、第１１～１７、２１～２６マーカーについても、第１～４マーカーのいずれかとの距離が１０ｋｂ以内であるため、これらのマーカーについても、第１～４、１８～２０マーカーと同様に大玉性のタマネギの判別に有用であると推察される。
本発明は、農業分野、植物育種分野等に利用することができる。

Claims (8)

  1. タマネギ種植物における球重の程度を判定する方法であって、
    タマネギ種植物において、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基：
    （ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
    （ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
    （ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基；及び
    （ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
    から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを、タマネギ種植物における球重に関する分子マーカーとして判定する工程を含む、方法。
  2. 前記分子マーカーは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基から１０ｋｂの範囲内にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分子マーカーは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記判定する工程において、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーを用いて、前記タマネギ種植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅する、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 大玉性のタマネギ種植物を製造する製造方法であって、
    タマネギ種植物において、請求項１又は２に記載された方法によって、大玉性のタマネギ種植物を選抜する選抜工程
    を含む、製造方法。
  6. 前記選抜工程において選抜された大玉性のタマネギ種植物の後代において、前記選抜工程を１又は複数回繰り返し行う、請求項５に記載の製造方法。
  7. タマネギ種植物における球重に関する分子マーカーであって、
    下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基（ＳＮＰ）：
    （ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
    （ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
    （ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基の塩基；及び
    （ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
    から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを含む、分子マーカー。
  8. 大玉性のタマネギ種植物を判定するための判定キットであって、
    タマネギ種植物において、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかの塩基に相当する塩基：
    （ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１２５番目の塩基；
    （ｂ）配列番号２に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５７番目の塩基；
    （ｃ）配列番号３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの１１５番目又は１１７番目の塩基の塩基；及び
    （ｄ）配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドの４５番目の塩基；
    から５ｃＭ以内の遺伝距離にある塩基の少なくとも１つ、又は、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチドを含む領域を増幅するプライマーを含む、判定キット。
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