JP2022046306A - キク白さび病抵抗性を判定する方法、製造方法、分子マーカー、キク白さび病抵抗性関連遺伝子、キク白さび病抵抗性のキク属植物 - Google Patents
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Abstract
【課題】キク属の植物におけるキク白さび病抵抗性を判定するための技術を提供する。【解決手段】キク白さび病抵抗性を判定する方法であって、キク属（Chrysanthemum属）の植物において、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：（ａ）特定の塩基配列に示す６３番目の塩基に相当する塩基；（ｂ）上記の特定の塩基配列とは異なる特定の塩基配列に示す２１番目の塩基に相当する塩基；をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む、方法。【選択図】なし
Description
本発明は、キク白さび病抵抗性を判定する方法、製造方法、分子マーカー、キク白さび病抵抗性関連遺伝子、キク白さび病抵抗性のキク属植物に関する。
キク白さび病は、キクの葉の裏面に淡黄色の隆起やピンクがかった小膿疱を形成する病害である。この病害は、１８９５年に日本で最初に発見されたＰｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ菌に感染することで発生し、現在では世界中に広がっている。Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ菌は、多くのキク種に感染する。キクは、世界中で最も重要な観賞用植物の１つである栽培品種であり、切り花、鉢物、及び庭園植物として提供されている。キク白さび病は、キクの商業生産において重大な経済的損失をもたらすものであり、防除技術が不可欠である。
Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ菌は殺菌剤耐性体の数が増加しており、登録された殺菌剤の数が減少していることから、化学的な制御は困難である（非特許文献１）。さらに、湿度を低下させる等の環境制御は、露地栽培や半被覆栽培の場合には適用できず、常に適用可能ではない。
病害制御の最も効果的な方法の一つは、抵抗性栽培品種を用いることである。抵抗性キク品種は広く研究されている。そのような研究にはキク白さび病抵抗性の遺伝様式の知見が含まれ、単一の顕性遺伝子を有する抵抗性品種の多くが見いだされている（非特許文献２）。
Cook，R.T.A., Plant Pathol. 50: 792，2001
De Jong, J. and W. Rademaker, Euphytica，35: 945-952，1986
非特許文献１及び２に記載したように、キク白さび病に対して様々な研究がなされているが、これまでのところ、キク白さび病抵抗性育種に利用可能な、キク白さび病抵抗性に関連するＤＮＡマーカーは知られていない。キク栽培品種であるイエギク種（Chrysanthemum morifolium）は同質６倍体ゲノムを有し、この複雑なゲノムでは、２つの対立遺伝子における一遺伝子性遺伝とした場合、単一の遺伝子座において全部で７の異なる対立遺伝子パターンが生成され得る。このように、マーカーの分離パターンが複雑となることから、キク白さび病抵抗性に関連するＤＮＡマーカーの開発は遅れている。
キク白さび病抵抗性に関連するＤＮＡマーカーは、キク白さび病抵抗性育種におけるマーカー支援育種（ＭＡＳ）として用いられ、キク属の植物におけるキク白さび病抵抗性の判定に有益である。
本発明の一態様は、キク属の植物におけるキク白さび病抵抗性を判定するための技術の提供を実現することを目的とする。
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、キク属（Chrysanthemum属）の植物において、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；
をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む、方法である。
（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；
をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む、方法である。
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する製造方法は、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物と、他のキク属の植物とを交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、上記キク白さび病抵抗性を判定する方法によって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程とを含む、製造方法である。
本発明の一態様に係るキク属の植物における、キク白さび病抵抗性に関する分子マーカーは、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該相当する塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；
である、分子マーカーである。
（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；
である、分子マーカーである。
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性関連遺伝子は、上記分子マーカーに連鎖しており、ゲノム上で当該分子マーカーからの距離が２Ｍ以内に位置している。
本発明の一態様に係るキク属植物は、上記キク白さび病抵抗性関連遺伝子を有する、上記製造方法によって得られる、キク白さび病抵抗性のキク属植物である。
本発明の一態様によれば、キク属の植物におけるキク白さび病抵抗性を判定する技術を提供することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、又は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記を使用する。
本発明の一形態は、キク属の植物におけるキク白さび病抵抗性を判定するための技術である。本発明の一形態は、キク属の植物のゲノムに存在する、キク白さび病に対する抵抗性又は感受性を決定するキク白さび病抵抗性遺伝子の遺伝子型を判定することで、キク属の植物における白さび病抵抗性を判定する。
キク属の植物は、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ属の植物であり、例えば、イエギク種（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）に属する植物であり得る。イエギク種の中でもスプレー菊に分類される植物であり得る。
また、キク属の植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物であり得る。育種素材の候補植物としては、例えば、交配に用いる親植物、及び、遺伝子組換え技術を利用した分子育種に用いられる植物が含まれる。また、育種のプロセスで得られた植物としては、例えば、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ属の植物を属内交雑した植物、イエギク種に属する植物を種内交雑した植物、及びこれらの後代系統である。また、キク属の植物は、イエギク種に属する植物とキク属の野生種との交雑植物のように種間交雑した植物、及びその後代系統であってもよい。さらに、キク属の植物は、“サザンペガサス”品種の植物であるか、当該品種の植物と、他のイエギク種に属する植物との交雑植物又はその後代系統であり得る。
本明細書において、植物とは、植物体の一部又は全部であってもよい。植物体の一部としては、例えば、繁殖素材（例えば、葉、枝、種子等）等が挙げられる。
キク白さび病は、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ菌（以下、キク白さび病菌ともいう）に感染することでキクに病斑が形成される病気を意味している。また、キク白さび病抵抗性とは、キク白さび病菌への感染による病斑の形成及び拡大を抑制又は阻害する能力、を意図している。したがって、キク白さび病抵抗性を示す植物は、キク白さび病菌に感染もしくはキク白さび病菌を接種しても病斑が全く発生しない若しくはごく少量の病斑しか発生しない、または、発生した病斑が拡大しないことが意図される。図１に示すように、罹病性品種においてキク白さび病に罹患した葉には病斑が見られるが、抵抗性の“サザンペガサス”では葉に病斑が見られない。
イエギク種に属する植物は、５４の染色体を有する同質６倍体である。イエギク種に属する植物における各染色体は、例えば、ゲノムの塩基配列情報は、キクタニギク種（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｅｔｉｃｕｓｐｅ）のゲノム（ＣＳＥ＿ｒ１．０）の塩基配列情報を参照して決定することができる。キクタニギク種のゲノムの塩基配列情報は、例えば、ＭｕｍＧＡＲＤＥＮのｗｅｂサイト（http://mum-garden.kazusa.or.jp）から入手可能である。
〔キク白さび病抵抗性に関する分子マーカー〕
本発明の一態様に係る分子マーカーは、キク属植物における、キク白さび病抵抗性に関する分子マーカーであって、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該相当する塩基を含む連続したポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；である。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、キク属植物における、キク白さび病抵抗性に関する分子マーカーであって、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該相当する塩基を含む連続したポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；である。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、キク属植物におけるキク白さび病抵抗性遺伝子を規定する分子マーカーである。このような分子マーカーには、ＳＮＰマーカー、ＡＦＬＰ（分子増幅断片長多型）マーカー、ＲＦＬＰマーカー、マイクロサテライトマーカー、ＳＣＡＲマーカー、ＣＡＰＳマーカー等が含まれる。ＳＮＰマーカーは、１個のＳＮＰであってもよいし、２個以上のＳＮＰの組み合わせであってもよい。本発明の一態様に係る分子マーカーは、キク属植物におけるキク白さび病抵抗性の判定に利用することができる。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、（ｉ）ＳＮＰに相当する塩基自体、（ｉｉ）ＳＮＰを含む連続したポリヌクレオチド、又は、（ｉｉｉ）２つのＳＮＰ間の領域の連続したポリヌクレオチドであり得る。
（ｉ：ＳＮＰマーカー）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰマーカーであり得る。ＳＮＰは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰマーカーであり得る。ＳＮＰは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に一塩基の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。
「配列番号Ｘ（Ｘ＝１～２）で表される塩基配列（塩基配列Ｘとする）のＹ番目（Ｘ＝１のときＹは６３、Ｘ＝２のときＹは２１）の塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーである。「配列番号Ｘで表される塩基配列のＹ番目の塩基に相当する塩基」とは、本実施例に記載されたＳＮＰマーカーと同一視できるＳＮＰマーカーである。塩基配列Ｘは、基準となるキク属の植物（“サザンペガサス”）由来の塩基配列であり、他のキク属の植物においては、ＳＮＰマーカーの部分以外でも塩基配列が異なる部分が含まれ得る。
すなわち、他のキク属の植物において、塩基配列Ｘに対応する塩基配列Ｘ’（すなわち植物間で高度に保存されている塩基配列）が存在する場合、「配列番号Ｘで表される塩基配列のＹ番目の塩基に相当する塩基」とは、ホモロジー検索等の手法によって、Ｙ番目の塩基に相当するとされた塩基配列Ｘ’上の塩基を指す。例えば、後述する（ａ２）や（ａ３）に記載のポリヌクレオチドや、（ｂ２）や（ｂ３）に記載のポリヌクレオチドが示す塩基配列が、塩基配列Ｘ’の一例である。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、例えば、本実施例に記載されたＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６及びＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９である。ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６及びＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９は、本発明者らが新たに同定したＳＮＰマーカーであり、当業者は、これらのＳＮＰマーカーの塩基配列に基づき、当該ＳＮＰマーカーのゲノム上の位置を特定することができる。
ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６（以下、ＳＮＰ（ａ）ともいう）は、配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基がＡである多型を示している。すなわち、ＳＮＰ（ａ）がＡであるとき、キク属植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。
ＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９（以下、ＳＮＰ（ｂ）ともいう）は、配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基がＣである多型を示している。すなわち、ＳＮＰ（ｂ）がＣであるとき、キク属植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。
本発明の一態様に係る分子マーカーとして、ＳＮＰ（ａ）とＳＮＰ（ｂ）とを組み合わせて用いてもよい。例えば、ＳＮＰ（ａ）がＡであり、かつ、ＳＮＰ（ｂ）がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定してもよい。このように、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）をハプロタイプブロックとして解析してもよい。
（ｉｉ：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ａ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ａ）は、（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ａ２）配列番号１の塩基配列において、６３番目の塩基以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ａ３）配列番号１の塩基配列において、６３番目の塩基以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ａ）におけるＳＮＰ（ａ）に相当する塩基がＡであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ａ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ａ）は、（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ａ２）配列番号１の塩基配列において、６３番目の塩基以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ａ３）配列番号１の塩基配列において、６３番目の塩基以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ａ）におけるＳＮＰ（ａ）に相当する塩基がＡであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。
前記（ａ１）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１に示す塩基配列に基づき、キク白さび病抵抗性を有する抵抗性植物（例えば、抵抗性の“サザンペガサス”）から得ることができる。
前記（ａ２）のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に、数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入または付加）を含むものであり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したデータベースに登録されているキクタニギク種のゲノム配列を参照することにより、又は、抵抗性植物のゲノム上におけるＳＮＰの近傍領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
前記（ａ３）のポリヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に対して、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するものであり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントとすることによって決定することができる。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ｂ）を含む連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｂ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｂ）は、（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド、（ｂ２）配列番号２の塩基配列において、２１番目の塩基以外の塩基配列に対して、１又は数個の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチド、又は、（ｂ３）配列番号２の塩基配列において、２１番目の塩基以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、キク属植物のキク白さび病抵抗性を判定する機能を有するポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド（ｂ）におけるＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。
前記（ｂ１）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２に示す塩基配列に基づき、抵抗性植物から得ることができる。
前記（ｂ２）のポリヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に、数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入または付加）を含むものであり得る。このようなポリヌクレオチドの塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、上述したデータベースに登録されているキクタニギク種のゲノム配列を参照することにより、又は、抵抗性植物のゲノム上におけるＳＮＰの近傍領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
前記（ｂ３）のポリヌクレオチドは、配列番号２に示す塩基配列において、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基は保存され、それ以外の塩基配列に対して、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するものであり得る。このような塩基配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、２つの塩基配列をアライメントとすることによって決定することができる。
なお、ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）は、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）を含む領域を増幅するプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ増幅産物であり得る。
本発明の一態様に係る分子マーカーとして、ポリヌクレオチド（ａ）とポリヌクレオチド（ｂ）とを組み合わせて用いてもよい。例えば、ポリヌクレオチド（ａ）におけるＳＮＰ（ａ）に相当する塩基がＡであり、かつ、ポリヌクレオチド（ｂ）におけるＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定してもよい。このように、ポリヌクレオチド（ａ）及びポリヌクレオチド（ｂ）をハプロタイプブロックとして解析してもよい。
（ｉｉｉ：２つのＳＮＰ間のポリヌクレオチド）
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）とＳＮＰ（ｂ）との２つのＳＮＰ間の領域の連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｃ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｃ）は、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）のいずれかの部位を含んでいることが好ましい。ポリヌクレオチド（ｃ）は、例えば、抵抗性植物における対応するＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）のＳＮＰ間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド（ｃ）の塩基配列は、抵抗性植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。
本発明の一態様に係る分子マーカーは、ＳＮＰ（ａ）とＳＮＰ（ｂ）との２つのＳＮＰ間の領域の連続したポリヌクレオチド（以下、ポリヌクレオチド（ｃ）ともいう）であってもよい。ポリヌクレオチド（ｃ）は、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）のいずれかの部位を含んでいることが好ましい。ポリヌクレオチド（ｃ）は、例えば、抵抗性植物における対応するＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）のＳＮＰ間の領域を参照することで得られる。ポリヌクレオチド（ｃ）の塩基配列は、抵抗性植物の塩基配列と少なくとも部分的に一致する。
上述した分子マーカーを用いてキク属植物においてキク白さび病抵抗性を判定する方法としては特に限定されず、例えば、ＳＮＰを検出する公知のＳＮＰ分析方法を用いることができる。このような公知のＳＮＰ分析方法には、キク属植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が含まれる。なお、上述した分子マーカーは、６倍体のキク属植物における６ゲノムのうちの少なくとも１つで見られればよく、６ゲノムのうちの少なくとも１つで抵抗性の遺伝子型であれば、抵抗性ありと判定できる。
すなわち、ＳＮＰ（ａ）又はＳＮＰ（ｂ）を含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、キク属植物の被検体のＤＮＡにおける前記領域を増幅してもよい。キク属植物の被検体のＤＮＡにおける前記領域の増幅は、キク属植物の被検体から抽出したＤＮＡを鋳型にして、ＳＮＰを含む領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことができる。そして、得られた増幅断片におけるＳＮＰの塩基（遺伝子型）を決定し、決定された塩基（遺伝子型）とキク白さび病抵抗性との関係を示すデータに基づいて、キク属植物におけるキク白さび病抵抗性を判定する。
ＰＣＲにおいて用いるプライマーセットは、標的のＳＮＰを含む領域のＤＮＡ断片を増幅することができるものである限り、特に限定されず、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計してもよい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、好ましくは、２００塩基対（ｂｐ）以下、１５０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、又は１００ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計する。プライマーセットは、フォワードプライマーである第１のプライマーと、リバースプライマーである第２のプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、または１９ｂｐ以上であってもよく、５０塩基ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、または３０ｂｐ以下であってもよい。
ＳＮＰ（ａ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１のプライマーと、配列番号４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、キク白さび病抵抗性のキク属植物においては配列番号５に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ａ）に相当する塩基を検出することができる。
ＳＮＰ（ｂ）を含む領域を増幅するプライマーセットは、例えば、配列番号６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第３のプライマーと、配列番号７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第４のプライマーとからなる、プライマーセットである。このプライマーセットを用いることで、キク白さび病抵抗性のキク属植物においては配列番号８に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、ＳＮＰ（ｂ）に相当する塩基を検出することができる。
また、プライマーセットは、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）の両方を含む領域を増幅するプライマーセットであることが好ましい。これにより、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）をハプロタイプブロックとして解析することができる。
〔キク白さび病抵抗性関連遺伝子〕
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性関連遺伝子は、上述したいずれかの分子マーカーに連鎖しており、ゲノム上で当該分子マーカーからの距離が２ｃＭ以内に位置している。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性関連遺伝子は、上述したいずれかの分子マーカーに連鎖しており、ゲノム上で当該分子マーカーからの距離が２ｃＭ以内に位置している。
キク白さび病抵抗性関連遺伝子は、キク白さび病抵抗性を供与する質的形質遺伝子を意味しており、ＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）の少なくとも一方に連鎖している。キク白さび病抵抗性関連遺伝子は、キク属植物のゲノム上におけるこれらのＳＮＰからの遺伝距離が２ｃＭ以内に位置していることが好ましく、１ｃＭ以内であることがより好ましい。例えば、キク白さび病抵抗性関連遺伝子は、ＳＮＰ（ａ）からの距離が０．８ｃＭであり、ＳＮＰ（ｂ）からの距離が１．９ｃＭである。キク白さび病抵抗性関連遺伝子は、キク属植物のゲノム上において、ＳＮＰ（ａ）とＳＮＰ（ｂ）との間に位置している。
キク白さび病抵抗性関連遺伝子は、キク属植物におけるキク白さび病抵抗性の有無を判定することができる。キク属植物の被検体において、キク白さび病抵抗性関連遺伝子の有無を検出することで、キク属植物におけるキク白さび病抵抗性を判定することができる。キク属植物の被検体において、キク白さび病抵抗性関連遺伝子の有無を検出する方法は特に限定されず、上述した分子マーカーを用いて従来公知の方法により検出することができる。
また、キク白さび病抵抗性関連遺伝子をキク属植物に導入することで、キク属植物にキク白さび病抵抗性を付与することもできる。キク白さび病抵抗性関連遺伝子をキク属植物に導入する方法は特に限定されず、従来公知の遺伝子工学的手法を採用することができる。
〔キク白さび病抵抗性のキク属植物〕
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性のキク属植物は、上述のキク白さび病抵抗性関連遺伝子を有し、後述する製造方法によって得られる植物である。キク白さび病抵抗性のキク属植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したキク白さび病抵抗性関連遺伝子領域を有し、キク白さび病に対して抵抗性を示す植物である。
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性のキク属植物は、上述のキク白さび病抵抗性関連遺伝子を有し、後述する製造方法によって得られる植物である。キク白さび病抵抗性のキク属植物は、上述した分子マーカーで特定される上述したキク白さび病抵抗性関連遺伝子領域を有し、キク白さび病に対して抵抗性を示す植物である。
本発明の一態様に係るキク白さび病抵抗性のキク属植物は、後述する製造方法に示すように、キク白さび病抵抗性を有するキク属植物と、他のキク属の植物とを交雑して得られた植物及びその後代系統から、上述した分子マーカーを用いてキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別することで得られる。なお、キク白さび病抵抗性関連遺伝子を遺伝子工学的に導入したキク白さび病抵抗性のキク属植物についても、本発明の範疇に含まれる。
〔キク白さび病抵抗性を判定する方法〕
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、キク属（Chrysanthemum属）の植物において、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、キク属（Chrysanthemum属）の植物において、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、上述したＳＮＰ（ａ）及びＳＮＰ（ｂ）、並びに、ポリヌクレオチド（ａ）～ポリヌクレオチド（ｃ）のいずれかの分子マーカーを用いて、キク属植物の被検体において、キク白さび病抵抗性を判定する。本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、キク属植物の被検体のゲノム上において、キク白さび病抵抗性関連遺伝子の有無を上述した分子マーカーにより特定することで、キク属植物の被検体のキク白さび病に対する抵抗性の有無を判定する。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法において、キク属植物の被検体は、キク白さび病抵抗性の有無が不明なキク属植物であり、例えば、キク白さび病抵抗性のキク属植物とキク白さび病感受性のキク属植物との交雑植物及びその後代系統であり得る。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、上述したいずれかの分子マーカーを用いて、キク白さび病抵抗性を判定する。すなわち、本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、（ａ’）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基がＡであるとき、又は、（ｂ’）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定することができる。また、本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基がＡであり、かつ、配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定してもよい。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法において用いる分子マーカーの詳細については、上述した本発明の一形態に係る分子マーカーの説明を援用する。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法において、分子マーカーを用いてキク属植物のキク白さび病抵抗性を検査する方法としては特に限定されず、公知のＳＮＰ分析方法を用いることができ、例えば、キク属植物の被検体のＰＣＲ増幅断片中のＳＮＰを検出することによりＳＮＰ分析する方法が挙げられる。すなわち、本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法は、前記検査する工程において、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、前記植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅してもよい。このようなプライマーセットの詳細については、上述したプライマーセットの説明を援用する。
ＳＮＰ分析におけるＰＣＲは、単独のプライマーセットを含む反応系でＤＮＡ断片を増幅するシングルプレックスＰＣＲ、または、複数のプライマーセットを含む反応系で遺伝子増幅するマルチプレックスＰＣＲ、のいずれであってもよい。マルチプレックスＰＣＲの場合は、異なる波長を有する蛍光物質（例えば、ＮＥＤ、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＥＴ）により標識したプライマーセットを混合してもよい。
ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程および伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、および、変性工程とアニーリングおよび伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。ＰＣＲ反応条件の一例としては、９０～１００℃で４０～６０秒（例えば、９５°Ｃで５０秒）、９０～１００℃（例えば、９５℃）で５秒の３０～６０サイクル（例えば、４０サイクル）、アニーリング１０～２０秒（例えば、１５秒）、及び６５～８０℃で１０～３０秒（例えば、７２℃で２０秒）。アニーリング温度は、６０～７０℃（例えば、６６℃）の初期アニーリング温度から５０～６０℃（例えば、５６℃）の最終アニーリング温度まで、所定サイクル毎に段階的に低下させる条件が挙げられる。鋳型となるＤＮＡの状態に応じて、ＳＮＰを安定的に検出するために、ＰＣＲ反応条件を調整してもよい。
ＳＮＰ分析におけるＰＣＲとして、ＰＣＲによる増幅およびＳＮＰマーカーの特定を行うＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法のようなリアルタイムＰＣＲを用いてもよい。すなわち、プライマーセットを用いて増幅した増幅断片に含まれるＳＮＰを検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをさらに用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ法を用いることにより、高処理能力の識別方法を提供することができる。なお、ＰＣＲにより増幅した増幅断片においてＳＮＰを特定する方法としては、自動ＤＮＡシークエンサー等を用いて増幅断片の塩基配列を決定することにより、解析してもよい。
キク属植物の被検体から、ＰＣＲにより増幅するＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。被検体の種類および夾雑物の量等に応じて、ＤＮＡ抽出工程の前に、適宜に前処理を行ってもよい。また、被検体から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲ反応において鋳型として用いるために、必要に応じて洗浄または精製してもよい。さらに、被検体から抽出されたＤＮＡを２種類の制限酵素で消化した制限酵素切断断片をＰＣＲにより増幅してもよい。
本発明の一形態に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法によれば、分子マーカーによりキク属植物におけるキク白さび病抵抗性の有無を判定することができるので、判定結果に基づきキク白さび病抵抗性のキク属植物及びその後代系統を選抜することができる。
〔製造方法〕
本発明の一形態に係る製造方法は、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する方法であって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物と、他のキク属の植物とを交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、上述したキク白さび病抵抗性を判定する方法によって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程とを含む。
本発明の一形態に係る製造方法は、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する方法であって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物と、他のキク属の植物とを交雑する交雑工程と、前記交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、上述したキク白さび病抵抗性を判定する方法によって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程とを含む。
したがって、上述した分子マーカー、キク白さび病抵抗性関連遺伝子、キク白さび病抵抗性のキク属植物、及びキク白さび病抵抗性を判定する方法に関する説明を、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する方法の説明に援用する。
交雑工程において、親植物として使用するキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物は、本発明に係るキク白さび病抵抗性のキク属植物であり得る。また、交雑工程において用いるキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物は、本発明に係るキク白さび病抵抗性を判定する方法により選抜されたキク白さび病抵抗性のキク属植物であってもよい。すなわち、本発明の一形態に係る製造方法は、前記交雑工程の前に、上述したいずれかのキク白さび病抵抗性を判定する方法により、被験キク属植物からキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程をさらに含み得る。
判別工程は、上述したいずれかのキク白さび病抵抗性を判定する方法により、交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、上述したキク白さび病抵抗性を判定する。
本発明の一形態に係る製造方法によれば、分子マーカーによりキク属植物におけるキク白さび病抵抗性の有無を判定し、判定結果に基づき選抜したキク白さび病抵抗性のキク属植物を製造することができる。
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔材料及び方法〕
（植物材料及びＤＮＡ抽出）
Ｆ１母集団を、感受性“ＮＡＲＯ＿ｃｇｓ０３０２０３３”と抵抗性“サザンペガサス”との交配種由来とした。合計１２８個のＦ１苗を、市販の園芸用の土（クレハ園芸培土、クレハ化学製）を含むプラスチックポット（内径１２ｃｍ、ポット１個あたり１苗）に植え、１８℃～２５℃、自然日長＋６時間の暗期中断条件の温室内で、採穂用株として維持した。ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて、茎頂（生重量３０ｍｇ）からゲノムＤＮＡを抽出した。
（植物材料及びＤＮＡ抽出）
Ｆ１母集団を、感受性“ＮＡＲＯ＿ｃｇｓ０３０２０３３”と抵抗性“サザンペガサス”との交配種由来とした。合計１２８個のＦ１苗を、市販の園芸用の土（クレハ園芸培土、クレハ化学製）を含むプラスチックポット（内径１２ｃｍ、ポット１個あたり１苗）に植え、１８℃～２５℃、自然日長＋６時間の暗期中断条件の温室内で、採穂用株として維持した。ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて、茎頂（生重量３０ｍｇ）からゲノムＤＮＡを抽出した。
（キク白さび病に対する植物の感受性／抵抗性の表現パターンの検査）
キク白さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ）を含む罹病葉を、２０１７年に農研機構において育成した“フローラル優香”植物から回収し、接種材料源として用いた。単一の冬胞子堆を用いて、無病の“秀芳の力”植物体に接種し、その後継代維持した。
キク白さび病菌（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｈｏｒｉａｎａ）を含む罹病葉を、２０１７年に農研機構において育成した“フローラル優香”植物から回収し、接種材料源として用いた。単一の冬胞子堆を用いて、無病の“秀芳の力”植物体に接種し、その後継代維持した。
キク白さび病菌の接種試験は、生育チャンバ内において発泡スチロール箱（長さ５０．８ｃｍ×幅３６．０ｃｍ×深さ３４．９ｃｍ）を用いて行った。Ｆ１集団の各個体及び両親の未発根穂木を、園芸培地（Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ ３６０；Ｓｃｏｔｔｓ製）を含む２００穴のセルトレイに挿し、発泡スチロール箱の底に置いた。箱の上部開口をプラスチックネット（５ｍｍメッシュ）により覆った。“秀芳の力”の発病葉を約１ｃｍ２の小片に切断し、３ｃｍ×３ｃｍの密度として、ネット上に冬胞子堆を下に向けて配置した。高湿度条件を確保するために、切片、箱の内側、及び接種材料を保持するネットに、スプレー器を用いて脱塩水を噴霧した。箱を密閉し、１９℃暗黒とした生育チャンバ内に搬入した。接種開始から１６時間後に、２００穴のセルトレイをプラスチックの透明容器（長さ３７．５ｃｍ×幅２４．７ｃｍ×高さ１２．９ｃｍ）内に入れ、生長チャンバ内に搬入し、２２℃・１６時間の明期条件で維持した。病徴を、接種後２８日間評価した。
上記の接種試験を３回行った。３回の分析において病徴が視認されなかったＦ１植物は、さらに３回の追加の分析を行った。植物上に少なくとも１つの冬胞子堆がいずれかの分析において観察された場合、「感受性（Ｓ）」とした。合計６回の分析を通して冬胞子堆が全く観察されなかった植物は、「抵抗性（Ｒ）」と評価した。
（ｄｄ－ＲＡＤ－Ｓｅｑ分析）
ｄｄ－ＲＡＤ－Ｓｅｑライブラリーを生成するために、ＰｓｔＩ及びＭｓｐＩの２つの制限酵素により、Ｆ１集団及びその親系統からのゲノムＤＮＡを消化した。ライブラリーのヌクレオチド配列を、ＨｉＳｅｑ４０００ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームにおいて決定した。
ｄｄ－ＲＡＤ－Ｓｅｑライブラリーを生成するために、ＰｓｔＩ及びＭｓｐＩの２つの制限酵素により、Ｆ１集団及びその親系統からのゲノムＤＮＡを消化した。ライブラリーのヌクレオチド配列を、ＨｉＳｅｑ４０００ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プラットフォームにおいて決定した。
（データ処理及びシンプレックスＳＮＰデータマイニング）
リード及びシンプレックスＳＮＰ決定のデータ処理を、以下に要約するように行ったｄｄ－ＲＡＤ－Ｓｅｑ分析から得たリードを、参照として用いたＣ． ｓｅｔｉｃｕｓｐｅのゲノム配列（ＣＳＥ＿ｒ１．０）上にマッピングした。ＳＮＰ候補を抽出し、得られた配列アライメントからＳＮＰを決定した。
リード及びシンプレックスＳＮＰ決定のデータ処理を、以下に要約するように行ったｄｄ－ＲＡＤ－Ｓｅｑ分析から得たリードを、参照として用いたＣ． ｓｅｔｉｃｕｓｐｅのゲノム配列（ＣＳＥ＿ｒ１．０）上にマッピングした。ＳＮＰ候補を抽出し、得られた配列アライメントからＳＮＰを決定した。
各ＳＮＰ座において、Ｆ１全個体のリードデータをプールし、各ＳＮＰ座において変異型塩基を有するリード数を総リード数によって割ることで、各位置の対立遺伝子頻度を算出した。対立遺伝子頻度及び集団内でのヘテロ個体の出現頻度にしたがって、シンプレックスＳＮＰ及びダブルシンプレックスＳＮＰを選択した。
（ゲノムワイド関連解析）
遺伝子型と表現型との間の関連性を、ＴＡＳＳＥＬプログラムを用いて、一般線形モデルにより分析した。
遺伝子型と表現型との間の関連性を、ＴＡＳＳＥＬプログラムを用いて、一般線形モデルにより分析した。
（連鎖解析）
連鎖解析をＪｏｉｎＭａｐ ４．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｋｙａｚｍａ Ｂ．Ｖ．製）により行った。キク白さび病抵抗性に有意に関連するＳＮＰマーカーのｄｄ－ＲＡＤ－ｓｅｑ遺伝子型データ及びキク白さび病抵抗性の表現型データをＪｏｉｎＭａｐ ４．１ ｓｏｆｔｗａｒｅにインポートし、初期回帰マッピングパラメータを用いてマップを構築した。
連鎖解析をＪｏｉｎＭａｐ ４．１ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｋｙａｚｍａ Ｂ．Ｖ．製）により行った。キク白さび病抵抗性に有意に関連するＳＮＰマーカーのｄｄ－ＲＡＤ－ｓｅｑ遺伝子型データ及びキク白さび病抵抗性の表現型データをＪｏｉｎＭａｐ ４．１ ｓｏｆｔｗａｒｅにインポートし、初期回帰マッピングパラメータを用いてマップを構築した。
（キク白さび病抵抗性連鎖ＳＮＰマーカー）
“サザンペガサス”におけるキク白さび病抵抗性に関連する２つのＳＮＰに対応する対立遺伝子特異的プライマーを設計した（表１）。
“サザンペガサス”におけるキク白さび病抵抗性に関連する２つのＳＮＰに対応する対立遺伝子特異的プライマーを設計した（表１）。
（独立集団におけるＳＮＰマーカーと抵抗性連鎖の有効性）
感受性“イエロークイン”と“サザンペガサス”との交配種由来の６３のＦ１植物の母集団を準備し、ＳＮＰマーカーが他の独立集団においても有効か否かを調査した。抵抗性連鎖ＳＮＰマーカーであるＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６を用いて、当該独立集団のキク白さび病に対する抵抗性及び遺伝子型を評価した。
感受性“イエロークイン”と“サザンペガサス”との交配種由来の６３のＦ１植物の母集団を準備し、ＳＮＰマーカーが他の独立集団においても有効か否かを調査した。抵抗性連鎖ＳＮＰマーカーであるＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６を用いて、当該独立集団のキク白さび病に対する抵抗性及び遺伝子型を評価した。
〔結果〕
（表現型データ）
接種開始後２８日目に病徴の評価を行った。キク白さび病感受性“ＮＡＲＯ＿ｃｇｓ０３０２０３３”と抵抗性“サザンペガサス”との交配種の１２８のＦ１個体は、抵抗性：感受性が７３：５５（おおむね１：１）に分離した。このことは、“サザンペガサス”がキク白さび病抵抗性に対して、単一の顕性遺伝子を有することを示している。
（表現型データ）
接種開始後２８日目に病徴の評価を行った。キク白さび病感受性“ＮＡＲＯ＿ｃｇｓ０３０２０３３”と抵抗性“サザンペガサス”との交配種の１２８のＦ１個体は、抵抗性：感受性が７３：５５（おおむね１：１）に分離した。このことは、“サザンペガサス”がキク白さび病抵抗性に対して、単一の顕性遺伝子を有することを示している。
（ＳＮＰ選抜）
１サンプルあたり約２．９Ｍの高品質リードを、Ｆ１母集団（ｎ＝１２８）及び親品種から得た。配列リードの８０．１％を参照ゲノムであるＣ．ｓｅｔｉｃｕｓｐｅのゲノム（ＣＳＥ＿ｒ１．０）にマッピングできた。合計７３，３３８のＳＮＰ候補を同定した。対立遺伝子頻度値及びカイ２乗検定（Ｐ＞０．０１）によりシンプレックスおよびダブルシンプレックスＳＮＰを選択した。
１サンプルあたり約２．９Ｍの高品質リードを、Ｆ１母集団（ｎ＝１２８）及び親品種から得た。配列リードの８０．１％を参照ゲノムであるＣ．ｓｅｔｉｃｕｓｐｅのゲノム（ＣＳＥ＿ｒ１．０）にマッピングできた。合計７３，３３８のＳＮＰ候補を同定した。対立遺伝子頻度値及びカイ２乗検定（Ｐ＞０．０１）によりシンプレックスおよびダブルシンプレックスＳＮＰを選択した。
１１，５１５のシンプレックスおよびダブルシンプレックスＳＮＰマーカーのＧＬＭ分析により、キク白さび病抵抗性に有意に関連する２２のＳＮＰマーカーを同定した。
（連鎖解析）
“サザンペガサス”においてキク白さび病抵抗性に関連する２１のシンプレックスＳＮＰは、連鎖解析によって１つの連鎖群を形成し、これらのＳＮＰマーカーが遺伝的に連鎖することが明らかとなった。“サザンペガサス”のキク白さび病抵抗性遺伝子の遺伝子座は、ＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９とＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６との間に位置し、前者から１．９ｃＭ、後者から０．８ｃＭの位置であった。ｄｄ－ＲＡＤ－ｓｅｑデータを用いたＧＷＡＳによると、これらのＳＮＰマーカーは、形質に有意に関連している（それぞれｐ＝２．１８×１０-２３及び２．８５×１０-３１）。
“サザンペガサス”においてキク白さび病抵抗性に関連する２１のシンプレックスＳＮＰは、連鎖解析によって１つの連鎖群を形成し、これらのＳＮＰマーカーが遺伝的に連鎖することが明らかとなった。“サザンペガサス”のキク白さび病抵抗性遺伝子の遺伝子座は、ＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９とＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６との間に位置し、前者から１．９ｃＭ、後者から０．８ｃＭの位置であった。ｄｄ－ＲＡＤ－ｓｅｑデータを用いたＧＷＡＳによると、これらのＳＮＰマーカーは、形質に有意に関連している（それぞれｐ＝２．１８×１０-２３及び２．８５×１０-３１）。
ｄｄ－ＲＡＤ－ｓｅｑは、ＳＮＰマーカーであるＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９及びＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６の遺伝子型が、感受性“ＮＡＲＯ＿ｃｇｓ０３０２０３３”では、それぞれＴ及びＧのホモ接合である。一方で、抵抗性“サザンペガサス”では、それぞれTTTTTC及びGGGGGAのヘテロ接合である。それゆえに、“GGGGGA”は、ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６のＳＮＰ部位における対立遺伝子のパターンであり、ＳＮＰの対立遺伝子及びＰｈｒ１遺伝子座は、“サザンペガサス”ゲノムにおける相引である。
（ＳＮＰマーカー－抵抗性関連性のＰＣＲ分析）
ＰＣＲ分析の結果（図２）、ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６の遺伝子型を決定した。１２８のＦ１植物において、ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６におけるホモ接合（GGGGGG）：ヘテロ接合（GGGGGA）の分離は、５２：７６であり、１：１に概ね一致していた。抵抗性の親由来のＡ対立遺伝子を有する７６個体のうち、７２のＦ１植物はキク白さび病抵抗性を表し、４のＦ１植物は感受性であった。感受性の親のＧ対立遺伝子を有する５２のＦ１植物のうち５１は感受性であったが、１のＦ１植物が抵抗性を示した。これらの結果は、５のＦ１植物においてＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６のＡ対立遺伝子とＰｈｒ１との間に組換えがあったことを示している。
ＰＣＲ分析の結果（図２）、ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６の遺伝子型を決定した。１２８のＦ１植物において、ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６におけるホモ接合（GGGGGG）：ヘテロ接合（GGGGGA）の分離は、５２：７６であり、１：１に概ね一致していた。抵抗性の親由来のＡ対立遺伝子を有する７６個体のうち、７２のＦ１植物はキク白さび病抵抗性を表し、４のＦ１植物は感受性であった。感受性の親のＧ対立遺伝子を有する５２のＦ１植物のうち５１は感受性であったが、１のＦ１植物が抵抗性を示した。これらの結果は、５のＦ１植物においてＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６のＡ対立遺伝子とＰｈｒ１との間に組換えがあったことを示している。
ＰＣＲ分析により、ＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９の遺伝子型を決定した。１２８のＦ１植物において、ＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９におけるホモ接合（ＡＡＡＡＡＡ）：ヘテロ接合（ＡＡＡＡＡＣ）の分離は、５１：７７であり、１：１に概ね一致していた。抵抗性の親由来の多型を有する７７個体のうち、６８のＦ１植物はキク白さび病抵抗性を表し、９のＦ１植物は感受性であった。感受性の親のＡ対立遺伝子を有する５１のＦ１植物のうち、４８は感受性であったが、３のＦ１植物が抵抗性を示した。これらの結果は、１２のＦ１植物においてＳＣＳＥ＿ＳＣ００３１８２．１＿５８５７９のＣ対立遺伝子とＰｈｒ１との間に組換えがあったことを示している。
（独立個体におけるＳＮＰマーカー－抵抗性連鎖の検証）
感受性“イエロークイン”と“サザンペガサス”とを交配して得られた集団において、キク白さび病抵抗性に対するＳＮＰマーカーＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６の連鎖を検証した。この集団におけるキク白さび病抵抗性の分離は、Ｒ：Ｓが３２：３１の比率であった。これは１：１の分離に一致する。抵抗性“サザンペガサス”由来の多型を有するＦ１植物は全て、キク白さび病抵抗性を示した。“サザンペガサス”由来の多型を有さない３２のＦ１植物の内、３１のＦ１植物はキク白さび病感受性であり、１のＦ１植物はキク白さび病抵抗性であった。ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６は、独立した集団においても有用なＳＮＰマーカーであることが示された。
感受性“イエロークイン”と“サザンペガサス”とを交配して得られた集団において、キク白さび病抵抗性に対するＳＮＰマーカーＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６の連鎖を検証した。この集団におけるキク白さび病抵抗性の分離は、Ｒ：Ｓが３２：３１の比率であった。これは１：１の分離に一致する。抵抗性“サザンペガサス”由来の多型を有するＦ１植物は全て、キク白さび病抵抗性を示した。“サザンペガサス”由来の多型を有さない３２のＦ１植物の内、３１のＦ１植物はキク白さび病感受性であり、１のＦ１植物はキク白さび病抵抗性であった。ＳＣＳＥ＿ＳＣ０２３４１７．１＿１５７３６は、独立した集団においても有用なＳＮＰマーカーであることが示された。
本発明は、農業分野、植物育種分野等に利用することができる。
Claims (12)
- キク白さび病抵抗性を判定する方法であって、
キク属（Chrysanthemum属）の植物において、下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；
をキク白さび病抵抗性に関する分子マーカーとして検査する工程を含む、方法。 - 上記キク属の植物は、育種素材の候補植物であるか、育種のプロセスで得られた植物である、請求項１に記載の方法。
- （ａ’）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基がＡであるとき、又は、
（ｂ’）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定する、請求項１又は２に記載の方法。 - 配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基がＡであり、かつ、配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基がＣであるときに、当該植物はキク白さび病抵抗性を持つと判定する、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記検査する工程において、前記分子マーカーを含む領域を増幅するプライマーセットを用いて、前記植物のＤＮＡにおける前記領域を増幅する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記プライマーセットは、配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基、及び、配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基に相当する塩基を含む領域を増幅するプライマーセットである、請求項５に記載の方法。
- 上記キク属の植物が、イエギク種（Chrysanthemum morifolium）に属する植物である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
- キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を製造する製造方法であって、
キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物と、他のキク属の植物とを交雑する交雑工程と、
前記交雑工程により得られたキク属の植物又はその後代系統のキク属の植物から、請求項１から７のいずれか１項に記載された方法によって、キク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程と
を含む、製造方法。 - 前記交雑工程の前に、請求項１から７のいずれか１項に記載された方法により、被験キク属植物からキク白さび病抵抗性を有するキク属の植物を判別する判別工程をさらに含む、請求項８に記載の製造方法。
- キク属の植物における、キク白さび病抵抗性に関する分子マーカーであって、
下記（ａ）又は（ｂ）の塩基自体（ＳＮＰ）か、当該相当する塩基を含む連続したポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示す６３番目の塩基に相当する塩基；
（ｂ）配列番号２に示す２１番目の塩基に相当する塩基；
である、分子マーカー。 - 請求項１０に記載の分子マーカーに連鎖しており、ゲノム上で当該分子マーカーからの距離が２ｃＭ以内に位置している、キク白さび病抵抗性関連遺伝子。
- 請求項１１に記載のキク白さび病抵抗性関連遺伝子を有する、請求項８又は９に記載の製造方法によって得られる、キク白さび病抵抗性のキク属植物。
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| WO2023180832A1 (en) | 2022-03-23 | 2023-09-28 | Ricoh Company, Ltd. | Liquid discharge system |
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| US10743497B2 (en) | 2015-10-06 | 2020-08-18 | Dümmen Group B.V. | White rust resistant Chrysanthemum plants |
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