KR101733303B1 - 수박 종자 크기 판별용 분자 마커 및 이의 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수박 종자 크기 판별용 분자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 NS(medium-seed size), SS(small-seed seed), MS(micro-seed size), 또는 TS(tamato-seed size)의 크기를 갖는 종자를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 이를 이용하여 수박 종자 크기를 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 수박 종자크기 판별용 분자마커의 제공으로 육종과정에서 수박 종자크기를 유식물체에서 예측할 수 있으며, 대상 후대교배종이 종자크기 형질을 다음 세대에서 분리할 것인지 (헤테로 유전자형), 고정되어 분리되지 않을 것인지 (호모 유전자형)에 대한 판단이 가능하다. 이에 따라, 본 발명에 따른 수박 종자크기 판별 분자마커의 제공으로 수박의 육종과정에서 과육과 동시 섭식이 가능한 종자크기가 매우 작은 품종을 육성하기 위해 TS 크기와 연관된 마커를 활용할 수 있으며, 반면, 3배체 씨없는 수박을 육성시 종자생산성을 유지하기 위하여 SS 크기를 목표로 하는 경우에도 본 발명에서 개발된 분자마커를 활용할 수 있다.

Description

수박 종자 크기 판별용 분자 마커 및 이의 이용{Molecular marker for validating seed size of watermelon and use thereof}
본 발명은 수박 종자 크기 판별용 분자 마커 및 이의 이용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 NS(medium-seed size), SS(small-seed seed), MS(micro-seed size), 또는 TS(tamato-seed size)의 크기를 갖는 종자를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물, 프라이머 세트, 이를 이용하여 수박 종자 크기를 판별하는 방법에 관한 것이다.
현재 염기서열 분석법의 발달과 비용의 절감으로 식물의 염기서열 분석이 빠르게 진행되고 있다. 박과 식물의 경우 최근 오이(2009년), 멜론(2012년), 수박(2013년)의 전장 염기서열이 공개되었으며, 최근 게놈의 서열분석을 통한 게놈서열기반 고밀도 유전자지도가 작성되고 있으며, 특히 단일염기다양성(single nucleotide polymorphism; SNP) 정보의 확보로 다양한 식물 계통, 품종의 구분뿐만 아니라, 분자마커로서의 활용도가 증가되고 있다. 특히, 종래의 전통 교배육종 방법에서 표현형 검정까지 많은 시간이 걸리는 문제점을 형질과 연관된 분자마커의 개발로 육종효율 증진과 육종기간 단축, 노동력 감소 등의 단점을 성공적으로 해결하고 있다.
한편, 수박(Citrullus lanatus, watermelon)의 종자크기는 수박 유전자원별로 크기가 다양한데, 특징적인 것은 계통별로 한 과실 내에서 만들어지는 종자의 크기는 매우 일정하며, 전체 유전자원을 대상으로 할 때, GS (giant-seed size), BS (big-seed size), NS(medium-seed size), SS(small-seed size), MS(micro-seed size), TS(tamato-seed size) 순서로 크기에 따른 분류가 보고되어 있다 (도 1). 수박 종자의 크기는 종자의 생산성과도 관련이 커서 크기가 작을수록 과실당 종자생산량은 증가하는 경향을 뚜렷하게 나타낸다. 특히, TS (가장 작은 크기의 종자크기 범위) 크기는 수박의 섭취시 과육과 같이 섭식하여도 섭식 거부감이 매우 적어 동남아 등지에서 각광받고 있으며, SS 크기의 수박종자를 생산할 수 있으면, 3배체 수박 (씨없는 수박)의 종자생산성도 향상시킬 수 있다. 따라서, 수박 육종 및 채종에 있어 종자의 크기에 대한 유전분석은 매우 중요하며, 종자크기에 연관된 분자마커를 확보할 경우, 수박의 과실을 획득할 때까지의 재배기간 없이, 어린 식물생장시기에 분자마커로 미리 종자크기를 판별할 수 있는 장점이 있다.
상기에서 기재한 바와 같이, 수박 종자 크기를 판별하기 위한 분자마커에 대한 개발이 시급한 상황이며, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 TS3344 (TS 크기)와 PI 189225 (GS 크기)를 교배친으로 한 분리집단에서 수박 종자 크기 연관 QTL 분석으로 얻어진 수박 게놈영역을 토대로 수박 종자 크기를 판별할 수 있는 분자마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분자 마커를 이용하여 수박 종자 크기를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 더 이상 후대 종자크기의 변화가 없는 유전적으로 완전히 고정된 수박 계통들을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 2의 염기서열 내에서 552번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 3의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 4의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 종자 크기를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 종자 크기를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 종자 크기를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 상기 PCR 키트와 수박 종자로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(2) 상기 (1)단계의 증폭된 시료를 이용하여 HRM(High resolution melting) 분석을 수행하는 단계를 포함하는 수박 종자 크기를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 후대 종자크기 변화 없이 종자 크기가 고정되는 특성을 갖는, 수박의 종자(KCTC18406P, KCTC18407P, KCTC18405P 및 KCTC18408P)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 종자는 각각 270.41-366.45㎟, 153.87-226.53㎟, 109.10-152.88㎟ 및 49.64-74.93㎟의 종자면적을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 수박 종자크기 판별용 분자마커의 제공으로 육종과정에서 수박 종자크기를 유식물체에서 예측할 수 있으며, 대상 후대교배종이 종자크기 형질을 다음 세대에서 분리할 것인지 (헤테로 유전자형), 고정되어 분리되지 않을 것인지 (호모 유전자형)에 대한 판단이 가능하다. 이에 따라, 본 발명에 따른 수박 종자크기 판별 분자마커의 제공으로 수박의 육종과정에서 과육과 동시 섭식이 가능한 종자크기가 매우 작은 품종을 육성하기 위해 TS 크기와 연관된 마커를 활용할 수 있으며, 반면, 3배체 씨없는 수박을 육성시 종자생산성을 유지하기 위하여 SS 크기를 목표로 하는 경우에도 본 발명에서 개발된 분자마커를 활용할 수 있다.
또한, 수박 게놈의 종자크기를 결정하는 유전자들과 연관된 서열이 존재하는 게놈영역을 제공함으로써, 지속적인 분자마커의 개발도 가능하다.
더욱이, 본 발명은 자가수분시 후대에서 종자크기가 변하지 않는 고정된 4가지 종자크기별 계통들을 제공함으로써 상업용 F1 품종 개발에 직접적인 활용과 분자마커와 표현형 검증이 가능하다.
도 1은 수박 유전자원들의 종자크기를 6가지로 분류한 그림이다.
도 2는 수박의 PI 189225와 TS3344를 모부계로 하는 F1과 F2에서의 종자크기 및 그 변이를 나타낸 그림이다.
도 3은 수박 PI 189225(P1)과 TS3344(P2)의 교배후 F2 개체가 만들어내는 종자크기 분포 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 수박 PI 189225(P1)과 TS3344(P2)의 교배후 F2:3 에서 얻어진 종자크기 표현형을 QTL 분석한 결과를 나타낸 것이다(2번 염색체).
도 4b는 수박 PI 189225(P1)과 TS3344(P2)의 교배후 F2:3 에서 얻어진 종자크기 표현형을 QTL 분석 결과를 나타낸 것이다(6번 염색체).
도 5는 수박의 NT, SS, MS, TS 크기 종자를 결정하는 염색체 2와 6의 게놈 영역을 표시하였다.
도 6은 서열번호 1의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 2의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 8은 서열번호 3의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 9는 서열번호 4의 염기서열 및 해당 염기서열 내에서 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 10은 4가지 고정계통인 NT(NS)BC4F9, NT(SS)BC4F9, NT(MS)BC4F9, NT(TS)BC4F9에 대하여 서열번호 3을 이용한 HRM 분석을 수행한 결과이다. 각 그래프는 유전자형을 나타내며, 적색그래프는 참조서열과 동일한 개체들 [NT(NS)BC4F9, NT(MS)BC4F9], 청색그래프는 참조서열과 상이한 염기를 갖는 개체들 [NT(SS)BC4F9, NT(TS)BC4F9], 노란색그래프는 헤테로(H = Ref + Alt)를 나타내며, 유전자형이 헤테로인 개체는 NT(NS)와 NT(TS)가 교배된 F1으로 고정계통(homozygous line)들에 대한 비교를 위하여 추가 분석되었다.
본 발명자들은 고정된 종자 크기를 갖는 수박(Citrullus lanatus, watermelon) 계통 및 수박 종자크기를 판별할 수 있는 HRM 마커를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, TS3344 (TS 크기) X PI 189225 (GS 크기)의 F2 세대에서 QTL 분석으로 종자 크기 연관 게놈영역을 결정하고, 이를 기준으로 제작한 4가지 종자크기 수박 계통의 게놈 서열과 참조서열을 비교하여, SNP를 확보한 후, 해당 SNP를 확인할 수 있는 프라이머를 디자인하여 검정한 결과, 사용한 프라이머 세트는 연관마커와 표현형이 모두 일치하는 결과를 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 2의 염기서열 내에서 552번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
서열번호 3의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
서열번호 4의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 종자 크기를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열은 수박의 2번 또는 6번 염색체에 존재하는 염기서열일 수 있으며, 바람직하게는 2번 염색체의 29,248,332-30,180,046 bp 및 6번 염색체의 5,057,193-5,927,079 bp 영역 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2번 염색체의 29,761,887-30,053,080bp 및 6번 염색체의 5,540,129-5,542,892bp 영역일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 수박 유전자원 중 가장 작은 종자크기를 갖는 국내 수박 재배계통 TS3344 (tomato-seed size)(화분친: 부계)와 유전자원들 중 가장 큰 종자크기를 갖는 수박 야생계통 PI 189225 (giant-seed size)(종자친: 모계)의 교잡을 통하여 얻어진 F2세대 개체들의 DNA를 추출한 후, GBS 분석을 통한 유전자지도를 작성하였고, F2세대의 종자크기 조사결과를 토대로 양적형질 유전자좌 (quantitative trait loci; QTL) 분석을 실시하여 2번 염색체의 29,248,332-30,180,046 bp 및 6번 염색체의 5,057,193-5,927,079 bp 영역을 종자 크기 연관 게놈영역으로 결정하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 4가지 종자크기인 NS(medium-seed size), SS(small-seed seed), MS(micro-seed size), TS(tamato-seed size)의 크기를 갖는 각 계통들을 제작한 후(NT-BC4F9, SS-BC4F9, MS-BC4F9, TS-BC4F9), 기 분석된 종자크기와 연관된 QTL 영역을 기준으로, 해당 범위 내에서 4가지 종자크기 계통의 게놈 염기서열 변이를 비교 분석하여 기 분석된 QTL 영역을 좀더 좁힐 수 있었으며, 해당 영역 내에 존재하는 SNP를 확보하였다.
본 발명에 따른 SNP 마커 간의 조합을 통해 수박 종자의 크기를 하기와 같이 판별할 수 있다:
■ NS(medium-seed size) : 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열을 포함(참조염기서열과 동일함)
■ SS(small-seed seed) : 서열번호 1의 염기서열을 포함하고(참조염기서열과 동일함), 서열번호 2 내지 서열번호 4의 염기서열을 포함하지 않음(참조염기서열과 상이함, 즉, 서열번호 2의 염기서열 내에서 552번째 염기가 G이고, 서열번호 3의 염기서열 내에서 553번째 염기가 결실(deletion)되고, 서열번호 4의 염기서열 내에서 553번째 염기가 T임)
■ MS(micro-seed size) : 서열번호 1의 염기서열은 포함하지 않고(참조염기서열과 상이함, 즉, 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기가 C임), 서열번호 2 내지 서열번호 4의 염기서열은 포함(참조염기서열과 동일함)
■ TS(tamato-seed size) : 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기서열을 포함하지 않음(참조염기서열과 상이함, 즉, 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기가 C이고, 서열번호 2의 염기서열 내에서 552번째 염기가 G이고, 서열번호 3의 염기서열 내에서 553번째 염기가 결실(deletion)되고, 서열번호 4의 염기서열 내에서 553번째 염기가 T임)
상기 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 분자마커로 사용함으로써 육종과정에서 수박 종자크기를 유식물체에서 예측할 수 있으며, 이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 종자 크기를 판별하기 위한 프라이머 세트를 제공하며, 바람직하게는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 4개의 프라이머 세트를 이용하여 4가지 고정계통(NT-BC4F9, SS-BC4F9, MS-BC4F9, TS-BC4F9)의 표현형 및 유전자형 검정을 수행하였고, 그 결과, 사용한 4개의 프라이머 세트는 연관마커와 표현형이 모두 일치한 결과를 나타냄을 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 HRM(High resolution melting) 분석을 통하여 핵산 서열에서의 변이를 확인하는데 사용될 수 있는바, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 수박 종자 크기를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트를 제공한다.
본 발명에서 "HRM"은 PCR 영역 내에 존재하는 DNA 상의 SNP에 따라서, 형광시약과 결합한 증폭산물 DNA를 약 60℃에서 90℃까지 온도를 변화시키며 단일가닥의 DNA로 변성될 때의 형광강도 변화를 측정하는 방법을 의미한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은
1) 상기 PCR 키트와 수박 종자로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
2) 상기 1)단계의 증폭된 시료를 이용하여 HRM(High resolution melting) 분석을 수행하는 단계를 포함하는 수박 종자 크기를 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서, 종자크기 연관 마커의 개발을 위하여 제작한 각 종자크기별(NS, SS, MS, TS) 고정계통들은 더 이상 후대 종자크기의 변화가 없는 유전적으로 완전히 고정된 계통들이며, 상업육종용 계통으로도 사용이 가능한 고정계통들이다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 후대 종자크기 변화 없이 종자 크기가 고정되는 특성을 갖는 수박의 종자(KCTC18406P, KCTC18407P, KCTC18405P 및 KCTC18408P)를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 수박 종자 크기를 판별하기 위한 QTL 분석
1-1. 유전자 지도 작성 및 F2 집단의 종자 크기 확인
수박 종자크기를 결정하는 게놈상의 영역을 결정하기 위하여 QTL 분석을 수행 하였다. 수박 유전자원 중 가장 작은 종자크기를 갖는 국내 수박 재배계통 TS3344 (tomato-seed size)(화분친: 부계)와 유전자원들 중 가장 큰 종자크기를 갖는 수박 야생계통 PI 189225 (giant-seed size)(종자친: 모계)의 교잡을 통하여 얻어진 F1을 자가수분시켜 F2세대에서 165개체를 확보하였으며(도 2), SNP 기반의 유전자지도 작성을 위하여 GBS(genotyping by sequencing) 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, F2 각 개체에서 추출한 게놈 DNA를 제한효소 ApeKI으로 자른 후, 각 개체를 확인할 수 있는 DNA 서열 (barcode)과 sequencing용 서열이 합성된 oligo DNA (총칭하여 adaptor)를 접합(ligation) 시킨 후, 어댑터(adaptor) 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 1회의 PCR을 거치고 정제하여 sequencing용 library를 제작하였다. 제작된 library를 NGS (next generation sequening)를 통해 ApeKI으로 잘려진 주변 염기서열을 분석하였고, 수박 참조게놈서열(reference genome) (http://www.icugi.org)과 PI 189225 (모계) 및 TS3344 (부계)의 전체 염기서열 분석 (whole genome sequencing) 결과를 비교 분석하여 SNP (single nucleotide sequence polymorphism)를 도출한 후, 얻어진 SNP 정보를 기반으로 JoinMap (v. 4.1) 소프트웨어를 이용하여 연관유전자지도를 작성하였다.
또한, F2 세대 개체들이 생산한 종자의 크기를 조사한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 양적형질의 분포를 나타냄을 확인할 수 있었다.
1-2. 수박 종자 크기 연관 QTL 분석
실시예 1-1을 통해 작성된 유전자지도와 F2세대의 종자크기 조사결과를 토대로 양적형질 유전자좌 (quantitative trait loci; QTL) 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 이를 통해 결정된 종자크기 연관 양적형질 유전자좌는 수박 염색체 2번 (qC2Sz1)과 6번 (qC6Sz1)에 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 2번 염색체 상의 QTL은 우성효과가 10.29, 6번 염색체 상의 QTL은 우성효과가 -9.85로 나타나 각 염색체의 QTL은 종자가 큰 쪽과 작은 쪽으로 영향을 주는 것으로 나타났다. 분석된 QTL 영역은 염색체 2번의 경우 29,248,332~30,180,046 bp, 염색체 6번의 경우 5,057,193~5,927,079 bp 로 나타났다.
실시예 2. 4가지 크기 범위(NS, SS, MS, TS)의 고정 계통 제작
종자크기 연관 마커의 개발을 위하여, 4가지 종자크기인 NS(medium-seed size), SS(small-seed seed), MS(micro-seed size), TS(tamato-seed size)의 크기를 갖는 계통들을 제작하였다.
보다 구체적으로, NS 크기 (medium-seed size) 종자를 만드는 상업용 고정계통 NT와 TS 크기 (tomato-seed size) 종자를 만드는 상업용 고정계통 TS3344의 교잡 후 얻어진 F1 개체를 우선 각기 NT와 TS3344에 여교잡하였다. 이때 NT와 여교잡에서 나타난 후대에서는 NS, SS, MS 크기의 종자들이 발생하였으며, NS와 SS 크기의 식물체는 NT를 3회 더 여교잡후 각 NS와 SS 크기의 계통을 8회 자가수분하여 각기 다른 NS 및 SS 크기의 고정계통을 제작하였다.
한편, F1을 TS3344와 여교잡한 경우는 MS와 TS의 분리개체들이 나타났으며, TS와 3회 더 여교잡 후, 각 MS 크기와 TS 크기의 계통을 8회 자가수분하여 각기 다른 MS 및 TS 크기의 고정계통을 제작하였다.
각기 다른 크기의 종자를 생산하는 4가지 고정계통은 자가수분시 더 이상 분리하지 않아, 4가지 종자크기를 대변하는 고정계통(NT-BC4F9, SS-BC4F9, MS-BC4F9, TS-BC4F9)으로 제공하였다.
실시예 3. 수박 종자 크기 판별을 위한 HRM 마커 개발
3-1. 수박 종자 크기 판별을 위한 SNP 확보
실시예 2를 통해 제작한 각기 다른 고정계통들을 파종 후 잎에서 DNA를 추출하고, 전체 게놈에 대하여 대량염기서열 재분석 (next generation resequencing)을 수행하였다. 얻어진 염기서열은 수박의 참조게놈서열 (reference genome sequence)과 비교하여 변이염기서열을 분석하였다.
또한, 실시예 1-2를 통해 분석된 종자크기와 연관된 QTL 영역을 기준으로, 해당 범위 내에서 4가지 종자크기 계통의 게놈 염기서열 변이를 비교 분석한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 참조염기서열을 기준으로 염색체 2번의 29,761,887- 30,053,080bp 영역은 NS와 SS 종자크기 계통은 참조염기서열과 동일한 서열을 갖고 있었으며, MS와 TS 종자크기 계통은 참조염기서열과 다른 서열들이 존재하고 있었다. 한편, 염색체 6번의 5,540,129-5,542,892bp 영역은 NS와 MS가 참조염기서열과 동일한 서열을, 그리고 SS와 TS는 참조염기서열과 다른 서열을 나타내고 있었다.
상기 결과들을 종합하여, 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기, 서열번호 2의 염기서열 내에서 552번째 염기, 서열번호 3의 염기서열 내에서 553번째 염기 및 서열번호 4의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 SNP를 확보하였다(도 6 내지 도 9 참조).
3-2. 프라이머 세트 제작
실시예 3-1을 통해 확보한 SNP를 중심으로 공개된 웹용 소프트웨어인 Primer 3 (http://primer3.ut.ee/)을 이용하여 각 SNP에 대한 프라이머 세트를 제작하였고, 각 프라이머 세트에 대한 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
Primer Sequence mer
Set 1
WSize-Ch2-1aF primer GGTGGGCATT TTCCAGCAGA TC (서열번호 5) 22
WSize-Ch2-1aR primer CTCTTCTCCC CGCTCTTCAA (서열번호 6) 20
Set 2
WSize-Ch6-1F primer ACACTACCCC GAGCTTTGAT (서열번호 7) 20
WSize-Ch6-1R primer AGGTGAGCTT AACGACATAC AT (서열번호 8) 22
Set 3
WSize-Ch6-2aF primer AGGGAGTCTC GCACACTTAG (서열번호 9) 20
WSize-Ch6-2aR primer AGCACCTATG TTCCCCTGAA (서열번호 10) 20
Set 4
WSize-Ch6-4F primer ATTGTGGTGG GGCTTAGGAT (서열번호 11) 20
WSize-Ch6-4R primer ACCTCGACCA ACCCAAATCT (서열번호 12) 20
실시예 4. HRM 마커의 적용성 검증
먼저, 실시예 2를 통해 제작된 4가지 고정계통(NT-BC4F9, SS-BC4F9, MS-BC4F9, TS-BC4F9)의 표현형을 검정하였다. 즉, 상기 4가지 고정계통(NT-BC4F9, SS-BC4F9, MS-BC4F9, TS-BC4F9) 200립씩에 대하여 20립씩 나누어 측정하여 이들의 평균, 최대값, 최소값을 얻었다(표 2). 또한 각 종자들을 촬영하여 종자면적을 ImageJ 소프트웨어로 산출하였다(표 3).
ID NS SS MS TS
계통명 NT(NS)BC4F9 NT(SS)BC4F9 NT(MS)BC4F9 NT(TS)BC4F9
평균(gram) 0.72425 0.42383 0.21905 0.11758
최대값(gram) 0.741 0.4334 0.2361 0.1247
최소값(gram) 0.6967 0.4123 0.2046 0.1105
ID NS SS MS TS
계통명 NT(NS)BC4F9 NT(SS)BC4F9 NT(MS)BC4F9 NT(TS)BC4F9
평균(㎟) 314.53 185.61 124.08 62.73
최소값(㎟) 270.41 153.87 109.10 49.64
최대값(㎟) 366.45 226.53 152.88 74.93
다음으로, 실시예 3을 통해 제작된 프라이머 세트를 이용하여 상기 4가지 고정계통들 각 20개체에 대하여 유전자형 검정을 수행하였다. 이때, SNP 기반의 HRM 분석에서 참조게놈의 서열과 동일한 뉴클레오티드일 경우 Ref로, 다른 뉴클레오티드일 경우 Alt로 표현 하였으며, 이들이 염색체 2번과 6번에서 4가지 유전자형 조합으로 종자크기를 판정하였다. 그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 사용한 4개의 프라이머 세트는 연관마커와 표현형이 모두 일치한 결과를 얻었다.
Figure 112015100892875-pat00001
또한, 서열번호 3을 이용하여 NS, SS, MS, TS 각 계통을 대상으로 HRM 분석을 수행하였고, 그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이, 표현형 결과와 분석된 유전자형 결과가 일치하였다.
추가적으로, NS 및 TS 크기 고정계통의 교배후 얻어진 F2 분리세대의 유전자형 및 표현형 검정을 실시하였다. 보다 구체적으로, NS크기와 TS크기 고정계통 [NT(NS)BC4F9 x NT(TS)BC4F9] 교배후 얻어진 F2 분리세대에서의 종자크기에 대한 HRM 마커 검정을 수행한 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, NS/TS F2-22를 제외하고 모두 연관마커와 표현형이 일치한 결과를 얻었다.
Figure 112015100892875-pat00002
따라서, 본 발명을 통하여 제시된 HRM 마커의 조합을 통하여 NS, SS, MS, TS 종자크기를 구별할 수 있음을 입증하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC18406P 20150930 한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC18407P 20150930 한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC18405P 20151006 한국생명공학연구원 미생물자원센터 KCTC18408P 20151006
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gcgatggtct ccaaagcgtc 660 gaatccgccg tgaactccgc ccgttccgtc gacaaatccc aatttttcat ctccacctct 720 gtttacgagc ttgaatcctc tgttatcgac gccttaaaag caaaatttcc cttcccgatt 780 tacaccatcg gacccagtac tccatatttc gagctagaat gctccgcccc aaatggcggc 840 accgacgact atttccggtg gctggactcc caagcagagg gctctgtttt gtacatttca 900 cagggcagtt atctttcagt ttctagcgcc caaatagacg agatcgtcgc cggggtgaaa 960 gccagcggcg ttcggttctt gtgggtggtg cgtggagatg acggccggtt gaaggacgtg 1020 gacagagaaa ctgggatggt ggttggatgg tgcgatcaat tgaaggttct gtgccacaga 1080 tccgtgggag ggttttggac tcacgg 1106 <210> 2 <211> 1106 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 2 aaaaacagaa tgaaatgcac tgctctcttc cacgtttcta aattgaatgg taactcctct 60 ggaatgagat ttctgtttta aaagcaaaac tattcaatga cgcgagcaag aacagggctt 120 gattcttcaa caagttaaat tgtacagaat tacagatact gaattaccat tgcagagaca 180 gatttgtaag ggaagcaaca cataagaaat gacaaagttg atcaaaatgg tgccataaat 240 ttttttttaa gagcatgcaa acatttcttc acaatgtcgt agttattagc atgagactac 300 cattcttacc tcttcgctgg catcgccttc tgaaatgcaa actgactgaa cagggcctaa 360 ccgaaatatc tgtagacgtg aaaagaaata taaaattaat catattacat tctctaaatt 420 gatcacacca tcgattcatc gctaacaaat tctagcaaat accaacacgt aaacaattga 480 tcaatatgtc atatacgaca gtgcaagagt tcaacacact accccgagct ttgatactat 540 agtaaatcat cattgagcta aaagctaggt atctaggtta tggaacattt aaactattat 600 aagaacggaa aatgtatgtc gttaagctca cctgtaaagc aaaacgagca ttcttactat 660 gcctcactat ttctcatttt gaacaatgca gaaccaaaaa acaaaataaa gaaaacaaaa 720 aatagttctc ttttttctct cttctttatt cgttctaaac tctccaacac actagacaac 780 aatcacgata cgcaaattca ttacaaatga aacagaacct gagaagtccg aagatcgaaa 840 gcaaggtcat cggaatcagc ctcctgccgg aaccgaagct ctgccgcgcc ggaatcgcca 900 ctgaaccgcg caaccaccgg cgcggacgaa gaggacgagg aggaagacga agaagcaagc 960 tcagaaatcg aaacaagagt gaactcctga ggtttgtgct tttgccctaa ggagccttcc 1020 attaatgcaa aacctgaagc cgaaaatgta tcttcactcc aaaaaaaatg gaaaaatata 1080 gagtcgaagt ttcaatagtg caaagc 1106 <210> 3 <211> 1106 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 3 tatatttatt ttaaaatcat ggttggttac ttaatgggtt ggctttgtgt tgtctcaaat 60 cttgtcccaa cggttgtctc accgggtgtt gattatgcag aatattttat ttccttatta 120 tgcatctcat ttcttaattg tccgcctttc ttgactacgg tttaccgact ttatttgagg 180 gattataatt tccatatttt tgttgtgcta tttatgagca agaagtgatc ttgttatggt 240 tgtcgcattt gcttttaaga ggttgttcat tgtgttcccg acatagaaca ttttgtgggt 300 tttatgtttg ttgaacaata agttttctct ttattggcag cttgttctat tattgcatgt 360 tcaatgatta cttcatcctt gagaagcttt attcgttctt aggggagcct aaggataagt 420 tcattgaaaa tggattctct gacttagggg gagtctaagc cttccattaa aggaaagcta 480 atacaagaga agtgctcttc aatatgagag ggagtctcgc acacttaggg ggagtctaag 540 tgctttttca ttgatacgca tatacttaga gggagcctaa gtttgatgaa gaagaattct 600 cacatttcag gggaacatag gtgctacgtg tgtcgttgta ttcgttattt atattacata 660 taagtacaat gttgtaaatg cttgatttta ttatattagt taatataatt tcttccctta 720 gcacactacc caacagacgt aggtgtattt caccgaacta ggtcaacaaa ctttaagtga 780 tattatctct ctttattgct tgttgtccta atgtgtgata aagcgttgta tgtgacatct 840 gtgtggtatg tatcagattc tcctctattt ttcaatatat atatatatat atatatacct 900 aagacattta aattattatt attattttgt ttttaaaaaa tatattgtta tttagaattt 960 aataaattta aaattaaagt tatcttagtt ggagatattc tcattttgat cacttattta 1020 taaaattata caagtaaaac gcaacgtttt tttctttttt ttaaaggtaa attgtttatt 1080 tattaattct accattacat tgcgtg 1106 <210> 4 <211> 1106 <212> DNA <213> Citrullus lanatus <400> 4 ataacaaagt ttagatatgt tttttttttt cttttttctt taaataaaag gcatagttgt 60 gaacttcttt cttaatagtt tagctaataa aataatatga aacagtggta taggcaaact 120 actcgaagtc agtgatacta tagtataaaa tttaaattaa atattgatca aggcttatgt 180 gattcgacat tcaagtgagg gagtttgagc ttttgcataa atctgcgtta ttgttaaata 240 aacaatgaag aacaaatgat aatattgatg gtaaaattag gataaggaaa ctctttgaac 300 ttcatattct ttccacatta aatttataat tttggggaag gaagacgact aacaagataa 360 aaagagagaa catcgttgtg gtacctaact cataacctcc tatacttaaa caagtattta 420 gcaagatgtt agagcaagtt agaaagaagt aaaagaactt acttttgggt gtgcttgtga 480 ccccatattt ttattgtggt ggggcttagg atccaaacct aaagaagatt aagaaaagtt 540 gattcgggtc ggcctatgag gctaagattt gggttggtcg aggtacgcga gttgagttgt 600 tcggctcaac tcccttcttc ctcttggtct tttcctccct tggcctgttg gcatttctct 660 aattcttgcg tgacgataat ttttttgaac ttggaattct tgattagaga cgatctataa 720 tagataatat ttaaaataaa tttataataa acattagttt ttttatggaa aaaaaattat 780 aaatcaaaac aacattttga acaatttttt tagtacaata aaacgtgaga gattcaaatc 840 acaaaccttt taattactaa ttcatatttt atgtattgaa ctaggctcac cctaccaaat 900 tttgctttat taataaaaat atttgaataa agagcttaat aaaaacaaaa gttgaataat 960 aaaaataggt tttagactta cattacatgc accttttccc ccattttttc atatagaatg 1020 aaataaatgt gactatttga aaattaatat acaatcgatt ttatcaggtg cttaaaacgg 1080 ttaaaatgtt tctaacttag ttttac 1106 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch2-1aF primer <400> 5 ggtgggcatt ttccagcaga tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch2-1aR primer <400> 6 ctcttctccc cgctcttcaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch6-1F primer <400> 7 acactacccc gagctttgat 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch6-1R primer <400> 8 aggtgagctt aacgacatac at 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch6-2aF primer <400> 9 agggagtctc gcacacttag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch6-2aR primer <400> 10 agcacctatg ttcccctgaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch6-4F primer <400> 11 attgtggtgg ggcttaggat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSize-Ch6-4R primer <400> 12 acctcgacca acccaaatct 20

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 2의 염기서열 내에서 552번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열;
    서열번호 3의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
    서열번호 4의 염기서열 내에서 553번째 염기에 위치하는 단일뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism: SNP)을 포함하는 8-100개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 수박 종자 크기를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열을 증폭시킬 수 있는 수박 종자 크기를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 수박 종자 크기를 판별하기 위한 프라이머 세트.
  4. 제2항 또는 제3항의 프라이머 세트를 포함하는 수박 종자 크기를 판별하기 위한 HRM 분석용 PCR 키트.
  5. (1) 제4항의 PCR 키트와 수박 종자로부터 추출한 전체 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (2) 상기 (1)단계의 증폭된 시료를 이용하여 HRM(High resolution melting) 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 수박 종자 크기를 판별하는 방법.
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