CN110904264B

CN110904264B - 与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记、其引物及应用

Info

Publication number: CN110904264B
Application number: CN201911319873.8A
Authority: CN
Inventors: 李娜; 刘丽锋; 马双武; 周丹; 尚建立; 王吉明; 李楠楠
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110904264A

Abstract

本发明公开了一种与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记、其引物及应用，旨在解决现有技术无法快速准确的对西瓜种子小且少性状种群进行种质鉴定的技术问题。本发明筛选了一种与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记，设计了一种所述InDel分子标记的引物，提供了一种西瓜极小种子性状的鉴定方法，并将上述的分子标记、上述的引物或上述的鉴定方法在西瓜极小种子性状分子标记辅助育种中应用。本发明通过简便的步骤即可快速鉴定西瓜是否为极小种子，为西瓜种子性状的分子育种提供了新的技术支持，有利于提高育种的准确性和选择效率。

Description

与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记、其引物及应用

技术领域

本发明涉及西瓜遗传育种技术领域，具体涉及一种与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记、其引物及应用。

背景技术

西瓜是世界十大水果之一，第一用途是鲜食，而种子影响其食用，消费者喜欢无籽或是籽粒较小的西瓜，因此培育种子小的品种一直是育种家努力的方向之一。

早期的遗传学研究表明，西瓜种子大小遗传基础复杂，由l和s，Ti、ts等多对基因控制（Wehner, 2012）。近些年随着西瓜基因组测序的完成，为了揭示西瓜种子大小的遗传基础，一批西瓜种子大小QTL定位的工作已经开展，分别在2号和6号染色体检测到了主效QTLs（范敏等，2000；Hawkins等，2001；易克，2002；Prothro 等，2012；Meru 和 McGregor，2013），6号染色体的主效位点已找到候选基因（Li et al., 2018）。用于定位的标记或是检测到的连锁的标记都是SNP或是基于SNP的CAPS/dCAPs分子标记（Prothro et al., 2012;Kim et al., 2015）。这些基于测序产生的SNP标记不能直接用于分子标记辅助选择，即使可以转化为可用的标记（比如CAPS/dCAPS），检测过程需要酶切，成本较高，步骤繁琐，造成这些标记在西瓜种子大小分子标记辅助育种方面的应用具有一定的局限性。

InDel分子标记作为近年新兴的一种分子生物技术，以PCR扩增技术为基础，具有开发成本低、分型简单、检测简单便捷、扩增产物带型简单清晰、结果准确以及仪器设备要求低等优点。

然而，关于西瓜种子基因的遗传研究及相关的分子标记选育工作相对较少，亟需开发多样化的分子标记，以期可以快速准确的对西瓜种子性状种群进行种质鉴定，对西瓜种子小且少品种的改良及选育具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是开发一种与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记及其引物，应用于西瓜育种当中，以期能够快速准确的对西瓜种子小且少性状种群进行种质鉴定。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选了一种与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其位于西瓜参考基因组2号染色体29876565bp后。

设计了一种所述InDel分子标记的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示。

提供了一种西瓜极小种子性状的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA；

（2）利用所述的引物对，以所述总DNA为模板进行PCR扩增；

（3）对所述PCR扩增产物进行电泳、显影、染色和带型判读，根据扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型。

优选的，在所述步骤（2）中，PCR扩增的体系为：

西瓜叶片总DNA 1μL、权利要求2所述引物各 1μL、2 × Power Taq PCRMasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

PCR扩增的反应程序为：

94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s，72℃ 5 min。

优选的，在所述步骤（3）中，判读时，134bp的条带代表纯合极小种子基因型，122bp的条带代表纯合非极小种子基因型，同时存在134bp和122bp的条带代表杂合基因型。

将上述的分子标记、上述的引物或上述的鉴定方法在西瓜极小种子性状分子标记辅助育种中应用。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1.本发明定位了西瓜极小种子基因ts共分离InDel分子标记，该位点位于西瓜参考基因组（97103v1）第2号染色体29876565bp后，并基于差异位点鉴定出由一个单基因控制的西瓜极小种子性状，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.本发明进一步开发了一对精准的InDel分子标记引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2和3所示；该引物具有检测方便、快速，扩增稳定，准确率高等特点，在BC₁群体中该标记的准确率达到100%。

3.本发明通过简便的步骤即可快速鉴定西瓜是否为极小种子，为西瓜种子性状的分子育种提供了新的技术支持，有利于提高育种的准确性和选择效率。

4.本发明可实现对ts基因的克隆，进而为西瓜种子大小形成的分子机制研究奠定技术基础。

附图说明

图1为西瓜种子大小全基因组QTL定位图。

图2为利用分子标记tsmarker3的引物在部分BC₁群体基因组DNA中的扩增结果；

其中， A：母本基因型，B：父本基因型，H：杂合基因型，M：marker；名称皆为品种名称\代号的后两/三位。

图3利用分子标记tsmarker3的引物在父母本F₁和48份西瓜资源基因组DNA中的扩增结果；

其中，A：母本基因型，B：父本基因型，H：杂合基因型，M：marker；名称皆为品种名称\代号的后两/三位。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂和试验材料如无特别说明，均为市售产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：西瓜种子大小InDel分子标记的开发

以极小种子母本B132（tomato seed）和中等种子父本B135（由中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜资源课题筛选单系）为亲本，杂交获得F₁， F₁代与母本回交获得BC₁群体，鉴定统计F₁和BC₁群体的种子大小类型和千粒重。F₁为中等种子，BC₁群体中极小种子53个，中等种子46个。

结合构建的高密度遗传连锁图谱（西瓜种脐斑性状主效基因及检测该主效基因的分子标记和应用，中国发明专利文献201910089092.8）和种子大小性状统计结果，利用Rqtl-IM-binary方法进行QTL定位，在2号染色体定位到一个西瓜种子大小主效QTL，其LOD峰值为3.86，解释了95.94%的表型变异，置信区间对应的物理位置为2号染色体的29.8～29.9 5Mbp，如图1所示。

利用两个亲本（母本B132和父本B135）进行深度的重测序，共检测到232762个indel位点。

在QTL峰值区域的29876565bp位置发现母本B132存在一个12bp的插入，其核苷酸序列为：AATAATAATAAT，命名为tsmarker3。利用Perl语言自编脚本提取该变异位点上下游500bp的参考基因组序列，设计相应的InDel分子标记。

设计InDel分子标记tsmarker3的引物对，其核苷酸序列为：

tsmarker3F：GAAAGTAAAGAGACTAAAAT；

tsmarker3R：TGTAGTAATAGGCATAAAAT。

实施例2：西瓜BC₁群体InDel分子标记分析验证试验

（1）试验材料

以实施例1中的母本B132、父本B135及99份BC₁群体为试验材料。

（2）利用CTAB法提取叶片总DNA

1）取1 g西瓜新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1 ml CTAB抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60 min，其间颠倒混合2～3次；

2）将样品从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；

3）取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1，V/ V），轻轻颠倒使其充分混匀；

4）10000rpm离心5min，取上清液，置于另一新的离心管中；

5）加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇，混匀后置于-20℃冰箱（不超过30min），使DNA析出；

6）取出后，10000rpm离心5min，小心弃去上清液，取沉淀；

7）用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，置于超净工作台上晾干；

8）加入200μL的蒸馏水溶解DNA；

9）用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。

（3）PCR反应

利用实施例1的引物tsmarker3F和tsmarker3R进行PCR。

PCR反应体系如下：西瓜叶片总DNA (100ng/μL) 1μL、上游引物 (10μM) 1μL、下游引物 (10μM) 1μL、2× Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

PCR反应程序如下：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min。

（4）试剂配制

1）5× TBE电泳缓冲液：称取Tris-base 53.9g，EDTA 3.72g，硼酸27.5g，蒸馏水定容至1L；

2）40％聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺193.34g，甲叉双丙烯酰胺6.66g，蒸馏水定容至500mL；

3）8％聚丙烯酰胺凝胶：40％聚丙烯酰胺溶液10ml；5×TBE 5mL；10％过硫酸铵(APS)200μL；四甲基乙二胺(TEMED)80μL；蒸馏水22mL；

4）银染液：硝酸银1g；冰醋酸5mL；无水乙醇50mL；去离子水定容至500mL；

5）显影液：氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5mL；去离子水定容至500mL。

（5）凝胶板准备

玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子（一个制胶器可制作两板凝胶）。在洗瓶内配置8%聚丙烯酰胺凝胶溶液（两份），混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子（不要让梳子齿的下方产生气泡）；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。

（6）电泳

将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA LoadingBuffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。

（7）染色和显影：

电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。

（8）带型判读

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察父母本以及BC₁群体条带的位置差异。

结果如图2所示，观察分析条带的差异，可以看出BC1群体中，极小种子纯合基因型A（134bp）的有53个，杂合基因型H（134bp和122bp）的有46个；基因型与表型完全一致，准确率为100%，统计结果如表1所示（母本基因型为A，父本基因型为B，杂合基因型为H）。

表1 tsmarker3在BC₁群体中的鉴定和验证

。

实施例3：非极小种子的栽培西瓜资源InDel分子标记分析验证试验

（1）试验材料

以48份非极小种子的栽培西瓜资源 (表2，全部由中国农业科学院郑州果树研究所国家西甜瓜中期库提供) 为试验材料。

（2）以实施例2的鉴定方法检测48份非极小种子的栽培西瓜资源的基因型，检测tsmarker3分子标记的两种基因型（A代表母本带型，B代表父本带型，H代表杂合基因型）在48份栽培西瓜资源中的分布情况。

结果如图3所示，分子标记tsmarker3的基因型仅在母本极小种子中为A（134bp）。在48份非极小种子资源中，有46份为B（122bp），2份没有扩增出目的条带，其基因型鉴定的准确率达到95.8%。

表2 48份用于鉴定的西瓜种质资源

。

通过分子标记tsmarker3来预测西瓜种子大小，可以提高西瓜极小种子大小育种的选择效率，从而加速育种进程。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记、其引物及应用

<130> 2019

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

aataataata at 12

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaaagtaaag agactaaaat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgtagtaata ggcataaaat 20

Claims

1.一种与西瓜极小种子基因ts共分离的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记在西瓜参考基因组第2号染色体第29876565bp位置插入如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述西瓜参考基因组是西瓜97103参考基因组v1版本。

2.一种扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括如SEQ IDNO：2所示的上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物。

3.一种西瓜极小种子性状的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA；

（2）利用权利要求2所述的引物对，以所述总DNA为模板进行PCR扩增；

（3）对所述PCR扩增产物进行电泳、显影、染色和带型判读，根据扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型；判读时，134bp的条带代表纯合极小种子基因型，122bp的条带代表纯合非极小种子基因型，同时存在134bp和122bp的条带代表杂合基因型。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，PCR扩增的体系为：

西瓜叶片总DNA 1μL、权利要求2所述引物各 1μL、2 × Power Taq PCRMasterMix12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，PCR扩增的反应程序为：

6.检测权利要求1所述的分子标记的试剂、权利要求2所述的引物或权利要求3所述的鉴定方法在西瓜极小种子性状分子标记辅助育种中的应用。