CN107254542B

CN107254542B - 西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用

Info

Publication number: CN107254542B
Application number: CN201710673538.2A
Authority: CN
Inventors: 李娜; 马双武; 尚建立; 王吉明; 李楠楠
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2037-08-09
Also published as: CN107254542A

Abstract

本发明公开了一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用。结合肉色为粉红色和红色的母本和父本杂交的F₂群体遗传连锁图谱和对父母本、F₁和F₂群体进行肉色的表型鉴定，用Rqtl‑IM‑binary法进行QTL初定位；结合亲本的重测序设计InDel引物；用InDel引物在父母本、F₁进行多态性筛选，用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定；用JoinMap4.0进行图谱构建。经上述技术措施，得到西瓜肉色性状主效基因位点FC6，并制备了与肉色紧密连锁的插入缺失分子标记InDel19_fc6。可为鉴定西瓜肉色提供新手段，加速西瓜肉色的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

Description

西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用。

背景技术

西瓜肉色是西瓜遗传育种的一个重要性状，肉色的变异非常丰富。根据2012年国际葫芦科遗传协会年报中发表的“西瓜基因目录2012”所述，利用传统的遗传学实验目前已知控制西瓜肉色的基因有8个：B、C、i-C、Wf、Yscr、Ycrl、yo、y。传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制肉色的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个基因在染色体上的位置和基因产生的效应。

随着分子标记和测序技术的发展，西瓜肉色基因的研究有了一定的进展，国内有学者利用白肉西瓜PI296341-FR和红肉西瓜97103分别在2号和4号连锁群定位到了肉色基因，并克隆了控制红肉的B基因(LCYB)，同时将上位性Wf基因位置缩减到了2号染色体的较小区域。最新研究利用西瓜转录组筛选的方法发现基因CIPHT4；2的高表达是西瓜肉色形成所必需的。但西瓜其他肉色基因的遗传研究相对很少或是没有，现有标记的基因型和表型的符合率比较低，利用标记进行辅助选择西瓜肉色育种的选择效率和准确率都比较低。

发明内容

本发明提供一种西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记，并在西瓜肉色育种中进行了应用，可为鉴定西瓜肉色提供新手段，加速西瓜肉色的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

为实现上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

设计一种西瓜肉色性状主效基因位点FC6，位于西瓜6号染色体18-23.8Mb处。

设计一种西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记，其核苷酸序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG。

西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记的上游引物为InDel19_fc6F，核苷酸序列为CTTTAATGCCTAATAACCAA；分子标记的下游引物为InDel19_fc6R，核苷酸序列为AAAGGAGGAAATTCAAATCA。

设计一种西瓜肉色基因型的鉴定方法，包括以下步骤：

①DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；

②PCR扩增：反应体系：100ng/μL西瓜植株总DNA 1μL、InDel19_fc6F(10μmol/L)1μL、InDel19_fc6R(10μmol/L)1μL、2×PowerTaqPCRMasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL；反应程序：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min；

③电泳图谱分析：对所述扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，198bp的条带代表粉红肉色基因型，175bp的条带代表红肉色基因型。

西瓜肉色性状主效基因位点或西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记在西瓜肉色基因图位克隆中的应用。

本发明的有益技术效果在于：

1.本发明首次在6号染色体定位了西瓜肉色的主效基因位点，可解释90.36％的表型方差。

2.本发明肉色紧密连锁的InDel分子标记变异稳定、检测容易，并且成本低廉，该标记的准确率达到96.7％。

3.本发明为鉴定西瓜肉色提供了快速、便捷的新手段，提高了西瓜肉色育种的选择效率和准确率，从而能加快育种进程。

附图说明

图1是肉色形态学标记的连锁分析与QTL效应的对比图；

图2是利用分子标记InDel19_fc6的引物在部分F₂群体基因组DNA中的PCR结果电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的原料如无特别说明，均为市售常规原料；所涉及的检测方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：

西瓜肉色性状主效基因位点的确定，具体步骤如下：

(1)西瓜肉色全基因组QTL定位

依据文献Shang et al.,Construction of a high-density genetic map forwatermelon(Citrullus lanatus L.)based on large-scale SNP discovery byspecific length amplified fragment sequencing(SLAF-seq).ScientiaHorticulturae 2016,203:38-46.中利用母本“ZXG01478”(粉红肉)和父本“14CB11”(红肉)杂交获得F₂群体构建的高密度的遗传连锁图谱，对父母本、F₁和F₂群体的93个单瓜进行肉色的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和F₂群体表型鉴定结果，利用Rqtl-IM-binary方法进行QTL初定位，仅在LG6鉴定到一个肉色的主效QTL(FC6)，如图1所示，其LOD峰值为23.65，解释90.36％的表型变异，对应的置信区间(2-LOD)为69-106cM，对应的物理位置为6号染色体的18-23.8Mb。

(2)父母本的重测序

利用母本和父本进行了22×深度的高通量重测序。两个亲本共检测到45134个小的InDel。

(3)QTL区域InDel标记的开发

在QTL定位的峰值区域搜索插入缺失片段大于20bp的InDels。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，设计InDel引物。

实施例2：

西瓜F₂群体分子标记分析，具体步骤如下：

(1)利用CTAB法提取西瓜叶片总DNA，具体步骤如下：

①取1g新鲜西瓜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1mL CTAB抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2-3次；

②从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；

③取上清液置于另一离心管中，加与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合液，轻轻颠倒使其充分混匀，其中氯仿和异戊醇体积比为24：1；

④10000rpm离心5min，取上清液；

⑤加入0.7倍体积的提前预冷30min的异丙醇，混匀后置于-20℃冷冻不超过30min让DNA析出；取出后10000rpm离心5min，留沉淀弃上清液；

⑥用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；

⑦加入200μL的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。

(2)PCR反应体系和程序

PCR反应体系如下：西瓜叶片总DNA(100ng/μl)1μL、Forward primer(10μmol/L)1μL、Reverse primer(10μmol/L)1μL、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL。

PCR反应程序为：94℃5min，35个循环的94℃20s、55℃1min、72℃30s、72℃5min。

(3)对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。

①试剂配制：

A.5×TBE：

Tris-base 53.9g；EDTA 3.72g；硼酸27.5g；用蒸馏水定容至1L。

B.40％聚丙烯酰胺溶液：

聚丙烯酰胺193.34g；甲叉双丙烯酰胺6.66g；用蒸馏水定容至500mL。

C.8％聚丙烯酰胺凝胶：

40％聚丙烯酰胺溶液10Ml；5×TBE 5mL；10％过硫酸铵(APS)200μL；四甲基乙二胺(TEMED)80μL；蒸馏水22mL

D.银染液：

硝酸银1g；冰醋酸5mL；无水乙醇50mL；用去离子水定容至500mL。

E.显影液：

氢氧化钠15g；甲醛(37％)2.5mL；用去离子水定容至500mL。

②凝胶板准备：

玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子。在洗瓶内配置8％聚丙烯酰胺凝胶溶液，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子，等待溶液充分凝固。

③电泳：

将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA LoadingBuffer，混匀后取0.8μL加入点样孔内，260V电泳35min。

④染色和显影：

电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15min，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10s；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上观察并拍照保存。

⑤带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，观察两亲本条带的位置差异。

实施例3

F₂群体遗传连锁图谱的重新构建，其步骤如下：

将肉色表型归为一个形态学标记FC_P，依据FC_P和LG6上的其它SNP标记利用JoinMap4.0进行图谱构建和连锁分析，发现FC_P位于主效QTL FC6的峰值区域，如图1所示。

至此，我们制备了与肉色QTL(FC6)紧密连锁的共显性分子标记InDel19_fc6，对应于6号染色体21671788bp的一个23bp的插入缺失，其序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG，其引物序列为，InDel19_fc6F：CTTTAATGCCTAATAACCAA；InDel19_fc6R：AAAGGAGGAAATTCAAATCA。该引物在母本(粉红肉)中的扩增产物大小为198bp，在父本(红肉)中的扩增产物大小为175bp。

实施例4

InDel19_fc6分子标记在育种中的应用，其应用步骤如下：

(1)与实施例2不同之处在于，PCR反应体系中所用引物为InDel19_fc6F和InDel19_fc6，以鉴定InDel19_fc6分子标记在F₂群体中的基因型，电泳结果如图2所示，父母本方框中条带为目的条带，名称皆为品种名称或代号的后两或三位。

(2)检查InDel19_fc6分子标记的两种基因型在93个F₂群体中的分布情况，如表1所示，其中A代表母本带型，扩增产物大小为198bp；B代表父本带型，扩增产物大小为180bp；H代表杂合基因型。

结果如表1所示，分子标记InDel19_fc6的基因型在19份粉红肉株系中都为A。而在74份红肉株系中，有2份为A，30份为B，42份为H。

表1 InDel19_fc6在F₂群体中的鉴定和验证

分子标记InDel19_fc6的基因型为A的21个株系19个是粉红肉，2个是红肉，而在基因型为B的30个株系都是红肉，其基因型鉴定的准确率达到96.7％。

综上所述，通过分子标记InDel19_fc6来预测西瓜肉色，即区分粉红肉和红肉，可以提高肉色育种的选择效率，从而加速育种进程。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 西瓜肉色性状主效基因位点及其InDel分子标记和应用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

aaatgaaaca tgatatatta agg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctttaatgcc taataaccaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaggaggaa attcaaatca 20

Claims

1.一种西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为AAATGAAACATGATATATTAAGG。

2.一种权利要求1所述西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记的上游引物为InDel19_fc6F，核苷酸序列为CTTTAATGCCTAATAACCAA；所述分子标记的下游引物为InDel19_fc6R，核苷酸序列为AAAGGAGGAAATTCAAATCA。

3.一种西瓜肉色基因型的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1） DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；所述西瓜品种为 “ZXG01478”和“14CB11”的子代、“ZXG01478”或“14CB11”；

（2） PCR扩增：反应体系：100 ng/μL西瓜植株总DNA 1μL、权利要求2所述引物InDel19_fc6F 10 μmol/L 1 μL、权利要求2所述引物InDel19_fc6R 10 μmol/L 1 μL、2×Power TaqPCR MasterMix 12.5 μL、ddH₂O 9.5 μL；反应程序：94℃ 5 min，35个循环的94℃ 20 s、55℃ 1 min、72℃ 30 s、72℃ 5 min；

（3）电泳图谱分析：对所述扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据所述扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型，198bp的条带代表粉红肉色基因型，175bp的条带代表红肉色基因型。

4.权利要求1所述的西瓜肉色性状主效基因位点的InDel分子标记在西瓜肉色基因图位克隆中的应用。