CN110042172B - 一种基于snp标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法，该方法包括：1)提取杂交柑橘的亲本DNA，并作为模板，使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增，扩增片段长度858bp，对扩增产物进行Sanger测序，分析亲本间的SNP标记位点；2)提取杂交后代叶片组织的基因组DNA，并作为模板，以P29488785F/P29489624R作为引物，进行PCR获得扩增产物，以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序。分析测序峰图中，若在上述SNP位点出现杂峰则为真杂种，完成杂种鉴定工作。本发明步骤简单，可大规模快速鉴定杂种后代。而且，鉴定结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及植物间杂交品种鉴定方法，特别涉及一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法。
背景技术
柑橘遗传上高度杂合，且大多数柑橘主栽品种具有多胚性，使有性杂交较难获得杂种，配抢救能够将真杂种的幼胚保存下来，但大量的珠心胚也存活下来并发育成幼苗，如何从杂交后代中鉴定出真杂种是困扰柑橘育种工作的一大难题。目前，柑橘杂种鉴定主要采用形态学、细胞学、同工酶、随机扩增多态DNA(RAPD)、SSR标记和分子杂交等方法。形态学方法受环境条件影响大，准确性较差；染色体计数不能区别同源与异源融合四倍体；同工酶只能间接推测基因的变化，检测位点较少，且受器官、部位、生理状态、环境条件等影响；RAPD技术受随机引物和模板的结合等诸多因素影响，特异性不强，结果的重复性不太好；SSR技术步骤复杂，且该类标记受杂交过程中重组产生的新的等位基因的限制，DNA复制时的偶然滑动也会导致重复单元数发生改变；分子杂交是体细胞杂种鉴定的有效方法，但对DNA质量要求高，用量大，分析过程繁琐。
SNP分子标记数量多，总体多态信息含量大，在已知亲本的前提下，理论上一个SNP标记就能够用于鉴定杂种。大多数SNP是两等位性，通过Sanger法测序就能够直观地看到杂种后代在亲本间SNP位点的区别，从而鉴定出真杂种。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是提供一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法，以达到柑橘杂种快速鉴定的目的。
在Phytozome克里曼丁橘基因组(http://www.phytozome.org)序的第9个scaffold_9:29488746-29491310上，不同柑橘品种在该区段的基因组序列变异位点丰富，适于柑橘的品种鉴定工作。
因此，本发明设计引物P29488785F/P29489624R，正向P29488785F引物的序列是AGGCCAAATTCCTTTCTCG，反向P29489624R引物的序列是TACAGCAGCACCAACAGAG。
本发明的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法，包括如下步骤：
1)、提取杂交柑橘的亲本DNA，并作为模板，使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增，对扩增产物进行Sanger测序，分析亲本间的SNP标记位点。本步骤是通过比对亲本间的序列差异，得到SNP标记位点；
2)、提取杂交后代叶片组织的基因组DNA，并作为模板，以P29488785F/P29489624R作为引物，进行PCR扩增，以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序，观察测序峰，以在上述的SNP位点处是否出现杂峰作为评价真杂种的依据，完成杂种鉴定工作。
作为优选地，步骤2)的鉴定中，在上述SNP位点，真杂种在测序峰图中会出现类似套峰的杂峰，而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质，测序峰图则不会出现杂峰。
作为优选地，所述步骤2)中，杂交后代叶片组织的基因组DNA的提取采用微量法：取约3mm×3mm大小的叶片组织，PE管中加液氮研磨，CTAB法提取DNA。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
1、步骤简单，可大规模快速鉴定杂种后代。仅需要提取基因组DNA，进行PCR扩增并进行测序即能够区分出真杂种和珠心胚后代，且对基因组DNA的质量要求比较低。
2、结果准确可靠。Sanger测序是一种完全成熟的测序技术，且成本较低，能够在短时间内完成大量的鉴定工作。
附图说明
图1为实施例中杂交柑橘亲本一的测序峰图；
图2为实施例中杂交柑橘亲本二的测序峰图；
图3为实施例的杂交柑橘亲本间的SNP标记位点图；
图4为实施例的真杂种的测序峰图；
图5为实施例中珠心胚后代的测序峰图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
本实施例的一种基于SNP标记的可快速鉴定柑橘杂种的方法，其包括如下步骤：
1)、提取杂交柑橘的亲本DNA，并作为模板，使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增，扩增片段长度858bp，对扩增产物进行Sanger测序，分析亲本间的SNP标记位点；如图1和2所示，为杂交柑橘的亲本序列，结果显示，亲本测序结果峰形较好，没有出现杂峰现象，通过对比，如图3所示，亲本间存在SNP标记，分别是A/G、T/C和C/A；
2)、微量法提取杂交后代叶片组织的基因组DNA。取约3mm×3mm大小的叶片组织，PE管中加液氮研磨，CTAB法提取DNA并作为模板，以P29488785F/P29489624R作为引物，进行PCR扩增，扩增片段长度858bp，将扩增产物以P29488785F作为起始测序引物进行Sanger测序，在上述的SNP位点，根据测序峰图中是否出现杂峰完成杂种鉴定工作。
如图4-5所示，在上述SNP位点，真杂种会在测序峰图中出现了类似套峰的杂峰，而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质，测序峰图则不会出现杂峰。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、提取杂交柑橘的亲本DNA，并作为模板，使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增，对扩增产物进行Sanger测序，分析亲本间的SNP标记位点；其中，
正向P29488785F引物的序列是AGGCCAAATTCCTTTCTCG；
反向P29489624R引物的序列是TACAGCAGCACCAACAGAG；
2)、提取杂交后代叶片组织的基因组DNA，并作为模板，以P29488785F/P29489624R作为引物，进行PCR扩增，以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序，观察测序峰，以在上述的SNP位点处是否出现杂峰作为评价真杂种的依据，完成杂种鉴定工作。
2.根据权利要求1所述的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法，其特征在于，步骤2)的鉴定中，在上述SNP位点，真杂种在测序峰图中会出现类似套峰的杂峰，而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质，测序峰图则不会出现杂峰。
3.根据权利要求1所述的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)中，杂交后代叶片组织的基因组DNA的提取采用微量法：取约3mm×3mm大小的叶片组织，PE管中加液氮研磨，CTAB法提取DNA。
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