CN110042172A - 一种基于snp标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法,该方法包括:1)提取杂交柑橘的亲本DNA,并作为模板,使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增,扩增片段长度858bp,对扩增产物进行Sanger测序,分析亲本间的SNP标记位点;2)提取杂交后代叶片组织的基因组DNA,并作为模板,以P29488785F/P29489624R作为引物,进行PCR获得扩增产物,以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序。分析测序峰图中,若在上述SNP位点出现杂峰则为真杂种,完成杂种鉴定工作。本发明步骤简单,可大规模快速鉴定杂种后代。而且,鉴定结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明涉及植物间杂交品种鉴定方法,特别涉及一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法。
背景技术
柑橘遗传上高度杂合,且大多数柑橘主栽品种具有多胚性,使有性杂交较难获得杂种,配抢救能够将真杂种的幼胚保存下来,但大量的珠心胚也存活下来并发育成幼苗,如何从杂交后代中鉴定出真杂种是困扰柑橘育种工作的一大难题。目前,柑橘杂种鉴定主要采用形态学、细胞学、同工酶、随机扩增多态DNA(RAPD)、SSR标记和分子杂交等方法。形态学方法受环境条件影响大,准确性较差;染色体计数不能区别同源与异源融合四倍体;同工酶只能间接推测基因的变化,检测位点较少,且受器官、部位、生理状态、环境条件等影响;RAPD技术受随机引物和模板的结合等诸多因素影响,特异性不强,结果的重复性不太好;SSR技术步骤复杂,且该类标记受杂交过程中重组产生的新的等位基因的限制,DNA复制时的偶然滑动也会导致重复单元数发生改变;分子杂交是体细胞杂种鉴定的有效方法,但对DNA质量要求高,用量大,分析过程繁琐。
SNP分子标记数量多,总体多态信息含量大,在已知亲本的前提下,理论上一个SNP标记就能够用于鉴定杂种。大多数SNP是两等位性,通过Sanger法测序就能够直观地看到杂种后代在亲本间SNP位点的区别,从而鉴定出真杂种。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题是提供一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物及方法,以达到柑橘杂种快速鉴定的目的。
在Phytozome克里曼丁橘基因组(http://www.phytozome.org)序的第9个scaffold_9:29488746-29491310上,不同柑橘品种在该区段的基因组序列变异位点丰富,适于柑橘的品种鉴定工作。
因此,本发明设计引物P29488785F/P29489624R,正向P29488785F引物的序列是AGGCCAAATTCCTTTCTCG,反向P29489624R引物的序列是TACAGCAGCACCAACAGAG。
本发明的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法,包括如下步骤:
1)、提取杂交柑橘的亲本DNA,并作为模板,使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增,对扩增产物进行Sanger测序,分析亲本间的SNP标记位点。本步骤是通过比对亲本间的序列差异,得到SNP标记位点;
2)、提取杂交后代叶片组织的基因组DNA,并作为模板,以P29488785F/P29489624R作为引物,进行PCR扩增,以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序,观察测序峰,以在上述的SNP位点处是否出现杂峰作为评价真杂种的依据,完成杂种鉴定工作。
作为优选地,步骤2)的鉴定中,在上述SNP位点,真杂种在测序峰图中会出现类似套峰的杂峰,而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质,测序峰图则不会出现杂峰。
作为优选地,所述步骤2)中,杂交后代叶片组织的基因组DNA的提取采用微量法:取约3mm×3mm大小的叶片组织,PE管中加液氮研磨,CTAB法提取DNA。
本发明的上述技术方案的有益效果如下:
1、步骤简单,可大规模快速鉴定杂种后代。仅需要提取基因组DNA,进行PCR扩增并进行测序即能够区分出真杂种和珠心胚后代,且对基因组DNA的质量要求比较低。
2、结果准确可靠。Sanger测序是一种完全成熟的测序技术,且成本较低,能够在短时间内完成大量的鉴定工作。
附图说明
图1为实施例中杂交柑橘亲本一的测序峰图;
图2为实施例中杂交柑橘亲本二的测序峰图;
图3为实施例的杂交柑橘亲本间的SNP标记位点图;
图4为实施例的真杂种的测序峰图;
图5为实施例中珠心胚后代的测序峰图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合具体实施例进行详细描述。
本实施例的一种基于SNP标记的可快速鉴定柑橘杂种的方法,其包括如下步骤:
1)、提取杂交柑橘的亲本DNA,并作为模板,使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增,扩增片段长度858bp,对扩增产物进行Sanger测序,分析亲本间的SNP标记位点;如图1和2所示,为杂交柑橘的亲本序列,结果显示,亲本测序结果峰形较好,没有出现杂峰现象,通过对比,如图3所示,亲本间存在SNP标记,分别是A/G、T/C和C/A;
2)、微量法提取杂交后代叶片组织的基因组DNA。取约3mm×3mm大小的叶片组织,PE管中加液氮研磨,CTAB法提取DNA并作为模板,以P29488785F/P29489624R作为引物,进行PCR扩增,扩增片段长度858bp,将扩增产物以P29488785F作为起始测序引物进行Sanger测序,在上述的SNP位点,根据测序峰图中是否出现杂峰完成杂种鉴定工作。
如图4-5所示,在上述SNP位点,真杂种会在测序峰图中出现了类似套峰的杂峰,而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质,测序峰图则不会出现杂峰。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定引物,其特征在于,所述引物名称为P29488785F/P29489624R;其中,
正向P29488785F引物的序列是AGGCCAAATTCCTTTCTCG;
反向P29489624R引物的序列是TACAGCAGCACCAACAGAG。
2.一种基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)、提取杂交柑橘的亲本DNA,并作为模板,使用P29488785F/P29489624R作为引物进行PCR扩增,对扩增产物进行Sanger测序,分析亲本间的SNP标记位点;
2)、提取杂交后代叶片组织的基因组DNA,并作为模板,以P29488785F/P29489624R作为引物,进行PCR扩增,以P29488785F作为测序引物对扩增产物进行Sanger测序,观察测序峰,以在上述的SNP位点处是否出现杂峰作为评价真杂种的依据,完成杂种鉴定工作。
3.根据权利要求2所述的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法,其特征在于,步骤2)的鉴定中,在上述SNP位点,真杂种在测序峰图中会出现类似套峰的杂峰,而珠心胚发育而来的幼苗只含有母本的遗传物质,测序峰图则不会出现杂峰。
4.根据权利要求2所述的基于SNP标记的柑橘杂种快速鉴定方法,其特征在于,所述步骤2)中,杂交后代叶片组织的基因组DNA的提取采用微量法:取约3mm×3mm大小的叶片组织,PE管中加液氮研磨,CTAB法提取DNA。
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