CN104087578A - 一种与水稻白叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与水稻白叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。所述引物对的引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在用于水稻白叶枯病检测时，通过PCR扩增，若所得PCR扩增产物为98bp碱基片段，则待测水稻为白叶枯病抗性品种，若所得PCR扩增产物为103bp碱基片段，则待测水稻为白叶枯病感病品种。本发明方法可以对白叶枯病抗性水稻进行早期世代选择而缩短育种周期，能够较快地筛选出抗白叶枯病的水稻材料，可广泛应用于水稻的辅助育种。

Description

一种与水稻白叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记、引物及其应用

技术领域

本发明属于植物抗病育种技术领域，特别涉及用于检测水稻白叶枯病抗性的方法和功能特异性分子标记及其应用。

背景技术

基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段，辅之于高效率地基因型定向选择，才能快速高效地培育出优异水稻新品种。随着分子生物学和基因组学的迅速发展，分子标记技术的应用更加广泛。基于PCR的分子标记如微卫星或SSR(simple sequence repeat)等具有多态率高、相对稳定、检测方法简便快速及易于操作等特点而被广泛的应用。由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰等，可以从分子水平定向选择目标性状基因，同时还有可能打破不利基因之间的连锁而高效率地聚合多个优良基因于一体。通常所说的分子标记既包括目标基因的连锁标记也包括目标基因自身功能标记。分子标记辅助多基因聚合育种技术已经成为水稻、玉米等作物育种研究的一种发展趋势，运用该技术能否有效地将优质、多抗和高产等基因聚合到少数骨干品种中，关键在于能否获得与目标性状基因或主效QTL紧密连锁的实用分子标记。

水稻是世界上最重要的粮食作物，世界半数以上的人口以此为生。由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonas oryzae pv.Oryzae Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻生产上危害最大的细菌性病害之一。轻则减产10-20％，重时则达50％，在分蘖期受侵可导致颗粒无收。白叶枯病最早于1884年在日本福冈地区发现50年代以来，发病范围不断扩大，目前白叶枯病的发生范围已遍及世纪各水稻产区。白叶枯病在亚洲国家比较严重，尤其在我国，从南到北，几乎各稻区都有分布，一般而言，其灾害南方重于北方，籼稻重于粳稻，双季晚稻重于双季早稻，单季中稻重于单季晚稻。

水稻白叶枯病抗性遗传研究开始于20世纪50年代，自上世纪60年代末以来，科学家们就致力于水稻白叶枯病抗性品种基因的发掘和利用。近20年来，分子生物学技术的飞速发展及其在植物病理学中的广泛应用，为水稻抗病基因的研究奠定了坚实的基础，新基因的发现、鉴定、定位和克隆不断完善。目前在不同的水稻资源中已鉴定出多于30个白叶枯病抗性基因，已经定位的有19个，已克隆的基因有6个，其中xa5基因(Petpisit V,Khush G S,Kauffinan H E,etal.Inheritance of Resistance to Bacterial Blight in Rice.Crop Science,1987,17(0):551-554)由Petpisit等从水稻品种DZ192中鉴定出来，McCouch研究小组于2004年宣布克隆了这个基因，序列分析表明其编码产物可能为TFIIAγ小亚基。

发明内容

本发明目在于提供用于检测水稻白叶枯病抗性的功能特异性分子标记和方法，采用本发明方法可以对白叶枯病抗性水稻进行早期世代选择而缩短育种周期，能够较快地筛选出抗白叶枯病的水稻材料，可广泛应用于水稻的辅助育种。

为实现本发明目采用如下技术方案：

一种与水稻白叶枯病抗性基因xa5紧密连锁的分子标记，其特点在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

一种扩增如上所述分子标记的引物对，其特点在于，所述引物对的引物1为序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸，所述引物对的引物2为SEQ ID NO：3所示的核苷酸。

一种检测水稻白叶枯病抗性的方法，其特点在于，所述方法包括如下步骤：

(1)PCR扩增：以待测水稻提取的基因组作为DNA扩增模板，以序列表SEQID NO：1所示核苷酸、序列表SEQ ID NO：2所示核苷酸和序列表SEQ ID NO：3所示核苷酸组成的扩增引物对进行PCR扩增；

(2)扩增产物的鉴定：若所得PCR扩增产物为98bp碱基片段，则待水稻为白叶枯病抗性品种，若所得PCR扩增产物为103bp碱基片段，则待测水稻为白叶枯病感病品种。

所述步骤(2)中，98bp碱基片段序列如SEQ ID NO：4所示；103bp碱基片段序列如SEQ ID NO：5所示。

所述步骤(1)中待测水稻基因组采用碱煮法提取，具体方法如下：取0.8－1.2cm长的水稻叶片，用0.2Mol/L氢氧化钠40ml在100℃水浴5分钟，再加入60ml的0.17Mol/Ltris-HCL水浴3分钟，所得提取液即为待测水稻提取的基因组，4。C冰箱冷却备用。

所述步骤(1)中的PCR扩增的反应体系中包含：含Mg2+的10X Buffer2μ1，1OmM的dNTP0.4μl，5μM的序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列各2μ1，所述待测玉米提取的基因组DNA1μ1,5U/μ1的taq酶0.5μ1，其余为超纯水，反应体积为20μ1，滴加一滴矿物油覆盖；PCR反应程序为：94℃5min；94℃45s、56℃45s,72℃45s,32个循环；72℃5min。

本发明同时保护所述的与水稻白叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记在水稻育种中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明的方法克服了常规育种中因表型选择易受环境因素干扰而导致育种效率低等问题，可以利用分子标记对水稻白叶枯病抗性基因xa5进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出抗白叶枯病的水稻材料。本发明可应用于水稻育种，以提高育种效率和水稻产量水平。

本发明的方法克服了分子标记辅助育种中，由于分子标记和抗白叶枯病基因有一定的遗传距离，在育种过程中存在分离的可能性的问题。本发明中的分子标记位点位于抗性基因的功能位点，与抗性基因紧密连锁，不会出现分离，可以更有效地提高育种效率。

本发明的分子标记扩增采用2个上游引物和1个下游引物，其中2个上游引物的设计，可以对不同水稻品使用相同的扩增体系和扩增条件，并且能够通过凝胶电泳区分抗白叶枯病水稻和不抗白叶枯病水稻，达到快速、直观检测的技术效果。

本发明中水稻基因组的提取过程简化操作方便，提高了检测的效率。

附图说明

图1是本发明实施例扩增抗性品种IRBB60、不抗品种1030以及两者F₂材料的电泳图。图中1为IRBB60，2为1030，3到13为两者的F₂材料。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均由常规生化试剂公司购买得到，抗性品种IRBB60来自国际水稻所选育、不抗品种1030为本公司育种材料。本发明实施例所使用的抗性材料和感病材料仅用于进一步解释说明本发明技术方案，并非是对本发明的进一步限定，本发明方法除了可以检测本实施例所用的抗性品种和感病品种外，也可以用于其它抗性品种和感病品种的检测。

实施例1、白叶枯病抗性性状鉴定专用分子标记BYK1的获得

一、序列查找与引物设计

通过感病材料IR24和抗病材料IRBB5的杂交，扩大研究群体对xa5基因所在区域进行重组事件的分析，扫描了2345株的“IR24×IRBB5”群体，将基因定位于一个开放读码框内，序列分析表明其编码产物可能为TFIIAγ小亚基，利用软件Primer Premier5.0进行引物设计，命名为BYK1，由正向引物BYK-F1、正向引物BYK-F2和反向引物BYK-R组成，对应的序列信息分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。

SEQ ID NO.1(5，-3，)gccattcaagttcttgag

SEQ ID NO.2(5，-3，)agctcgccattcaagttcttgtc

SEQ ID NO.3(5，-3，)aatgaggagtcgaatttttcaa

二、引物合成和验证

引物由北京梓熙生物公司合成。以白叶枯病抗性品种IRBB60、不抗白叶枯病水稻品种1030以及两者的杂交种F₂为扩增对象。分子标记BYK1的PCR扩增条件：20μl反应体系中包括PCR反应体系为：含Mg2+的10X Buffer2μ1，dNTP0.4μ1(1OmM)，正向引物BYK-F1、正向引物BYK-F2和反向引物BYK-R3条各0.15μM的引物5μΜ)，基因组DNA1μ1,Taq酶0.5μ1(5U)，其余为超纯水，反应体积为20μ1，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为：94℃5min；94℃60s、53.5℃60s,72℃60s,35个循环；72℃1Omin。

PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照。结果BYK得到清晰的电泳图，见图1。

实施例2、BYK引物对的扩增产物与抗性性状的相关性验证

以抗白叶枯病材料IRBB60和不抗白叶枯病材料1030做亲本，两者杂交后的96个F₂代材料为试验对象。采用碱煮法提取水稻叶片的基因组DNA，以BYK1引物对进行PCR扩增实验。PCR反应体系为：含Mg2+的10X Buffer2μ1，dNTP0.4μ1(1OmM)，正向引物BYK-F1、正向引物BYK-F2和反向引物BYK-R3条各0.15μM的引物5μΜ)，基因组DNA1μ1,Taq酶0.5μ1(5U/μ1)，其余为超纯水，反应体积为20μ1，滴加一滴矿物油覆盖。PCR反应程序为：94℃5min；94℃60s、53.5℃60s,72℃60s,35个循环；72℃1Omin。(以上反应试剂除水稻基因组以外，均由市场购买获得)

本发明也可以采用其他现有技术获得水稻叶片基因组。

PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照记录,见图2所示。其中纯合的103bp的22株，纯合98bp的24株，杂合带型的50株。

供试稻白叶枯病菌株为经提纯的I、II、III、IV和V等5个生理小种代表菌株，由安徽农业大学提供。于水稻成株期，人工剪叶方法接菌，菌龄72h，菌液浓度3亿个细菌/ml，接种后21d参照方中达等(1990)的分级标准调查病级，每株调查2-3片叶子。抗感类型的划分标准见表1。

分析如下：供试水稻样本中存在纯合98bp的24株，22株表现为中抗以上，有2株为感病；而不带有98bp片段的22个材料中20株感病，有2株中抗；杂合的50株，46株表现为不抗，4株抗病；两者的一致性达到91.6％。见表2。因此，BYK1是与水稻白叶枯病抗性性状相关位点相紧密连锁的功能标记，可用于水稻分子辅助育种。

表1：水稻白叶枯病抗性分级标准

注：I、HR、MR、MS、S和HS分别表示免疫、

高抗、中抗、感病和高感，病斑长度单位为cm。

表2：BYK1扩增产物鉴定结果与田间白叶枯病接种试验对照

Claims (7)

1.一种与水稻白叶枯病抗性基因xa5紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。 

2.一种扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。 

3.一种检测水稻白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 

(1)PCR扩增：以待测水稻提取的基因组作为DNA扩增模板，以序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸、序列表SEQ ID NO：2所示核苷酸和序列表SEQ ID NO：3所示核苷酸组成的扩增引物对进行PCR扩增； 

(2)扩增产物的鉴定：若所得PCR扩增产物为98bp碱基片段，则待测水稻为白叶枯病抗性品种，若所得PCR扩增产物为103bp碱基片段，则待测水稻为白叶枯病感病品种。 

4.根据权利要求3所述的一种检测水稻白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，98bp碱基片段序列如SEQ ID NO：4所示；103bp碱基片段序列如SEQ ID NO：5所示。 

5.根据权利要求3所述的一种检测水稻白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测水稻基因组采用碱煮法提取，具体方法如下：取0.8－1.2cm长的水稻叶片，用0.2Mol/L氢氧化钠40ml在100℃水浴5分钟，再加入60ml的0.17Mol/Ltris-HCL水浴3分钟，所得提取液即为待测水稻提取的基因组，4℃冰箱冷却备用。 

6.根据权利要求3所述一种检测水稻白叶枯病抗性的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR扩增的反应体系中包含：含Mg2+的10X Buffer 2μ1，1OmM的dNTP 0.4μl，5μM的序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列和序列表SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列各2μ1，所述待测玉米提取的基因组DNA 1μ1,5U/μ1的taq酶0.5μ1，其余为超纯水，反应体积为20μ1，滴加一滴矿物油覆盖；PCR反应程序为：94℃5min；94℃45s、56℃45s,72℃45s,32个循环；72℃5min。 

7.权利要求1所述的一种与水稻白叶枯病抗性基因紧密连锁的分子标记在 水稻育种中的应用。