CN109338010A - 一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物及其应用 - Google Patents

一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，该引物可以特异识别萝卜细胞质雄性不育基因orf138，用于分子辅助选择育种，进行萝卜细胞质雄性不育基因orf138的基因分型。利用上述分子标记引物扩增待测萝卜总DNA，对所得的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，当出现212bp大小的电泳条带时，判定待测萝卜中含有细胞质雄性不育基因orf138，表明其雄性不育表型由orf138基因导致。若未出现电泳条带，判定待测萝卜中不含细胞质雄性基因orf138。利用该分子标记引物，可快速鉴定萝卜细胞质雄性不育类型，且准确率高，特异性强，方便快捷。

Description

一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物及其应用。
背景技术
植物细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)是一种广泛存在于高等植物中的母性遗传性状，表现为植株仅仅不能产生正常的花粉。细胞质雄性不育不仅为研究核质互作提供了良好材料，同时也是植物杂交优势利用的重要基础，因此，植物细胞质雄性不育的研究一直受到分子遗传学、细胞生物学、进化生物学及育种学等多个领域的广泛关注。目前已经在玉米、水稻和小麦等作物中研究报道了大量有关细胞质雄性不育机理的研究，有关萝卜、油菜和白菜等十字花科作物的雄性不育机理也有了一定的研究进展。自从Ogura细胞质雄性不育发现以来，国内外学者对萝卜雄性不育分子机理进行了多方面的研究，萝卜细胞质雄性不育类型多种多样，不同类型的细胞质雄性不育其不育基因也不尽相同。Ogura型萝卜细胞质雄性不育研究最为深入，研究表明萝卜Ogura细胞质雄性不育相关的不育基因为orf138，并获得orf138的DNA序列。
分子标记辅助育种是分子育种中的一种，其基本原理是利用分子生物学手段对目的基因或与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型进行分子选择，筛选目的基因个体，从而提高育种效率，其优点是特异性强，简捷高效。传统萝卜细胞质雄性不育选育主要通过表型观察进行选育，其缺点是周期长，任务量大，速度慢。为加快萝卜细胞质雄性不育育种效率，利用分子生物学技术，进行分子标记辅助育种十分迫切。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种萝卜细胞质雄性不育基因orf138分子标记引物。通过检测萝卜细胞质雄性不育基因特异的分子标记，可以快速鉴定萝卜细胞质雄性不育类型，为开展萝卜细胞不育分子标记辅助育种奠定基础。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：根据不育基因orf138的序列特征，设计了用于检测萝卜细胞质雄性不育基因的分子标记引物，所述分子标记引物的上游引物具有如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列，为5’-GTATGGGTGGCTAGGTGTCA-3’，下游引物具有如SEQID NO：2所示的核苷酸序列，为5’-TCGGTCCATTTTCCACCTCT-3’。
进一步地，使用所述的分子标记引物对待测萝卜总DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判定待测萝卜是否含有细胞质雄性不育基因orf138，若出现一条212bp的特异片段，则表明待测萝卜中含有orf138基因，若未出现条带则表明不含orf138基因。
上述特异片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，为：
GTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGA。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为25μl，具体为DNA模板40ng，2×Taq-mix12.5μl，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，变性、退火和延伸进行40个循环后72℃延伸5min。
上述的分子标记引物在鉴定萝卜细胞质雄性不育基因orf138中的应用。
本发明具有以下优点：本发明提供了一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，该引物可以特异识别萝卜细胞质雄性不育基因orf138，用于分子辅助选择育种。当利用上述分子标记引物扩增待测萝卜总DNA，对所得的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，当出现212bp大小的电泳条带时，判定待测萝卜中含有细胞质雄性不育基因orf138，若未出现电泳条带，判定待测萝卜中不含细胞质雄性基因orf138。利用该分子标记引物，可快速鉴定萝卜细胞质雄性不育类型，且准确率高，方便快捷。
附图说明
图1为本发明分子标记PCR上下游引物的位置图，其中，核苷酸序列为萝卜细胞质雄性不育基因orf138的全长DNA序列，图中箭头表示本发明分子标记PCR上下游引物的位置；
图2为利用本发明的分子标记引物检测待测萝卜是否含有萝卜细胞质雄性不育基因orf138的电泳图；其中，M：DL2000marker；1：萝卜种质1；2：萝卜种质2；3：萝卜种质3；4：萝卜种质4；5：萝卜种质5。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：萝卜细胞质雄性不育基因orf138的引物设计
根据萝卜细胞质雄性不育基因orf138全长的DNA序列，设计了能够特异性识别萝卜细胞质雄性不育基因orf138的特异性引物，所述分子标记引物的上游引物具有如SEQ IDNO：1所述的核苷酸序列，为5’-GTATGGGTGGCTAGGTGTCA-3’，下游引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，为5’-TCGGTCCATTTTCCACCTCT-3’。利用该引物对待测萝卜总DNA进行扩增，电泳结果出现212大小的片段，则表明含有orf138基因，该引物在orf138全长DNA中的位置如图1所示。orf138全长的DNA序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：ATGATTACCTTTTTCGAAAAATTGTCCACTTTTTGTCATAATCTCACTCCTACTGAATGTAAAGTTAGTGTAATAAGTTTCTTTCTTTTAGCTTTTTTACTAATGGCCCATATTTGGCTAAGCTGGTTTTCTAACAACCAACATTGTTTACGAACCATGAGACATCTAGAGAAGTTAAAAATTCCATATGAATTTCAGTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGAGAAAATAA
实施例2：萝卜叶片总DNA的提取
采用SDS法分别提取萝卜种质1、萝卜种质2、萝卜种质3、萝卜种质4和萝卜种质5叶片的总DNA，具体方法为：
1.取萝卜叶片0.5g，置于1.5ml离心管中，用研磨棒充分研磨叶片；
2.加400μl提取液(0.2mol/L Tris-HCl pH7.5，0.25mol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS)，震荡5sec，12000r/min离心1min；
3.取300μl上清液转移至1.5ml离心管中，加入300μl异丙醇，混匀后放置2min，在离心机中以12000r/min速度离心5min以沉淀DNA；
4.弃去上清液，倒置干燥，加入200μl TE溶解DNA，置于4℃冰箱中备用。
实施例3：萝卜总DNA的PCR扩增
利用实施例1中的引物，以萝卜的总DNA为模板，对待测萝卜种质1-5进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系25μl：DNA模板40ng，2×Taq-mix 12.5μl，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM。
PCR扩增反应程序为：94℃预变性1min，(94℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec)循环40次，72℃延伸5min。
实施例4：扩增片段的电泳分析
用上述引物对待测萝卜进行扩增后，扩增产物采用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，在电压120V，电流80mA条件下电泳1h，电泳结束后用凝胶成像系统照相，实验结果如图2所示。通过与DL2000marker进行比对，分析电泳条带大小。
如图2所示，萝卜种质1、萝卜种质2和萝卜种质3电泳结果出现一条明显的条带，大小为212bp，该片段对应的核苷酸序列如上述特异片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，为：
GTATGGGTGGCTAGGTGTCAAAATTACAATAAAATCAAATGTACCTAACGATGAAGTGACGAAAAAAGTCTCACCTATCATTAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGGGAAAGGGGAAATAGAGGGGAAAGAGGAAAAAAAAGAGGTGGAAAATGGACCGA。从而表明这3份萝卜材料中含有萝卜细胞质雄性不育基因orf138，萝卜种质4和萝卜种质5电泳后没有出现条带，表明这两份材料不含萝卜细胞质雄性不育基因orf138。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物及其应用
<130> 2018
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
gtatgggtgg ctaggtgtca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
tcggtccatt ttccacctct 20
<210> 3
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
gtatgggtgg ctaggtgtca aaattacaat aaaatcaaat gtacctaacg atgaagtgac 60
gaaaaaagtc tcacctatca ttaaagggga aatagagggg aaagaggaaa aaaaagaggg 120
gaaaggggaa atagagggga aagaggaaaa aaaagagggg aaaggggaaa tagaggggaa 180
agaggaaaaa aaagaggtgg aaaatggacc ga 212
<210> 4
<211> 417
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
atgattacct ttttcgaaaa attgtccact ttttgtcata atctcactcc tactgaatgt 60
aaagttagtg taataagttt ctttctttta gcttttttac taatggccca tatttggcta 120
agctggtttt ctaacaacca acattgttta cgaaccatga gacatctaga gaagttaaaa 180
attccatatg aatttcagta tgggtggcta ggtgtcaaaa ttacaataaa atcaaatgta 240
cctaacgatg aagtgacgaa aaaagtctca cctatcatta aaggggaaat agaggggaaa 300
gaggaaaaaa aagaggggaa aggggaaata gaggggaaag aggaaaaaaa agaggggaaa 360
ggggaaatag aggggaaaga ggaaaaaaaa gaggtggaaa atggaccgag aaaataa 417

Claims (6)

1.一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，其特征在于，标记的不育基因为orf138，所述分子标记引物的上游引物具有如SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列，为5’-GTATGGGTGGCTAGGTGTCA-3’，下游引物具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，为5’-TCGGTCCATTTTCCACCTCT-3’。
2.如权利要求1所述的一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，其特征在于，使用所述的分子标记引物对待测萝卜总DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判定待测萝卜是否含有细胞质雄性不育基因orf138，若出现一条212bp的特异片段，则表明待测萝卜中含有orf138基因，若未出现条带则表明不含orf138基因。
3.如权利要求2所述的一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，其特征在于，所述特异片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求2或3所述的一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25μl，具体为DNA模板40ng，2×Taq-mix 12.5μl，上游引物0.2μM，下游引物0.2μM。
5.如权利要求2或3所述的一种萝卜细胞质雄性不育基因分子标记引物，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，变性、退火和延伸进行40个循环后72℃延伸5min。
6.如权利要求1或2或3所述的分子标记引物在鉴定萝卜细胞质雄性不育基因orf138中的应用。
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