CN105586432B - 检测小麦是否含有簇毛麦6vs染色体臂的成套试剂与分子标记 - Google Patents

检测小麦是否含有簇毛麦6vs染色体臂的成套试剂与分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂与分子标记。本发明公开的的成套试剂，由A‑P与B‑P、C‑P、D‑P和E‑P中的至少一种组成；所述A‑P由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；所述B‑P由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；所述C‑P由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；所述D‑P由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；所述E‑P由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。本发明的成套试剂和方法可用于小麦杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育具有簇毛麦优良性状(如抗白粉病)的小麦新品系/品种。

Description

检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂与分子 标记
技术领域
本发明涉及生物技术领域中检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂与分子标记。
背景技术
簇毛麦Dasypyrum villosum(L.)P.Candargy(syn.Haynaldia villosa Schur)是小麦族簇毛麦属的一个二倍体种，2n＝2x＝14。它起源于地中海的东北部，从南欧的法国南部到里海，西南亚，俄罗斯和高加索地区(De Pace等1995；Frederiksen 1991)，是一种杂草类植物，生长在恶劣、干旱的环境中(Agnieszka Gradzielewska,2006)。由于其颖壳脊上和外稃顶端有丛生的毛状物，故名之。
簇毛麦含有许多生物胁迫和非生物胁迫抗性基因及优质基因，是改良小麦的优良基因源。Sears、Lukaszewski和刘大均等先后将簇毛麦基因组转移到小麦的遗传背景，育成3套染色体附加系。根据簇毛麦来源的不同，Qi等(1998)首先将Sears培育的小麦-簇毛麦附加系用DA1V#1-DA7V#1表示，将南京农业大学培育的小麦-簇毛麦附加用DA1V#2-DA7V#2表示，Liu等(2011)随后将A.J.Lukaszewski培育的附加系用DA1V#3-DA7V#3表示，申请人将前苏联簇毛麦No.1026衍生的6VS染色体命名为6V#4S(Lin等，2013)。
6V#1S，6V#2S，6V#3S和6V#4S染色体臂的区别仅在于来源地不同。6V#1S，6V#2S，6V#3S和6V#4S染色体短臂来源不同对小麦白粉病抗性也表现不同。携带6V#1S和6V#3S染色体的小麦不抗白粉病，而具有6V#2S和6V#4S染色体的小麦对白粉病均表现免疫(Liu等，2011)。
陈佩度等(1995)利用6V#2(6A)异代换系与扬麦5号杂交，结合杂种后代的γ-射线处理，成功选育出抗白粉病T6V#2S·6AL易位系，其抗病基因命名为Pm21(Qi等，1996)。陈孝等(1996)利用来自前苏联的簇毛麦No.1026培育了硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH1，TH2和TH3，及抗白粉病的6V#4(6D)代换系94G22-1、94G25-1、94G32-1和94G33-1，利用TH3与小麦品种宛7107杂交、回交，未成熟胚培养及/花药培养等方法，培育出6V#4S·6DL染色体易位系Pm97033、Pm97034和Pm97035(Li等，2005)。
虽然6V#2S·6AL易位系和6V#4S·6DL易位系对小麦条纹花叶病毒及其传媒载体-小麦卷曲螨的敏感性不同；在染色体水平上，2条外源染色体臂也与不同的小麦染色体建立了连锁关系，但二者对白粉病菌所有小种表现免疫，故在白粉病抗性表型上难于相互区分。
基于PCR扩增的分子标记是一种鉴定外源染色体的简便手段。目前为止，针对6V#2S·6AL易位系开发的特异PCR标记有如下7个。Qi等通过随机引物扩增法筛选的RAPD标记OPH17；Liu等将该标记的扩增片段回收测序后转化为稳定的SCAR标记SCAR1700；Cao等(2006)基于一个受白粉菌诱导表达的丝/苏氨酸蛋白激酶基因(Contig17515)序列开发了一个可同时扩增6VS/6AS/6BS/6DS的共显性标记NAU/xibao15F和NAU/xibao15R；Chen(2006)等利用抑制差减杂交获得一个在携带Pm21的抗病系中特异表达的富亮氨酸结构域基因Ta-LRR2，将其转化为PCR标记，可特异扩增6VS和6AS；王春梅等(2006)对11个抗病基因同源序列(RGA)和17对STS引物进行多态性分析，获得2个稳定的特异性分子标记CINAU17-1086和CINAU18-723，可特异扩增6VS染色体臂。上述Cao、Chen和王春梅等开发的标记均在聚丙烯酰胺凝胶中分离。
对6V#4S·6DL易位系，李辉等(2005)筛选了5个6VS染色体特异的RAPD分子标记，其中OPAL03750仅能从携带6V#4S染色体臂的簇毛麦和小麦中扩增，成为区别于6V#2S·6AL的分子标记。申请人也开发了1个可特异区别6V#2S·6AL和6V#4S·6DL的分子标记(张云龙等，2012)。
最近，Bie等(2015)筛选出一个可同时鉴定6V#2S/6V#4S/6AS/6DS的分子标记MBH1。
小麦白粉病是由活体营养白粉菌小麦专化型(Blumeria graminis formaspecialis tritici)引起的一种世界性真菌病害，常造成小麦产量的严重损失。目前中国多数大面积推广的小麦品种对白粉病的抗性较差，限制了其推广应用的范围和年限。因此，选育高抗白粉病的小麦品种和改良目前推广优良小麦品种的白粉病抗性，是防治小麦白粉病，实现小麦安全生产最安全、有效的措施。迄今为止，在小麦农家品种和野生近缘种中已经发掘了多个白粉病抗性基因，并开发了一些抗病基因的分子标记。但白粉菌的生理小种变异快，很多抗病基因在生产上使用不久就被新的小种所克服。抗白粉病是小麦育种的一个长期而重要的内容。来自簇毛麦(Haynaldia villosa)的6V#2S·6AL和6V#4S·6DL易位系因对小麦白粉病菌所有生理小种免疫，表现出一种广谱的抗性，目前已被广泛用于育种计划。一些品种或品系的系谱中包含了2个易位系，后代抗源的归属有待鉴定。另方面，由于6V#2S和6V#4S染色体属于相同同源群，其抗性是否相同一直是个悬而未解的问题，获得特异染色体臂上不同位点的遗传标记有助于对此开展深入的研究。因此，无论对于抗病育种的辅助选择，还是对于理论研究，都迫切需要开发大量特异于目标染色体的分子标记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色体臂。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂，其名称为成套试剂1。所述成套试剂1由A-P与B-P、C-P、D-P和E-P中的至少一种组成；
所述A-P由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
所述B-P由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
所述C-P由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
所述D-P由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
所述E-P由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
所述成套试剂1中的各单链DNA均可独立包装，也可包装在一起；也可将其中的各引物对单独包装。所述成套试剂1中各单链DNA的摩尔数比例可以根据实际检测的样品进行调整，所述成套试剂1中各单链DNA的摩尔数也均可相同，所述成套试剂1中各引物对的摩尔数也均可相同。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色体臂的引物对，该引物对为所述A-P。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂，其名称为成套试剂1-1。所述成套试剂1-1由所述成套试剂1或所述A-P与X1组成；所述X1为F-P、G-P和H-P中的至少一种；
所述F-P由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；
所述G-P由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；
所述H-P由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成。
所述成套试剂1-1中的各单链DNA均可独立包装，也可包装在一起；也可将其中的各引物对单独包装。所述成套试剂1-1中各单链DNA的摩尔数比例可以根据实际检测的样品进行调整，所述成套试剂1-1中各单链DNA的摩尔数也均可相同，所述成套试剂1-1中各引物对的摩尔数也均可相同。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色体臂的系统。所述系统为系统A1、系统A2或系统A3；
所述系统A1由所述成套试剂1与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成；
所述系统A2由所述A-P与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成；
所述系统A3由所述成套试剂1-1与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成。
上述系统中，所述系统A1、所述系统A2和所述系统A3中的进行PCR扩增所需的试剂均可为DNA聚合酶或含有DNA聚合酶的试剂(如2x Taq MasterMix)。2x Taq MasterMix可为北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0682A。所述系统A1、所述系统A2和所述系统A3中的进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述PCR仪可为Bio-RAD T100TM ThermalCycler。
为解决上述技术问题，本发明还提供了簇毛麦6VS分子标记。所述簇毛麦6VS分子标记为分子标记a1、分子标记a2或分子标记a3；
所述分子标记a1由A与B、C、D和E中的至少一种组成；
所述A为序列17所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述A-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述B为序列18所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述B-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述C为序列19所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述C-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述D为序列20所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述D-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述E为序列21所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述E-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述分子标记a2为所述A；
所述分子标记a3由所述分子标记a1或所述分子标记a2与U1组成；所述U1为F、G和H中的至少一种；
所述F为序列22所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述F-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述G为序列23所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述G-P进行PCR扩增得到的DNA分子；
所述H为序列24所示的DNA分子，该DNA分子为以簇毛麦基因组DNA为模板用所述H-P进行PCR扩增得到的DNA分子。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测小麦遗传背景中是否含有簇毛麦6VS染色体臂的方法。所述方法为下述R或S：
R、下述R1)或R2)：
R1)包括R11)和R12)：
R11)分别以待测小麦、参比小麦和簇毛麦的基因组DNA为模板，用5种引物对分别进行PCR扩增，得到所述5种引物对的待测小麦PCR产物、所述5种引物对的参比小麦PCR产物和所述5种引物对的簇毛麦PCR产物；所述参比小麦为不含簇毛麦6VS染色体臂的小麦，作为确定簇毛麦特异条带的参比；
R12)将所述5种引物对的待测小麦PCR产物、所述5种引物对的参比小麦PCR产物和所述5种引物对的簇毛麦PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述5种引物对的待测小麦PCR产物中是否含有簇毛麦相应引物对的特异扩增条带，如果所述5种引物对的待测小麦PCR产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中含有簇毛麦相应引物对的特异扩增条带，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如果所述5种引物对的待测小麦PCR产物中均不含有簇毛麦相应引物对的特异扩增条带，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
所述5种引物对为所述A-P、所述B-P、所述C-P、所述D-P和所述E-P；
R2)包括R21)和R22)：
R21)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述5种引物对分别进行PCR扩增，得到所述5种引物对的待测小麦PCR产物；
R22)检测R21)所述5种引物对的待测小麦PCR产物的序列，如所述5种引物对的待测小麦PCR产物中含有所述A、所述B、所述C、所述D和所述E中的至少一种，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如所述5种引物对的待测小麦PCR产物中均不含所述A、所述B、所述C、所述D和所述E中的任一种或任几种，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
S、下述S1)或S2)：
S1)包括S11)和S12)：
S11)分别以待测小麦、参比小麦和簇毛麦的基因组DNA为模板，用8种引物对分别进行PCR扩增，得到所述8种引物对的待测小麦PCR产物、所述8种引物对的参比小麦PCR产物和所述8种引物对的簇毛麦PCR产物；所述参比小麦为不含簇毛麦6VS染色体臂的小麦，作为确定簇毛麦特异条带的参比；
S12)将所述8种引物对的待测小麦PCR产物、所述8种引物对的参比小麦PCR产物和所述8种引物对的簇毛麦PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述8种引物对的待测小麦PCR产物中是否含有簇毛麦相应引物对的特异扩增条带，如果所述8种引物对的待测小麦PCR产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中含有簇毛麦相应引物对的特异扩增条带，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如果所述8种引物对的待测小麦PCR产物中均不含有簇毛麦相应引物对的特异扩增条带，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
所述8种引物对为所述A-P、所述B-P、所述C-P、所述D-P、所述E-P、所述F-P、所述G-P和所述H-P；
S2)包括S21)和S22)：
S21)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述8种引物对分别进行PCR扩增，得到所述8种引物对的待测小麦PCR产物；
S22)检测S21)所述8种引物对的待测小麦PCR产物的序列，如所述8种引物对的待测小麦PCR产物中含有所述A、所述B、所述C、所述D、所述E、所述F、所述G和所述H中的至少一种，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如所述8种引物对的待测小麦PCR产物中均不含所述A、所述B、所述C、所述D、所述E、所述F、所述G和所述H中的任一种或任几种，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
所述簇毛麦相应引物对的特异条带为同一种引物对的簇毛麦PCR产物含有但所述同一种引物对的所述参比小麦的PCR产物不含有的条带。所述簇毛麦相应引物对的特异条带具体为所述A、所述B、所述C、所述D、所述E、所述F、所述G或所述H在电泳中显示的条带。
上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火温度可为58-64℃。
上述方法中，用所述A-P、所述F-P和所述G-P分别进行PCR扩增的退火温度均可为60℃；
用所述B-P、所述C-P、所述D-P和所述E-P分别进行PCR扩增的退火温度均可为58℃；
用所述H-P进行PCR扩增的退火温度可为64℃。
上述方法中，所述PCR扩增的反应体系可由所述2x Taq MasterMix、基因组DNA、引物对和水组成。所述反应体系中各引物对的正向引物的浓度可为0.4μM,各引物对的反向引物的浓度可为0.4μM，所述2x Taq MasterMix浓度可为2×，基因组DNA的浓度可为8ng/μl。
所述PCR扩增的PCR反应条件均可为：95℃5min；94℃30s,58-64℃30s,72℃1min，35个循环；72℃5min。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂1、所述成套试剂1-1、所述A-P、所述系统、所述簇毛麦分子标记、或所述检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的方法的下述Z1或Z2的应用：
Z1、在检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂中的应用；
Z2、在小麦育种中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了小麦的育种方法。所述小麦的育种方法包括以按照检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的方法得到的含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂的待测小麦作为亲本进行育种。
本发明中，所述待测小麦和所述小麦均可为簇毛麦或利用簇毛麦进行改良得到的小麦，如6V#2S·6AL易位系、6V#4S·6DL易位系Pm97033、扬麦22、内麦836、扬麦18、CB037或金禾9123。
本发明中，所述簇毛麦6VS染色体臂具体可为6V#2S和/或6V#4S染色体臂。
本发明获得了8种簇毛麦6VS染色体臂的新分子标记：A、B、C、D、E、F、G和H。本发明采用上述分子标记及其引物对的检测或辅助检测待测小麦中是否含有簇毛麦6VS染色体臂的方法与以及利用鉴定6V#2S和6V#4S的标记MBH1检测待测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的方法的结果完全一致。本发明的成套试剂和方法可用于小麦杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育具有簇毛麦优良性状(如抗白粉病)的小麦新品系/品种。
附图说明
图1为成套试剂1中A-P、B-P和C-P检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂的电泳结果。
图2为成套试剂1中D-P和E-P检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂的电泳结果。
图1和图2中，泳道M均为DNA分子量标准(DM2000bp)，泳道1均为宛7107，泳道2均为簇毛麦NO.1026(HV-S)，泳道3均为6V#4S·6DL易位系Pm97033，泳道4均为扬麦22，泳道5均为6V#2S·6AL易位系，泳道6均为内麦836，泳道7均为扬麦18，泳道8均为CB037，泳道9均为金禾9123。
图3为利用成套试剂1对感白粉病的小麦宛7107、抗白粉病小麦易位系Pm97033、簇毛麦NO.1026和6V#2S·6AL易位系进行检测的部分电泳图。其中，泳道1表示宛7107，泳道2表示Pm97033，泳道3表示簇毛麦NO.1026，泳道4表示6V#2S·6AL易位系，泳道M表示DNA分子量标准。
图4为利用成套试剂1中A-P对宁春号及其抗白粉病的宁春号改良系(以感白粉病的宁春号小麦为定向回交亲本与携带6V#2S·6AL易位染色体的小麦CB037杂交的BC5F6代)中簇毛麦染色体臂的检测结果。其中，泳道M为DNA分子量标准DM(2000bp)，泳道1-5均为宁春4号改良系，泳道6-10均为宁春47号改良系，泳道11-15均为宁春50改良系，泳道16为宁春4号，泳道17为宁春47，泳道18为宁春50，泳道19为CB037，泳道20为簇毛麦，泳道21为Pm97033。
图5为成套试剂2中F-P、G-P和H-P检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂的电泳结果。其中，泳道M为DNA分子量标准(DM2000bp)，泳道1为宛7107，泳道2为簇毛麦NO.1026(HV-S)，泳道3为6V#4S·6DL易位系Pm97033，泳道4为扬麦22，泳道5为6V#2S·6AL易位系，泳道6为内麦836，泳道7为扬麦18，泳道8为CB037，泳道9为金禾9123。
图6为利用成套试剂2对宛7107、抗病小麦易位系Pm97033、簇毛麦NO.1026和6V#2S·6AL易位系进行检测的电泳图。其中，泳道1表示宛7107，泳道2表示抗病小麦易位系Pm97033，泳道3表示簇毛麦NO.1026，泳道4表示6V#2S·6AL易位系，泳道M表示DNA分子量标准。
图7为利用MBH1标记对小麦簇毛麦染色体臂的检测结果。其中，泳道M为DNA分子量标准(DM2000bp)，泳道1为宛7107，泳道2为簇毛麦NO.1026(HV-S)，泳道3为6V#4S·6DL易位系Pm97033，泳道4为扬麦22，泳道5为6V#2S·6AL易位系，泳道6为内麦836，泳道7为扬麦18，泳道8为CB037，泳道9为金禾9123。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的2x Taq MasterMix为北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0682A。
实施例1、小麦是否含有簇毛麦染色体臂的检测
一、检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂的成套试剂的制备
检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂的成套试剂为成套试剂1和成套试剂2，成套试剂1由A-P、B-P、C-P、D-P和E-P组成；
A-P由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
B-P由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
C-P由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
D-P由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
E-P由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成；
成套试剂2由F-P、G-P和H-P组成；
F-P由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；
G-P由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；
H-P由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成。
成套试剂1和成套试剂2中的各单链DNA均独立包装，每个引物对中各单链DNA的摩尔比均为1:1。在以簇毛麦基因组DNA为模板进行PCR扩增时，
利用A-P可以扩增出序列17所示的DNA分子；
利用B-P可以扩增出序列18所示的DNA分子；
利用C-P可以扩增出序列19所示的DNA分子；
利用D-P可以扩增出序列20所示的DNA分子；
利用E-P可以扩增出序列21所示的DNA分子；
利用F-P可以扩增出序列22所示的DNA分子；
利用G-P可以扩增出序列23所示的DNA分子；
利用H-P可以扩增出序列24所示的DNA分子。
二、小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的检测
1、检测样本的选择
待测小麦：6V#2S·6AL易位系也称南农易位系(NY，由南京农业大学培育而成)(Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhang SZ,Liu DJ(1995)Development and molecularcytogenetic Analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL.Translocation linesspecifying resistance to powdery mildew.Theor Appl Genet 91:1125–1128)
携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033(6V#4S·6DL易位系,以下简称Pm97033，是一个利用前苏联引进的簇毛麦培育的易位系，Li H,Chen X,Xin ZY,Ma YZ,XuHJ,Chen XY,Jia X(2005)Development and identification of wheat–Haynaldiavillosa T6DL·6VS chromosome translocation lines conferring resistance topowdery mildew.Plant Breed 124:203–205)
扬麦22:Pm97033后代,国审麦2012004，江苏省里下河地区农业科学所，白粉病免疫。
金禾9123:石4185/92R137//石4185(国审麦2012008,含有Pm21，河北省农林科学院遗传生理研究所,系谱中92R137是6V#2S·6AL易位系)，白粉病免疫。
内麦836：国审麦2008001，四川省内江市农业科学院
扬麦18：皖麦2008001，江苏省里下河地区农业科学所
中麦113(京审麦2013001)，中国农科院作物科学研究所
CB037(6V#2S·6AL易位系)(张云龙，王美蛟，张悦，褚翠萍，林志珊(通讯作者)，徐琼芳，叶兴国，陈孝，张宪省。不同簇毛麦6VS染色体臂的白粉病抗性特异功能标记的开发及应用，作物学报，2012，38(10):1827-1832。)
参比小麦：感病的小麦亲本宛7107(以下简称宛7107，普通小麦)(陈孝，施爱农，尚立民，簇毛麦对不同白粉病菌菌系的抗性反应及其在小麦遗传背景下的表达，植物病理学报，1997.27(1):17～22)。
簇毛麦：簇毛麦NO.1026(HV-S)(陈孝，徐惠君，杜丽璞，尚立民，韩彬，施爱农，肖世和，利用组织培养技术向普通小麦导入簇毛麦抗白粉病基因的研究，中国农业科学，1996(5)，29:1-8。)
2、利用成套试剂1检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂
2.1检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂
提取步骤1的待测小麦(6V#4S·6DL易位系Pm97033、扬麦22、6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、中麦113、CB037和金禾9123)、参比小麦与簇毛麦的基因组DNA，利用步骤一的成套试剂1进行PCR扩增，PCR反应体系均为20μl反应体系，具体为：包括ddH2O 14μl,2xTaq MasterMix 10μl,正向引物(10μmol×L-1)0.4μl,反向引物(10μmol×L-1)0.4μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl。
PCR反应条件为：95℃变性5min；94℃变性30s,引物对相应退火温度退火30s,72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。进行PCR扩增的PCR仪为Bio-RAD T100TM ThermalCycler，PCE扩增结束后，将各引物对的各小麦的PCR产物利用1-3％的普通琼脂糖凝胶在120V下、1×TAE buffer中电泳30min。部分小麦的电泳结果如图1和图2所示。
步骤一的成套试剂1的退火温度如表1所示。
表1、步骤一的成套试剂1的退火温度
引物对名称 序列 退火温度
A-P 正向引物A-F，序列1；反向引物A-R，序列2 60℃
B-P 正向引物B-F，序列3；反向引物B-R，序列4 58℃
C-P 正向引物C-F，序列5；反向引物C-R，序列6 58℃
D-P 正向引物D-F，序列7；反向引物D-R，序列8 58℃
E-P 正向引物E-F，序列9；反向引物E-R，序列10 58℃
根据电泳结果确定各种引物对的簇毛麦特异条带，引物对A-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的A-P PCR产物中含有而参比小麦的A-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列17所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带A)；引物对B-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的B-P PCR产物中含有而参比小麦的B-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列18所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带B)；引物对C-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的C-P PCR产物中含有而参比小麦的C-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列19所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带C)；引物对D-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的D-P PCR产物中含有而参比小麦的D-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列20所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带D)；引物对E-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的E-P PCR产物中含有而参比小麦的E-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列21所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带E)。
根据上述结果，确定各待测小麦各引物对PCR产物中是否含有各引物对的簇毛麦特异条带，结果如表2所示。
表2、各小麦是否含有各PCR引物对簇毛麦特异条带的结果
表2中，A表示含有簇毛麦特异条带A，B表示含有簇毛麦特异条带B，C表示含有簇毛麦特异条带C，D表示含有簇毛麦特异条带D，E表示含有簇毛麦特异条带E，F表示含有簇毛麦特异条带F，G表示含有簇毛麦特异条带G；-表示不含有簇毛麦特异条带。
结果显示，在待测小麦中，6V#4S·6DL易位系Pm97033、扬麦22、6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、CB037和金禾9123均含有簇毛麦特异条带A、B、C、D和E，而中麦113不含有簇毛麦特异条带A、B、C、D和E中的任一种。
2.2目的片段为簇毛麦6VS染色体臂
用成套试剂1的各引物对分别以簇毛麦NO.1026、6V#2S·6AL易位系(NY，是一个利用来自英国剑桥植物园的簇毛麦培育的易位系，Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhang SZ,Liu DJ(1995)Development and molecular cytogenetic Analysis of wheat-Haynaldiavillosa 6VS/6AL.Translocation lines specifying resistance to powderymildew.Theor Appl Genet 91:1125–1128，其外源染色体片段仅为6V#2S染色体臂)、携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033(以下简称Pm97033，是一个利用前苏联引进的簇毛麦培育的易位系，Li H,Chen X,Xin ZY,Ma YZ,Xu HJ,Chen XY,Jia X(2005)Development and identification of wheat–Haynaldia villosa T6DL·6VSchromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew.PlantBreed 124:203–205，其外源染色体片段仅为6V#4S染色体臂)和宛7107(陈孝，施爱农，尚立民，簇毛麦对不同白粉病菌菌系的抗性反应及其在小麦遗传背景下的表达，植物病理学报，1997.27(1):17～22，其不含来自于簇毛麦的染色体片段)的基因组DNA为模板按照步骤2.1的反应体系和反应条件进行PCR扩增，A-P、C-P和D-P的电泳结果如图3所示。
测序结果表明，利用A-P仅在簇毛麦NO.1026、NY和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(图3中A-P中箭头所示条带，在宛7107的PCR反应中无该条带)的序列为序列17，表明，序列17所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带A)为簇毛麦6VS染色体臂；利用B-P仅在簇毛麦NO.1026、NY和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(在宛7107的PCR反应中无该条带)的序列为序列18，表明，序列18所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带B)为簇毛麦6VS染色体臂；利用C-P仅在簇毛麦NO.1026、NY和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(图3中C-P中箭头所示条带，在宛7107的PCR反应中无该条带)的序列为序列19，表明，序列19所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带C)为簇毛麦6VS染色体臂；利用D-P仅在簇毛麦NO.1026、NY和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(图3中D-P中箭头所示条带，在宛7107的PCR反应中无该条带)的序列为序列20，表明，序列20所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带D)为簇毛麦6VS染色体臂；利用E-P仅在簇毛麦NO.1026、NY和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(在宛7107的PCR反应中无该条带)的序列为序列21，表明，序列21所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带E)为簇毛麦6VS染色体臂。
2.3宁春号及其宁春号白粉病抗性改良系中簇毛麦染色体臂的检测
选取5株宁春4号改良系、5株宁春47号改良系、5株宁春50改良系、宁春4号、宁春47号和宁春50号利用A-P进行簇毛麦染色体臂的检测，其中，宁春4号改良系为利用含有6V#2S·6AL染色体的的小麦CB037与宁春4号杂交，再用宁春4号回交进行改良得到的株系，以相同方法，宁春47号改良系为利用CB037对宁春47号进行改良得到的株系，宁春50改良系为利用CB037对宁春50号进行改良得到的株系。用CB037、簇毛麦NO.1026和Pm97033(6V#4S·6DL易位系)作为对照，检测方法同步骤2.1。
结果(图4)显示，5株宁春4号改良系、5株宁春47号改良系和5株宁春50改良系中均含有簇毛麦特异条带A，而宁春4号、宁春47号和宁春50号均不含有簇毛麦特异条带A，表明，这5株宁春4号改良系、5株宁春47号改良系和5株宁春50改良系均含有簇毛麦6VS染色体臂。
3、利用成套试剂2检测小麦是否含有簇毛麦6V#4S染色体臂
3.1检测小麦是否含有簇毛麦染色体臂
提取步骤1的各待测小麦、参比小麦与簇毛麦的基因组DNA，利用步骤一的成套试剂2进行PCR扩增，PCR反应体系均为20μl反应体系，具体为：包括ddH2O 14μl,2x TaqMasterMix 10μl,正向引物(10μmol×L-1)0.3μl,反向引物(10μmol×L-1)0.3μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl。PCR反应条件为：95℃变性5min；94℃变性30s,引物对相应退火温度退火30s,72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。进行PCR扩增的PCR仪为Bio-RAD T100TMThermal Cycler，PCE扩增结束后，将各引物对的各小麦的PCR产物利用1-3％的普通琼脂糖凝胶在120V下、1×TAE buffer中电泳30min。部分小麦的电泳结果如图5所示。
步骤一的成套试剂2的退火温度如表3所示。
表3、步骤一的成套试剂2的退火温度
引物对名称 序列 退火温度
F-P 正向引物F-F，序列11；反向引物F-R，序列12 60℃
G-P 正向引物G-F，序列13；反向引物G-R，序列14 60℃
H-P 正向引物H-F，序列15；反向引物H-R，序列16 64℃
根据电泳结果确定各种引物对的簇毛麦特异条带，引物对F-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的F-P PCR产物中含有而参比小麦的F-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列22所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带F)；引物对G-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的G-P PCR产物中含有而参比小麦的G-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列23所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带G)；引物对H-P的簇毛麦特异条带为簇毛麦的H-P PCR产物中含有而参比小麦的H-P PCR产物不含的条带，将该条带回收进行测序，该条带为序列24所示的DNA分子(将该条带命名为簇毛麦特异条带H)。
根据上述结果，确定各待测小麦各引物对PCR产物中是否含有各引物对的簇毛麦特异条带，结果如表4所示。
表4、各小麦是否含有各PCR引物对簇毛麦特异条带的结果
表4中，F表示含有簇毛麦特异条带F，G表示含有簇毛麦特异条带G，H表示含有簇毛麦特异条带H；-表示不含有簇毛麦特异条带。
结果显示，在待测小麦中，6V#4S·6DL易位系Pm97033与扬麦22均含有簇毛麦特异条带F、G和H，而6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、CB037、金禾9123和中麦113均不含有簇毛麦特异条带F、G和H中的任一种。
3.2目的片段为簇毛麦6V#4S染色体臂
用成套试剂2的各引物对分别以簇毛麦NO.1026、6V#2S·6AL易位系(NY，是一个利用来自英国剑桥植物园的簇毛麦培育的易位系，Chen PD,Qi LL,Zhou B,Zhang SZ,Liu DJ(1995)Development and molecular cytogenetic Analysis of wheat-Haynaldiavillosa 6VS/6ALtranslocation lines specifying resistance to powderymildew.Theor Appl Genet 91:1125–1128，其外源染色体片段仅为6V#2S染色体臂)、携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033(以下简称Pm97033，是一个利用前苏联引进的簇毛麦培育的易位系，Li H,Chen X,Xin ZY,Ma YZ,Xu HJ,Chen XY,Jia X(2005)Development and identification of wheat–Haynaldia villosa T6DL·6VSchromosome translocation lines conferring resistance to powdery mildew.PlantBreed 124:203–205，其外源染色体片段仅为6V#4S染色体臂)和感病的小麦亲本宛7107(陈孝，施爱农，尚立民，簇毛麦对不同白粉病菌菌系的抗性反应及其在小麦遗传背景下的表达，植物病理学报，1997.27(1):17～22，其不含来自于簇毛麦的染色体片段)的基因组DNA为模板按照步骤2.1的反应体系和反应条件进行PCR扩增，结果如图6所示。
测序结果显示，利用F-P仅在簇毛麦NO.1026和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(图6中F-P中箭头所示条带，在宛7107和NY的PCR反应中均无该条带)的序列为序列22，表明，序列22所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带F)为簇毛麦6V#4S染色体臂；利用G-P仅在簇毛麦NO.1026和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(图6中G-P中箭头所示条带，在宛7107和NY的PCR反应中均无该条带)的序列为序列23，表明，序列23所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带G)为簇毛麦6V#4S染色体臂；利用H-P仅在簇毛麦NO.1026和携带6V#4S·6DL染色体的抗病小麦易位系Pm97033的PCR反应中扩增得到的条带(图6中H-P中箭头所示条带，在宛7107和NY的PCR反应中均无该条带)的序列为序列24，表明，序列24所示的DNA分子(即簇毛麦特异条带24)为簇毛麦6V#4S染色体臂。
表明，6V#4S·6DL易位系Pm97033与扬麦22均含有簇毛麦6V#4S染色体臂，而6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、CB037、金禾9123和中麦113均不含有簇毛麦6V#4S染色体臂。
4、待测小麦簇毛麦6VS染色体臂与簇毛麦6V#4S染色体臂的进一步验证
MBH1是Bie等开发的一个鉴定6V#2S和6V#4S的标记(Tongde Bie等，Mol Breeding(2015)35:189，DOI 10.1007/s11032-015-0385-3)，利用该标记对步骤1中的待测小麦、参比小麦和簇毛麦NO.1026(HV-S)进行检测，部分小麦的电泳检测结果如图7所示。
结果显示，宛7107不含271bp和341bp的条带，簇毛麦NO.1026、6V#4S·6DL易位系Pm97033与扬麦22均含有271bp的条带但不含有341bp的条带，6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、CB037、金禾9123均含有341bp的条带但不含有271bp的条带，中麦113既不含有271bp的条带也不含有341bp的条带。表明，待测小麦6V#4S·6DL易位系Pm97033与扬麦22均含有簇毛麦6V#4S染色体臂，而6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、CB037和金禾9123均含有含有簇毛麦6V#2S染色体臂，进一步可以得知待测小麦6V#4S·6DL易位系Pm97033、扬麦22、6V#2S·6AL易位系、内麦836、扬麦18、CB037和金禾9123均含有簇毛麦6VS染色体臂；中麦113不含有簇毛麦6VS染色体臂。进一步说明，成套试剂1与成套试剂2在检测小麦簇毛麦6VS染色体臂以及成套试剂2在检测小麦簇毛麦6V#4S染色体臂中的可行性。

Claims (9)

1.检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂，由A-P与B-P、C-P、D-P和E-P中的至少一种组成；
所述A-P由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成；
所述B-P由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成；
所述C-P由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成；
所述D-P由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成；
所述E-P由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成。
2.检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的引物对，为权利要求1中所述A-P。
3.检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的成套试剂，由权利要求1所述成套试剂或权利要求1中所述A-P与X1组成；所述X1为F-P、G-P和H-P中的至少一种；
所述F-P由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成；
所述G-P由序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成；
所述H-P由序列表中序列15和序列16所示的两条单链DNA组成。
4.检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的系统，为系统A1、系统A2或系统A3；
所述系统A1由权利要求1所述成套试剂与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成；
所述系统A2由权利要求1中所述A-P与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成；
所述系统A3由权利要求3所述成套试剂与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成。
5.检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂的方法，为下述R或S：
R、下述R1)或R2)：
R1)包括R11)和R12)：
R11)分别以待测小麦、参比小麦和簇毛麦的基因组DNA为模板，用5种引物对分别进行PCR扩增，得到所述5种引物对的待测小麦PCR产物、所述5种引物对的参比小麦PCR产物和所述5种引物对的簇毛麦PCR产物；所述参比小麦为不含簇毛麦6VS染色体臂的小麦，作为确定簇毛麦特异条带的参比；
R12)将所述5种引物对的待测小麦PCR产物、所述5种引物对的参比小麦PCR产物和所述5种引物对的簇毛麦PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述5种引物对的待测小麦PCR产物中是否含有簇毛麦相应引物对的特异条带，如果所述5种引物对的待测小麦PCR产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中含有簇毛麦相应引物对的特异条带，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如果所述5种引物对的待测小麦PCR产物中均不含有簇毛麦相应引物对的特异条带，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
所述5种引物对为权利要求1中所述A-P、所述B-P、所述C-P、所述D-P和所述E-P；
R2)包括R21)和R22)：
R21)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述5种引物对分别进行PCR扩增，得到所述5种引物对的待测小麦PCR产物；
R22)检测R21)所述5种引物对的待测小麦PCR产物的序列，如所述5种引物对的待测小麦PCR产物中含A、B、C、D和E中的至少一种，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如所述5种引物对的待测小麦PCR产物中均不含A、B、C、D和E中的任一种或任几种，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
S、下述S1)或S2)：
S1)包括S11)和S12)：
S11)分别以待测小麦、参比小麦和簇毛麦的基因组DNA为模板，用8种引物对分别进行PCR扩增，得到所述8种引物对的待测小麦PCR产物、所述8种引物对的参比小麦PCR产物和所述8种引物对的簇毛麦PCR产物；所述参比小麦为不含簇毛麦6VS染色体臂的小麦，作为确定簇毛麦特异条带的参比；
S12)将所述8种引物对的待测小麦PCR产物、所述8种引物对的参比小麦PCR产物和所述8种引物对的簇毛麦PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述8种引物对的待测小麦PCR产物中是否含有簇毛麦相应引物对的特异条带，如果所述8种引物对的待测小麦PCR产物中至少有一种引物对的待测小麦PCR产物中含有簇毛麦相应引物对的特异条带，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如果所述8种引物对的待测小麦PCR产物中均不含有簇毛麦相应引物对的特异条带，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
所述8种引物对为权利要求1中所述A-P、所述B-P、所述C-P、所述D-P和所述E-P以及权利要求3中所述F-P、所述G-P、所述H-P；
S2)包括S21)和S22)：
S21)以待测小麦的基因组DNA为模板，用所述8种引物对分别进行PCR扩增，得到所述8种引物对的待测小麦PCR产物；
S22)检测S21)所述8种引物对的待测小麦PCR产物的序列，如所述8种引物对的待测小麦PCR产物中含有A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一种，所述待测小麦含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂；如所述8种引物对的待测小麦PCR产物中均不含A、B、C、D、E、F、G和H中的任一种或任几种，所述待测小麦不含或候选不含簇毛麦6VS染色体臂；
所述A为序列17所示的DNA分子；
所述B为序列18所示的DNA分子；
所述C为序列19所示的DNA分子；
所述D为序列20所示的DNA分子；
所述E为序列21所示的DNA分子；
所述F为序列22所示的DNA分子；
所述G为序列23所示的DNA分子；
所述H为序列24所示的DNA分子；
所述簇毛麦相应引物对的特异条带为同一种引物对的簇毛麦PCR产物含有但所述同一种引物对的所述参比小麦的PCR产物不含有的条带。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的引物退火温度为58-64℃。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：
用所述A-P、所述F-P和所述G-P分别进行PCR扩增的退火温度均为60℃；
用所述B-P、所述C-P、所述D-P和所述E-P分别进行PCR扩增的退火温度均为58℃；
用所述H-P进行PCR扩增的退火温度为64℃。
8.权利要求1或3所述成套试剂、或权利要求2所述引物对、或权利要求4所述的系统、或权利要求5-7任一所述方法的下述Z1或Z2的应用：
Z1、在检测或辅助检测小麦是否含有簇毛麦6VS染色体臂中的应用；
Z2、在小麦育种中的应用。
9.小麦的育种方法，包括以按照权利要求5-7任一所述方法得到的含有或候选含有簇毛麦6VS染色体臂的待测小麦作为亲本进行育种。
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