CN107502675B - 用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用。本发明提供了用于检测簇毛麦染色体臂的成套引物，由用于检测簇毛麦2V、3V、4V、6V和7V染色体臂的引物对(序列表中序列1‑28所示的14个引物对)中的全部或部分组成。本发明利用RNA‑seq技术获得了簇毛麦的转录组序列，在转录组序列的基础上，设计引物，筛选能准确鉴定簇毛麦各条染色体的特异标记并设计相应的扩增引物。实验证明，采用本发明所提供的成套引物可以实现对簇毛麦各条染色体的特异性检测，已成功应用于硬‑簇双二倍体与小麦杂交及回交后代材料中簇毛麦染色体的检测工作。本发明为簇毛麦的进一步研究和利用提供了更便捷有效的工具。

Description

用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用。
背景技术
簇毛麦Dasypyrum villosum(L.)P.Candargy(syn.Haynaldia villosa Schur)是小麦族簇毛麦属的一年生或多年生常异花授粉二倍体植物(2n＝2x＝14，Sears将簇毛麦基因组命名为VV)。它起源于地中海的东北部，从南欧的法国南部到里海，西南亚，俄罗斯和高加索地区，是一种杂草类植物，生长在恶劣、干旱的环境中。由于其颖壳脊上和外稃顶端有丛生的毛状物，故名之。簇毛麦具有抗条锈、叶锈、秆锈病、白粉病和小麦梭条花叶病毒等多种小麦主要病虫害的特性，同时具有耐寒、分蘖力强、生长繁茂、多小花、蛋白质含量高和耐盐抗旱等特性。簇毛麦含有许多生物胁迫和非生物胁迫抗性基因及优质基因，是改良小麦的优良基因源。
开发簇毛麦不同染色体臂和不同染色体区段的分子标记，对于将簇毛麦中蕴藏的抗病、抗逆和优质基因以染色体易位方式导入小麦至关重要。截止目前，对二倍体簇毛麦的研究利用还不够，需要加强，如对其特定染色体上的特异性DNA片段进行克隆、分子标记开发的报道还较少。有关簇毛麦特异标记已有一些报道，但大多集中于6VS染色体，分布于1V至7V染色体的目前主要有SSR、ISSR、EST-STS标记，利用这些标记来鉴定大量的簇毛麦结构变异染色体，远远不能满足大量开展的簇毛麦优异基因向小麦中转移的分子遗传与育种学研究的需要。因此，需要继续发掘簇毛麦染色体上的特异分子标记，对于在小麦育种研究过程中快速有效地跟踪、检测和鉴定导入到小麦中的簇毛麦染色体臂及其片段具有极为重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用。
第一，本发明请求保护一种用于检测簇毛麦染色体臂的成套引物。
本发明所请求保护的用于检测簇毛麦染色体臂的成套引物，具体由用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对、用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对、用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对、用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对和用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对中的全部或部分组成。
所述用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对为引物对1；所述用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对为引物对2或引物对3或引物对4或引物对5；所述用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对为引物对6或引物对7或引物对8或引物对9；所述用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对为引物对10或引物对11或引物对12；所述用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对为引物对13或引物对14。
所述引物对1为如下(a1)或(b1)：
(a1)由序列表中序列1和序列2所示的两条引物组成的引物对；
(b1)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对2为如下(a2)或(b2)：
(a2)由序列表中序列3和序列4所示的两条引物组成的引物对；
(b2)由将序列表中序列3和序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对3为如下(a3)或(b3)：
(a3)由序列表中序列5和序列6所示的两条引物组成的引物对；
(b3)由将序列表中序列5和序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对4为如下(a4)或(b4)：
(a4)由序列表中序列7和序列8所示的两条引物组成的引物对；
(b4)由将序列表中序列7和序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对5为如下(a5)或(b5)：
(a5)由序列表中序列9和序列10所示的两条引物组成的引物对；
(b5)由将序列表中序列9和序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对6为如下(a6)或(b6)：
(a6)由序列表中序列11和序列12所示的两条引物组成的引物对；
(b6)由将序列表中序列11和序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对7为如下(a7)或(b7)：
(a7)由序列表中序列13和序列14所示的两条引物组成的引物对；
(b7)由将序列表中序列13和序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对8为如下(a8)或(b8)：
(a8)由序列表中序列15和序列16所示的两条引物组成的引物对；
(b8)由将序列表中序列15和序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对9为如下(a9)或(b9)：
(a9)由序列表中序列17和序列18所示的两条引物组成的引物对；
(b9)由将序列表中序列17和序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对10为如下(a10)或(b10)：
(a10)由序列表中序列19和序列20所示的两条引物组成的引物对；
(b10)由将序列表中序列19和序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对11为如下(a11)或(b11)：
(a11)由序列表中序列21和序列22所示的两条引物组成的引物对；
(b11)由将序列表中序列21和序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对12为如下(a12)或(b12)：
(a12)由序列表中序列23和序列24所示的两条引物组成的引物对；
(b12)由将序列表中序列23和序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对13为如下(a13)或(b13)：
(a13)由序列表中序列25和序列26所示的两条引物组成的引物对；
(b13)由将序列表中序列25和序列26经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
所述引物对14为如下(a14)或(b14)：
(a14)由序列表中序列27和序列28所示的两条引物组成的引物对；
(b14)由将序列表中序列27和序列28经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条引物组成且具有相同功能的引物对。
第二，本发明请求保护一种用于检测簇毛麦染色体臂的试剂盒。
本发明所请求保护的用于检测簇毛麦染色体臂的试剂盒，除了含有前文所述的成套引物外，还含有DNA聚合酶、dNTPs、PCR扩增缓冲液。
第三，本发明请求保护一种用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记。
本发明所请求保护的用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记，具体由以簇毛麦的基因组DNA为模板，采用前文所述的成套引物或试剂盒中的各引物对分别进行PCR扩增后所得的所有DNA片段组成。
第四，本发明请求保护如下三种应用：
前文所述的成套引物或试剂盒或分子标记在检测簇毛麦染色体臂中的应用。
前文所述的成套引物或试剂盒或分子标记在跟踪检测导入到小麦中的簇毛麦染色体中的应用。
前文所述的成套引物或试剂盒或分子标记在小麦育种中的应用。
第五，本发明请求保护一种检测簇毛麦染色体臂的方法
本发明所请求保护的检测簇毛麦染色体臂的方法，具体可包括如下步骤：
(A)以待测样本的基因组DNA为模板，采用前文所述的成套引物或试剂盒中的各引物对分别进行PCR扩增，得到扩增产物；
(B)根据所述扩增产物按照如下确定所述待测样本中是否含有相应的簇毛麦染色体臂：
如果采用所述用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带2V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦2V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带3V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦3V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带4V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦4V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带6V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦6V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带7V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦7V染色体臂；
所述标准条带2V为以含有簇毛麦2V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带3V为以含有簇毛麦3V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带4V为以含有簇毛麦4V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带6V为以含有簇毛麦6V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带7V为以含有簇毛麦7V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带。
在本发明中，所述含有簇毛麦2V染色体臂的标准DNA样本具体为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦2V附加系的基因组DNA。
在本发明中，所述含有簇毛麦3V染色体臂的标准DNA样本具体为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦3V附加系的基因组DNA。
在本发明中，所述含有簇毛麦4V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦4V附加系的基因组DNA。
在本发明中，所述含有簇毛麦6V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦6V附加系的基因组DNA。
在本发明中，所述含有簇毛麦7V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦7V附加系的基因组DNA。
更加具体的，采用所述引物对1进行PCR扩增所得的所述标准条带2V大小具体为320bp。采用所述引物对2进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小具体为850bp；采用所述引物对3进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小具体为250bp；采用所述引物对4进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小具体为250bp；采用所述引物对5进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小具体为270bp。采用所述引物对6进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小具体为1200bp；采用所述引物对7进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小具体为300bp；采用所述引物对8进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小具体为520bp；采用所述引物对9进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小具体为310bp。采用所述引物对10进行PCR扩增所得的所述标准条带6V大小具体为450bp；采用所述引物对11进行PCR扩增所得的所述标准条带6V大小具体为1500bp；采用所述引物对12进行PCR扩增所得的所述标准条带6V大小具体为450bp。采用所述引物对13进行PCR扩增所得的所述标准条带7V大小具体为480bp；采用所述引物对14进行PCR扩增所得的所述标准条带7V大小具体为250bp。
在所述方法中，所述待测样本具体可为导入或未导入簇毛麦染色体的小麦。
在本发明的一个实施例中，所述待测样本具体为小麦品种中国春、簇毛麦No.1026和小麦-簇毛麦1V-7V附加系(DA1V-7V)。
本发明利用RNA-seq技术获得了簇毛麦的转录组序列，在转录组序列的基础上，设计相应的扩增引物，筛选能准确鉴定簇毛麦各条染色体的特异标记引物。实验证明，采用本发明所提供的成套引物可以实现对簇毛麦各条染色体的特异性检测。本发明为簇毛麦的进一步研究和利用提供了更便捷有效的工具。
附图说明
图1为采用标记2V-1的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图2为采用标记3V-1的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图3为采用标记3V-2的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图。
图4为采用标记3V-3的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图5为采用标记3V-4的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图6为采用标记4V-1的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图7为采用标记4V-2的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图8为采用标记4V-3的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图9为采用标记4V-4的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图10为采用标记6V-1的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图11为采用标记6V-2的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图12为采用标记6V-3的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图13为采用标记7V-1的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图14为采用标记7V-2的扩增引物进行PCR扩增所得电泳图谱。
图15为标记2V-1的扩增引物检测硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代部分单株的扩增电泳图。方框内为中国春和簇毛麦No.1026(有目的条带的为No.1026，无目的条带的为中国春)。
图16为标记3V-2的扩增引物检测硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代部分单株的扩增电泳图。方框内为中国春和簇毛麦No.1026(有目的条带的为No.1026，无目的条带的为中国春)。
图17为标记4V-2的扩增引物检测硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代部分单株的扩增电泳图。方框内为中国春和簇毛麦No.1026(有目的条带的为No.1026，无目的条带的为中国春)。
图18为标记6V-3的扩增引物检测硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代部分单株的扩增电泳图。方框内为中国春和簇毛麦No.1026(有目的条带的为No.1026，无目的条带的为中国春)。
图19为标记7V-1的扩增引物检测硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代部分单株的扩增电泳图。方框内为中国春和簇毛麦No.1026(有目的条带的为No.1026，无目的条带的为中国春)。
图1至图19均是，M：DNA标准分子量，各条带由小到大依次为100、250、500、750、1000、1500、2000bp。图1至图14中，CS：中国春，1-7：小麦-簇毛麦1V-7V附加系(DA1V-7V)，8：簇毛麦No.1026。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
簇毛麦No.1026：由前中国农业科学院作物品种资源研究所陶琨研究员提供。在“张云龙.簇毛麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因Stpk-V2、Stpk-V3的克隆与分析.2012年,山东农业大学,硕士论文”一文中有记载，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
小麦-簇毛麦1V-7V附加系(DA1V-7V)：由南京农业大学王秀娥教授惠赠。在“曹爱忠,陈全战,王海燕等.基于专化的反转录转座子序列开发鉴定簇毛麦染色质的PCR分子标记.西北植物学报,2007,27(6):1078-1084”一文中有记载，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。小麦-簇毛麦1V附加系(DA1V)含有小麦AABBDD染色体及簇毛麦1V染色体臂，不含簇毛麦2V-7V染色体臂；小麦-簇毛麦2V附加系(DA1V)含有小麦AABBDD染色体及簇毛麦2V染色体臂，不含簇毛麦1V、3V-7V染色体臂；以此类推。
硬-簇双二倍体(硬粒小麦-簇毛麦双二倍体)：由我们实验室培育并保存。分别在“陈孝，徐惠君，杜丽璞，尚立民，韩彬，施爱农，肖世和.中国农业科学，1996年5期：利用组织培养技术向普通小麦导入簇毛麦抗白粉病基因的研究”和“马海丽,张云龙,林志珊,叶兴国,徐琼芳,陈孝,王化俊,李葆春.簇毛麦NBS类R基因相关序列的分子标记开发及其染色体定位.植物遗传资源学报.2014年3期”中有记载，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。
实施例1、用于检测簇毛麦染色体臂的成套引物的开发
供试簇毛麦：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系(DA1V-7V)、硬-簇双二倍体。
转录组测序：取簇毛麦叶片，提取RNA之后，进行转录组测序，获得转录组序列。
序列比对：将转录组序列提交到https://urgi.versailles.inra.fr/blast/比对，寻找分别定位到小麦1-7群基因组上的序列。
引物设计：根据比对到小麦相应基因组的序列，利用primer premier 6设计引物，引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物初筛：以中国春、小麦-簇毛麦1V-7V附加系(DA1V-7V)、簇毛麦No.1026的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，筛选引物，初步确认可能的用于鉴定簇毛麦1V-7V各染色体臂的特异引物。
引物确认：将初步确认可能的DA1V-7V特异引物，以小麦品种中国春、小麦-簇毛麦附加系DA1V、DA2V、DA3V、DA4V、DA5V、DA6V、DA7V、簇毛麦No.1026的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，确认引物，确认用于鉴定簇毛麦1V-7V各染色体臂的特异引物(表1)，获得用于鉴定簇毛麦1V-7V各染色体臂的各特异性分子标记。
硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代的检测：引物确认以后，以硬簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代每一单株的DNA为模板，进行PCR扩增，确认硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交后代中含有哪一条簇毛麦染色体。
PCR扩增体系为20μL，包括模板DNA 100ng左右、上下游引物(10μmol·L-1)各0.6μL、2×Taq MasterMix(Mg2+、dNTP)10μL，加ddH2O至20μL。
PCR反应程序为：95℃5min；95℃20s，60℃30s，72℃1min，35个循环；72℃8min，然后4℃保存。
表1用于鉴定簇毛麦1V-7V各染色体臂的特异引物及退火温度
Figure BDA0001434817450000081
以中国春、DA1V、DA2V、DA3V、DA4V、DA5V、DA6V、DA7V、簇毛麦No.1026的基因组DNA为模板，采用表1中的标记2V-1的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图1所示，采用表1中的标记3V-1的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图2所示，采用表1中的标记3V-2的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图3所示，采用表1中的标记3V-3的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图4所示，采用表1中的标记3V-4的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图5所示，采用表1中的标记4V-1的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图6所示，采用表1中的标记4V-2的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图7所示，采用表1中的标记4V-3的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图8所示，采用表1中的标记4V-4的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图9所示，采用表1中的标记6V-1的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图10所示，采用表1中的标记6V-2的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图11所示，采用表1中的标记6V-3的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图12所示，采用表1中的标记7V-1的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图13所示，采用表1中的标记7V-2的扩增引物进行PCR扩增，所得电泳图谱如图14所示。由各图所示的结果，可见：采用针对簇毛麦各染色体臂的引物进行扩增，均只有簇毛麦No.1026和相应染色体的小麦-簇毛麦附加系有特异性扩增条带出现，而中国春和其他染色体的小麦-簇毛麦附加系均没有扩增条带。这证明采用本发明所提供的成套引物可以实现对簇毛麦各条染色体的特异性检测。
引物确认以后，以硬簇双二倍体与小麦杂交、回交分离世代各单株的DNA为模板，进行PCR扩增，确认硬-簇双二倍体与小麦杂交、回交后代中含有哪一条簇毛麦染色体，图15-19为部分检测结果。该结果表明本发明以上所提供的各引物可用于跟踪检测导入到小麦中的簇毛麦染色体。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记及其应用
<130> GNCLN171768
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
cgacagcctc tccatcttct cct 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
caagcccttc tcagcctcca atg 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tccatcatag caccttcaga ctcaag 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gacaactcgg caatcaccaa gga 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
ggcaactcaa attataggat cacgac 26
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223>
<400> 6
gcaaggcgga gtagctcaca 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ttcgtcatct ttgttgacat ggcaa 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
gcaaggcgga gtagctcaca 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
ggcaactcaa attataggat cacgac 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
actatatgtt gatgacgagg agcaa 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
aagaacatgg accagatacg caaca 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
tggcaccagc attgtcgaac tc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
gcagcaggca gcacatcata ca 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
ttggagtagc gacgacgagg at 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
gaggtcgttc tctgaggtca tcgt 24
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
gctccttgga attggcggct tc 22
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
agcaccgacg acgacgaaga 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
actgacgcac gcatggcatc 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
ccgtgcgaca gaacagaagt ga 22
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
gcaatcagcc acatacaggt catc 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
aaccaaccac cactccaatc tcc 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
ccttgccatc aatgtcatac acctt 25
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
agcagacgag gacgcaacaa g 21
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
gcaatcagcc acatacaggt catc 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 25
gacgaacacc atgaacacga agg 23
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
ctaaaggaag aggcgaatca gcaaag 26
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 27
tacgagatgg agcgtgacga agg 23
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
cgatgttgtc atcccggaca gg 22

Claims (9)

1.用于检测簇毛麦染色体臂的成套引物，由用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对、用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对、用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对、用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对和用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对组成；
所述用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对为引物对1；所述用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对为引物对2或引物对3或引物对4或引物对5；所述用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对为引物对6或引物对7或引物对8或引物对9；所述用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对为引物对10或引物对11或引物对12；所述用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对为引物对13或引物对14；
所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对3为由序列表中序列5和序列6所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对4由序列表中序列7和序列8所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对5为由序列表中序列9和序列10所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对6由序列表中序列11和序列12所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对7为由序列表中序列13和序列14所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对8为由序列表中序列15和序列16所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对9为由序列表中序列17和序列18所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对10为由序列表中序列19和序列20所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对11为由序列表中序列21和序列22所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对12为由序列表中序列23和序列24所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对13为由序列表中序列25和序列26所示的两条引物组成的引物对；
所述引物对14为由序列表中序列27和序列28所示的两条引物组成的引物对；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
2.用于检测簇毛麦染色体臂的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中除了含有权利要求1所述的成套引物外，还含有DNA聚合酶、dNTPs、PCR扩增缓冲液；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
3.用于检测簇毛麦染色体臂的成套分子标记，由以簇毛麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的试剂盒中的各引物对分别进行PCR扩增后所得的所有DNA片段组成；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
4.权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的试剂盒在检测簇毛麦染色体臂中的应用；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
5.权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的试剂盒在跟踪检测导入到小麦中的簇毛麦染色体中的应用；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
6.权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的试剂盒在小麦育种中的应用；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
7.一种检测簇毛麦染色体臂的方法，包括如下步骤：
（A）以待测样本的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的成套引物或权利要求2所述的试剂盒中的各引物对分别进行PCR扩增，得到扩增产物；
（B）根据所述扩增产物按照如下确定所述待测样本中是否含有相应的簇毛麦染色体臂：
如果采用所述用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带2V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦2V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带3V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦3V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带4V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦4V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带6V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦6V染色体臂；
如果采用所述用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物中含有标准条带7V，则所述待测样本中含有或候选含有簇毛麦7V染色体臂；
所述标准条带2V为以含有簇毛麦2V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦2V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带3V为以含有簇毛麦3V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦3V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带4V为以含有簇毛麦4V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦4V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带6V为以含有簇毛麦6V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦6V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述标准条带7V为以含有簇毛麦7V染色体臂的标准DNA样本为模板，采用所述用于检测簇毛麦7V染色体臂的引物对进行PCR扩增所得扩增产物的电泳条带；
所述含有簇毛麦2V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦2V附加系的基因组DNA；
所述含有簇毛麦3V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦3V附加系的基因组DNA；
所述含有簇毛麦4V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦4V附加系的基因组DNA；
所述含有簇毛麦6V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦6V附加系的基因组DNA；
所述含有簇毛麦7V染色体臂的标准DNA样本为簇毛麦No.1026或小麦-簇毛麦7V附加系的基因组DNA；
所述簇毛麦选自如下任一：簇毛麦No.1026、小麦-簇毛麦1V-7V附加系、硬-簇双二倍体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：采用所述引物对1进行PCR扩增所得的所述标准条带2V大小为320bp；
采用所述引物对2进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小为850bp；采用所述引物对3进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小为250bp；采用所述引物对4进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小为250bp；采用所述引物对5进行PCR扩增所得的所述标准条带3V大小为270bp；
采用所述引物对6进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小为1200bp；采用所述引物对7进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小为300bp；采用所述引物对8进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小为520bp；采用所述引物对9进行PCR扩增所得的所述标准条带4V大小为310bp；
采用所述引物对10进行PCR扩增所得的所述标准条带6V大小为450bp；采用所述引物对11进行PCR扩增所得的所述标准条带6V大小为1500bp；采用所述引物对12进行PCR扩增所得的所述标准条带6V大小为450bp；
采用所述引物对13进行PCR扩增所得的所述标准条带7V大小为480bp；采用所述引物对14进行PCR扩增所得的所述标准条带7V大小为250bp。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述待测样本为导入或未导入所述簇毛麦的染色体的小麦。
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