CN110499385B - 一种簇毛麦3vl染色体分子标记检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测方法及应用，所述簇毛麦3VL染色体分子标记检测用引物的核苷酸序列为：F:5’‑ATGCTGAACGCAAGGTCAAATA‑3’，R:5’‑TGCTGAAGCCCATCACGAAG‑3’；利用该方法，簇毛麦和小麦‑簇毛麦3VL附加系中能扩增出特异片段。本发明为将3VL染色体上的优良性状应用于小麦育种中提供了基础。

Description

一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测方法及应用。
背景技术
一年生二倍体簇毛麦(2n＝14,VV)是小麦重要的近缘种属，其1V-7V染色体上都携带多种抗性基因。其中，3V染色体上具有抗小麦全蚀病及眼斑病基因。同时，普通小麦中国春(CS)-一年生二倍体簇毛麦3V附加系具有优异的小麦条锈病抗性。并已初步将该条锈抗性定位于3V染色体长臂(3VL)上。因此，迫切需要开发簇毛麦3VL的高效快速的分子标记检测方法，以使3VL染色体上的优良性状能应用于小麦育种中。
现有技术中利用RNA-seq测序结果，与小麦基因组数据库进行比对，获得检测簇毛麦3V染色体特异的标记。但这些标记未被定位于染色体臂上，因此无法满足特异检测3V染色体长臂的要求。
现有技术中已获得的3VL染色体特异的分子标记，PCR耗时大于1.5h，且由于条带较多，分辨率较低，需用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。而该电泳方法存在以下缺点：(1)耗时较长，需用2h才能拿到实验结果；(2)步骤繁琐，电泳结束后还需要进行染色-清洗-复染-清洗等处理。因此并不适合大群体高通量的小麦-3VL异源材料的筛选与鉴定。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测方法及应用，满足簇毛麦3VL染色体的准确鉴定与追踪。为将簇毛麦3VL染色体转移到小麦遗传背景中，并进一步在小麦遗传改良中利用簇毛麦3VL染色体的优异抗性提供了基础。
本发明采用的技术方案如下：
一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测用引物，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物F:5’-ATGCTGAACGCAAGGTCAAATA-3’；
下游引物R:5’-TGCTGAAGCCCATCACGAAG-3’。
采用上述引物检测簇毛麦3VL染色体的方法，包括步骤如下：
S1.提取待测植株的DNA；
S2.以待测植株的DNA为模板，利用权利要求1所述引物3VL-71，进行PCR扩增反应；
S3.检测PCR扩增产物。
进一步地，PCR扩增反应体系如下：
样品DNA 100-150ng；
上游引物 5pmol；
下游引物 5pmol；
Taq PCR Master Mix(2×,without dye,CAT.NO:B639293)12μL；
ddH2O 加至终体积25μL。进一步地，PCR反应程序如下：
Figure BDA0002188975540000021
上述的簇毛麦3VL染色体分子标记检测用引物在簇毛麦3VL染色体的鉴定与追踪中的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的方法用于在分子标记辅助选择育种过程中，快速、有效地追踪簇毛麦的3VL染色体，有利于加快簇毛麦3VL染色体上所携带的优良性状向受体品种的转移与利用，加速育种进程，提高新品质选育的效率；
2、本发明的检测方法有效区分普通小麦中国春、普通小麦中国春-簇毛麦3V二体附加系、簇毛麦、普通小麦中国春-簇毛麦3VS双端体附加系以及普通小麦中国春-簇毛麦3VL双端体附加系；
3、本发明条带仅有一条，因而分辨率高，采用琼脂糖凝胶进行电泳检测，PCR耗时短，步骤简捷，电泳结束后无需进行染色-清洗-复染-清洗等处理，可直接拍照，因此适合大群体高通量的小麦-3VL异源材料的筛选与鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明基于簇毛麦3VL染色体特异标记引物的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图中，1-普通小麦中国春；2-普通小麦中国春-簇毛麦3V二体附加系；3-簇毛麦；4-普通小麦中国春-簇毛麦3VS双端体附加系；5-普通小麦中国春-簇毛麦3L双端体附加系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本发明较佳实施例提供的一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测用引物，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物F:5’-ATGCTGAACGCAAGGTCAAATA-3’；
下游引物R:5’-TGCTGAAGCCCATCACGAAG-3’。
实施例2
本发明基于上述实施例1提供的采用上述引物检测簇毛麦3VL染色体的方法，包括如下步骤：
(1)、采用CTAB法提取待检测植株基因组DNA，提取步骤如下：
1)取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1M Tris-HCl，pH 8.0，0.1M EDTA，pH 8.0)15ml，混匀。
2)65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min。
3)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA。
4)勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH 8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl。
5)100V恒定电压下，1％琼脂糖凝胶电泳30分钟，检测DNA浓度及质量。
(2)、PCR扩增：
反应体系如下：
样品DNA 100-150ng；
上游引物 5pmol；
下游引物 5pmol；
Taq PCR Master Mix 12μL
ddH2O 加至终体积25μL。
PCR反应程序：
Figure BDA0002188975540000041
PCR反应在PTC-200型PCR仪(MJ Research,U.S.A.)中进行。100mL 1％琼脂糖凝胶煮沸，稍微晾凉(低于60℃)后加入5μL的核酸染料(GoldenView)(100:5，V:V)摇匀，静置。最后引物扩增产物在该琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳40分钟后检测。
结果如图1所示。由图可知，簇毛麦和小麦-簇毛麦3VL附加系中能扩增出特异片段，而在普通小麦、小麦-簇毛麦1VS中则不能扩增出该片段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgctgaacg caaggtcaaa ta 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctgaagcc catcacgaag 20

Claims (5)

1.一种簇毛麦3VL染色体分子标记检测用引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物F: 5’-ATGCTGAACGCAAGGTCAAATA-3’；
下游引物R: 5’-TGCTGAAGCCCATCACGAAG-3’。
2.采用权利要求1所述引物检测簇毛麦3VL染色体的方法，其特征在于，包括步骤如下：
S1.提取待测植株的DNA；
S2.以待测植株的DNA为模板，利用权利要求1所述引物对其进行PCR扩增反应；
S3.检测PCR扩增产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应体系如下：
样品DNA 100-150 ng；
上游引物 5 pmol；
下游引物 5 pmol；
Taq PCR Master Mix，2×， without dye12 μL；
ddH2O 加至终体积25 μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应程序如下：
（1）94℃保持3分钟；
（2）94℃保持1分钟；
（3）55 ℃保持30秒；
（4）72℃保持30秒；
重复（2）至（4）30个循环；
（5）72℃保持10分钟。
5.权利要求1所述的簇毛麦3VL染色体分子标记检测用引物在簇毛麦3VL染色体的鉴定与追踪中的应用。
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