CN109456967B - 一种大果酸浆的特异性核苷酸、标记引物及鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大果酸浆的特异性核苷酸序列、标记引物及鉴别方法。用于鉴别大果酸浆的特征性核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于鉴别大果酸浆的分子特异性标记引物上游序列SPM01F：如SEQ ID NO.2所示；下游序列SPM01R：如SEQ ID NO.3所示。利用特异性标记引物SPM01F/SPM01R，通过常规PCR扩增，电泳检测，即可快速、准确的鉴别出大果酸浆样品。本发明样品用量少，结果准确、灵敏度高，SPM01F/SPM01R为大果酸浆分子特异性扩增引物，若为其他酸浆属植物种类，为阴性反应；本发明方法操作简便，耗时短，4～6小时即可完成。

Description

一种大果酸浆的特异性核苷酸、标记引物及鉴别方法

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法鉴别大果酸浆Physalis macrophysa的技术领域，涉及一种大果酸浆的特异性核苷酸序列、分子特异性标记引物，以及利用该分子特异性标记引物对大果酸浆进行快速鉴别的方法。

背景技术

大果酸浆(Physalis macrophysa Rydb)，别名：紫果酸浆、紫菇娘、大鼻子菇娘、通肯酸浆、通肯茄、紫桃子、紫姑鲁、大紫姑、大紫菇娘等，茄科酸浆属一年生草本植物。原产美洲，在我国东北地区有少数栽培或野生。大果酸浆的果实味道清香，甜美可口，富含维生素C、胡萝卜素、钙、铁等20多种矿物质和18种人体所需要的氨基酸，可生食或做蜜饯。除此之外，大果酸浆还具有很好的药用价值，常用于开胃消食、止咳定喘。大果酸浆与毛酸浆P.pubescens、小酸浆P.minima、苦蘵P.angulata及酸浆P.alkekengi var.franchetii等植物的茎、叶、花和果实等形态学特征非常相似，利用传统分类方法很难将大果酸浆与其他酸浆属相似植物区分开。这也为大果酸浆的鉴定、保护和利用带来了困难。

DNA分子标记技术弥补和克服了传统形态学鉴定方法的一些缺陷和难题。该技术不受环境及基因表达与否的限制，能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。本专利经过对酸浆属植物DNA指纹图谱分析、筛选实验，获得大果酸浆特异性条带，通过切胶回收、TA克隆、测序等方法，获得大果酸浆的特征性核苷酸序列，并在此基础上开发设计了用于大果酸浆快速鉴别的分子特异性标记引物，为大果酸浆种质资源的准确鉴别及保护提供有效的分子方法技术。迄今为止，尚未有分子特异性标记应用于大果酸浆鉴别的研究报道。

发明内容

本发明第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种大果酸浆的特异性核苷酸序列。

本发明用于鉴别大果酸浆的特征性核苷酸序列是在对被测酸浆属植物SCoT-DNA指纹图谱特异性位点进行筛选的基础上，通过切胶回收、TA克隆和测序分析，获得的。其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CAACAATGGCTACCACGGAATCGTCTTGACGCGTAGTATTGTATTTTGATAGTGTTGGAGCGTTTGGAGCTTGCTCGTGTCGGTTTGAGCTATGGGAGCCCGTTTGGCTTCGTTTCTGCGGTTCTGCATTGAGGTAGGCTTTGTCTTCCTTTTTGGTTCAGACTGTACTGTTGTAGGACTGACACAGCACGGCTGGTCGTGTGGGAGGAGTTTATAGGTTGGATACCTGCTTTGTTATTATTATTACCTTCTCGTGTCACATGGGGCCCGGTAAGGGCATAGTTGGGCGGTTGAGCCGCGTGGGTCCCCGTAGGCCGTGCTTTGGCCGATGGACCATCTTTTGCTATAGCTTAGCCTTATTTCAGCTATCCTGTAGAGGTTAGATAATGTAGACTTGTTTAGGCTCCCATTGATCCTTCTGGCCTAGGTGGGGCTTACGGTGGTTGGGTTTTGTTGTGCTGACGTTGGAGGTGAGCTCCTGAAGCCCTCGTTACCCTATTAGGTGCTCTGGTTGTAGCTGCTAGCTCCCGTTTGAGCCGGATCTGGTGAGGCTTTGCCTCCCGAGTGACGGGCGGGTCACGATCCGTGGTGCTTTAGTGTTACCTGGACCTTTTTACGGGGTGGCCTACTTGGCCTCCTGGGGTCCCGCACACCGGCTGCAGTAGCCGTGGACGATATCTTTGACCTTACGAGCCGACTTTGTTGTTGGGGTCCCGATTCTGAGATGGATCTTGTTACGATGATGGCATGGTTTGGGTACTTCAGCTTATTTCTTTTGATGGATACGTTGGACTGGTTCTTTCCCGTGGTA。

本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别大果酸浆核苷酸序列开发的用于鉴别大果酸浆的特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)，该特异性标记引物序列如下：

上游引物SPM01F：5’-CGTTTGGCTTCGTTTCTGC-3’，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物SPM01R：5’-TATCGTCCACGGCTACTGC-3’，如SEQ ID NO.3所示。

上述分子特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)，具有极高的特异性，以该分子特异性标记引物对酸浆属植物进行PCR扩增，只与大果酸浆样本DNA发生反应，而不与其他酸浆属植物样品反应。因此，运用该特异性标记引物，通过常规PCR扩增即可以快速鉴别出大果酸浆样品。

本发明的第三个目的是提供上述分子特异性标记引物鉴别大果酸浆的方法。该方法为：采用上述引物组合(SPM01F/SPM01R)作为特异性扩增引物，以被测酸浆属植物的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现分子量为577bp大小的特异性片段，则待测酸浆属植物样品为大果酸浆，反之则不是。

具体的，所述方法如下：

步骤一、基因组DNA的提取：取被测酸浆属植物(大果酸浆P.macrophysa、毛酸浆P.pubescens、小酸浆P.minima、苦蘵P.angulata及酸浆P.alkekengi var.franchetii)样品新鲜叶片，加液氮研磨至粉末，利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)进行基因组DNA提取。

步骤二、以步骤一提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)作为扩增引物，进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系(总体积20μL)：2μL的10×Buffer(含MgCl₂)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL的上游引物SPM01F(10μM)，1μL的下游引物SPM01R(10μM)，1μL的模板DNA(50ng/μL)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，13.7μL ddH₂O。

PCR反应程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

步骤三、利用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤二PCR产物进行电泳检测，经凝胶成像系统拍照检测，若电泳结果出现分子量为577bp大小的DNA条带，则被测样品为大果酸浆，反之则不是。

本发明主要有益效果表现为：本发明实验样品用量少；结果准确、灵敏度高，SPM01F/SPM01R为大果酸浆专一性扩增引物，若为其他酸浆属植物样品，为阴性反应；方法简便，采用常规PCR技术进行检测，耗时短，4～6小时即可完成。

附图说明

图1是采用SCoT7引物按照常规PCR方法对被测酸浆属植物进行PCR反应后的电泳图(箭头所指的条带是大果酸浆特有的条带，分子量为811bp)，其中，M为DNA分子量标准Trans2K DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；通道1～5：小酸浆；6～9：苦蘵；10～13：酸浆；14～17：毛酸浆；18～22：大果酸浆；

图2是采用本发明提供的分子特异性标记引物SPM01F/SPM01R对被测酸浆属植物进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测图。其中，M为DNA分子量标准Trans2K DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；通道1～5：小酸浆；6～9：苦蘵；10～13：酸浆；14～17：毛酸浆；18～22：大果酸浆。电泳图显示只有大果酸浆所有样品扩增出分子量为577bp大小的特异性DNA条带；

图3是采用本发明提供的分子特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)对12份不同大果酸浆个体样品的总基因组DNA进行PCR扩增得到的电泳图。其中，M：DNA分子量标准Trans2KDNA Marker；通道1～12：对应为12个不同大果酸浆个体的样品。电泳图显示12个不同大果酸浆个体样品均能扩增出分子量为577bp大小的特异性DNA电泳条带。

具体实施方式

本发明可以从分子水平上快速、准确的鉴别大果酸浆样品，通过以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：大果酸浆特异性核苷酸序列的制备

1.基因组DNA的提取

剪取被测酸浆属植物样品(包括5个小酸浆样品、4个苦蘵样品、4个酸浆样品、4个毛酸浆样品和4个大果酸浆样品)的新鲜叶片0.1g放入研钵，加入液氮并研磨至粉末，然后使用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)分别提取各被测酸浆属植物样品的基因组DNA，所得基因组DNA用1.0％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL。

2.SCoT–PCR扩增，电泳检测

运用SCoT通用引物7SEQ ID NO.4(5’-CAACAATGGCTACCACGG-3’)分别对各被测酸浆属植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，反应体系(总体积20μL)：2μL的10×Buffer(含MgCl₂)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL引物SCoT7(10μM)，0.5μL Taq酶(2U/μL)，1μL模板DNA(50ng/μL)，14.7μL ddH₂O。

PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

经过筛选实验，获得具有大果酸浆特异性条带的DNA指纹图谱(见图1)，图1中箭头标记的条带(分子量为811bp，通道为18～22)，是筛选出的大果酸浆特异性DNA片段。如图2所示，只有大果酸浆(通道为18～22)在分子量为811bp位置条带出现，而其他酸浆属植物在分子量811bp位置没有条带出现。因此，此条带为大果酸浆的特异性核苷酸序列。

3.序列测定

对上述筛选实验获得的大果酸浆特异性DNA片段(图1中箭头所指的条带)进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)回收纯化DNA片段。然后，将所得的纯化DNA片段连接到pMD19-T载体(TaKaRa)上，并转化到大肠杆菌感受态细胞中，送上海生工生物工程有限公司测序，得到一种大果酸浆特异性核苷酸序列SEQ ID NO.1。一种大果酸浆特异性核苷酸序列SEQ ID NO.1的具体DNA序列为：

CAACAATGGCTACCACGGAATCGTCTTGACGCGTAGTATTGTATTTTGATAGTGTTGGAGCGTTTGGAGCTTGCTCGTGTCGGTTTGAGCTATGGGAGCCCGTTTGGCTTCGTTTCTGCGGTTCTGCATTGAGGTAGGCTTTGTCTTCCTTTTTGGTTCAGACTGTACTGTTGTAGGACTGACACAGCACGGCTGGTCGTGTGGGAGGAGTTTATAGGTTGGATACCTGCTTTGTTATTATTATTACCTTCTCGTGTCACATGGGGCCCGGTAAGGGCATAGTTGGGCGGTTGAGCCGCGTGGGTCCCCGTAGGCCGTGCTTTGGCCGATGGACCATCTTTTGCTATAGCTTAGCCTTATTTCAGCTATCCTGTAGAGGTTAGATAATGTAGACTTGTTTAGGCTCCCATTGATCCTTCTGGCCTAGGTGGGGCTTACGGTGGTTGGGTTTTGTTGTGCTGACGTTGGAGGTGAGCTCCTGAAGCCCTCGTTACCCTATTAGGTGCTCTGGTTGTAGCTGCTAGCTCCCGTTTGAGCCGGATCTGGTGAGGCTTTGCCTCCCGAGTGACGGGCGGGTCACGATCCGTGGTGCTTTAGTGTTACCTGGACCTTTTTACGGGGTGGCCTACTTGGCCTCCTGGGGTCCCGCACACCGGCTGCAGTAGCCGTGGACGATATCTTTGACCTTACGAGCCGACTTTGTTGTTGGGGTCCCGATTCTGAGATGGATCTTGTTACGATGATGGCATGGTTTGGGTACTTCAGCTTATTTCTTTTGATGGATACGTTGGACTGGTTCTTTCCCGTGGTA。

实施例2：大果酸浆特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)的制备，PCR扩增，电泳检测

在实施例1所得大果酸浆特异性核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的基础上，开发设计获得大果酸浆分子特异性标记引物SPM01F/SPM01R序列(SPM01F：5’-CGTTTGGCTTCGTTTCTGC-3’，如SEQ ID NO.2所示；SPM01R：5’-TATCGTCCACGGCTACTGC-3’，如SEQ ID NO.3所示。)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。利用大果酸浆分子特异性标记引物SPM01F/SPM01R对不同被测酸浆属植物样品(具体见附图说明)进行PCR扩增及电泳检测。

PCR扩增反应体系(总体积20μL)：2μL的10×Buffer(含MgCl₂)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL的上游引物SPM01F(10μM)，1μL的下游引物SPM01R(10μM)，1μL的模板DNA(50ng/μL)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，13.7μL ddH₂O。

PCR反应程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪琼脂糖凝胶对10μL PCR产物进行电泳检测，经凝胶成像系统拍照检测，电泳图如图2所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2K DNA Marker；通道1～22为5种不同酸浆属植物的样品，具体见附图说明)，从图2可以看出，只有大果酸浆(通道18～22)能够扩增出577bp大小的特异性DNA片段，而其他酸浆属植物样品没有扩增出任何条带，这表明本发明提供的分子特异性标记引物具有极高的专一性，因此可以用于大果酸浆样品的快速鉴别。对大果酸浆的特异性片段进行测序，确定其序列为一种大果酸浆特异性核苷酸序列SEQ ID NO.1的101～677位碱基所示，其长度为577bp。

实施例3：分子特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)的进一步验证为了进一步验证本发明提供的分子特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)的稳定性和应用范围，利用实施例2所得的大果酸浆分子特异性标记引物SPM01F/SPM01R对12份来自不同大果酸浆个体的样品总基因组DNA进行PCR扩增，以及琼脂糖凝胶电泳检测。所得电泳图如附图3所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2K DNA Marker；通道1～12：对应为12个不同大果酸浆个体的样品)。附图3显示所有大果酸浆样品都能扩增出577bp大小的特异性DNA电泳条带，说明本发明提供的分子特异性标记引物(SPM01F/SPM01R)具有很好的稳定性和应用范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种大果酸浆的特异性核苷酸序列、标记引物及鉴别方法

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 811

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

caacaatggc taccacggaa tcgtcttgac gcgtagtatt gtattttgat agtgttggag 60

cgtttggagc ttgctcgtgt cggtttgagc tatgggagcc cgtttggctt cgtttctgcg 120

gttctgcatt gaggtaggct ttgtcttcct ttttggttca gactgtactg ttgtaggact 180

gacacagcac ggctggtcgt gtgggaggag tttataggtt ggatacctgc tttgttatta 240

ttattacctt ctcgtgtcac atggggcccg gtaagggcat agttgggcgg ttgagccgcg 300

tgggtccccg taggccgtgc tttggccgat ggaccatctt ttgctatagc ttagccttat 360

ttcagctatc ctgtagaggt tagataatgt agacttgttt aggctcccat tgatccttct 420

ggcctaggtg gggcttacgg tggttgggtt ttgttgtgct gacgttggag gtgagctcct 480

gaagccctcg ttaccctatt aggtgctctg gttgtagctg ctagctcccg tttgagccgg 540

atctggtgag gctttgcctc ccgagtgacg ggcgggtcac gatccgtggt gctttagtgt 600

tacctggacc tttttacggg gtggcctact tggcctcctg gggtcccgca caccggctgc 660

agtagccgtg gacgatatct ttgaccttac gagccgactt tgttgttggg gtcccgattc 720

tgagatggat cttgttacga tgatggcatg gtttgggtac ttcagcttat ttcttttgat 780

ggatacgttg gactggttct ttcccgtggt a 811

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

cgtttggctt cgtttctgc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

tatcgtccac ggctactgc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

caacaatggc taccacgg 18

Claims (5)

1.一种大果酸浆的特异性核苷酸片段，其特征在于：该核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

CAACAATGGCTACCACGGAATCGTCTTGACGCGTAGTATTGTATTTTGATAGTGTTGGAGCGTTTGGAGCTTGCTCGTGTCGGTTTGAGCTATGGGAGCCCGTTTGGCTTCGTTTCTGCGGTTCTGCATTGAGGTAGGCTTTGTCTTCCTTTTTGGTTCAGACTGTACTGTTGTAGGACTGACACAGCACGGCTGGTCGTGTGGGAGGAGTTTATAGGTTGGATACCTGCTTTGTTATTATTATTACCTTCTCGTGTCACATGGGGCCCGGTAAGGGCATAGTTGGGCGGTTGAGCCGCGTGGGTCCCCGTAGGCCGTGCTTTGGCCGATGGACCATCTTTTGCTATAGCTTAGCCTTATTTCAGCTATCCTGTAGAGGTTAGATAATGTAGACTTGTTTAGGCTCCCATTGATCCTTCTGGCCTAGGTGGGGCTTACGGTGGTTGGGTTTTGTTGTGCTGACGTTGGAGGTGAGCTCCTGAAGCCCTCGTTACCCTATTAGGTGCTCTGGTTGTAGCTGCTAGCTCCCGTTTGAGCCGGATCTGGTGAGGCTTTGCCTCCCGAGTGACGGGCGGGTCACGATCCGTGGTGCTTTAGTGTTACCTGGACCTTTTTACGGGGTGGCCTACTTGGCCTCCTGGGGTCCCGCACACCGGCTGCAGTAGCCGTGGACGATATCTTTGACCTTACGAGCCGACTTTGTTGTTGGGGTCCCGATTCTGAGATGGATCTTGTTACGATGATGGCATGGTTTGGGTACTTCAGCTTATTTCTTTTGATGGATACGTTGGACTGGTTCTTTCCCGTGGTA。

2.基于如权利要求1所述的一种大果酸浆的特异性核苷酸片段开发获得一种大果酸浆的特异性标记引物，其特征在于：包括如SEQ ID NO.2所示的上游引物SPM01F和如SEQ IDNO.3所示的下游引物SPM01R，具体序列如下：

上游引物SPM01F：5’-CGTTTGGCTTCGTTTCTGC-3’；

下游引物SPM01R：5’-TATCGTCCACGGCTACTGC-3’。

3.利用如权利要求2所述的一种大果酸浆的特异性标记引物鉴别大果酸浆的方法，其特征在于：

步骤一、提取被测植物样品的基因组总DNA；

步骤二、以步骤一提取的样品基因组总DNA为模板，以上游引物SPM01F和下游引物SPM01R作为扩增引物，进行PCR扩增，获得PCR产物；

步骤三、利用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤二所获得的PCR产物进行电泳检测，若电泳结果出现分子量为577bp大小的DNA条带，则被测样品为大果酸浆，反之则不是。

4.如权利要求3所述的鉴别大果酸浆的方法，其特征在于：步骤二中，所述的PCR扩增体系为：2μL的10×Buffer，0.8μL的dNTPs，1μL的上游引物SPM01F，1μL的下游引物SPM01R，1μL的模板DNA，0.5μL的Taq酶，13.7μL ddH₂O。

5.如权利要求3所述的对大果酸浆进行鉴别的方法，其特征在于，步骤二中，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5min；32个循环；72℃延伸10min。

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