CN109022610B - 一种金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法。当前对金线莲的真假鉴别，效率低下，且准确率不高。本发明中分子特异性标记引物的序列为：上游引物S8FJF：5’‑CTTCGTGGCTTTGACTGGTT‑3’；下游引物S8FJR：5’‑CTGCCCCCTCGTTGATGTTC‑3’。利用特异性引物S8FJF/S8FJR，通过常规PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，即可快速、准确的鉴别金线莲样品。S8FJF/S8FJR为金线莲的特异性扩增引物，待测样品若为金线莲，则会扩增出714bp大小的特异性DNA片段，若为其他近缘物种样品，则为阴性反应；本发明方法操作简便，结果准确，并且耗时较短。

Description

一种金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种名贵药材金线莲Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl的分子特异性标记引物，以及利用该特异性标记引物对金线莲药材资源进行快速鉴别的方法。
背景技术
金线莲(Anoectochilus roxburghii)是兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus Bl.)多年生草本植物，又名金线兰、金丝草等，在我国主要分布于福建、广东、广西、海南、湖南、江西、四川、云南和浙江等省份。金线莲是我国非常珍贵的传统中药材，素有“药王”、“金草”、“神药”和“乌人参”等美称，在《本草拾遗》、《中药辞海》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》、《中华本草》、《中国经济植物志》、《新华本草纲要》、《福建药物志》等著名典籍均有记载。作为珍贵中药材，金线莲以全草入药，其性平、味甘，具有清热凉血、解毒消肿、祛风利湿、镇惊平肝、补肾、利尿、润肺止咳等功效。常用于风湿性关节炎、肝炎、肾炎、支气管炎、小儿惊风、膀胱炎、糖尿病、高血压、高血脂等疾病的治疗，另外，还有增强人体免疫力，抗肿瘤、祛除青春痘和雀斑等作用。
由于金线莲药用价值高，价格昂贵，其野生资源遭到人为过度采挖，其生境破坏严重，再加上金线莲对生长环境要求较高，繁殖困难，使得金线莲野生资源日益匮乏。关于金线莲原植物的来源，一直以来就备受争议。目前，市场上流通的所谓金线莲药材主要来源有金线莲(A.roxburghii)、台湾金线莲(台湾银线莲，A.formosanus)和滇越金线莲(A.chapaensis)。由于这三种植物都同属于开唇兰属，其形态特征非常相似，故人们常常把台湾金线莲A.formosanus和滇越金线莲A.chapaensis与金线莲A.roxburghii混淆，并将三种植物均作为金线莲使用，药材市场上存在着严重的“同物异名、同名异物”现象。另外，一些不法分子，为了牟取更多利益，故意以假乱真，以次充好，严重影响了商品金线莲药材的质量。金线莲药材基原不同，其具体药用价值和使用方法也有所不同，因此，建立快速、有效的金线莲A.roxburghii药材资源的鉴别方法是保证金线莲药材安全使用和建立规范质量标准的重要基础。
关于金线莲药材的资源鉴定，已经成为相关研究学者所关注的焦点。例如，易骏等人采用徒手切片、显微观察和数码照相方法，通过比较分析不同植物基原金线莲的植物形态特征、根、茎、叶的横切面组织构造及其组织特征，金线莲干燥药材粉末特征，对金线莲、台湾金线莲和滇越金线莲进行了生药鉴别(易骏等，不同植物基原金线莲生药鉴别，中草药，2015，46：3570-3576)；胡珊梅等人采用高效液相色谱法，通过构建HPLC指纹图谱进行了金线莲和台湾金线莲之间的鉴别(胡珊梅等，一种金线莲指纹图谱的建立方法及福建金线莲和台湾金线莲指纹图谱，中国发明专利，专利申请号：201210203783.4)。但是，金线莲、台湾金线莲和滇越金线莲的表型特征十分相似，其形状特征及化学成分含量容易受生境、气候、生理状况等的影响，进而常常会导致主观辨别上的偏差。因此，形态学鉴定方法和HPLC指纹图谱鉴定方法不但操作繁琐，而且很难实现金线莲药材种质资源的快速、准确鉴定。DNA分子标记尤其是特异性分子标记技术弥补和克服了传统形态学鉴定和化学指纹图谱鉴定方法的一些缺陷和难题，DNA分子标记数量非常多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制，该技术能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。本发明通过开发设计提供一种金线莲A.roxburghii的分子特异性标记引物，并建立其鉴别方法，为实现该珍贵药材资源的真伪鉴别及保护提供技术支持。
发明内容
本发明的第一个目的针对现有技术的不足，是提供用于鉴别金线莲A.roxburghii的分子特异性标记引物，该分子特异性标记引物序列如下：
上游引物S8FJF：5’-CTTCGTGGCTTTGACTGGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物S8FJR：5’-CTGCCCCCTCGTTGATGTTC-3’，如SEQ ID NO.2所示。
该分子特异性标记引物组合的获得首先是采用常规PCR技术及琼脂糖凝聚电泳检测，以及经过大量DNA指纹图谱比较分析，筛选获得金线莲的特异性DNA片段。之后，经过切胶回收、TA克隆及测序分析，获得该特异性DNA序列，在此基础上，开发获得金线莲分子特异性标记引物。以该引物组合(S8FJF/S8FJR)作为PCR引物，对金线莲及其近缘开唇兰属物种(台湾金线莲A.formosanus和滇越金线莲A.chapaensis)样品进行PCR扩增，该引物组合只和金线莲样本DNA发生反应，获得714bp大小的特异性DNA片段，而与台湾金线莲和滇越金线莲的样品材料不发生反应。为了进一步验证特异性引物S8FJF/S8FJR的稳定性和应用范围，利用该引物组合对来自10个不同金线莲个体的样本总基因组DNA进行PCR扩增，结果所有金线莲样品都能扩增出714bp大小的特异性条带，说明该特异性标记引物组合具有很好的稳定性和应用范围。
本发明的第二个目的是提供上述分子特异性标记引物对金线莲进行鉴别的方法。所述方法为：采用上述分子特异性标记引物组合(S8FJF/S8FJR)作为特异性扩增引物，以被测金线莲与其近缘开唇兰属物种样品DNA为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现分子量为714bp大小的特异性DNA片段，则被测植物样品为金线莲A.roxburghii，反之则不是。
具体的，所述方法如下：
(1)样品总基因组DNA提取：剪取被测植物样品(金线莲及相似物种)片100mg放入研钵，加液氮研磨至粉末，然后，利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(订购于上海生工生物工程股份有限公司)提取被测植物样品的基因组DNA。所得DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL。
(2)PCR扩增：以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为模板，以所述分子特异性标记引物(S8FJF/S8FJR)作为扩增引物(引物由上海生工生物工程有限公司合成)，进行PCR扩增。
PCR反应体系(总体积20μL)：2μL的10×PCR Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL上游引物S8FJF(10μM)，1μL下游引物S8FJR(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，1μL的模板DNA(50ng/μL)，13.7μL的ddH2O。
PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min)；最后，72℃延伸10min。
(3)电泳检测：取10μL步骤(2)所得的PCR产物，利用1.5﹪琼脂糖凝胶进行电泳检测。然后，利用凝胶成像系统(BIO-RAD Molecular
Figure BDA0001799076600000041
Gel DocTMXR+System withImage LabTMSoftware)进行拍照检测。若电泳图通道出现分子量为714bp大小的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品为金线莲，反之则不是。
本发明主要有益效果表现为：本发明提供的引物组合(S8FJF/S8FJR)是金线莲的种特异性PCR扩增引物。被测植物样品若为金线莲，则PCR反应为阳性，电泳图上会有714bp大小的特异性DNA电泳条带出现；被测植物样品若为其他近缘物种的样品DNA，则PCR反应为阴性，电泳图上没有714bp大小的特异性DNA电泳条带出现。进而可以实现金线莲药材资源的快速鉴别，检测结果准确，使用方法简便，操作耗时短。
附图说明
图1为利用本发明提供的分子特异性标记引物(S8FJF/S8FJR)对12个开唇兰属植物样品进行PCR扩增的电泳图。其中，M：DNA分子量标准Trans2K DNA Marker(订购于北京全式金生物技术有限公司)；C：阴性对照；通道1～4：金线莲A.roxburghii；通道5～8：台湾金线莲A.formosanus；通道9～12：滇越金线莲A.chapaensis。电泳图显示只有金线莲A.roxburghii样品扩增出分子量为714bp大小的特异性DNA条带。
图2为利用本发明提供的分子特异性标记引物(S8FJF/S8FJR)对10份不同金线莲样品个体的总基因组DNA进行PCR扩增的电泳图。其中，M：DNA分子量标准Trans2K DNAMarker；C：阴性对照；通道1～10：对应为10个不同金线莲个体的样品。电泳图显示10个不同金线莲个体样品均扩增出分子量为714bp大小的特异性DNA条带。
具体实施方式
本发明提供的分子特异性标记引物和方法可以在分子水平较为快速、准确的鉴别金线莲样品，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：金线莲分子特异性标记引物开发设计
1.样品基因组DNA提取
剪取被测开唇兰属植物样品叶片100mg放入研钵，其中样品包括4个金线莲A.roxburghii样品、4个台湾金线莲A.formosanus样品和4个滇越金线莲A.chapaensis样品。立即加入液氮研磨至粉末，然后运用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)进行样品总基因组DNA提取。所得基因组DNA用0.8％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL，4℃保存，用于后续PCR扩增反应。
2.分子特异性标记引物S8FJF/S8FJR获得
运用常规PCR扩增技术及琼脂糖凝胶电泳检测，以及通过大量DNA指纹图谱比较分析，筛选获得金线莲特异性核苷酸片段。然后，经过切胶回收、克隆及测序，获得金线莲特异性核苷酸序列。获得金线莲特异性核苷酸序列的方式为送上海生工生物工程股份有限公司测序。
最后，基于获得的金线莲特异性核苷酸序列开发获得金线莲的特异性标记引物S8FJF/S8FJR(S8FJF：5’-CTTCGTGGCTTTGACTGGTT-3’；S8FJR：5’-CTGCCCCCTCGTTGATGTTC-3’)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
实施例2：特异性标记引物S8FJF/S8FJR的PCR扩增及电泳检测
以本发明开发的特异性标记引物组合S8FJF/S8FJR为扩增引物，对四份金线莲A.roxburghii、四份台湾金线莲A.formosanus、四份滇越金线莲A.chapaensis的总基因组DNA(具体见附图1说明)进行PCR扩增，以及电泳检测。
PCR反应体系(总体积20μL)：2μL的10×PCR Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100]，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL上游引物S8FJF(10μM)，1μL下游引物S8FJR(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，1μL的模板DNA(50ng/μL)，13.7μL的ddH2O。
PCR反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min)；最后，72℃延伸10min。
电泳检测：取10μL PCR扩增产物，利用1.5﹪琼脂糖凝胶进行电泳检测。然后，利用凝胶成像系统(BIO-RAD Molecular
Figure BDA0001799076600000051
Gel DocTMXR+System with ImageLabTMSoftware)进行拍照检测。所得电泳图如附图1所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2K DNA Marker；C为阴性对照；通道1～12为12个不同被测植物的样品，具体见附图1说明)。从附图1可以看出只有金线莲A.roxburghii样品(通道1～4)能扩增出714bp大小的特异性DNA片段。而台湾金线莲和滇越金线莲的所有样品都没有扩增出任何条带，这表明本发明提供的特异性标记引物专一性好，灵敏度高，可以用于金线莲样品的快速鉴定。
实施例3：分子特异性标记引物S8FJF/S8FJR进一步验证
为了进一步验证本发明开发的特异性标记引物S8FJF/S8FJR的稳定性和应用范围，利用引物组合S8FJF/S8FJR对10份来自不同金线莲个体的样品总基因组DNA进行PCR扩增及电泳检测；所得电泳图如附图2所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2K DNAMarker；C为阴性对照；通道1～10：对应为10个不同金线莲样品，样品编号分别为JXF1～JXF10)。附图2显示所有金线莲样品都能扩增出714bp大小的特异性DNA条带，说明本发明提供的特异性标记引物S8FJF/S8FJR具有很好的稳定性和应用范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 一种金线莲的分子特异性标记引物及其鉴别方法
<130> 1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 1
cttcgtggct ttgactggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
ctgccccctc gttgatgttc 20

Claims (4)

1.一种金线莲的分子特异性标记引物，其特征在于，该特异性引物序列如下：
上游引物S8FJF:5’-CTTCGTGGCTTTGACTGGTT-3’；
下游引物S8FJR:5’-CTGCCCCCTCGTTGATGTTC-3’。
2.利用权利要求1所述的一种金线莲的分子特异性标记引物对金线莲进行鉴别的方法，其特征在于，具体步骤如下，
(1)提取被测植物样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为扩增模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增；
(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现714bp大小的特异性DNA片段，则被测植物样品为金线莲；
所述分子特异性标记引物序列为：
上游引物S8FJF:5’-CTTCGTGGCTTTGACTGGTT-3’；
下游引物S8FJR:5’-CTGCCCCCTCGTTGATGTTC-3’。
3.如权利要求2所述的对金线莲进行鉴别的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增体系包括：2μL的10×PCR Buffer，0.8μL浓度为10mM的dNTPs，1μL浓度为10μM的上游引物S8FJF，1μL浓度为10μM的下游引物S8FJR，0.5μL浓度为2U/μL的Taq酶，1μL浓度为50ng/μL的模板DNA，13.7μL的ddH2O，共20μL；其中，10×PCR Buffer包括200mM的pH值为8.8的Tris–HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2，1％TritonX-100。
4.如权利要求2所述的对金线莲进行鉴别的方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；35个循环，每个循环的条件为94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min；最后，72℃延伸10min。
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