CN112143827B - 用于鉴别甘草不同产地的ssr分子标记引物及方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鉴别甘草不同产地的SSR分子标记引物及方法与应用，所述SSR分子标记引物命名为GC01，由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成，本发明的SSR分子标记引物在甘草产地鉴别中的应用。本发明提供的鉴别甘草产地的SSR分子标记引物，可以对不同产地甘草进行鉴别，可以鉴别出新疆、内蒙、甘肃不同主产区的甘草种子，标记引物准确度高、稳定性强，鉴别方法操作简便，成本低廉、易于大范围推广应用。

Description

用于鉴别甘草不同产地的SSR分子标记引物及方法与应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于鉴别甘草产地的SSR分子标记引物及方法与应用。

背景技术

甘草(Glycyrrhizae Radix et rhizome)为豆科(Leguminosae)甘草属药材，《中国药典》规定甘草药材植物来源为甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎。市场上甘草药材以甘草(又称乌拉尔甘草)来源为主，其产地多分布于新疆、甘肃、内蒙古等省份。

不同产地甘草的种子价格差异显著，新疆产甘草的种子价格普遍比其他产地(如内蒙、甘肃等省份)低近一半左右，新疆地区种植的甘草药材俗称“大头草”，药材价格要低于内蒙、甘肃等省份甘草种源的药材；同时，内蒙古、甘肃不同地区的甘草种子种植后的甘草药材质量不一，甘草酸、甘草苷的含量不相同，所以种植企业或农户的需求不尽一致。这就导致在市场交易及流通过程中，新疆产甘草的种子经常混杂在其他产地的种子中进行销售，或者内蒙古、甘肃不同产地甘草种子相互“冒名”销售，而传统的鉴别方式多为经验判别，主要从甘草种子的外观形态方面进行区分，但是外观鉴别存在很大的不确定性，很难准确区分不同产地的甘草种子。

因此，针对目前的市场现状，需要一种用于鉴别甘草产地标记物。

发明内容

本发明为解决上述问题提供了一种用于鉴别甘草不同产地的SSR分子标记引物及方法与应用。

一种用于鉴别甘草不同产地的SSR分子标记引物，所述SSR分子标记引物命名为GC01，由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物组成。

进一步地，所述引物的退火温度为55℃-60℃之间，所述引物的长度在20-25bp之间，PCR扩增产物长度在150bp-350bp之间。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

提取待鉴别甘草样本的DNA；

以待鉴别甘草样本的DNA为模板，用SSR分子标记引物进行PCR扩增；

取扩增产物进行电泳检测。

进一步地，所述扩增反应的程序包括：

95℃预变性5min；95℃变性0.5min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，30次循环；72℃延伸10min；；4℃保存。

进一步地，在所述电泳鉴定时，所用的凝胶为1％的琼脂糖凝胶，电压为140V，电泳20-30min。

本发明还涉及上述SSR分子标记引物在甘草产地鉴别中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了用于鉴别甘草产地的SSR分子标记引物可以对不同产地甘草进行鉴别，可以鉴别出新疆、内蒙、甘肃不同主产区的甘草种子，所采用的SSR筛选引物准确度高、稳定性强，采用本发明的引物鉴别甘草产地的方法操作简便，成本低廉、易于大范围推广应用。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是不同产地甘草的SSR特异性位点图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

引物筛选

根据甘草基因组组装草图进行候选SSR marker开发设计甘草SSR引物9174对。具体技术细节如下：

(1)寻找序列中存在的SSR

采用SSRIT为核心程序，在甘草基因组序列中进行扫描，扫描条件2-6个碱基重复4次以上，排除连续相同碱基的重复。

(2)引物设计

在SSR核心区侧翼序列中(150bp范围)，使用primer3进行primer引物设计，具体参数如下：

PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE＝80-300；

PRIMER_OPT_SIZE＝24；引物最佳长度24bp；

PRIMER_MIN_SIZE＝20；引物最小长度20bp；

PRIMER_MAX_SIZE＝28；引物最大长度28bp；

PRIMER_OPT_TM＝63；最佳退火温度63℃；

PRIMER_MIN_TM＝60；最低退火温度60℃；

PRIMER_MAX_TM＝65；最高退火温度65℃；

PRIMER_MAX_DIFF_TM＝1；一对引物退火温度的最大差值1℃；

其他参数采用primer3的默认参数。

(3)引物过滤

将引物blast比对回基因组上，将成对引物在基因组上可以扩增得到的序列长度进行比较，与含有目标SSR的产物长度差在2k以上，保留该对引物，与含SSR产物长度差在2k以内的，滤掉该引物，即可得到候选SSR引物。

所选择的引物长度在20-25bp之间，理论退火温度55℃-60℃之间，PCR扩增产物长度处于100bp-350bp之间。引物设计完成后由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

本发明提供了用于鉴别甘草产地的SSR分子标记引物，所述SSR分子标记引物命名为GC02，由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，具体如下：

F：GGGTTTTGTTTTGATCTGGACCTT

R：AAAGGAAGATGACGAAGAAAATTGG

本发明还提供利用上述SSR分子标记引物鉴别甘草产地的方法，所述方法包括以下步骤：

1.提取待鉴别甘草样本的DNA

将采集的具有市场代表性的各产地甘草种子样本(见表1)使用硅胶进行干燥，待完全干燥后，使用小钢珠与球磨仪(德国FRITSCH，PULVERISETTE 6)将样本粉碎研磨。利用试剂盒法(CTAB法，天根生化，DP305试剂盒)提取植物样本基因组总DNA。具体步骤如下：

1)将研磨好的样本粉末迅速转移至2.0mL的EP管中，加入65℃预热的缓冲液GP1700μl，巯基乙醇1μl；将EP管盖子顶端用Parafilm封口膜进行密封，上下颠倒混匀后，放入65℃水浴30min，在水浴过程中，不断颠倒EP管数次。

2)加入700μl氯仿：异戊醇(24:1)混合液，充分混匀，12000rpm离心5min。3)将离心后分离的上清液小心转移至新的2.0mL EP管中，加入700μl异丙醇(放-20℃冰箱保存，低温效果更佳)，充分混匀。

4)将混匀后的液体分两次转移到吸附柱CB3内，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

5)向吸附柱CB3内加入500μl缓冲液GD(使用前确定加入规定体积的无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

6)向吸附柱CB3内加入700μl漂洗液PW，(使用前确定加入规定体积的无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

7)重复操作步骤6)。

8)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱CB3放入新的1.5mL EP管中，置室温放置数分钟，直到彻底晾干吸附柱CB3内的残余漂洗液(以无乙醇味为判断标准)。

9)向吸附柱CB3中间滤膜位置悬空加入100μl洗脱液TE，室温放置3-5分钟，使得洗脱液充分洗脱DNA。

10)将放有吸附柱CB3的1.5mLEP管12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mLEP管内，-20℃保存备用。

表1不同产地甘草信息表

2.以待鉴别甘草样本的DNA为模板，用SSR分子标记引物进行PCR扩增

PCR扩增体系：

10μLPCR-MIX(2X)，0.15μL M13-Forwardprimer(10μM/L)，0.15μL反向引物(Reverse primer)(10μM/L)，2μL DNA，双蒸水(ddH₂O)补齐20μL。反应条件为95℃预变性5min；30个循环的三步PCR(95℃变性0.5min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min)；72℃延伸10min；4℃保存。

扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，在140V电压下电泳20-30min，扩增成功的样品经北京睿博兴科生物技术有限公司利用3730xl DNA analyzer(ABI)进行毛细管荧光电泳检测进行分析。

3.结果分析

利用GeneMarker软件对测序结果进行不同产地甘草的遗传多样性数据分析，寻找不同引物在不同产地甘草样品中的特异性位点，据此为鉴定新疆甘草与其它产地甘草提供参考依据，见图1；其他不符合要求的引物予以淘汰。

利用GeneMarker软件读取毛细管电泳数据，分析不同产地甘草的SSR扩增片段，其中AB是甘肃省白银市甘草样本，且两者产地较近，二者在(180bp，180bp)处特异峰一致，未产生遗传变异；C内蒙古鄂尔多斯市杭锦旗甘草样本、D内蒙古赤峰市松山区甘草样本分别在(170bp，185bp)、(175bp，180bp)处表现稳定，由于CD产地相距较远，地理隔离引起了遗传变异；而E新疆伊犁巩留县、F新疆阿勒泰福海县的甘草样品虽然产地相距较远，但均在(180bp，185bp)、(185bp，185bp)处表现稳定。由此可知引物GC02可以将甘草6个主产区的样品进行有效区分。

对于内蒙古产地样品或新疆产地样品，由于所检测样品为杂合基因导致有两个特征峰，但只需确定检测结果中有较为特殊的特征峰，如170bp、175bp、或185bp处的特征峰，即可确认检测样品的生产地。

由结果可知，采用GC02进行样品产地检测时，通过在180bp处出现特征峰即可确认产地为甘肃；对于在170bp或175bp处出现特征峰的样品即可确认产地为内蒙古；在185bp出现特征峰的样品即可确认产地为新疆地区。

因此，采用本方案所制备的引物GC02检测未知地的甘草样本，能够有效鉴别不同产地的甘草样品。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国中药有限公司

<120> 用于鉴别甘草产地的SSR分子标记引物及方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggttttgtt ttgatctgga cctt 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaggaagat gacgaagaaa attgg 25

Claims (4)

1.利用SSR分子标记引物鉴别乌拉尔甘草产地的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

提取待鉴别乌拉尔甘草样本的DNA；

以待鉴别乌拉尔甘草样本的DNA为模板，用SSR分子标记引物进行PCR扩增；

取扩增产物进行电泳检测；

所述SSR分子标记引物由核苷酸序列如SEQID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO：2所示的下游引物组成；所述的SSR分子标记引物的退火温度为55℃-60℃之间；

对扩增片段进行电泳分析，当SSR扩增片段在180bp出现特征峰时，则待鉴定样本为甘肃产地；当SSR扩增片段在170bp和185bp，或在175bp和180bp出现特征峰时，则待测样本为内蒙古产地；当SSR扩增片段在180bp和185bp，或在185bp出现特征峰时，则待测样本为新疆产地。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的程序包括：

95℃预变性5min；95℃变性0.5min，60℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，30次循环；72℃延伸10min；4℃保存。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述电泳检测时，所用的凝胶为1％的琼脂糖凝胶，电压为140V，电泳20-30min。

4.一种SSR分子标记引物在乌拉尔甘草产地鉴别中的应用，其特征在于，所述SSR分子标记引物由核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；所述引物的退火温度为55℃-60℃之间；

对扩增片段进行电泳分析，当SSR扩增片段在180bp出现特征峰时，则待鉴定样本为甘肃产地；当SSR扩增片段在170bp和185bp，或在175bp和180bp出现特征峰时，则待测样本为内蒙古产地；当SSR扩增片段在180bp和185bp，或在185bp出现特征峰时，则待测样本为新疆产地。

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