CN101096708B - 鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。属于利用分子生物学方法鉴定玄参药材道地性的技术领域。本发明提供了浙江种源的玄参(Srophularia ningpoensis)特异性核苷酸序列及来源于该序列的核酸分子探针，以及利用该探针鉴别玄参浙江种源的方法。本发明具有的有益效果：1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。2)准确、灵敏度高，cc874u/cc874d为浙江种源玄参的专一性分子探针，若为其他种源，为阴性反应。
Description
技术领域
本发明属于利用分子生物学方法鉴定道地浙玄参的技术领域，具体地说，是涉及一种鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。
背景技术
玄参(Scrophularia ningpoensis Hemsl.)最早记载于《神农本草经》，又名元参，浙玄参，水萝卜，八秽麻等(中国植物志六十七卷第二分册，1979)，是著名中药材“浙八味”之一，根药用，有滋阴降火，消肿解毒的功效；现也运用于化妆品生产，作为植物润滑剂、防冻霜、防皱霜等。
玄参是我国特有种，分布较广，很多地区都有栽培，其中浙江种源的玄参根粗肥大、产量高、品质佳。但是，中药材种植上存在品种混乱问题，原材料市场上存在品质优劣问题。仅仅依靠传统的形态分析已不能进行品种的科学鉴定和种源的遗传分析。目前还没有一种可靠有效的方法可以将品质较好的浙江种源的玄参与其他地区的玄参区分开来，解决药材地道性问题。
近年来，随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展和打入国际市场的瓶颈。药用植物或植物药的发展离不开标准化生产，即目前大力推行的GAP(Good agriculturing Practice，中药材生产质量管理规范)工作的核心。而种(品)质的标准及科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提。迄今为止，国际上有关玄参植物化学、药用价值等方面的研究已有不少报导，(戴金秋等，1994；邹节明等，2005；谢丽华等，2000；俞静静等，2006.)但是尚未见有关玄参药材道地性DNA快速鉴定的技术的研究报导(Cao H.，Liu Y.P.，1998)。因此，有必要在DNA分子标记水平采用新方法新技术快速鉴定浙江种源的玄参，解决中草药种植上品种混乱和原材料市场上品质优劣等问题。(Elizabeth et al.，2003；Elizabeth，A.S.，2003)
参考文献
《中国植物志》1979，第六十七卷，第二分册，科学出版社。
戴金秋等，1994.浙江产玄参的化学成分。现代应用药学，11(4)：16-17.
邹节明等，2005.苦玄参HPLC指纹图谱研究.中国药学杂志09期.
谢丽华等.，2000.中药玄参薄层色谱鉴别法的建立.中国中药杂志，25(11)：654-656.
俞静静等，2006.玄参有效部位的药理研究进展.Chinese Journal of thePractical Chinese with Modern
Medicine 2006 VOL.(19)NO.15.Cao H.，Liu Y.P.，1998.Applications of molecular markers in the detectionof herbal medicine.Chin.Pharm.J.33(5)：269-273.
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发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。
用于鉴定浙江种源的玄参的核苷酸序列是该序列来源于ISSR通用引物UBC874扩增所得的浙江玄参特异性核苷酸序列，具体序列为：
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caaagcatgaaatatttgttcacgctaggacaatcacctgaaatctttcgatgacggtgaggcggcga
tgggcggtgggcggcgtgacttgtgcgcgctgagggagggagggagg。
浙江种源的玄参专一性核酸分子探针是：该核酸分子探针来源于权利要求1所述核苷酸序列中的1段或2段22个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10％的序列。
核苷酸序列为：cc874u：5′-ctatcatcgtctttgtccatcc-3′或cc874d：5′-tgctttgaaacatttgaacttg-3′，或者为cc874u和cc874d。
鉴定浙江种源的玄参的方法是采用PCR方法，以权利要求2或3所述的核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。所说的核酸分子探针为权利要求3所述的cc874u和cc874d。
本发明具有的有益效果：
1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。
2)准确、灵敏度高，cc874u/cc874d为浙江种源玄参的专一性分子探针，若为其他种源，为阴性反应。
附图说明
图1是采用ISSR引物UBC874进行PCR扩增的电泳图(红色框内的条带是浙江种源的玄参特有的条带，分子量为1300bp左右)；
图2是采用玄参浙江种源专一性核酸分子探针cc874u和cc874d对各地玄参进行检测的PCR扩增电泳图；
图3是采用玄参浙江种源专一性核酸分子探针cc874u和cc874d对各地玄参进行检测的PCR扩增电泳图；
图中：YC：浙江磐安窈川种源的玄参，RL：浙江磐安仁川种源的玄参，GMC：浙江磐安光明村种源的玄参，XJ：浙江仙居种源的玄参，PA：浙江磐安尚湖种源的玄参，HB：湖北种源的玄参，SX：陕西种源的玄参，SC：种植在四川广源地区的玄参(引种自浙江)，M：分子量。
具体实施方法
本发明可以从遗传本质上客观准确地鉴定浙江产的玄参。具体包括：1提供用于玄参浙江种源鉴定的DNA片段；2提供来源于上述DNA片段的浙江种源玄参专一性核酸分子探针；3提供利用上述核酸分子探针鉴定浙江种源的玄参的方法。
在采用ISSR分子标记研究各地产的玄参的遗传多样性时发现，ISSR通用引物UBC874扩增的带型中，浙江产的玄参有特异性条带，能将其与其他地区的玄参区别开。因此，可根据此特异性条带合成专一性的核酸分子探针，建立快速、准确鉴定浙江种源玄参的分子生物学方法，用于玄参药材道地性的检测。
本发明提供的用于鉴别浙江种源玄参的核苷酸序列来源于采用ISSR通用引物UBC874扩增所得的浙江玄参的特异性序列，该序列的结构特征如序列表中的序列1(<210>1)所示。
该序列(<210>1)可通过如实施例1所述的方法得到；或者按已知的该序列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。
本发明的浙江种源玄参专一性核酸分子探针是以上述浙江玄参特异性核苷酸序列为基础，利用Primer Primer 5.0(Vinay Singh，1998)软件设计得出。该分子探针为浙江玄参特异性核苷酸序列中的1段或2段22个核苷酸组成的寡核苷酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列再经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过总核苷酸量的10％的序列。。
本发明的上述浙江玄参专一性核酸分子探针为序列表中<210>2和<210>3所示的序列(分别简称为cc874u和cc874d)。
本发明的上述浙江玄参专一性核酸分子探针，可按照预先根据浙江玄参特异性核苷酸序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。
本发明的上述浙江玄参专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与浙江种源的玄参专一性反应，但不与其他种源的玄参的DNA发生反应。所以，利用该核酸分子探针，通过PCR方法可以快速、准确地鉴别浙江种源的玄参。
本发明所提供的玄参浙江种源的鉴定方法，可采用PCR方法：以前面所述的本发明的核酸分子探针(优选为cc874u和cc874d)为PCR引物，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行：按照经过优化的PCR体系逐一将样品加入PCR管中，放入PCR仪器，采用经过优化的PCR程序进行PCR扩增。采用该PCR方法可快速、准确地检测鉴定玄参的浙江种源，而且样品用量少。
由于本发明所提供的核酸分子探针为浙江种源的玄参专一性探针，因此，在样品种源未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，鉴定出其是否为浙江种源，为玄参药材道地性的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，解决了药材市场上玄参种源混杂的问题。
序列表中的<210>1序列是浙江种源的玄参特异性核苷酸序列，其中带下划线的部分(70-92bp和1210-1232bp)分别为本发明的浙江种源玄参专一性寡核苷酸分子探针cc874u和cc874d。
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：浙江种源玄参特异性核苷酸序列的制备
1基因组DNA的提取
采用改良CTAB法(Doyle，1991)提取叶片基因组DNA。步骤如下：
1)取约0.05克的硅胶干燥叶片，加入少量PVP粉，置入磨样管中，用BIO101磨样机研磨，SPEED 4.0，TIME 20s。
2)迅速加入65℃预热的2×CTAB提取缓冲液(含2％b-巯基乙醇)800-1000ul，摇均后转入5ml离心管中，再用800-1000ul 2×CTAB清洗磨样管，转入同一个5ml管中，65。C水浴30分钟。
3)冷却至室温，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合均匀(缓慢颠倒)15-30分钟，室温10000rpm离心10-15分钟。
4)吸取上层水相，加入1/10体积的10％CTAB，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，重复步骤(3)。
5)吸取上层水相，加入0.5体积的5M NaCl混匀，再加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，于放置2小时或过夜。
6)10000rpm离心10min，使DNA附着离心管管底，弃水相。
7)加75％乙醇浸洗2-3次，用无水乙醇清洗一次，去乙醇，风干。
8)用适量0.1×TE溶解DNA沉淀，-20℃保存备用。
2ISSR--PCR
用ISSR通用引物UBC874进行PCR扩增，扩增体系如下表所示：
PCR程序为：
PCR产物电泳结果见图1，红色框内的条带(分子量为1300bp左右)是采用ISSR引物UBC874进行PCR扩增时寻找到的浙江种源的玄参特有的条带。如图所示，浙江种源的玄参(包括种植于四川的玄参)在分子量1300bp左右均有条带出现，而其他种源的玄参在分子量1300bp左右没有条带出现。因此，此条带即为浙江种源玄参的特有条带。
3序列测定
PCR结束后，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，对只在浙江群体中出现的特异性ISSR片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(Sangon，Shanghai，China)回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体(Sangon，Shanghai，China)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中。目的片段采用引物M13+/-于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中<210>1序列所示的核苷酸组成与排列。
实施例2：玄参浙江种源专一性核酸分子探针cc874u和cc874d的制备
在获得浙江玄参特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Primer 5.0(VinaySingh，1998)软件设计，得出cc874u和cc874d(分别为序列表中<400>1所示的70-92bp和1210-1232bp)的核苷酸组成与排列是用于鉴定浙江种源的玄参的良好寡核苷酸片段。根据cc874u和cc874d的核苷酸组成的排列(序列表中<210>2和<210>3序列所示的核苷酸组成与排列)，在DNA自动合成仪上合成得到。
实施例3：玄参浙江种源的鉴定(常规PCR方法)
1、DNA的提取：采用改良CTAB法提取玄参DNA
2、PCR反应体系为：
3、PCR操作：取2个0.5毫升PCR管，按照步骤2分别加入22.5微升PCR混合液，然后一管加入DNA2.5微升，另一管加入2.5微升PCR混合液(对照)，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：
PCR扩增结果用含有0.1％EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果见图2和图3，如图所示，浙江种源的玄参(包括种植于四川的玄参)在分子量1300bp左右均有条带出现，而其他种源的玄参在分子量1300bp左右没有条带出现。表明：采用cc874u和cc874d进行PCR检测，若样品中含有浙江种源的玄参则为阳性反应，反之则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了cc874u和cc874d引物的专一性。
Claims (1)
1.一种浙江种源的玄参PCR引物，其特征是该引物为2段22个核苷酸的长的寡核苷酸，其序列为：5’-ctatcatcgtctttgtccatcc-3’和5’-tgctttgaaacatttgaacttg-3’，该2段寡核苷酸是以如下所述的浙江玄参特异性DNA序列为基础而设计的：
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