CN101139605B

CN101139605B - 鉴别浙贝母变种—东贝母的核苷酸序列,分子探针和方法

Info

Publication number: CN101139605B
Application number: CN200710070814A
Authority: CN
Inventors: 赵云鹏; 刘晓贤; 陈川; 潘兰兰; 陈斌龙; 傅承新
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-08-17
Filing date: 2007-08-17
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2027-08-17
Also published as: CN101139605A

Abstract

本发明公开了一种鉴定变种东贝母的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。属于中药鉴定技术领域，本发明提供了东贝母(Fritillaria thunbergii.Miq.var.chekiangensis Hsiao et K.C.Hsia)简单重复序列间扩增ISSR的特异序列以及基于该序列的东贝母鉴定探针和方法。本发明具有的有益效果：1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。2)准确、灵敏度高，friD1/friD2为东贝母专一性分子探针，若为其他种源，为阴性反应。

Description

鉴别浙贝母变种---东贝母的核苷酸序列，分子探针和方法

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法鉴定浙贝母变种---东贝母的技术领域，具体地说，是涉及一种鉴定变种东贝母的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。

背景技术

东贝母(Fritillaria thunbergii Miq.var.chekiangensis Hsiao et K.C.Hsia)主产于浙江金华地区的东阳、磐安等地，栽培历史悠久。性味苦寒，具有清热化痰、开郁散结的功效，用于风热、痰火咳嗽、肺痈、乳痈、瘰疠、疮毒、心胸郁闷等症，功效主治与浙贝母相类似。《浙江省中药炮制规范》94版将其作为浙贝母的来源之一收载。

东贝母一般认为是浙贝母的优品，需要与普通浙贝母进行区分。同时，由于小东贝的形状、大小与川贝母较相似，而价格较川贝低，随着药用贝母市场需求的不多扩大，出现用小东贝混充为川贝母进行交易的现象。由于东贝母与川贝母具有不同的药效，在处方时必须严格区分。综合上述原因，有必要找出一种快速，准确鉴别东贝母的方法。

近年来，中药的标准化已成为中药产业发展和打入国际市场的瓶颈。药用植物或植物药的发展离不开标准化生产，即目前大力推行的GAP(GoodAgriculturing Practice，中药材生产质量管理规范)工作的核心。而种(品)质的标准及科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提。因此，中药材品质鉴定的方法必须满足快速，准确，标准化等要求。目前对东贝母品种鉴别主要依据药材形态和化学成分，尚未见有关东贝母DNA快速鉴定的技术的研究报导。因此，有必要在DNA分子标记水平采用新方法新技术快速鉴定东贝母，解决药材市场上品种混乱和品质优劣等问题。

参考文献

蔡朝晖董婷霞2001不同产地浙贝母的基因序列及生物碱含量比较中药材-2001年3期

程存归陈宗良2002 FTIR直接测定法对川贝母和珠贝、小东贝的区别鉴定中草药-2002年3期

高文远李志亮1996常用中药浙贝母的研究进展.中国中药杂志-1996年6期

高文远傅荣昭1998浙贝母基因组DNA的提取与分析中国中药杂志-1998年2期

高文远傅荣昭1998浙贝母质体的研究中国药学：英文版-1998年3期

李冰岚陈宗良东贝母的生药鉴定中药材-1999年1期

林泉 1991浙江植物志第七卷浙江科学技术出版社杭州

吴忠郑少珠1997浙贝母，川贝母微量元素灰关联度分析及鉴别分类中药材-1997年6期.

谢志民吕润霞2000贝母类中药品种的本草考证中药材-2000年7期

张建兴劳爱娜1993东贝母化学成分的研究中草药-1993年7期

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定浙贝母变种---东贝母的核苷酸序列、核酸分子探针和方法。

用于鉴定东贝母的核苷酸序列是该序列来源于ISSR通用引物UBC835扩增所得的东贝母特异性核苷酸序列，具体序列为：

5’-caactcatccaagtatccaagctaaaccgagagcataatccgagagttaaatcatccaagaagctctagtgcgtgaccactcaccgctggctcataggatcacgagctaactaaacatgacaaacaaacattcaacacacaagaagtcactgagagagacccccgagctcaatgtcaccgagctcggggtgtgcccgacccctcaccaacgatcacagaggtcgggtacagagaacacaaacatatcaactattacaagccaaaccaatacaagccacacacaataagtatcacaatccaaaatacgaatgtcatccatcaacccatcaaagatccgggacccgagaaggatccaacatccaactggaatccgacccgacccggcttcaaaccgcatccgacttcgaagattcgacccactcgagttcgacccgacccgctcgagttcgacttgacctgcttgagctcgaccctgcccgcatcagctcgactcgacccgcatcagctccggtcaccggcgatggtgatggaggtacctgcaaaagaagtgatacattagaaccgaacaaagggaaaaagataaaaagggaagggaagaaaggggacaaggggataagggatggtcggggac agagacggagaaggcgatggagtaggctcgaggtgaagagggagttggctttgcgggcgactcgaggaagcttgaggaagacggtgatggagggagctctctgttggacatatagagctcgagggcacagagtaagacaatacagctgagcttcgatgtggatggtgacggcggtgtcggcgaaggcacggatggcaacagaggaaggcgcaacaggaggcgcaggcggcggcgcaacaggcggcaataacagacggcgacaacgaaaagcggtcatgggaactcgagctc-3’

东贝母专一性核酸分子探针是：该核酸分子探针来源于权利要求1所述核苷酸序列中的1段或2段19个核苷酸的长的寡核苷酸序列或它们的互补序列；或者是上述这些序列经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过10％的序列。

核苷酸序列为：friD1 5′-actcaccgctggctcatag-3′或friD25′-ccaactccctcttcacctc-3′，或者为friD 1和friD2。

鉴定东贝母的方法是采用PCR方法，以权利要求2或3所述的核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。所说的核酸分子探针为权利要求3所述的friD1和friD2。

本发明具有的有益效果：

1)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。

2)准确、灵敏度高，friD1/friD2为东贝母专一性分子探针，若为其他种源，为阴性反应。

附图说明

图1是采用ISSR引物UBC835进行PCR扩增的电泳图(红色框内的条带是东贝母特有的条带，分子量为1000bp左右)；

图2是采用东贝母专一性核酸分子探针friD1和friD2对几种主要药用贝母进行检测的PCR扩增电泳图；

图3是采用东贝母专一性核酸分子探针friD1和friD2对几种主要药用贝母进行检测的PCR扩增电泳图；

具体实施方式

本发明可以从遗传本质上客观准确地鉴定东贝母。具体包括：1提供用于东贝母鉴定的DNA片段；2提供来源于上述DNA片段的东贝母专一性核酸分子探针；3提供利用上述核酸分子探针鉴定东贝母的方法。

在采用ISSR分子标记研究几种药用贝母的遗传多样性时发现，ISSR通用引物UBC835扩增的带型中，东贝母有特异性条带，能将其与其他药用贝母区别开。因此，可根据此特异性条带合成专一性的核酸分子探针，建立快速、准确鉴定东贝母的分子生物学方法。

本发明提供的用于鉴别东贝母的核苷酸序列来源于采用ISSR通用引物UBC835扩增所得的东贝母特异性序列，该序列的结构特征如序列表中的序列1(<210>1)所示。

该序列(<210>1)可通过如实施例1所述的方法得到；或者按已知的该序列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。

本发明的东贝母专一性核酸分子探针是以上述东贝母特异性核苷酸序列为基础，利用Primer Primer 5.0(Vinay Singh，1998)软件设计得出。该分子探针为东贝母特异性核苷酸序列中的1段或2段19个核苷酸组成的寡核苷酸序列，或它们的互补序列；或者是上述这些序列再经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过总核苷酸量的10％的序列。

本发明的上述东贝母专一性核酸分子探针为序列表中<210>2和<210>3所示的序列(分别简称为friD1和friD2)。

本发明的上述东贝母专一性核酸分子探针，可按照预先根据东贝母特异性核苷酸序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。

本发明的上述东贝母专一性核酸分子探针，具有极高的专一性，能与东贝母专一性反应，但不与其他药用贝母的DNA发生反应。所以，利用该核酸分子探针，通过PCR方法可以快速、准确地鉴别东贝母。

本发明所提供的东贝母的鉴定方法，可采用PCR方法：以前面所述的本发明的核酸分子探针(优选为friD1和friD2)为PCR引物，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作进行：按照经过优化的PCR体系逐一将样品加入PCR管中，放入PCR仪器，采用经过优化的PCR程序进行PCR扩增。采用该PCR方法可快速、准确地检测鉴定东贝母，而且样品用量少。

由于本发明所提供的核酸分子探针为东贝母专一性探针，因此，在样品品种未知的情况下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，鉴定出其是否为东贝母，为东贝母的鉴定提供了客观、快速、准确的方法，为解决药材种植上品种混杂的问题提供了有效快速的解决方法。

序列表中的<210>1序列是东贝母特异性核苷酸序列，其中带下划线的部分(79-97bp和661-679bp)分别为本发明的东贝母专一性寡核苷酸分子探针friD1和friD2。

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：东贝母特异性核苷酸序列的制备

1基因组DNA的提取

采用改良的CTAB法(Doyle，1991)提取贝母叶片基因组DNA，步骤如下：

(1)取0.05克硅胶干燥的贝母叶片材料，置于BIO101管中研磨成粉末后，加入65℃预热的2ml 2×CTAB抽提缓冲液(100mMTris-HCL(PH8.0)，20mMEDTA，1.4M NaCl，2％CTAB，2％β-硫基乙醇)，轻轻摇动使溶液分散均匀，65℃水浴20-30分钟，水浴过程每隔5分钟轻轻摇动。

(2)冷却至室温，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合均匀，10000g离心10分钟。

(3)吸取上层水相转入新的5ml离心管，加入1/10体积的10×CTAB-0.7MNaCl，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，重复步骤(2)。

(4)吸取上层水相转入新的5ml离心管，加入超过2倍体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动，待DNA沉淀析出，8000g离心1min(离心之前可在-20℃放置半个小时)，使DNA附着离心管管底，但不要结块，弃水相。

(5)加70％乙醇洗涤2次，用无水乙醇洗涤1次，风干。

(6)用适量高盐TE溶解DNA，加入RNA酶10ul，37℃至少保温0.5小时。

(7)用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提蛋白质，摇匀后10000g离心10分钟。

(8)吸取上层水相转入新的1.5ml离心管，加入1/10体积3MNaAc(Ph＝5.2)和2倍体积的无水乙醇，轻轻摇动，直到出现DNA絮状沉淀后，8000g离心1min(离心之前可在-20℃放置半个小时)，使DNA附着离心管管底，但不要结块，弃水相。

(9)加70％乙醇洗涤2次，用无水乙醇洗涤1次，风干。

(10)用适量0.1×TE溶解DNA，-20℃长期保存。

(11)1.0％琼脂糖电泳检测DNA质量。

2ISSR--PCR

用ISSR通用引物UBC835进行PCR扩增，扩增体系如下表所示：

PCR程序为：

PCR产物电泳结果见图1，红色框内的条带(分子量为1000bp左右)是采用ISSR引物UBC835进行PCR扩增时寻找到的东贝母特有的条带。如图所示，仅东贝母在分子量1000bp左右有条带出现，而其他药用贝母在分子量1000bp左右没有条带出现。因此，此条带即为东贝母的特有条带。

3序列测定

PCR结束后，PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳，对只在东贝母群体中出现的特异性ISSR片段进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(Sangon，Shanghai，China)回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到PUCm-T载体(Sangon，Shanghai，China)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中。目的片段采用引物M13+/-于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表中<210>1序列所示的核苷酸组成与排列。

实施例2：东贝母专一性核酸分子探针friD1和friD2的制备

在获得东贝母特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Primer 5.0(VinaySingh，1998)软件设计，得出ffiD1和friD2(分别为序列表中<400>1所示的79-97bp和661-679bp)的核苷酸组成与排列是用于鉴定东贝母的良好寡核苷酸片段。根据ffiD1和friD2的核苷酸组成的排列(序列表中<210>2和<210>3序列所示的核苷酸组成与排列)，在DNA自动合成仪上合成得到。

实施例3：东贝母的鉴定(常规PCR方法)

1、DNA的提取：采用改良CTAB法提取贝母DNA

2、PCR反应体系为：

3、PCR操作：取2个0.5毫升PCR管，按照步骤2分别加入22.5微升PCR混合液，然后一管加入DNA2.5微升，另一管加入2.5微升PCR混合液(对照)，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：

PCR扩增结果用含有0.1％EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果见图2和图3，如图所示，东贝母在分子量1000bp左右均有条带出现，而其他药用贝母在分子量1000bp左右没有条带出现。表明：采用friD1和friD2进行PCR检测，若样品中含有东贝母则为阳性反应，反之则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了friD1和friD2引物的专一性。

Claims

1.一种用于鉴定浙贝母变种---东贝母的核苷酸分子，其特征是其序列来源于ISSR通用引物UBC835扩增所得的东贝母特异性核苷酸序列，具体序列为：

5’-caactcatccaagtatccaagctaaaccgagagcataatccgagagttaaatcatccaagaagctctagtgcgtgaccactcaccgctggctcataggatcacgagctaactaaacatgacaaacaaacattcaacacacaagaagtcactgagagagacccccgagctcaatgtcaccgagctcggggtgtgcccgacccctcaccaacgatcacagaggtcgggtacagagaacacaaacatatcaactattacaagccaaaccaatacaagccacacacaataagtatcacaatccaaaatacgaatgtcatccatcaacccatcaaagatccgggacccgagaaggatccaacatccaactggaatccgacccgacccggcttcaaaccgcatccgacttcgaagattcgacccactcgagttcgacccgacccgctcgagttcgacttgacctgcttgagctcgaccctgcccgcatcagctcgactcgacccgcatcagctccggtcaccggcgatggtgatggaggtacctgcaaaagaagtgatacattagaaccgaacaaagggaaaaagataaaaagggaagggaagaaaggggacaaggggataagggatggtcggggacagagacggagaaggcgatggagtaggctcgaggtgaagagggagttggctttgcgggcgactcgaggaagcttgaggaagacggtgatggagggagctctctgttggacatatagagctcgagggcacagagtaagacaatacagctgagcttcgatgtggatggtgacggcggtgtcggcgaaggcacggatggcaacagaggaaggcgcaacaggaggcgcaggcggcggcgcaacaggcggcaataacagacggcgacaacgaaaagcggtcatgggaactcgagctc-3’。

2.一种以权利要求1的核苷酸分子的序列为基础而设计的东贝母专一性核酸分子探针，其特征是其核苷酸序列为：friD15′-actcaccgctggctcatag-3′和friD25′-ccaactccctcttcacctc-3′。

3.一种用权利要求2所述的核酸分子探针鉴定东贝母的方法，其特征是采用PCR方法，以权利要求2所述的核酸分子探针为PCR引物，进行PCR反应，其步骤和过程按常规PCR方法进行。