CN109593872B - 一种利用毛细管电泳荧光ssr指纹图谱鉴别白蜡新品种青碧的方法 - Google Patents
一种利用毛细管电泳荧光ssr指纹图谱鉴别白蜡新品种青碧的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法,是由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA,并以提取的DNA为模板,利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增,将PCR扩增产物进行毛细管电泳,根据电泳结果中每对SSR引物的峰值,组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱,实现对白蜡新品种‘青碧’的鉴别。本发明方法中利用筛出特异性稳定、多态性好的6对SSR特异引物,构建了白蜡新品种‘青碧’的指纹图谱,能够简便、快速、准确地完成白蜡新品种‘青碧’样品的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于植物品种分子鉴定技术领域,具体而言,涉及一种利用毛细管电泳荧光 SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法。
背景技术
白蜡属植物为风媒花,混栽时很容易发生天然授粉杂交,尤其是绒毛白蜡(F.velutina)、红枔(F.pennsylvanica)、白枔(F.americana)等同为枔亚属样组,其形态特征非常相似,亲缘关系极为亲近,杂交后代传统的方法往往无法区分。‘青碧’为绒毛白蜡(FraxinusVelutina‘qingbi’)雌株新品种,是由山东省林业科学研究院课题组培育的,2016年通过国家审定。该品种树干黄褐色,当年生枝条微弯下垂,耐盐碱,应用范围广,适于园林绿化和造林。传统的白蜡分类鉴别主要依靠翅果、花、芽、叶及花粉粒等形态学标记,以翅果和花性状的差异最为明显,其次是芽、叶缘锯齿和果实缺刻被作为分类的依据。虽然形态标记研究简单直观且较经济,但有些不同种或品种间的形态特征极为相似,在种间交互难以区分,造成了白蜡属植物分类混淆问题,常出现同种多名称以及同名多品种的现象,导致白蜡命名上存在一些争议。在种质资源的鉴别中,仅依靠其形态性状,通常不能准确的反映不同品种的差别,因为形态性状极易受到环境的影响而发生变化,这给种或品种鉴别带来困难。在分子水平上对种质进行鉴定不受环境和生长阶段的影响,结果稳定,可靠性强。因此,寻求从分子水平真正准确识别白蜡良种极具现实意义。特别是在苗期的‘青碧’很难通过表型特征来进行鉴定,DNA分子标记的出现和快速发展,有望为‘青碧’的准确鉴定提供了一种新的技术手段。
简单重复序列(Simple5equencerepeat,SSR)分子标记具有信息含量高、共显性遗传、数量丰富、分析方法简单、结果重复性好、省时省力省钱等优点。目前SSR标记是种质鉴定方面最灵敏、最可靠的一种分子标记,已成为鉴别品种分子身份证的较理想的分子标记技术,并且已成功应用于玉米、水稻、大豆、小麦、棉花等作物中。但检索发现:利用毛细管电泳荧光SSR分子标记技术,开发基于毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’方法的专利未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明要解决的问题是供用一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法。
本发明所述利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法,步骤是:
(1)由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA;
(2)以提取的DNA为模板,利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增;
(3)将PCR扩增产物进行毛细管电泳;
(4)根据电泳结果中每对SSR引物的峰值,组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱,实现对白蜡新品种‘青碧’的鉴别;
其特征是:
步骤(1)中DNA的提取采用CTAB法,提取缓冲液中加入2%β-巯基乙醇和2%PVP;紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度,稀释至30ng/μl,-20℃保存,备用;
步骤(2)筛选出的SSR引物对为6对,分别是F82和R82,F93和R93,F95和 R95,F120和R120,F123和R123,F167和167;其中在每对引物5′端加有选自FAM、 TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记,正向引物为与携带荧光标记的TP-M13 引物组成;所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列,R82的核苷酸序列是如SEQ IDNo.2所示的反向引物序列,所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列,R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的反向引物序列,所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如 SEQ ID No.5所示的正向引物序列,R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的反向引物序列,所述F120和R120引物对中F120的核苷酸序列是如SEQID No.7所示的正向引物序列,R120的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的反向引物序列,所述F123和 R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ ID No.9所示的正向引物序列,R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的反向引物序列,所述F167和R167引物对中F167 的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列,R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的反向引物序列;
PCR反应体系为10μL:10ng/μl的DNA模板1μL、2×Taq plus PCR Master Mix 5μL、10μmol/L的正反向引物各0.1μL以及ddH2O共10μL;
PCR扩增程序采用Touchdown模式:95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s;每个循环降低0.5℃;72℃延伸30s,15个循环;95℃变性30s,50℃退火 30s,72℃延伸30s,20个循环;72℃延伸10min,4℃保存;
步骤(3)所述将PCR扩增产物进行毛细管电泳的方法是:取PCR产物0.3μL、 GS-500LIZ分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板,95℃变性5min, 4℃冷却后离心,1×Buffer缓冲液上机检测;采用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳:预电泳15kV下3min;1.6kV下进样15s;电泳15kV下20min;
步骤(4)所述的鉴别方法是:采用GenemarkerZ.2.0软件进行数据整理和图像分析,根据每对SSR引物的峰值,组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱;其中,F82和 R82引物对的峰值为250,F93和R93引物对的峰值为144/147,F95和R95引物对的峰值为150,F120和R120引物对的峰值为134,F123和R123引物对的峰值为142/148, F167和R167引物对的峰值为171。
本发明还公开了用于上述方法的SSR引物对,其特征是:所述SSR引物对为6对,分别是F82和R82,F93和R93,F95和R95,F120和R120,F123和R123,F167和 167;其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记,正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成;所述F82和R82引物对中F82 的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列,R82的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的反向引物序列,所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3 所示的正向引物序列,R93的核苷酸序列是如SEQID No.4所示的反向引物序列,所述 F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列,R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的反向引物序列,所述F120和R120引物对中F120 的核苷酸序列是如SEQ ID No.7所示的正向引物序列,R120的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的反向引物序列,所述F123和R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ ID No.9所示的正向引物序列,R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的反向引物序列,所述F167和R167引物对中F167的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列, R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的反向引物序列。具体的,所述6对SSR引物对信息见表1。
表1:6对SSR引物对信息
本发明所述的SSR引物对在构建白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱中的应用。
本发明根据转录组测序获得的序列数据设计并通过大量的筛选,选出特异性稳定、多态性好的6对SSR特异引物,用于构建白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱;具有分辨率高、操作简便、快速、结果准确等特点,能够快速实现白蜡新品种‘青碧’样品的鉴定。
本发明提供了一种白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱,其特征是:所述图谱由上述利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’方法中的相关步骤构建获得。
上述白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱中,SSR引物F82和R82引物对的峰值为250,F93和R93引物对的峰值为144/147,F95和R95引物对的峰值为150,F120和 R120引物对的峰值为134,F123和R123引物对的峰值为142/148,F167和R167引物对的峰值为171。
与现有技术相比,本发明的优益效果体现在:
1)本发明提供的方法是一种从分子水平上快速、高效鉴定白蜡新品种方法,具有快速、准确、操作方便等优势,并且鉴定结果不易受环境影响。
2)本发明利用毛细管电泳荧光标记电泳技术,克服了聚丙烯酞胺凝胶电泳的不足,能准确读出产物片段的大小,精确度达到l bp之内,能对品种进行精确鉴定,而且成本较低,应用价值大。
3)本发明提供的SSR引物对以及白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱为DNA指纹图谱的在白蜡上的进一步应用研究提供了坚实的理论支持。
附图说明
图1:SSR引物对82在‘青碧’中的PCR扩增产物毛细管电泳图。
图2:SSR引物对93在‘青碧’中的PCR扩增产物毛细管电泳图。
图3:SSR引物对95在‘青碧’中的PCR扩增产物毛细管电泳图。
图4:SSR引物对120在‘青碧’中的PCR扩增产物毛细管电泳图。
图5:SSR引物对123在‘青碧’中的PCR扩增产物毛细管电泳图。
图6:SSR引物对167在‘青碧’中的PCR扩增产物毛细管电泳图。
具体实施方式
实施例1
1.鉴定材料
选用‘青碧’幼嫩叶片提取基因组DNA。
2.DNA的提取
2.1将配制好的CTAB提取缓冲液置于65℃的水浴锅中预热30min,氯仿一异戊醇(24:1)、无水乙醇、70%乙醇置于-20℃冰箱预冷备用,研钵需提前预冷,使用前再用少量液氮预冷;
2.2取0.4-0.5g白蜡幼叶,加充足液氮研磨至粉末状,迅速转入2mL离心管中,加入600μL 2%的CTAB提取液(含2%β-巯基乙醇),充分混匀。在65℃的水浴锅中水浴30min,其间轻轻颠倒3-4次;
2.3冷至室温后加入600μL的氯仿:异戊醇(24:1)抽提10min,其间不停地轻轻地摇动,冷却至室温,在12000r/min离心10min;
2.4将上清液(约500μl)转入另一离心管中,加等体积氯仿:异戊醇(24:l)重复步骤2.3;
2.5取出上清液并移到另一个干净的1.5ml的离心管中,再加1ml的预冷无水乙醇沉淀 DNA(-20℃放置30min),轻轻旋转离心管,出现絮状DNA,-20℃放置1h,观察沉淀生成;
2.6 8000rmp室温离心5min,倒掉上清液,沉淀用1mL 75%的酒精洗涤两次,超净工作台静置乙醇挥发干净。
2.7待DNA风干后(DNA不宜过分干燥,否则极难溶解),用适量的TE(pH8.0、50μl)或超纯水溶解,4℃放置6-12h使其充分溶解;
2.8加入2μL RNA酶10mg/mL,37℃水浴1h,-80℃保存备用;
3.DNA定量和质量检测
3.1取2μL DNA用微量核酸蛋白检测仪检测,可以直接读出DNA浓度和A260/A280的比值,比值在1.8~2.0之间符合要求。
3.2另取3μL DNA加1μL的溴酚蓝,在0.8%琼脂糖凝胶上电泳15min~20min,稳压100 V,电泳缓冲液为1×TBE,325nm紫外灯下观察,照相,通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知DNA的浓度。
3.3植物总DNA样品呈现一条相对分子量较大而迁移速率很小的清晰条带。
3.4将样品稀释成浓度为20ng/μL,在-80℃保存备用。
4.毛细管电泳系统检测
4.1在公知的196份资源中逐一筛选,选出多态性好的6对SSR引物(详细信息见表1),在每对引物5′端添加荧光标记FAM(6-carboxy-fluorescein)。正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成,由山东华博基因工程有限公司合成。
表1:6对SSR引物对信息
4.2荧光标记毛细管电泳的PCR扩增采用10μL的反应体系:10ng/μl的DNA模板 1μL、2×Taq plus PCR Master Mix 5μL、正反向引物各0.1μL(10μmol/L)以及ddH2O 共10μL。
4.3 PCR扩增程序采用Touchdown模式:95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s(每个循环降低0.5℃),72℃延伸30s,15个循环;95℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,20个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
4.4 PCR产物变性:PCR产物用双蒸水稀释10-20倍,取PCR产物0.3μL、分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混匀加入PCR板;在PCR仪上运行变性程序:95℃变性 5min,4℃冷却后离心,1×Buffer缓冲液上机检测。
4.5 PCR产物扩增检测:PCR产物检测采用美国ABI公司生产的3730xl DNAanalyzer 基因分析仪,采用美国ABI公司生产的50cm,96道毛细管电泳,预电泳15kV下3min; 1.6kV下进样15s;电泳15kV下20min。
将上机结果原始文件导入Genemarker 2.2.0软件,进行数据收集和图像分析。
5.数据分析
根据筛选引物时确定的分子量大小及引物颜色进行分子量的确定,将收集的原始数据采用Data Collection软件导入Gene Marker 2.2.0系统进行分析。根据目标峰值大小系统软件与其泳道中的GS-500LIZ分子量内标进行比较,准确计算出目标DNA片段大小,将电泳结果转化成PDF图片格式导出。
各荧光标记毛细管电泳检测3次重复,3次重复的平均值作为实验材料在该座位上的数据。
6.SSR指纹图谱构建及分子鉴定:
根据6对SSR引物的峰值大小,构建白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱,见表2。
表2 6对SSR荧光引物组合构建的白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱
上述白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱中,SSR引物F82和R82引物对的峰值为250,F93和R93引物对的峰值为144/147,F95和R95引物对的峰值为150,F120和 R120引物对的峰值为134,F123和R123引物对的峰值为142/148,F167和R167引物对的峰值为171。
序列表
<110> 山东省林业科学研究院山东华博基因工程科技有限公司
<120> 一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种青碧的方法
<141> 2018-12-20
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物F82核苷酸序列
<400> 1
atgactcgtg tttagggatg aat 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物R82核苷酸序列
<400> 2
agctcttgaa gggaaaattt gaa 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物F93核苷酸序列
<400> 3
gaaaaggagg agagtgggaa tag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物93核苷酸序列
<400> 4
gctccatttc acttcaactc ttc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物F95核苷酸序列
<400> 5
agaatagatg aggatgaagg gaa 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物R95核苷酸序列
<400> 6
ctaactcatc cctctgcgaa ac 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物F120核苷酸序列
<400> 7
gaatgatctg gttgctgaat act 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物R120核苷酸序列
<400> 8
agagatttgg acatctgatg gaa 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物F123核苷酸序列
<400> 9
ggacaaaatg gttcagaatt tca 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物R123核苷酸序列
<400> 10
aaagaaagaa tcaaattcgt cgtc 24
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物F167核苷酸序列
<400> 11
tgagcaaatg tgaagaccgt ag 22
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 引物R167核苷酸序列
<400> 12
taatttcatc caccagtttc cac 23
Claims (3)
1.一种利用毛细管电泳荧光SSR指纹图谱鉴别白蜡新品种‘青碧’的方法,步骤是:
(1)由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组DNA;
(2)以提取的DNA为模板,利用筛选出的SSR引物对进行PCR扩增;
(3)将PCR扩增产物进行毛细管电泳;
(4)根据电泳结果中每对SSR引物的峰值,组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱,实现对白蜡新品种‘青碧’的鉴别;
其特征是:
步骤(1)中DNA的提取采用CTAB法,提取缓冲液中加入2%β-巯基乙醇和2%PVP;紫外分光光度法测定DNA的浓度和纯度,稀释至30ng/μl,-20℃保存,备用;
步骤(2)筛选出的SSR引物对为6对,分别是F82和R82,F93和R93,F95和R95,F120和R120,F123和R123,F167和167;其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记,正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成;所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列,R82的核苷酸序列是如SEQ IDNo.2所示的反向引物序列,所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列,R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的反向引物序列,所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列,R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的反向引物序列,所述F120和R120引物对中F120的核苷酸序列是如SEQID No.7所示的正向引物序列,R120的核苷酸序列是如SEQ ID No.8所示的反向引物序列,所述F123和R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ ID No.9所示的正向引物序列,R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的反向引物序列,所述F167和R167引物对中F167的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列,R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的反向引物序列;
PCR反应体系为10μL:10ng/μl的DNA模板1μL、2×Taq plus PCR Master Mix 5μL、10μmol/L的正反向引物各0.1μL以及ddH2O共10μL;
PCR扩增程序采用Touchdown模式:95℃预变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s;每个循环降低0.5℃;72℃延伸30s,15个循环;95℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,20个循环;72℃延伸10min,4℃保存;
步骤(3)所述将PCR扩增产物进行毛细管电泳的方法是:取PCR产物0.3μL、GS-500LIZ分子量内标0.5μL和去离子甲酰胺9.5μL混合加入PCR板,95℃变性5min,4℃冷却后离心,1×Buffer缓冲液上机检测;采用3730xl DNA测序仪进行毛细管电泳:预电泳15kV下3min;1.6kV下进样15s;电泳15kV下20min;
步骤(4)所述的鉴别方法是:采用GenemarkerZ.2.0软件进行数据整理和图像分析,根据每对SSR引物的峰值,组合形成白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱;其中,F82和R82引物对的峰值为250,F93和R93引物对的峰值为144/147,F95和R95引物对的峰值为150,F120和R120引物对的峰值为134,F123和R123引物对的峰值为142/148,F167和R167引物对的峰值为171。
2.用于权利要求1所述方法的SSR引物对,其特征是:所述SSR引物对为6对,分别是F82和R82,F93和R93,F95和R95,F120和R120,F123和R123,F167和167;其中在每对引物5′端加有选自FAM、TAMRA、HEX和ROX中的任意一种荧光标记,正向引物为与携带荧光标记的TP-M13引物组成;所述F82和R82引物对中F82的核苷酸序列是如SEQ ID No.1所示的正向引物序列,R82的核苷酸序列是如SEQ ID No.2所示的反向引物序列,所述F93和R93引物对中F93的核苷酸序列是如SEQ ID No.3所示的正向引物序列,R93的核苷酸序列是如SEQ ID No.4所示的反向引物序列,所述F95和R95引物对中F95的核苷酸序列是如SEQ ID No.5所示的正向引物序列,R95的核苷酸序列是如SEQ ID No.6所示的反向引物序列,所述F120和R120引物对中F120的核苷酸序列是如SEQ ID No.7所示的正向引物序列,R120的核苷酸序列是如SEQID No.8所示的反向引物序列,所述F123和R123引物对中F123的核苷酸序列是如SEQ IDNo.9所示的正向引物序列,R123的核苷酸序列是如SEQ ID No.10所示的反向引物序列,所述F167和R167引物对中F167的核苷酸序列是如SEQ ID No.11所示的正向引物序列,R167的核苷酸序列是如SEQ ID No.12所示的反向引物序列。
3.权利要求2所述的SSR引物对在构建白蜡新品种‘青碧’的SSR指纹图谱中的应用。
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