CN110791586B - 鉴定板栗品种的ssr标记引物组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴定板栗品种的SSR标记引物组及其应用。本发明通过构建板栗雌雄花差异表达谱，在雌雄花特异表达基因中识别和定位了19个SSR位点；通过在SSR两端设计特异引物，经过PCR扩增，筛选到3对多态性和稳定性较好的引物；进一步利用上述的3对引物对17份板栗品种资源进行了亲缘关系分析，证实所述SSR标记重复性和多态性较高，可用于板栗遗传分析和品种鉴定。

Description

鉴定板栗品种的SSR标记引物组及其应用

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及鉴定板栗品种的SSR标记引物组及其应用。

背景技术

我国是栗属植物的起源中心和世界食用栗主产国。世界栗属植物中商业化栽培的种主要有中国板栗(Castanea mollissima Blume)、日本栗(C.crentata)和欧洲栗(C.sativa)。栗子风味独特，营养丰富，富含淀粉、粗蛋白和矿物质，为低脂肪和低硫的健康食品，许多国家和地区都有消费板栗的传统习惯，国内外市场需求量较大。2017年全世界食用栗产量232.7万吨，其中我国板栗产量194万吨，占全世界产量的83.3％。我国板栗遗传资源丰富，地方品种繁多，品种形成和分布具明显区域性，大体可分北方板栗和南方板栗两大类型。随着板栗产业的发展，板栗新种质发掘和创制能力不断增强，地方板栗引种、选种活动频繁，板栗生产上存在品种混杂、同名异物、异名同物等问题。因此，进行板栗资源多样性研究和品种鉴定对板栗优良新品种选育和综合开发利用具有重要意义。

SSR分子标记在基因组中广泛存在，开发检测成本低，具有稳定性好、多态性高、共显性遗传等优点，在种质资源鉴定、遗传图谱构建、分子辅助育种等方面应用广泛。目前，利用SSR分子标记在包括中国板栗、欧洲栗、日本栗和美洲栗(C.dentata)等栗属植物中进行了许多遗传多样性研究和资源鉴定。但所用的SSR标记大多数源自欧洲栗和日本栗，这些标记主要基于壳斗科基因组数据库(http://www.fagaceae.org)开发而来。尽管前人通过构建基因组文库或利用公共EST数据库的方法获得了源自中国板栗的SSR标记，但这些SSR标记或来自基因组，与目的基因相关联的标记很少；或通过生物信息学手段预测，序列并未公布，其有效性和多态性尚待进一步验证，因此，实际应用中仍采用来自欧洲栗和日本栗中的SSR标记。而在理论研究和育种实践中，本物种内与目标性状或目的基因相关的分子标记更具价值，也尤为珍贵。

随着高通量测序成本降低，利用转录组/表达谱测序结合生物信息学分析，可批量定位和识别SSR位点。因此，基于表达谱测序开发的板栗SSR标记可为板栗资源遗传分析、品种鉴定提供可靠的分子标记，同时为开发目的基因连锁的SSR标记奠定基础，具有重要的理论和实践价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中缺乏与目的基因相关联的板栗SSR标记引物的不足，提供一组与板栗雌雄花基因相关联的、尤其适合于中国板栗资源遗传分析和品种鉴定的SSR标记引物组及其应用。

申请人前期构建了板栗雌花和雄花高通量测序文库，获得了大量雌雄花差异表达基因；然后进一步在差异表达基因中，筛选雌雄花特异表达基因。在雌雄花特异表达基因序列中，采用Microsatellite(MISA)软件识别和定位SSR位点，并用Primer3软件设计SSR引物。以8份中国来源不同品种板栗DNA为模板，利用上述SSR引物进行PCR扩增，产物经过2.5％琼脂糖凝胶电泳初步筛选，之后用全自动毛细管电泳仪QIAxcel Advanced(德国QIAgen生物公司)验证，最终获得3对条带清晰、多态性高、重复性好的SSR标记引物(表1)。

表1鉴定板栗品种的SSR标记引物

因此，本发明的第一个目的是提供鉴定板栗品种的SSR标记引物组，包括3对SSR标记引物：

(1)CmS1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)CmS2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)CmS3：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二个目的是提供所述的SSR标记引物组在板栗遗传分析和品种鉴定中的应用。

优选，所述的应用，包括以下步骤：

提取待测板栗基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用所述的SSR标记引物组中的每对引物分别进行PCR扩增反应，然后采用毛细管电泳方法对PCR扩增产物进行分型。

优选，所述的PCR扩增反应的体系为：200ng模板DNA，包含预混Es Taq聚合酶、3mMMgCl₂和400μΜ dNTPs的2×Es Taq MasterMix 12.5μl，10μM正向引物和10μM反向引物各1μl，用双蒸水定容至25μl。

优选，所述的PCR扩增反应的程序为：

以CmS1正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性3min；94℃30s，49.2℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min；

以CmS2正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性3min；94℃30s，52.5℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min；

以CmS3正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性3min；94℃30s，52.5℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min。

本发明的SSR标记引物经过多轮筛选和验证，稳定性好，多态性高，并且所述SSR标记位点来自板栗雌雄花特异表达基因，可应用于板栗遗传分析和品种鉴定，以及板栗及其近缘属种质遗传鉴定和育种等。

附图说明

图1是5对多态性引物在8份板栗样品中的PCR扩增电泳图谱；所示引物为S1、S2、S3、S10、S15；每对引物检测8个样品，样品从左至右依次为：1.超短枝2号；2.罗田红栗；3.腰子栗；4.红光油栗；5.金优2号；6.金栗王；7.燕红；8.九月寒；M：DL5000 Marker。

图2是引物CmS1在17份板栗样品中PCR-QIAxcel扩增图谱。

图3是引物CmS2在17份板栗样品中PCR-QIAxcel扩增图谱。

图4是引物CmS3在17份板栗样品中PCR-QIAxcel扩增图谱。

图5是基于SSR标记的17份板栗资源亲缘关系图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：基于表达谱测序开发的板栗SSR标记

1.1SSR标记识别和引物设计

基于申请人前期构建的板栗雌花和雄花高通量测序数据库，以错误发现率<0.01且差异倍数≥2为标准筛选雌雄花中差异表达基因。进一步在差异表达基因中，利用RPKM(Reads Per Kilobase per Million mapped reads)值筛选雌雄花特异表达基因(如雄花中RPKM＝0，而雌花中RPKM>10，则表示该基因可能为雌花特异表达基因)，共鉴定到基因239个，其中雌花特异表达基因59个，雄花特异表达基因180个。采用Microsatellite(MISA)软件(Thiel et al.2003)在其中18个特异基因中识别和定位到19个SSR位点，利用qRT-PCR分析上述18个基因在板栗雌花或雄花中的表达水平，证实其中8个为雌花特异表达基因，10个为雄花特异表达基因。进一步采用Primer3软件设计SSR引物(表2)，引物由天一辉远生物科技有限公司(武汉)合成，PAGE方式纯化。

表2板栗雌雄花特异基因SSR引物

1.2引物有效性和多态性分析

1.2.1板栗试材及取样

在湖北省农业科学院果树茶叶研究所板栗资源圃中随机选取8个板栗品种树(超短枝2号、罗田红栗、腰子栗、红光油栗、金优2号、金栗王、燕红、九月寒)采样，为嫁接10年左右的结果树，砧木为实生板栗(C.mollissima Blume)。选择无病虫害的植株，每个品种至少3株，随机采集树体外围、内膛、上部和下部的叶片，暂存于冰盒中。带回实验室后，将叶片用清水洗净晾干，并用液氮迅速冷冻后于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2DNA提取和质检

应用CTAB法(Doyle&Doyle，1987)提取上述8个样品叶片基因组DNA；采用NanoDrop1000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientifific Inc.,Wilmington,DE,USA)和1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量。

1.2.3SSR标记PCR扩增

以上述8个板栗样品的DNA为模板，利用19对SSR引物(表2)进行PCR扩增。PCR扩增采用25μl反应体系，其中包含200ng模板DNA；2×Es Taq MasterMix(预混Es Taq聚合酶、3mM MgCl₂、400μΜdNTPs)(北京康为世纪生物科技有限公司)12.5μl；单个引物对的正向引物(10μM)和反向引物(10μM)各1μl；用双蒸水定容至25μl。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃30s，各引物对应的最适退火温度(表2)下退火30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min。PCR扩增产物采用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Gelred(Biotium)染色，130v电压下电泳50min后凝胶成像系统拍照，以DL5000作为DNA marker。

经过引物筛选，19对引物中有9对引物可扩增出清晰的条带，其中5对引物具有多态性，电泳结果如图1所示。进一步，选择其中多态性高的3对引物(S3、S10和S15；将上述引物对依次重新命名为CmS1、CmS2和CmS3)用于后续板栗资源遗传分析。

实施例2：基于表达谱测序开发的板栗SSR标记的应用

2.1板栗试材及取样

在湖北省农业科学院果树茶叶研究所板栗资源圃中选取17份板栗资源采样，资源品种名称及来源见表3，为嫁接10年左右的结果树，砧木为实生板栗(C.mollissimaBlume)。选择无病虫害的植株，每个品种至少3株，随机采集树体外围、内膛、上部和下部的叶片，暂存于冰盒中。带回实验室后，将叶片用清水洗净晾干，并用液氮迅速冷冻后于-80℃冰箱保存备用。

表3板栗名称及其来源

2.2DNA提取和质检

应用CTAB法(Doyle&Doyle，1987)提取17份样品叶片基因组DNA；采用NanoDrop1000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientifific Inc.,Wilmington,DE,USA)和1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量。

2.3SSR标记PCR扩增

以上述17个品种资源的DNA为模板，选择多态性高的3对引物(S3、S10和S15，依次对应CmS1、CmS2和CmS3)进行PCR扩增。PCR扩增采用25μl反应体系，其中包含200ng模板DNA；2×Es Taq MasterMix(预混Es Taq聚合酶、3mM MgCl₂、400μΜ dNTPs)(北京康为世纪生物科技有限公司)12.5μl；单个引物对的正向引物(10μM)和反向引物(10μM)各1μl；用双蒸水定容至25μl。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃30s，各引物对应的最适退火温度(表2)下退火30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min。

2.4PCR扩增产物的毛细管电泳检测

采用全自动毛细管电泳仪QIAxcel Advanced(德国QIAgen生物公司)对上述PCR扩增产物进行检测分析。毛细管电泳仪运行所用

DNA High Resolution Kit OM800、QX Alignment Marker 15/600bp、QX DNA Size Marker 25～500bp均购自德国QIAgen生物公司，样品吸取时间10s，电压5kV；样品分离时间800s，电压3.5kV，运行过程中氮气气压为0.4MPa，其他采用默认参数。

运行结果导入QIAxcel ScreenGel 1.4软件，对PCR扩增产物片段大小和浓度进行分析。主要分析15bp～600bp片段区间每个位点的等位基因扩增片段情况。图2-图4依次为引物CmS1-CmS3的电泳图谱。其中，横坐标为片段长度，纵坐标为荧光强度(RFU)，荧光强度越大，表示PCR产物浓度越大。图中显示扩增信号峰值与琼脂糖凝胶上跑出的条带较一致，且条带大小与预期基本相同。如图4结果所示，为引物CmS3在17个不同板栗样品当中共有7个差异位点(如125bp、187bp、241bp、317bp、388bp、463bp、508bp，允许±3bp误差)。此外，图中均无明显的特异性杂峰，表明引物在该PCR反应条件下具有良好的多态性和稳定性。

2.5品种亲缘关系分析

根据上述PCR-QIAxcel扩增图谱，将毛细管电泳数据转化为“1，0”矩阵，利用NTSYS-pc2.10软件中的SM相似系数(coefficient)计算17个样本间的遗传距离，运用非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类，构建亲缘关系树状图(图5)。结果显示，17个品种遗传多样性系数在0.48～0.93之间，以0.74为阈值，可将品种分为3大类，其中第Ⅰ类群包含‘短枝1号’、‘短枝2号’、‘沂蒙短枝’、‘燕红’等6个品种，主要为北方板栗品种；第Ⅱ类群中包含10份资源，主要为包括湖北地方品种在内的南方板栗品种；第Ⅲ类与前两大类亲缘关系明显较远，只包含‘金栗王’1个品种，该品种由日本栗和中国板栗杂交选育而来。该聚类结果与前人报道的栗属资源分布、来源和品种特征等相吻合，客观地反映出品种间的亲缘关系。这表明本发明所筛选的SSR引物来具有良好的多态性和稳定性，可用于包括板栗在内的栗属资源的遗传分析和品种鉴定。

序列表

<110> 湖北省农业科学院果树茶叶研究所

<120> 鉴定板栗品种的SSR标记引物组及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgggaacaa gaagaagcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagtcatttt gcatggagca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaggaggt ttgcaaggta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggtgtagat ggtggtggtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgatgaga gcttggcctc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagaagaaga tgcagaccgc 20

Claims (5)

1.鉴定板栗品种的SSR标记引物组，其特征在于，包括3对SSR标记引物：

(1)CmS1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

(2)CmS2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；

(3)CmS3：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

2.权利要求1所述的SSR标记引物组在板栗遗传分析和品种鉴定中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测板栗基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用权利要求1所述的SSR标记引物组中的每对引物分别进行PCR扩增反应，然后采用毛细管电泳方法对PCR扩增产物进行分型。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增反应的体系为：200ng模板DNA，包含预混Es Taq聚合酶、3mM MgCl₂和400μΜdNTPs的2×Es Taq MasterMix 12.5μl，10μM正向引物和10μM反向引物各1μl，用双蒸水定容至25μl。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增反应的程序为：

以CmS1正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性3min；94℃30s，49.2℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min；

以CmS2正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性3min；94℃30s，52.5℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min；

以CmS3正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性3min；94℃30s，52.5℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃5min。

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