CN113388696B - 用于山桐子遗传资源分析的ssr标记引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于山桐子遗传资源分析的SSR标记引物组及其应用，基于山桐子SLAF简化基因组测序数据库，在多态性的SLAF标签中识别SSR位点，通过在SSR两端设计特异引物，经过PCR扩增，筛选到6对多态性和稳定性较好的引物；进一步利用上述的6对引物对24份山桐子品种资源进行了亲缘关系分析，证实所述SSR标记重复性和多态性较高，可用于山桐子遗传多样性分析和亲缘关系分析。

Description

用于山桐子遗传资源分析的SSR标记引物组及其应用
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及用于山桐子遗传资源分析的SSR标记引物组及其应用。
背景技术
山桐子(Idesia polycarpa Maxim.)是杨柳科山桐子属乔木，其果实和种子含油率高，油料富含亚油酸等营养成分，是一种重要的木本油料树种。山桐子油可作为生物燃油的原料，经深加工后也可食用，具有良好的生态和经济价值。目前，山桐子已被国家和部分省份列为重点发展的木本油料植物，2020年国家卫生健康委员会将山桐子油纳入普通食品管理，山桐子产业和相关科研工作也得以快速发展。
山桐子分布广泛，主要生长于中国、朝鲜、日本和俄罗斯远东地区。在我国，山桐子野生资源主要分布于秦岭、淮河以南，在四川、陕西、湖南、湖北、浙江、江西、江苏、安徽、福建等省份均有分布，但数量稀少，呈零星分布。前人研究显示，长期的生态生殖隔离及地理种源的自然变异，天然分布的山桐子存在着广泛的群体间和群体内遗传变异，特别是产量性状变异范围最广，为山桐子资源遗传研究、开发利用和良种选育提供了广阔的前景。
目前关于山桐子遗传多样性的研究主要是利用表型性状标记如树高、叶片、花和果实等进行地理分布差异、种源和家系差异性及种质资源鉴定。在分子标记方面主要是利用ISSR(inter-simple sequence repeat，简单重复序列间区扩增多态性)进行分析。由于表型性状和ISSR分子标记在稳定性、特异性、可靠性等方面存在局限性，急需开发更高效的分子标记技术。SSR(simple sequence repeat，简单序列重复)分子标记在基因组中广泛存在，开发检测成本低，具有稳定性好、多态性高、共显性遗传等优点，在种质资源鉴定、遗传图谱构建、分子辅助育种等方面应用广泛。当前山桐子全基因组数据尚未公布，相关的遗传信息匮乏，在分子标记研究、遗传多样性分析和分子育种等方面研究较少。前人利用山桐子雌雄花表达谱测序拼接的Unigene开发了大量SSR分子标记，选择合成了100对引物进行初步分析，其中仅31对能扩增出特异条带，19对可以扩增出预期大小的条带，通用性和多态性并不高(李娜等，2017，基于山桐子转录组序列的SSR分子标记开发。)。究其原因，这些SSR标记理论上来自雌雄花表达基因，不能全面反映基因组的SSR分布情况。
SLAF-Seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing，特异性位点扩增片段测序)是一种简化的基因组测序技术，采用适当的酶切方案，对基因组DNA进行酶切，对得到的酶切片段(SLAF标签)进行3’端加A处理、连接双向索引(Dual-index)测序接头，然后经过PCR扩增、纯化，选取目的片段构建文库进行高通量测序。SLAF-Seq可快速获取基因组遗传信息，目前在全基因组关联分析(GWAS)、遗传图谱构建和QTL定位、遗传进化分析、功能基因定位和分子育种应用较多。利用SLAF-seq开发SSR分子标记在红豆杉、苎麻等植物上有过成功的案例。因此，本发明基于山桐子SLAF-seq基因组测序数据，开发适用于山桐子遗传资源分析的SSR标记，可为山桐子遗传多样性分析、品种亲缘关系分析提供可靠的分子标记，具有重要的理论和实践价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中山桐子基因组来源的SSR标记缺乏以及现有技术获得的SSR标记通用性较低的问题，提供一组源自山桐子基因组的SSR标记引物组，该引物组适用于山桐子遗传资源分析应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
申请人前期构建了30个山桐子SLAF高通量测序文库，获得了大量高质量的SLAF标签(210bp)，然后基于单碱基变异(SNP)(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)标记，筛选到一大批多态性SLAF标签。在多态性SLAF标签序列中，采用Microsatellite(MISA)软件识别和定位SSR位点，并用Primer5.0软件设计SSR引物。以8份山桐子DNA为模板，利用上述SSR引物进行PCR扩增，产物经过2.5％琼脂糖凝胶电泳初步筛选，最终获得6对条带清晰、多态性高、重复性好的SSR标记引物(表1)。
表1山桐子SSR标记引物
Figure BDA0003180830100000021
Figure BDA0003180830100000031
因此，本发明的第一个目的是提供山桐子SSR标记引物组，包括6对SSR标记引物：
(1)IdS1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)IdS2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)IdS3：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)IdS4：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
(5)IdS5：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
(6)IdS6：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的第二个目的是提供所述的SSR标记引物组在山桐子遗传多样性分析和亲缘关系分析中的应用。
优选，所述的应用，包括以下步骤：
提取待测山桐子基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用所述的SSR标记引物组中的每对引物分别进行PCR扩增反应，然后对PCR扩增产物进行电泳，根据条带检测结果进行山桐子遗传多样性分析和亲缘关系分析。
优选，所述的PCR扩增反应的体系为：100ng模板DNA 1μl，包含Taq DNA聚合酶、Mg2 +、dNTPs、指示染料和反应缓冲液的PCR预混液12.5μl；10μM正向引物和反向引物各0.5μl；双蒸水补足至25μl。
优选，所述的PCR扩增反应的程序为：
以IdS1正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(51.2℃)45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；
以IdS2正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(51.5℃)45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；
以IdS3正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(56℃)45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；
以IdS4正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(54.3℃)45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；
以IdS5正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(51.6℃)45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；
以IdS6正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94℃预变性5min；94℃变性30s，退火(52.3℃)45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；
本发明的SSR标记引物经过多轮筛选和验证，稳定性好，多态性高，所述SSR标记位点来自山桐子基因组，可应用于山桐子遗传多样性分析和亲缘关系分析，也可用于山桐子及其近缘属种质遗传鉴定和育种等。
附图说明
图1是部分引物在8份山桐子样品中的PCR扩增电泳图谱。
图2是引物IdS1在24份山桐子样品中PCR扩增电泳图谱。
图3是引物IdS2在24份山桐子样品中PCR扩增电泳图谱。
图4是引物IdS3在24份山桐子样品中PCR扩增电泳图谱。
图5是引物IdS4在24份山桐子样品中PCR扩增电泳图谱。
图6是引物IdS5在24份山桐子样品中PCR扩增电泳图谱。
图7是引物IdS6在24份山桐子样品中PCR扩增电泳图谱。
图8是基于SSR标记的24份山桐子资源亲缘关系图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：基于SLAF简化基因组测序开发的山桐子SSR标记
1.1SSR标记识别和引物设计
基于申请人前期构建的山桐子SLAF高通量测序数据库，利用SNP标记，筛选出多态性SLAF标签488,976个。在多态性SLAF标签序列中，采用Microsatellite(MISA)软件识别和定位到SSR位点30,121个。随机选择100个含有SSR位点的SLAF标签，采用Primer5.0软件设计SSR引物(表2)，引物由天一辉远生物科技有限公司(武汉)合成，PAGE方式纯化。
表2随机合成的100对SSR引物
Figure BDA0003180830100000051
Figure BDA0003180830100000061
Figure BDA0003180830100000071
Figure BDA0003180830100000081
Figure BDA0003180830100000091
1.2引物有效性和多态性分析
1.2.1山桐子试材及取样
在湖北恩施利川、襄阳等地采集山桐子资源24份，选择无病虫害的植株，随机采集树体外围、内膛、上部和下部的叶片，暂存于冰盒中。带回实验室后，将叶片用清水洗净晾干，并用液氮迅速冷冻后于-80℃冰箱保存备用。
1.2.2DNA提取和质检
应用植物基因组DNA快速提取试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)提取上述24个样品叶片基因组DNA；采用NanoDrop 1000超微量分光光度计(Thermo FisherScientifific Inc.,Wilmington,DE,USA)和1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量。
1.2.3SSR标记PCR扩增
在上述24份DNA中选择8个山桐子样品的DNA为模板，以合成的100对(表2)SSR引物进行PCR扩增。PCR扩增采用25μl反应体系，其中包含模板DNA(100ng/μL)1.0μl；2×高效PCRMix(含染料)12.5μl包含：Taq DNA Polymerase，Mg2+，dNTPs，指示染料和反应buffer，浓度为2×(武汉吉泰克基因技术有限公司)；正向引物(10μM)和反向引物(10μM)各0.5μl；双蒸水补足至25μl。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，各引物对应的最适退火温度(表2)下退火45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；PCR产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Gelred(Bio sharp)染色，130v电压下电泳35min后凝胶成像系统拍照，以DL5000作为DNA marker。
经过引物筛选，100对引物中有96对引物可扩增出清晰的条带，其中35对引物具有多态性，部分引物电泳结果如图1所示。进一步，选择其中多态性高的6对引物(STZ-SSR9、STZ-SSR16、STZ-SSR17、STZ-SSR20、STZ-SSR55和STZ-SSR89；将上述6对引物依次重新命名为IdS1、IdS2、IdS3、IdS4、IdS5和IdS6)用于后续山桐子资源遗传分析。
实施例2：基于SLAF简化基因组测序开发的山桐子SSR标记的应用
2.1山桐子试材及取样
在湖北恩施利川、襄阳等地采集山桐子资源24份，选择无病虫害的植株，随机采集树体外围、内膛、上部和下部的叶片，暂存于冰盒中。带回实验室后，将叶片用清水洗净晾干，并用液氮迅速冷冻后于-80℃冰箱保存备用。
2.2DNA提取和质检
应用植物基因组DNA快速提取试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司)提取样品叶片基因组DNA；采用NanoDrop 1000超微量分光光度计(Thermo Fisher ScientifificInc.,Wilmington,DE,USA)和1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量。
2.3SSR标记PCR扩增
以上述24份山桐子资源DNA为模板，选择多态性高的6对引物(STZ-SSR9、STZ-SSR16、STZ-SSR17、STZ-SSR20、STZ-SSR55和STZ-SSR89)进行PCR扩增。PCR扩增采用25μL反应体系，其中包含模板DNA(100ng/μL)1.0μL；2×高效PCR Mix(含染料)12.5μL包含：TaqDNA Polymerase，Mg2+，dNTPs，指示染料和反应buffer，浓度为2×(武汉吉泰克基因技术有限公司)；正向引物(10μM)和反向引物(10μM)0.5μL；双蒸水补足至25μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，各引物对应的最适退火温度(表2)下退火45s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸8min；PCR产物经2.5％琼脂糖凝胶电泳检测，Gelred(Bio sharp)染色，130v电压下电泳35min后凝胶成像系统拍照，以DL5000作为DNA marker(图2～图7)。
2.4品种亲缘关系分析
根据上述PCR扩增图谱，将电泳数据转化为“1，0”矩阵，利用NTSYS-pc 2.10软件中的SM相似系数(coefficient)计算24个样本间的遗传距离，运用非加权配对算术平均法(UPGMA)聚类，构建亲缘关系树状图(图8)。结果显示，24个品种遗传多样性系数在0.58～0.94之间。以0.75为阈值，可将24份资源再分为3类，其中第Ⅰ类群包含6个资源，主要为湖北襄阳地方山桐子品种资源；第Ⅱ类群中包含16份资源，采集自湖北旭舟林农科技公司生产基地(湖北利川)，其山桐子资源除湖北本地品种资源外，还有部分从四川等地引进的桐子品种，其多样性丰富；第Ⅲ类(13号样本)与前两大类亲缘关系明显较远，该样本采集于襄阳古隆中山桐子古树，可能为当地野生资源。该聚类结果与前人报道的资源地理分布、品种来源等特征相吻合，客观地反映出资源间的亲缘关系。这表明本发明所筛选的SSR引物具有良好的多态性，可用于山桐子的遗传多样性分析和亲缘关系分析。
序列表
<110> 湖北省农业科学院果树茶叶研究所
<120> 用于山桐子遗传资源分析的SSR标记引物组及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attatttctc ccccctcc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctattaaacc taagcctggc 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagaaggctg aaagaggga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgaataagg ctgtcgcat 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acatcactgc caataggtca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttgttgagt agttctgccc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agataatccc ttgatgtcgt gg 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatgggtgga agatgctcg 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcgttgaagg agacagatac ac 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acaattgacc caagaccg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaatctgcta tttccttgcc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgctactctt cctcttgtcg 20

Claims (5)

1.山桐子SSR标记引物组，其特征在于，包括6对SSR标记引物：
（1）IdS1：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
（2）IdS2：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；
（3）IdS3：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
（4）IdS4：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.8所示；
（5）IdS5：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.10所示；
（6）IdS6：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.12所示。
2.权利要求1所述的SSR标记引物组在山桐子遗传多样性分析和亲缘关系分析中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测山桐子基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用权利要求1所述的SSR标记引物组中的每对引物分别进行PCR扩增，然后对PCR产物进行电泳，根据电泳结果对山桐子进行遗传多样性分析和亲缘关系分析。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增反应的体系为：100 ng模板DNA 1 μl，包含Taq DNA 聚合酶、Mg2+、dNTPs、指示染料和反应缓冲液的PCR预混液12.5 μl；10 μM正向引物和反向引物各0.5 μl；双蒸水补足至25 μl。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序为：
以IdS1正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，51.2℃退火45 s， 72℃延伸1min，32个循环；最后72 ℃延伸8 min；
以IdS2正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，51.5℃退火45 s，72℃延伸1min，32个循环；最后72 ℃延伸8 min；
以IdS3正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，32个循环；最后72 ℃延伸8 min；
以IdS4正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，54.3℃退火45 s，72℃延伸1min，32个循环；最后72 ℃延伸8 min；
以IdS5正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，51.6退火℃45 s，72℃延伸1min，32个循环；最后72 ℃延伸8 min；
以IdS6正向引物和反向引物进行PCR扩增反应时，为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，52.3℃退火45 s，72℃延伸1min，32个循环；最后72 ℃延伸8 min。
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CN109880822A (zh) * 2019-03-12 2019-06-14 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 一种山桐子高质量dna提取方法
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