CN112941230B - 利用多态性ssr引物鉴定韭菜品种的方法及引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法及引物及应用。本发明依据SSR分子标记技术检测重现性高，稳定性好的特点，对韭菜进行了转录组测序，通过对测序数据分析设计SSR引物，从这些引物中筛查出6对引物，所述引物包括SSR19、SSR38、SSR43、SSR61、SSR168、SSR374，上述引物对应的上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑12所示，这些引物能有效鉴别本发明的8个韭菜品种，并建立快速的鉴定程序，既可以应用于韭菜资源研究中品种的鉴定，也为韭菜品种销售时追溯源头奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法及引物及应用。
背景技术
韭菜(Allium tuberosum Rottler ex Spr.)是百合科(Liliaceae)葱属(AlliumL.)的多年生蔬菜作物，原产中国，我国各地均有栽培，在居民蔬菜消费中占有重要地位。目前中国农科院蔬菜花卉所和平顶山市农业科学院保存的韭菜资源有300份以上，韭菜资源的收集、鉴定、编目、保存面临很大问题。而且在市场上出售的韭菜品种至少几十个，在市场销售的过程中，由于韭菜品种的繁育简单易行，技术门槛和成本低，有关品种知识产权的认定与归属的问题就逐渐地显现出来。而对品种进行快速有效的鉴定，是知识产权认定最基本的证据。传统的韭菜品种鉴定方法是调查韭菜的表型性状，如株高、鞘长、叶长、叶色、叶形、抽薹期、薹高、始花期、盛花期、抗寒性等，但这些性状受田间水、肥、光、温影响极大，而且有些性状调查数据的精确度有限，像叶色的调查数据只有浅绿、绿、深绿几种，经常出现从不同地域采集的资源和不同地区出售的品种，拥有不同的名字，表型性状相似甚至相同。是异名同种还是表型相似的不同品种？我们需要更精确的鉴定方法。因此，我们平顶山市农业科学院研究利用SSR分子标记鉴定韭菜品种。
SSR(简单重复序列simple sequence repeat)，是一类广泛存在于真核生物基因组，由1-6个碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列，由于重复次数不同，造成了每个位点的多态性。SSR标记遍布整个基因组，标记数量丰富，具有共显性、多态性高和重复性好的特点，且SSR位点在属间和属内种间具有保守性。因此，SSR标记技术被广泛应用于植物的遗传图谱构建、品种鉴定、遗传多样性分析和亲缘关系研究等方面。然而，现有技术未见依据SSR分子标记技术鉴定韭菜品种的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法及引物及应用。
本发明提供了一种鉴定韭菜品种的多态性SSR引物，包括SSR19、SSR38、SSR43、SSR61、SSR168或SSR374，上述引物对应的上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-12所示。
本发明还提供了一种利用上述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，包括以下步骤：韭菜DNA提取、PCR扩增、PCR产物电泳和染色。
优选的，利用上述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，所述PCR扩增的体系如下：20ng/μL的DNA模板3μL、2×Taq Master Mix for PAGE 4μL、浓度为10μmol/L的上下游引物各1.5μL、ddH2O补足10μL；
PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55-56℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
优选的，利用上述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，所述SSR19、SSR38、SSR43、SSR61、SSR168、SSR374对应的退火温度均为55℃。
优选的，利用上述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，所述SSR19和所述SSR38各有两个特异性位点，所述SSR43、SSR61、SSR168、SSR374各有一个特异性位点；观察染色后的电泳图，在相同迁移位置上有带记为“1”，无带记为“0”，组成如下“0，1”矩阵：
优选的，利用上述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，所述韭菜品种包括但不限于内蒙古野生韭-2、四季青、长沙香韭、V08A0221、平韭2号、中华韭王阳光种苗、马蔺韭、汉中冬韭。
优选的，利用上述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，
优选的，上述利用多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，所述韭菜品种内蒙古野生韭-2、四季青、长沙香韭、V08A0221、平韭2号、中华韭王阳光种苗、马蔺韭、汉中冬韭的“0，1”矩阵分别为01001010、11000101、11111010、01000100、11110101、11110111、11000001、10110100。
本发明还提供了一种所述的多态性SSR引物在鉴定韭菜品种中的应用。
本发明还提供了一种所述的“0，1”矩阵在鉴定韭菜品种中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明依据SSR分子标记技术检测重现性高，稳定性好的特点，对韭菜进行了转录组测序，通过对测序数据分析设计SSR引物，从这些引物中筛查出6对引物，能有效鉴别本项目的8个韭菜品种，并建立快速的鉴定程序，既可以应用于韭菜资源研究中品种的鉴定，也为韭菜品种销售时追溯源头奠定了基础。
2、本发明采用的分子标记技术为微卫星分子标记，也称SSR标记。这种标记广泛随机分布于真核生物基因组中，具有高度的多态性、高信息含量、高度的可重复性和共显性遗传方式。因此，SSR标记方法比其他标记方法具有简便、快捷、特异、稳定、所揭示的等位基因多样性高等特点。
对随机分布于基因组中大量的SSR位点进行筛选，用SSR位点两翼序列设计的引物进行PCR扩增，可以对随机分布于基因组中的变异位点进行较为全面的扫描，尽可能多的筛选到有效的SSR引物，用于构建韭菜新品种的指纹图谱，达到鉴别韭菜新品种的目的。
附图说明
图1为SSR97、SSR102、SSR149的扩增结果；
图1中从左至右个泳道分别为marker、SSR97扩增的表1中1-8号韭菜资源、SSR102扩增的表1中1-8号韭菜资源、SSR149扩增的表1中1-8号韭菜资源；
图2为SSR38、SSR43的扩增结果；
图2中从左至右个泳道分别为marker、SSR38扩增的表1中1-8号韭菜资源、SSR43扩增的表1中1-8号韭菜资源；
图3为SSR19的扩增结果；
图4为SSR61的扩增结果；
图5为SSR168的扩增结果；
图6为SSR374的扩增结果；
图3-6中从左至右个泳道分别为marker、表1中1-8号韭菜资源。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
实施例1 测序和SSR引物设计
平顶山市农业科学院韭菜课题组2018年8月利用PacBio RSⅡ三代测序平台对韭菜品种‘791’的测序获得韭菜全长转录组数据。测序时分别取韭菜的叶、花序、薹、叶鞘和根为材料，提取上述材料的RNA后委托北京百迈客生物科技有限公司进行单分子实时(SMRT，Single Molecular,Real-Time)测序，获得了21.22Gb的数据量。测序后，对高质量转录本以及校正后的转录本使用CD-HIT进行去冗余分析，得到51719条转录本序列，以500bp以上的49876条转录本为背景数据进行SSR位点分析。
利用MISA(MicroSAtellite identification tool)软件(http://pgrc.ipk-Gatersleben.de/misa)对49876条大于500bp的转录本序列(总长为89.44Mb)进行搜索，共在10332条转录本序列中发现符合条件的13111个SSR位点。采用Primer Premier 5.0设计引物。引物设计的主要参数为：引物长度18～28bp，GC含量40％～60％之间，退火温度(Tm)55～65℃之间，上、下游引物的退火温度值相差不大于5℃，预计PCR产物长度在100～300bp之间，设计引物时尽量避免引物二级结构如发卡结构、二聚体、错配的出现。除去复合型SSR和单核苷酸重复SSR，对3648条2～6核苷酸重复的SSR位点进行引物设计，共设计出3311对SSR位点特异引物。
实施例2 SSR引物筛选
随机选取420对SSR引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为10μL，包括20ng/μL的DNA模板3μL、2×Taq Master Mix for PAGE(Vazyme，南京)4μL、浓度为10μmol/L的上下游引物各1.5μL(浓度5μM)、ddH2O补足10μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用质量分数8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，170V电压下电泳90min左右，电泳后的银染显色，拍照后进行带型分析。
420对引物筛选结果：具有特异性的引物38对，能扩增出目的片段但没有特异性的293对，没有扩增出条带的89对。
用于SSR引物筛选和可用性评价的材料为本课题组在全国各地收集和选育的8个不同类型的韭菜种质资源(表1)。表1中所述的各个韭菜品种资源均保存在平顶山市农业科学院。所用试验材料在2019年3月播种育苗，2019年6月份移栽定植，2019年9月采集韭菜幼嫩叶片，参照的CTAB法进行基因组DNA的提取。筛选出电泳条带明显，可区分不同品种的引物，从鉴定品种的角度出发，用较少量的引物可以降低鉴定成本，所以从中选了6对引物用于这8个韭菜品种的鉴定。其它引物有些没有特异性，比如SSR149；有些有特异性，但特异性位点条带颜色浅，容易误读比如SSR97、SSR102；，参见图1，最终选择了表现较好的这6对引物。这些引物的信息见表2-3。
表1 韭菜SSR多态性分析材料
表2 特异性引物信息
表3 非特异性或误读引物信息
实施例3 鉴定方法
3.1 韭菜DNA提取
以在田间生长的韭菜叶片为材料，参照CTAB法进行基因组DNA的提取。所获得的DNA可顺利进行鉴别反应。
CTAB法具体的操作步骤为：
(1)取样研磨：选取韭菜单株摘取2-3片嫩叶，进行液氮研磨，分装在编号的离心管中并放置在-40℃冰柜内。
(2)抽提：加入700μL CTAB提取液，14μL巯基乙醇，65℃水浴1h，混匀。CTAB提取液含CTAB 1％(w/w)、NaCl 1.4mol/L、Tris-HCl 0.1mol/L、EDTA-Na0.02mol/L。
(3)除蛋白：加等体积的氯仿一异戊醇，氯仿(北京化工厂，分析纯)与异戊醇(北京化工厂，分析纯)的体积比为24:1，混匀；12000rpm离心10min，取上清液；
(4)沉淀核酸：向上清液中加入2倍体积的无水乙醇(北京化工厂，分析纯)或2/3体积的异丙醇(北京化工厂，分析纯)沉淀DNA,12000rpm离心6min，弃上清液；
(5)溶解：风干沉淀后加入TE缓冲液溶解DNA，得到DNA样品，备用。
3.2 PCR扩增
提取的韭菜DNA样品用分光光度计测定浓度并稀释至20ng/μL用于PCR扩增。PCR反应体系为10μL，其中包括20ng/μL的DNA模板3μL、2×Taq Master Mix for PAGE(Vazyme，南京)4μL、浓度为10μmol/L的上下游引物各1.5μL、ddH2O补足10μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
3.3 PCR产物电泳和染色
PCR产物用8％(w/w)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，170V电压下电泳90min左右，电泳后银染显色，拍照后进行带型分析。
PCR产物经电泳及染色，形成不同韭菜品种的SSR指纹图谱，根据表2中6对引物的指纹图谱，进行8种韭菜资源品种的鉴别。
图2-6是不同引物分别对表1所述8种引物的电泳图片。从图片上看，SSR38的一个特异性位点(240bp位点)和SSR43的两个特异性位点(275bp位点、235bp位点)条带清晰(其他的条带为杂带)，与相邻条带区分明显读带容易，不同品种在这些位点呈现明显差异性，可以用于这8个品种的鉴定。
实施例4 构建SSR指纹图谱和韭菜品种分子编码
利用表2中SSR引物对表1的8个品种进行扩增，扩增产物进行电泳，电泳图上该品种有几条带表示这个韭菜品种利用这一对引物产生了几种片段，片段相对Marker的位置表示这个片段的大小。对于引物SSR38来说，他有一个非特异性位点(235bp)，这个位点8个品种都扩增出片段，所以是非特异性位点，无法用来鉴别品种；但他往上的位点(240bp)是特异性位点，8个品种四个品种(3号、5号、6号、8号)有这个片段，另外四个品种(1号、2号、4号、7号)没有这个片段，就可以用来鉴定品种。我们根据电泳图上每一个特异性片段的位置设定位点，比如SSR38(240bp位点)，这个位置有带记为“1”，无带记为“0”，组成“0，1”矩阵。结果参见表4。
表4 6对韭菜多态性SSR引物的PCR扩增结果矩阵
根据表2中6个引物的8个特异性位点，对每个韭菜资源品种进行分子编码，位点顺序固定按上表顺序，值为二进制，有带记为“1”，无带记为“0”，结果参见表4。即每个品种在这8个位置有没有条带生成一个8位的2进制编码。有了唯一互相不重复的编码，就像有了身份证号，有棵不清楚品种的韭菜用SSR引物检测，得到的编码与哪个品种的编码一致就可以确定他就是这个品种。
表5 8个韭菜品种的PCR扩增结果矩阵
每个品种的编码独一无二，具有唯一性。在韭菜资源管理过程中经常单株混杂的情况，如果按照表型性状判断是哪一个品种的单株，一是不够准确，很多表型性状相似，辨识度低；二是有些性状需要特定时期观察，比如花蕾颜色需要夏季开花时调查，休眠性需要秋冬季调查。有了这种方法，我们将待鉴定的资源品种单株进行DNA提取、PCR扩增、电泳，电泳结果根据固定的特异性位点顺序赋值，与哪个品种编码一致即为哪个品种。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 平顶山市农业科学院
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<120> 利用多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法及引物及应用
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (7)
1.鉴定韭菜品种的多态性SSR引物，其特征在于，包括SSR19、SSR38、SSR43、SSR61、SSR168和SSR374，上述引物对应的上下游核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-12所示；所述韭菜品种为内蒙古野生韭-2、四季青、长沙香韭、V08A0221、平韭2号、中华韭王阳光种苗、马蔺韭、汉中冬韭。
2.利用权利要求1所述的多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：韭菜DNA提取、PCR扩增、PCR产物电泳和染色，所述韭菜品种为内蒙古野生韭-2、四季青、长沙香韭、V08A0221、平韭2号、中华韭王阳光种苗、马蔺韭、汉中冬韭。
3.根据权利要求2所述的鉴定韭菜品种的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系如下：20ng/μL的DNA模板3μL、2×Taq Master Mix for PAGE 4μL、浓度为10μmol/L的上下游引物各1.5μL、ddH2O补足10μL；
PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55-56℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求3所述的鉴定韭菜品种的方法，其特征在于，所述SSR19、SSR38、SSR43、SSR61、SSR168、SSR374对应的退火温度均为55℃。
5.根据权利要求3所述的鉴定韭菜品种的方法，其特征在于，所述SSR19和所述SSR38各有两个特异性位点，所述SSR43、SSR61、SSR168、SSR374各有一个特异性位点；观察染色后的电泳图，在相同迁移位置上有带记为“1”，无带记为“0”，组成如下“0，1”矩阵：
。
6.根据权利要求5所述的利用多态性SSR引物鉴定韭菜品种的方法，其特征在于，所述韭菜品种内蒙古野生韭-2、四季青、长沙香韭、V08A0221、平韭2号、中华韭王阳光种苗、马蔺韭、汉中冬韭的“0，1”矩阵分别为01001010、11000101、11111010、01000100、11110101、11110111、11000001、10110100。
7.根据权利要求1所述的多态性SSR引物在鉴定韭菜品种中的应用，其特征在于，所述韭菜品种为内蒙古野生韭-2、四季青、长沙香韭、V08A0221、平韭2号、中华韭王阳光种苗、马蔺韭、汉中冬韭。
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2021
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